Summary
在这里,我们描述了一种水培植物生长测定,用于量化物种存在,并可视化细菌在植物根系初始殖民化期间和转移到不同生长环境后的空间分布。
Abstract
细菌形成复杂的根系层微生物群落,由相互作用的微生物、较大的生物体和非生物环境形成。在实验室条件下,植物生长促进细菌(PGPB)的根圈殖民化可以相对于非殖民化植物增加宿主植物的健康或发育。然而,在田间环境中,使用PGPB进行细菌处理通常不会给作物带来实质性的好处。一种解释是,这可能是由于在植物寿命期间与内源性土壤微生物相互作用时PGPB的丧失。这种可能性一直难以证实,因为大多数研究侧重于最初的殖民化,而不是根圈社区内PGPB的维持。这里假设细菌群落的组装、共存和维护是由根生圈微环境的确定性特征决定的,这些相互作用可能会影响PGPB在原生环境中的生存。为了研究这些行为,使用阿拉伯植物生长测定对水培植物生长测定进行了优化,以量化和可视化植物根系初始殖民化和转移到不同生长后的细菌空间分布环境。该系统的可重复性和实用性,然后验证与精心研究的PGPB伪多尼纳斯模拟。研究多种细菌物种的存在如何影响植物根系的殖民化和维护动力学,三种细菌菌株(一种阿尔氏杆菌、柯氏杆菌和微细菌)的模型群落物种)最初与A.thaliana根生球分离的构造。研究表明,这些不同的细菌物种的存在可以通过这种水培植物主量测定来测量,这为基于测序的细菌群落研究提供了替代方案。将来使用该系统的研究可以增进对多物种植物微生物群落中细菌行为的了解,以及随时间变化的环境条件。
Introduction
细菌和真菌疾病造成的作物破坏会导致粮食产量下降,并可能严重破坏全球稳定1。基于抑制土壤中的微生物对植物健康增加的发现2,科学家们询问植物微生物群落是否可以通过改变植物的存在和丰度来支持植物的生长。细菌种类3。发现有助于植物生长或发育的细菌统称为植物生长促进细菌 (PGPB)。最近,研究已从简单地识别潜在的PGPB转向了解土壤、根部周围或根圈(直接围绕和包括根表面的区域)的王国间相互作用如何影响PGPB活动4.
PGPB的根圈殖民化可以增加宿主植物的健康或发育,以应对相对于非殖民化植物的不同压力5。然而,结果在原生土壤条件下往往比在严格控制的温室和实验室环境中观察到的结果多变。这种差异的一个假设是,PGPB的生长或行为可能被原生土壤细菌或真菌在田地7,8抑制。根圈细菌的有益作用通常取决于细菌1)定位和向根部移动的能力,2)通过生物膜形成殖民根部,3)通过生产小分子与宿主植物或病原体相互作用代谢物7,9。任何这些殖民行为都可能受到邻近微生物10的存在和活动的影响。
我们设计了一个系统来量化和可视化根生球的这些独特的细菌殖民化阶段(图1)。这种方法将有助于研究为什么在植物转移到新环境(如接种前幼苗种植期间)后,有时无法观察到长期的PGPB维持。阿拉伯植物被选作植物模型,因为它在实验室研究中的广泛应用,以及关于其微生物相互作用的充分数据11。系统中有三个阶段:1) A. thaliana生长,2) 细菌殖民化,和 3) 细菌维护(参见图 1)。由于A.thaliana是陆地植物,因此必须确保它在水培系统12中不会遭受不必要的水压。受Haney等人13年使用的方法的启发,幼苗在塑料网中生长,将芽与液体生长介质分离。该系统似乎不会损害植物宿主的健康和发展,它提高了液体11的A.thaliana生长。当植物芽漂浮在表面之上时,根部完全暴露在细菌的殖民化中,这些细菌被接种到液体细菌生长培养基中。这允许对感兴趣的细菌进行殖民化,以在最有利于生长的营养物质中殖民化,然后改变条件,使植物在营养介质中继续生长,以支持其生长。两个阶段包括稳定摇动,以防止根13的缺氧。细菌可以从从殖民化介质或维护介质转移后从植物根进行可视化或量化。这种水培系统非常灵活,允许实验条件和应用应力根据研究人员的兴趣轻松改变。
在关于植物-微生物相互作用的文献中,这种描述的方法非常重要,因为它提供了一个强大的系统,用于研究根表面的这些相互作用,同时还可以根据植物-微生物的生长偏好进行定制。不同的细菌。植物生物学实验室经常在固体琼脂上进行植物微生物殖民化实验,只允许细菌的平面运动(如果是的话),同时要求在随后转移过程中对植物进行潜在的破坏性操作。相比之下,微生物实验室经常在实验中优先考虑细菌的健康,这不利于植物14、15。以植物和微生物为重点的实验室的这些不同优先级历来使得很难比较这些组之间的结果,因为每个组通常优化实验条件以优化其感兴趣的生物体。此处描述的浮网-植物生长系统可防止植物完全浸没,这是以往以微生物学为导向的研究的显著优势,同时还暂时优化了细菌的生长和存活,以促进殖民化。因此,我们在这里的测定可以解决植物生物学家的担忧(关于植物的过度水分和触觉操纵),同时满足微生物学家的标准(允许不同的细菌生长条件和多重物种的相互作用)7.该协议旨在适应各种细菌、植物和环境条件。
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Protocol
注: 为了清楚起见,实验设置被描述,并用于生成本报告中包含的代表性结果,但条件可以根据需要修改。所有步骤都应使用 PPE 执行,并遵循机构及联邦安全建议,根据所用细菌的 BSL 状态。
1. 细菌特征
- 确定生长培养基琼脂板上细菌的形态。在近似 OD600 = 0.5 处重新悬浮细胞,并将 1 μL 体积板到选择的琼脂培养基上。将X-gal添加到琼脂板中,最终浓度为20mg/mL,以更好地区分特定细菌群落的个体成员。在24°C或30°C生长,直到菌落形成,然后拍摄殖民地形态的照片和笔记。
- 定义每个细菌菌株的光密度与每mL16的CFU(菌群形成单位)数之间的相关性。将细菌在 24 孔板中的 1 mL 水中重新悬浮到大约 OD600 = 5,执行双倍串行稀释,监控所有稀释的 OD600,并各板确定每个样品中具有多种光学密度的可行 CFU/mL。
- 确定每种细菌菌株的最大声波耐受性。为此,将等分细胞放入含有液体介质的24孔板中,将一些细胞保留为无音速控制样本。使用带有 24 尖喇叭附件的超声波器,在 40 安培下应用三轮 12 秒的声波,并带有 2 秒脉冲。
注:建议使用24井超声波器,以方便加工厂样品的下游多路复用,但如果没有,请使用装有微尖的超声波器,并独立执行每个样品的声波。始终佩戴额定值至少为 25 NRR 保护的耳罩。 - 对声波和非音速样品进行10倍连续稀释,并点在琼脂板上。确定声波后活细胞是否减少。如果是这样,使用新鲜的样品和重复的声波步骤,使用减少的总声波时间或振幅,直到处理对最终的CFU/mL17没有影响。
2. 在塑料网上制备阿拉伯树苗
- 使用标准打孔机创建塑料网的磁盘。
- 收集玻璃容器中的磁盘,铝箔的松散盖,并使用高压灭菌器设置为20分钟干周期13消毒。
- 使用火焰消毒钳子,在植物生长培养基琼脂板表面的单个层中分配大约 40 个灭菌网盘。使用0.5x Murashige和Skoog(MS)盐,含有500毫克/升的MES缓冲液[2-(N-变形)酸]和1.5%的巴托琼脂,作为植物生长介质,在苗木的限量真菌污染中加入50微克/mL的诺美尔。
- 准备阿塔利亚纳的斧头种子,如前所述17。
- 将大约 100-300 个种子放入机架中的单个离心管中,放入可重新密封的玻璃或重型塑料容器("jar")中的烟机罩中。
- 小心,将100 mL的漂白剂放入罐中,在漂白剂中加入3 mL浓缩HCl,并立即密封罐子,让烟雾对种子进行至少4小时的消毒。
- 小心地从罐子下面取出消毒种子管并密封。
- 将两个种子放在每个网格的中心。用胶带密封板,在黑暗中4°C孵育2~6天,使种子幼虫化。
- 为了发芽和生长幼苗,在短日设置下,将板琼脂侧放在植物生长室中8~10天:在21°C下9小时,在18°C下变暗15小时(图1,步骤2)。
3. 液体细菌生长培养基中植物的殖民化
- 在无菌24孔板的每口孔中加入1mL的细菌生长培养基,但仅培养基控制孔除外。使用Lennox Luria Broth(10克胰腺酮,5克酵母提取物,5克NaCl)作为细菌生长培养基。
- 将嵌入在网中的发芽幼苗从琼脂板转移到液体(图1,步骤3a)。
- 使用火焰消毒钳子轻轻剥去含有两个发芽幼苗的网眼。选择具有大小相等且未损坏的幼苗的网格。
- 如果从琼脂上去除不光滑,丢弃该网格和植物。将一个浮子转移到每个细菌生长液的井,根侧向下。
- 将细菌接种到含有漂浮幼苗的井中。
- 将一夜之间生长在琼脂板上的细菌重新悬浮到OD600,相当于细菌生长介质液体中的108 CFU/mL。在每个井中加入10μL的细菌悬浮液,每口井的最终浓度为106 CFU细菌。
- 如果制备混合细菌,将每个细菌重新悬浮到相当于 108 CFU/mL 的 OD600,以相等的比例混合,并为每个液体井添加 10 μL 的最终混合物。
- 密封板进行无菌生长。在不接触粘性一侧的情况下,小心地将透气膜压过板。通过在井上制作的每个环周围施加压力,确保每口井都单独密封。将板的塑料盖紧贴在板和透气膜上(图 1,步骤 3b)。
- 在植物生长室中孵育板18小时,其条件与幼苗最初发芽的相同,但设定为220rpm的轨道板摇床除外。
4. 维持细菌殖民化
- 要冲洗所有浮子(网状植物),在新的 24 孔板的井中加入 1 mL 的无菌水。去除透气膜。使用无菌钳子,将浮子转移到带水的井中(图1,步骤4a)。在室温 (RT) 下静息 10 分钟,无搅拌冲洗。
注:为了确定根系的细菌殖民化效率,而不是它们随时间保持殖民化的能力,在此步骤中,可以通过直接将植物带到步骤5.1来牺牲它们。 - 用1mL的植物生长介质填充新的24孔板的井。将一个网格转移到每个井。盖上透气密封,在植物生长室中以 220 rpm 的转速在轨道板摇床上孵育 72 小时(图 1,步骤 4b)。
- 在 72 h 潜伏期后,对浮子重复步骤 4.1 中执行的漂泊。
5. 收集细菌以进行可行的细胞计数
注:可在任何孵育时间点确定每个幼苗根的细菌数量。殖民化可在 0 小时到 18 小时之间进行监控,而维护可以从 18 小时起进行监控。用于成像的植物可以直接进行到第6节。
- 从网格中取出幼苗(图1,步骤5)。轻轻地将火焰消毒的钳子放在叶子下方(但在网眼的叶子侧),轻轻捏紧茎。将幼苗向上摆动并远离网格,使其在不折断根部的情况下脱落。如果根部断裂,轻轻刮掉网格底部以收集全长。
- 从植物根部清除细菌。将细菌转移到含有 1 mL ddH20 的 24 孔板的孔中。如步骤 1.3 所述,对样品进行声波测试。
注:使用显微镜,在声波样品的根表面上寻找任何残留的细菌。如果细菌仍然存在,增加总声波时间或强度,直到没有细菌保持结合,达到不影响第1节确定的活细胞计数的最高水平。 - 量化根上的细菌。
- 在细菌生长培养基中连续对声波样品进行10倍稀释,达到10-6倍稀释。将每个稀释剂的50μL添加到单个琼脂板中,然后用无菌玻璃珠(或细菌扩散剂)传播。在细菌的最佳温度下孵育板,直到单个菌落可计数。
- 一旦可区分,计算每个菌落形态的数量(如第1节确定),并计算每个幼苗的每个细菌物种的CFU。丢弃任何显示污染的样品,因为殖民化或维护期间的污染可能会影响细菌的存在。
6. 收集完整的植物根,用于显微镜
- 使用钳子,如第 5 节所述,从网格中取出幼苗。
- 将每个工厂转移到显微镜幻灯片上。
- 将根尖放在幻灯片上,然后从尖端拖动,使拍摄与幻灯片齐平,确保根部拉直,以便进行最佳成像。在样品中加入一滴水或无菌植物生长培养基,以水合盖唇和滑片之间的界面。
- 将玻璃盖玻片放在根冠正上方(图1中最上面的盒装区域)和芽叶下方,以避免盖玻片倾斜(允许根冠成像),然后轻轻按压17。
- 如果使用荧光细菌,图像使用适当的激发/发射过滤器来区分细菌彼此和植物根18。
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Representative Results
著名的PGPB P. simiae WCS417r已知在水培文化中殖民A.thaliana的根。 这种天然荧光细菌在殖民化后可以很容易地使用显微镜在幼苗的根上进行可视化(图2)。虽然可以成像这些A.thaliana幼苗的全长(4⁄6毫米长度)根,这样做的许多植物将需要一段令人望而生畏的时间。由于不同时点和细菌物种的大多数变异可以通过成像根14的冠、中和尖端(如图1中的红色框表示),这些区域被优先用于成像,而不是成像全根长度。在P.simiae-殖民A.thaliana根的明亮场图像中(图2),可以可视化根部和根毛的轮廓;然而,在18小时的殖民化,不可能清楚地区分殖民根和非殖民化根使用明亮的场图像。当P.simiae显示自荧光时,我们使用了一种菌株,用于表达一种黄色荧光蛋白(YFP)19,其激发/发射波长为490-510/520-550nm18。放大倍数为100倍就足以清楚地识别A.thaliana根上的P.simiae细胞的单个和少量聚集体。如图2所示,能够使用高分辨率共聚焦显微镜或价格较低的台式显微镜的实验室可以可视化细菌在根部的存在和分布。
虽然显微镜图像在空间分布方面信息丰富,但不适合细菌细胞的定量。因此,我们收集细菌从根的表面使用超声波,如前所述和验证9,20。三轮12s的超声波21,振幅为40,足以破坏根苗的外表面(补充图1),并在不影响细菌生存能力的情况下清除所有细菌。使用声波而不是敲珠方法9,以更好地促进细菌聚集物/生物膜的分散。在18小时的殖民化和另外72小时的维持后,对CFU/根进行量化表明,P.simiae在我们的水培浮动幼苗系统中,在A.thaliana的根上都进行了殖民化并维持(图3)。两个时间点的CFU/幼苗数量在不同日期执行的生物复制中表现出良好的可重复性(图3)。观察到的变异在根殖民化测定22中很常见,可能是由于时间、环境条件或植物根径的微小变化,甚至在同时发芽的幼苗中,选择大小相似。我们看到,与殖民化后18小时时间点(图3)观察到的72小时后CFU/幼苗数量相比,维持介质中的CFU/幼苗数量有所增加。这表明在维护阶段,植物根上的结肠细菌活动生长。
除了这种水培测定对单个细菌殖民化和维护的量化作用外,它还适用于监测植物根系上多种物种的关联。为了证明这一点,从实验室条件下生长在天然土壤中的A.thaliana分离出的3种细菌被挑选出20种。分离物是阿尔氏杆菌、奥列沃兰微细菌和23号凝血杆菌。之所以选择这个简化的群落,是因为这些物种能够在摇动培养物(未发表的数据)中共存于液体细菌生长介质中。此外,由于菌落形态和颜色的差异,这三个物种在含有X-gal的介质上可以明显区分(图4A)。X-gal不会影响这些细菌物种的相对生长(未公布的数据)。X-gal的形态和菌落外观差异使我们能够计算每个物种的CFU/幼苗,无需抗生素选择,即使在多物种共育中也是如此。
A. 尼古丁、奥列沃兰和C.海洋沉积都被殖民化,并维持在根部,无论是单独种植还是细菌共栽(图4B)。每个物种在不同生物和技术复制中表现出相似的趋势,即使在混合社区也是如此。这表明,测定协议可用于测量每个物种的相对或总CFU/根。有趣的是,单独种植时,没有个别物种在维持阶段表现出明显的丰度增加,但组合群落的整体CFU/根在共栽培中增加,表明这些细菌并不禁止殖民化的其他菌株。
对于所有实验,在液体介质中生长的植物,没有添加细菌作为负控制,总是包括在内。在显微镜期间,这些控制根上看不到细菌(图2),也没有通过CFU电镀(未公布的数据)检测到任何细菌。这表明,除非有目的地殖民,否则种子的灭菌和在测定过程中使用无菌技术就足以保持植物的无菌状态。
图1:对A.thaliana根的细菌殖民化和维持的测定。A. 在消毒塑料网上生长的沙利亚纳幼苗被转移到一种针对细菌优化的生长培养基[这里,0.1 x LB(卢里亚布罗思)Lennox]。细菌然后殖民根超过18小时,而植物漂浮在颤抖的液体。冲洗后,殖民浮子被转移到为植物优化的生长介质(0.5x MS + MES)72小时,以测试根部细菌的维持。然后冲洗浮子,并去除任何附着微生物的植物进行分析(CFU/幼苗定量或通过显微镜成像)。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:用荧光显微镜可视化P.simiae根的殖民化。P. simiae(假色绿色)殖民A.thaliana根,并在转移到植物生长介质后在根上保持。根冠(左)、中长(中)和尖端(右)放大40倍,如图1所示区域显示。前两行显示由 P. simiae殖民的根的明亮场和荧光图像(通过表显荧光显微镜成像)。相同的根也由共聚焦显微镜(中心两行)成像。两行无细菌的负控制没有殖民化。比例尺代表50μm。请点击这里查看此图的较大版本。
图3:对A.thaliana根的P.simiae的量化。经过18小时的殖民化或72小时的维持后,每A.thaliana幼苗恢复的P.simiae活细胞总数。显示了三个单独的生物复制,每个复制包含每个浮子两个幼苗的三个技术复制。显示的数字是技术复制的均值,而柱表示均值的标准误差。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:对A.thaliana根系的混合细菌群落的殖民化和维持的量化。(A)在含有X-gal的琼脂介质上,可按菌落形态和颜色对含尼古丁、烯ovorans和C.海洋沉积的菌落进行区分。(B) 10天幼苗的根部接种了三株中约3x105 CFU/mL的接种。图中所示是每个物种在18小时殖民化或72小时维持后,单独殖民或三人细菌群落中恢复的CFU/幼苗总数。显示了两个生物复制,每个复制包括每个浮子两个幼苗的两个技术复制。显示的数字是两个技术复制的均值,而柱表示均值的标准误差。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1:超声波破坏根表面。为了将细菌从根部表面清除,整个植物被声波化,细菌被释放到液体中,液体被连续稀释和镀成CFU/幼苗的定量。(A)完整的幼苗在超声化后(B)结构上被打乱。请点击此处下载此文件。
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Discussion
所有环境中的植物与数千到数百万种不同的细菌和真菌相互作用5,7。这些相互作用可能对植物健康产生消极和积极的影响,对作物产量和粮食生产有潜在影响。最近的工作还表明,在田间试验中,PGPB对作物的可变殖民化可能是不可预测的植物规模和作物产量的原因。了解这些相互作用背后的机制可能使我们能够直接操纵植物相关的微生物群落,以帮助健康的植物发展,即使在压力24。
由于细菌对根系的殖民化及其在根部圈中的维持对植物-微生物相互作用9至关重要,我们希望建立一个系统来重复可视化和量化这些细菌行为。这种水培,浮动的幼苗生长系统允许微观成像和定量细菌种群的根部。
所述植物-微生物相互作用测定集成了现有实验方案的有益元素。浮网法基于哈尼等人13年,该方法测量了静态、浮A.thaliana幼苗上P.simiae WCS417r的初始殖民化。在评价这一系统时,P.simiae对A.thaliana根的强烈殖民化得到了验证,尽管使用了与Haney等人不同的生长介质,并在殖民化期间包括轨道震动。在殖民化和维护期间纳入轨道震动有利于在静态培养中可能不会发生的细菌相互作用,并减少可能同时抑制细菌生长和植物根系健康的缺氧条件13。我们还整合了以微生物学为中心的协议的各个方面,旨在支持各种细菌物种8、15、25的植物根殖民化。这包括从针对细菌殖民化优化的介质中的关键转移步骤,转变为针对植物生长优化的介质。这种转移到新的介质也将允许根部细菌维持机制开始得到解决,这种方法可能提供对在田间试验6中不稳定的PGPB维护的见解。
该测定针对多个样品的快速处理进行了优化,允许在一个多井生物复制中测定环境变量和混合细菌群落。虽然超声波处理先前已被证明足以破坏和收集根瘤菌,但24孔板和多孔角附件加快了样品处理。这种细胞活力计算方法可以补充或扩大到包括qPCR或MiSeq 16S rRNA基因群落分析,以确定殖民细菌的更多样化群落的相对丰度20.此外,在成像过程中,重点关注每个植物根的三个区域以加快细菌存在和根部定位的可视化的效用被突出显示。这些不同根系的殖民化已被证明在细菌物种14之间是不同的。成像可以进行自然自荧光细菌或基因可操作的细菌,以表达荧光蛋白。
此处描述的方法允许快速和可重复地评估 PGPB 细菌的根殖民化,但从这些实验中得出的结论存在局限性。例如,细菌对根的化学处理能力对于许多细菌物种对植物根系的殖民化非常重要,但在这个摇动的接种系统中,这个过程可能不需要。也就是说,对于特别感兴趣的化学菌株的研究,殖民化步骤可以在静态液体培养物或软琼脂培养物的表面进行,细菌可以镀在远离植物的地方,要求它们积极向根。此外,在殖民化期间,使用相对丰富的生长介质促进细菌生长和植物附着;然而,这些相对较高的营养浓度可能禁止在殖民化期间对植物源碳的细菌利用或竞争。同样,根据所研究细菌的生长要求,殖民化介质可以变化,以最适合特定研究人员的特定研究问题。
该系统的设计易于适应不同的细菌和植物生长条件,并可添加不同的环境压力因素和时间点。然而,这里描述的方法最适合测量细菌与A.thaliana幼苗的根部相互作用。该系列已针对该工厂进行了优化,在浮动多孔板系统中,较大或更敏感的植物可能难以处理。最后,虽然这里使用的感兴趣的细菌在液体培养中殖民植物根部,但对于其他细菌,可能有必要通过浸渍接种或电镀在固体琼脂培养基上接种植物根,而不是19。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了能源生物和环境研究部(DOE-BER 0000217519至E.A.S.)、国家科学基金会(INSPIRE IOS-1343020至E.A.S)提供的研究基金的支持。SLH还得到了国家科学基金会研究生研究奖学金计划的支持。我们感谢Jeffery Dangl博士提供细菌菌株和宝贵的洞察力。我们感谢安德鲁·克莱因博士和马修·鲍尔斯的实验建议。最后,SLH感谢社交媒体上的联系提醒我们,传播科学是一种特权和责任,特别是通过创造性和无障碍手段。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
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