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Immunology and Infection

एक फ्लोटिंग हाइड्रोपोनिक सिस्टम में Arabidopsis thaliana जड़ें पर बैक्टीरियल उपनिवेशन और रखरखाव की निगरानी

Published: May 28, 2019 doi: 10.3791/59517
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

यहाँ हम प्रजातियों की उपस्थिति की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक hydroponic संयंत्र विकास परख का वर्णन और संयंत्र जड़ों के प्रारंभिक उपनिवेशन के दौरान बैक्टीरिया के स्थानिक वितरण कल्पना और विभिन्न विकास के वातावरण में उनके हस्तांतरण के बाद.

Abstract

जीवाणु रोगाणुओं, बड़े जीवों और अजैविक वातावरण के बीच बातचीत करके जटिल राइज़ोस्फीयर माइक्रोबायोम बनाते हैं। प्रयोगशाला शर्तों के तहत, पौधों के विकास को बढ़ावा देने वाले बैक्टीरिया (पीजीपीबी) द्वारा राइज़ोस्फीयर उपनिवेशन बिना उपनिवेशित पौधों के सापेक्ष स्वास्थ्य या मेजबान पौधों के विकास को बढ़ा सकता है। हालांकि, क्षेत्र सेटिंग्स में, PGPB के साथ जीवाणु उपचार अक्सर फसलों के लिए पर्याप्त लाभ प्रदान नहीं करते हैं। एक स्पष्टीकरण यह है कि यह पौधे की उम्र से अधिक अंतर्जात मिट्टी रोगाणुओं के साथ बातचीत के दौरान पीजीपीबी के नुकसान के कारण हो सकता है। इस संभावना की पुष्टि करने के लिए मुश्किल हो गया है, के बाद से ज्यादातर अध्ययन ों के बजाय rhizosphere समुदायों के भीतर PGPB के रखरखाव के प्रारंभिक उपनिवेशपर ध्यान केंद्रित. यह यहाँ hypothesized है कि विधानसभा, सह-अस्तित्व, और जीवाणु समुदायों के रखरखाव rhizosphere microenvironment के नियतात्मक सुविधाओं के आकार के हैं, और है कि इन बातचीत देशी सेटिंग्स में PGPB अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं. इन व्यवहारों का अध्ययन करने के लिए, एक हाइड्रोपोनिक संयंत्र-वृद्धि परख को पौधों की जड़ों के प्रारंभिक उपनिवेशन के दौरान बैक्टीरिया के स्थानिक वितरण की मात्रा निर्धारित करने और कल्पना करने के लिए Arabidopsis thaliana का उपयोग करके अनुकूलित किया जाता है और विभिन्न विकास के लिए स्थानांतरण के बाद वातावरण. इस प्रणाली की पुन: उत्पादनीयता और उपयोगिता तो अच्छी तरह से अध्ययन PGPB Peudomonas simiaeके साथ मान्य कर रहे हैं. जांच करने के लिए कैसे कई जीवाणु प्रजातियों की उपस्थिति संयंत्र की जड़ पर उपनिवेशन और रखरखाव गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं, तीन जीवाणु उपभेदों से एक मॉडल समुदाय (एक Arthrobacter, Curtobacterium, और माइक्रोबैक्टीरियम प्रजातियों) मूल रूप से ए thaliana rhizosphere से अलग का निर्माण किया है. यह दिखाया गया है कि इन विविध जीवाणु प्रजातियों की उपस्थिति इस hydroponic संयंत्र-maintanence परख, जो अनुक्रमण आधारित जीवाणु समुदाय के अध्ययन के लिए एक विकल्प प्रदान करता है का उपयोग कर मापा जा सकता है. इस प्रणाली का उपयोग कर भविष्य के अध्ययन समय के साथ और बदलते पर्यावरण की स्थिति में multispecies संयंत्र microbiomes में जीवाणु व्यवहार की समझ में सुधार हो सकता है.

Introduction

जीवाणु और फंगल रोगों के कारण फसल नष्ट होने से खाद्य उत्पादन कम होता है और यह वैश्विक स्थिरता को बुरी तरह से बाधित कर सकताहै. खोज के आधार पर कि दमनकारी मिट्टी में रोगाणुओं संयंत्र स्वास्थ्य2बढ़ाने के लिए जिम्मेदार हैं , वैज्ञानिकों ने पूछा है कि क्या संयंत्र microbiome की उपस्थिति और विशेष की बहुतायत को संशोधित करके संयंत्र के विकास का समर्थन करने के लिए leveraged किया जा सकता है जीवाणु प्रजातियों3| पौधों के विकास या विकास में सहायता करने के लिए पाए जाने वाले बैक्टीरिया को सामूहिक रूप से पौधों के विकास को बढ़ावा देने वाले बैक्टीरिया (पीजीपीबी) कहा जाता है। हाल ही में, अध्ययन बस संभावित PGPB की पहचान करने से स्थानांतरित कर दिया है समझने के लिए कैसे मिट्टी में interkingdom बातचीत, जड़ों के आसपास, या rhizosphere में (क्षेत्र सीधे आसपास और जड़ की सतह सहित) PGPB प्रभावित हो सकता है गतिविधि4|

पीजीपीबी द्वारा राइजोस्फीज उपनिवेशन से बिना उपनिवेशित पौधों के सापेक्ष विभिन्न तनावों के जवाब में मेजबान पौधों के स्वास्थ्य या विकास में वृद्धि हो सकतीहै 5. तथापि, निकट नियंत्रित ग्रीनहाउस और प्रयोगशाला सेटिंग्स6में देखे गए परिणामों की तुलना में देशी मिट्टी की स्थितियों में परिणाम प्रायः अधिक परिवर्तनशील होते हैं। इस अंतर के लिए एक परिकल्पना यह है कि पीजीपीबी के विकास या व्यवहार को खेतों में देशी मिट्टी के बैक्टीरिया या कवक द्वारा बाधित किया जा सकता है7,8. rhizosphere बैक्टीरिया द्वारा लाभकारी प्रभाव आम तौर पर बैक्टीरिया की क्षमता पर निर्भर करने के लिए 1) का पता लगाने और जड़ की ओर ले जाने के लिए, 2) biofilm गठन के माध्यम से जड़ उपनिवेश, और 3) मेजबान संयंत्र या रोगजनकों के साथ बातचीत छोटे अणु के उत्पादन के माध्यम से चयापचय7,9. इनमें से कोई भी उपनिवेशन व्यवहार पड़ोसी सूक्ष्मजीवों की उपस्थिति और गतिविधि से प्रभावित हो सकताहै.

हमने राइज़ोस्फीयर के इन विशिष्ट जीवाणु उपनिवेशन चरणों की मात्रा निर्धारित करने और कल्पना करने के लिए एक प्रणाली तैयार की है (चित्र 1)। इस दृष्टिकोण से अध्ययन की सुविधा होगी कि क्यों लंबे समय तक पीजीपीबी रखरखाव कभी-कभी पौधों को नए वातावरण में स्थानांतरित करने के बाद नहीं देखा जाता है, जैसे कि पूर्व-संपीड़ित पौध रोपण के दौरान। प्रयोगशाला अध्ययनों में इसके व्यापक उपयोग के साथ -साथ इसके माइक्रोबियल इंटरैक्शन11के बारे में उपलब्ध पर्याप्त डेटा के कारण अरबिडोप्सिस थालियाना को संयंत्र मॉडल के रूप में चुना गया . प्रणाली में तीन चरण हैं: 1) ए थालियाना वृद्धि, 2) जीवाणु उपनिवेशन, और 3) जीवाणु रखरखाव (चित्र 1देखें)। क्योंकि ए thaliana एक स्थलीय संयंत्र है, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण था कि यह hydroponic प्रणाली12में अनुचित पानी के तनाव पीड़ित नहीं था. हैनी एट अल 13 द्वाराइस्तेमाल किया तरीकों से प्रेरित होकर, अंकुर तरल विकास माध्यम से गोली मार अलग करने के लिए प्लास्टिक जाल पर बड़े हो रहे हैं। इस प्रणाली के स्वास्थ्य और संयंत्र मेजबान के विकास से समझौता करने के लिए प्रकट नहीं होता है, और यह तरल11में ए thaliana विकास में सुधार. के रूप में संयंत्र गोली मार सतह के ऊपर तैरता है, जड़ों को पूरी तरह से तरल जीवाणु विकास माध्यम में inoculated बैक्टीरिया द्वारा उपनिवेशन के संपर्क में हैं. यह ब्याज के बैक्टीरिया पोषक तत्वों है कि विकास के लिए सबसे अधिक अनुकूल हैं में उपनिवेशन के लिए जांच की अनुमति देता है, जबकि फिर शर्तों स्थानांतरण संयंत्र एक पोषक तत्व अपने विकास का समर्थन करने के लिए डिज़ाइन में बढ़ रही जारी रखने के लिए अनुमति देने के लिए. दोनों अवस्थाओं में जड़13के एनॉक्सिया को रोकने के लिए लगातार झटकों का समावेश है . बैक्टीरिया कल्पना या या तो उपनिवेशन माध्यम या रखरखाव माध्यम से हस्तांतरण के बाद संयंत्र की जड़ों से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस hydroponic प्रणाली बहुत लचीला है, प्रयोगात्मक स्थितियों की अनुमति और लागू तनाव आसानी से शोधकर्ताओं के हितों के आधार पर बदला जा करने के लिए.

यह वर्णित विधि संयंत्र microbe बातचीत के बारे में साहित्य के बड़े शरीर के संदर्भ में महत्वपूर्ण है क्योंकि यह जड़ की सतह पर इन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत प्रणाली प्रदान करता है, जबकि भी की वृद्धि वरीयताओं के लिए अनुकूलन किया जा रहा विभिन्न बैक्टीरिया. संयंत्र जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं अक्सर ठोस agar पर संयंत्र microbe उपनिवेशन प्रयोगों प्रदर्शन, केवल planar आंदोलन के लिए अनुमति देता है (यदि है कि) बैक्टीरिया की, जबकि भी बाद में हस्तांतरण के दौरान पौधों की संभावित विनाशकारी हेरफेर की आवश्यकता होती है. इसके विपरीत, सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं ने अपने प्रयोगों के भीतर बैक्टीरिया केस्वास्थ्य को अक्सर प्राथमिकता दी है , पौधों की नुकसान14,15. संयंत्र और सूक्ष्म जीव विज्ञान केंद्रित प्रयोगशालाओं की इन विभिन्न प्राथमिकताओं ने ऐतिहासिक रूप से इन समूहोंके बीच परिणामों की तुलना करना कठिन बना दिया है, क्योंकि प्रत्येक आम तौर पर अपने जीव को ब्याज के 15 का अनुकूलन करने के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों का अनुकूलन करता है। यहाँ वर्णित फ्लोटिंग-मेश-प्लांट-ग्रोथ सिस्टम पूर्ण संयंत्र जलमग्न को रोकता है, जो पिछले माइक्रोबायोलॉजी उन्मुख अध्ययनों के लिए एक उल्लेखनीय लाभ है, जबकि उपनिवेशन की सुविधा के लिए बैक्टीरिया के विकास और अस्तित्व को अस्थायी रूप से अनुकूलित करता है। इस प्रकार, परख हम यहाँ मौजूद दोनों संयंत्र जीवविज्ञानियों से चिंताओं को संबोधित कर सकते हैं (के बारे में अधिक निर्जलीकरण और संयंत्र के स्पर्श हेरफेर) जबकि microbiologists के मानदंडों को संतुष्ट (विभिन्न जीवाणु विकास की स्थिति और कई के लिए अनुमति देता है प्रजाति' बातचीत)7| इस प्रोटोकॉल के लिए विभिन्न बैक्टीरिया, पौधों, और पर्यावरण की स्थिति के साथ उपयोग के लिए अनुकूलनीय बनाया गया है.

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Protocol

नोट: प्रयोगात्मक सेटअप स्पष्टता के लिए वर्णित है और इस रिपोर्ट में शामिल प्रतिनिधि परिणाम जनरेट करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन शर्तों वांछित के रूप में संशोधित किया जा सकता है। सभी कदम PPE का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाना चाहिए और सुरक्षा के लिए संस्थागत और संघीय reccomendations का पालन, इस्तेमाल किया बैक्टीरिया की बीएसएल स्थिति के अनुसार.

1. बैक्टीरिया की विशेषता

  1. विकास माध्यम आगर प्लेट पर बैक्टीरिया की आकृति विज्ञान का निर्धारण करें। कोशिकाओं को लगभग ओड600 र् 0.5 पर पुन: स्पंद करें तथा अपनी पसंद के आगर माध्यम पर 1 $L आयतन को प्लेट कीजिए। विशिष्ट जीवाणु समुदाय के अलग-अलग सदस्यों में बेहतर अंतर करने के लिए 20 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम सांद्रता में एक्स-गैल को आगर प्लेटों में जोड़ें। कालोनियों के रूप तक 24 डिग्री सेल्सियस या 30 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें, फिर कॉलोनी आकारिकी पर और नोट्स की तस्वीरें लें।
  2. प्रत्येक जीवाणु विकृति के ऑप्टिकल घनत्व और प्रति एमएल16के लिए CFU (कोलोनी बनाने इकाइयों) की संख्या के बीच सहसंबंध को परिभाषित करें। एक 24-वेल प्लेट में 1 एमएल पानी में बैक्टीरिया को एक अनुमानित OD600 - 5 के लिए, दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन, सभी कमजोर पड़ने के OD600 की निगरानी, और प्लेट प्रत्येक एकाधिक ऑप्टिकल घनत्व पर प्रत्येक नमूने में व्यवहार्य CFU/एमएल निर्धारित करने के लिए.
  3. प्रत्येक जीवाणु तनाव के लिए अधिकतम sonication सहिष्णुता निर्धारित करते हैं। ऐसा करने के लिए, तरल माध्यम युक्त एक 24-वेल प्लेट में एलिकोट कोशिकाओं, एक unsonicated नियंत्रण नमूने के रूप में कुछ कोशिकाओं को आरक्षित। एक 24 टिप सींग लगाव के साथ एक ultrasonicator का उपयोग करना, 2 s दालों के साथ 40 amp पर sonication के 12 s के तीन दौर लागू होते हैं।
    नोट: एक 24 अच्छी तरह से ultrasonicator का उपयोग प्रसंस्करण संयंत्र के नमूने के बहाव multiplexing की सुविधा के लिए सलाह दी जाती है, लेकिन एक उपलब्ध नहीं है, तो एक ultrasonicator एक microtip के साथ फिट का उपयोग करें और स्वतंत्र रूप से प्रत्येक नमूना sonication प्रदर्शन। हमेशा कम से कम 25 एनआरआर संरक्षण के लिए रेटेड earmuffs पहनते हैं।
  4. sonicated और unsonicated नमूने के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन और आगर प्लेटों पर हाजिर. निर्धारित करें कि क्या sonication के बाद व्यवहार्य कोशिकाओं में कमी है। यदि हां, तो उपचार अंतिम CFU/mL17पर कोई प्रभाव नहीं है जब तक एक कम कुल sonication समय या आयाम का उपयोग कर एक ताजा नमूना और दोहराने sonication कदम का उपयोग करें।

2. एक प्लास्टिक के जाल पर Arabidopsis thaliana अंकुर की तैयारी

  1. एक मानक छेद पंचर का उपयोग कर प्लास्टिक जाल की डिस्क बनाएँ.
    1. एल्यूमीनियम पन्नी के एक ढीले कवर के साथ एक गिलास कंटेनर में डिस्क ले लीजिए, और एक 20 मिनट सूखी चक्र13के लिए सेट एक autoclave का उपयोग कर बाँझ .
    2. लौ-स्टरलाइज़्ड टम्एज का उपयोग करके, एक संयंत्र-वृद्धि-मध्यम आगर प्लेट की सतह पर एक परत में लगभग 40 बाँझ जाल डिस्क वितरित करें। एमईएस बफर के 500 मिलीग्राम/एल युक्त 0.5x मुराशीज और स्कोग (एमएस) लवण ों का उपयोग करें, जिसमें एमईएस बफर [2-(एन-मॉर्फोलिनो) एथेनेसल्फोनिक एसिड और 1.5% बैक्टो ऐगार, पौधे के विकास माध्यम के रूप में, 50 ग्राम/एमएल बीनोमाइल के साथ पौध के कवक संदूषण में जोड़ा जाता है।
  2. ए thaliana के कुल्हाड़ी बीज तैयार के रूप में पहले17वर्णित .
    1. एक रैक में व्यक्तिगत अपकेंद्रित्र ट्यूबों में लगभग 100-300 बीज रखें और एक धुएं के हुड में एक रीसीलेबल ग्लास या भारी प्लास्टिक कंटेनर ("जार") में रखें।
    2. सावधानी का उपयोग करना, जार में ब्लीच के 100 एमएल के एक बीकर जगह, ब्लीच करने के लिए केंद्रित एचसीएल के 3 एमएल जोड़ें, और तुरंत जार सील और धुएं कम से कम 4 एच के लिए बीज बाँझ करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. ध्यान से जार और सील के नीचे से बाँझ बीज की ट्यूबों को हटा दें।
  3. प्रत्येक जाल के केंद्र में दो बीज रखें. शल्य चिकित्सा टेप के साथ सील प्लेटें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-6 दिनों के लिए इनक्यूबेट बीज vernalize करने के लिए।
  4. अंकुरित होने और बढ़ने के लिए, प्लेट एगार को 8-10 दिनों के लिए लघु दिन सेटिंग्स के अंतर्गत पौधे के विकास कक्ष में रखें: 9 ज प्रकाश का 21 डिग्री सेल्सियस और 18 डिग्री सेल्सियस पर 15 डिग्री सेल्सियस (चित्र1, चरण 2)।

3. तरल जीवाणु विकास माध्यम में पौधों का उपनिवेशन

  1. एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जीवाणु विकास के माध्यम के 1 एमएल जोड़ें, मीडिया केवल नियंत्रण कुओं को छोड़कर. जीवाणु विकास माध्यम के रूप में लेनॉक्स लुरिया ब्रोथ (10 ग्राम ट्रिप्टोन, 5 ग्राम खमीर निकालने, 5 ग्राम NaCl) का उपयोग करें।
  2. आगर प्लेटों से जाल में एम्बेड किए अंकुरित अंकुरों को द्रव में स्थानांतरित करें (चित्र 1, चरण 3क)।
    1. लौ-स्टरलाइज़्ड संदंश का उपयोग करके आगर प्लेट के ऊपर और बाहर दो अंकुरयुक्त जाल को धीरे से छील लें। समान रूप से आकार और क्षतिग्रस्त अंकुर के साथ जाल चुनें।
    2. यदि agar से हटाने चिकनी नहीं है, कि जाल और संयंत्र त्याग दें. जीवाणु विकास तरल, जड़ की ओर नीचे की प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक नाव स्थानांतरण।
  3. अस्थायी अंकुरयुक्त कुओं में बैक्टीरिया टीका।
    1. जीवाणु वृद्धि मध्यम तरल में 108 CFU/mL के बराबर एक OD600 करने के लिए agar प्लेटों पर रात भर में उगाए गए बैक्टीरिया को पुन: निलंबित करें। अच्छी तरह से 106 CFU बैक्टीरिया की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से जीवाणु निलंबन के 10 डिग्री एल जोड़ें.
    2. यदि बैक्टीरिया का मिश्रण तैयार कर रहा है, तो प्रत्येक को OD600 के बराबर 108 CFU/mL के बराबर, समान अनुपात में मिलाएं, और तरल के प्रति अंतिम मिश्रण के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  4. बाँझ विकास के लिए थाली सील. चिपचिपा पक्ष को छूने के बिना, ध्यान से प्लेट भर में गैस पारगम्य फिल्म दबाएँ. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से कुओं द्वारा किए गए छल्ले में से प्रत्येक के आसपास दबाव लागू करने से व्यक्तिगत रूप से सील कर दिया गया है. प्लेट के प्लास्टिक के ढक्कन को प्लेट और गैस पारगम्य फिल्म पर आराम से बदलें (चित्र 1, चरण 3b)।
  5. पौधों के रूप में एक ही शर्तों के तहत एक संयंत्र विकास कक्ष में 18 एच के लिए प्लेटों incubate मूल रूप से अंकुरित थे, एक कक्षीय प्लेट शेकर पर छोड़कर 220 आरपीएम के लिए सेट.

4. जीवाणु उपनिवेशन का रखरखाव

  1. सभी फ्लोट्स (मेश पर पौधे) को धोने के लिए, एक नई 24-वेल प्लेट के कुओं में 1 एमएल बाँझ पानी जोड़ें। गैस पारगम्य फिल्म निकालें. बाँझ संदंश का उपयोग करके, स्थानांतरण जल के साथ कुओं में तैरता है (चित्र 1, चरण 4क)। आंदोलन के बिना कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए आराम से कुल्ला।
    नोट: समय के साथ उपनिवेशन बनाए रखने की क्षमता के बजाय जड़ों के जीवाणु उपनिवेशन दक्षता निर्धारित करने के लिए, पौधों उन्हें सीधे कदम 5.1 करने के लिए ले जाकर इस कदम पर बलिदान किया जा सकता है.
  2. पौधे के विकास माध्यम के 1 एमएल के साथ एक नई 24-वेल प्लेट के कुओं को भरें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक जाल स्थानांतरण. पादप वृद्धि कक्ष में 220 आरपीएम पर कक्षीय प्लेट शेकर पर 72 एच के लिए गैस-पारगम्य मुहर तथा इनक्यूबेट के साथ कवर करें (चित्र1, चरण 4ठ)।
  3. 72 ज ऊष्मायन अवधि के बाद फ्लोट के साथ चरण 4.1 में किए गए के रूप में rinsing दोहराएँ।

5. व्यवहार्य सेल गिनती के लिए बैक्टीरिया का संग्रह

नोट: अंकुर जड़ प्रति बैक्टीरिया की संख्या किसी भी ऊष्मायन timepoint पर निर्धारित किया जा सकता है। उपनिवेशन 0 ज और 18 एच के बीच नजर रखी जा सकती है, जबकि रखरखाव 18 एच के बाद से नजर रखी जा सकती है। इमेजिंग के लिए किस्मत में पौधों अनुभाग 6 के लिए सीधे आगे बढ़ सकते हैं।

  1. जाल से अंकुर निकालें (चित्र 1, चरण 5).। पत्तियों के नीचे लौ-स्टरलाइज़्ड संदंश को धीरे-धीरे रखें (लेकिन जाल के पत्ते की ओर), और हल्के से स्टेम चुटकी। यह तोड़ने के बिना जड़ उखाड़ना करने के लिए जाल से ऊपर और दूर अंकुर Wiggles. यदि रूट टूट जाता है, धीरे पूरी लंबाई इकट्ठा करने के लिए जाल नीचे परिमार्जन.
  2. पौधे की जड़ों से बैक्टीरिया निकालें। बैक्टीरिया को 24-वेल प्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल डीडीएच20 है। चरण 1.3 में वर्णित के रूप में नमूने Sonicate.
    नोट: एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, एक sonicated नमूने पर जड़ की सतह पर किसी भी शेष बैक्टीरिया के लिए देखो. बैक्टीरिया रहते हैं, तो कुल sonication समय या तीव्रता में वृद्धि जब तक कोई बैक्टीरिया बाध्य रहते हैं, sonication के उच्चतम स्तर तक है कि व्यवहार्य सेल मायने रखता है के रूप में अनुभाग 1 में निर्धारित को प्रभावित नहीं करता है.
  3. जड़ों पर बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करें।
    1. जीविका विकास माध्यम में 10-6 कमजोर पड़ने तक sonicated नमूनों के धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं। व्यक्तिगत agar प्लेटों के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के 50 डिग्री एल जोड़ें और बाँझ कांच मोती (या जीवाणु स्प्रेडर) के साथ फैल गया। बैक्टीरिया के लिए इष्टतम तापमान पर इनक्यूबेट प्लेटें जब तक अलग-अलग कालोनियों गणनीय हैं।
    2. एक बार भेद करने योग्य, प्रत्येक कॉलोनी आकारिकी की संख्या गिनती (के रूप में अनुभाग 1 में निर्धारित), और अंकुर प्रति प्रत्येक जीवाणु प्रजातियों के CFU की गणना. संदूषण दिखा किसी भी नमूने छोड़ें, के रूप में उपनिवेशन या रखरखाव के दौरान संदूषण जीवाणु उपस्थिति को प्रभावित कर सकता है.

6. माइक्रोस्कोपी के लिए बरकरार पौधे की जड़ों का संग्रह

  1. संदंश का उपयोग करना, अनुभाग 5 में के रूप में जाल से अंकुर हटा दें।
  2. प्रत्येक संयंत्र माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए स्थानांतरण।
    1. स्लाइड पर रूट की नोक रखें और स्लाइड के साथ फ्लश नीचे शूट सेट करने के लिए टिप से दूर खींचें, सबसे अच्छा इमेजिंग के लिए एक सीधा रूट सुनिश्चित करना। coverslips और स्लाइड के बीच इंटरफेस हाइड्रेट करने के लिए नमूने के लिए पानी या बाँझ संयंत्र विकास माध्यम की एक बूंद जोड़ें।
    2. रूट क्राउन के ठीक ऊपर एक ग्लास कवरस्लिप रखें (चित्र 1में सबसे ऊपरी बॉक्स्ड क्षेत्र ) और शूट के पत्तों के नीचे कवरस्लिप के तिरछा होने से बचने के लिए (रूट क्राउन इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए), और धीरे से17दबाएँ।
  3. यदि फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया का उपयोग कर, छवि उचित उत्तेजना / उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करने के लिए एक दूसरे से बैक्टीरिया और संयंत्र की जड़18अंतर .

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Representative Results

अच्छी तरह से विशेषता PGPB पी simiae WCS417r हाइड्रोपोनिक संस्कृति में ए thaliana की जड़ों उपनिवेश के लिए जाना जाता है। यह स्वाभाविक रूप से फ्लोरोसेंट जीवाणु आसानी से उपनिवेशन के बाद अंकुर की जड़ों पर माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है (चित्र 2) . हालांकि यह इन ए thaliana अंकुर की पूरी लंबाई छवि संभव है ' (4-6 मिमी लंबाई) जड़ों, कई पौधों के लिए ऐसा करने के समय की एक निषिद्ध राशि ले जाएगा. क्योंकि timepoints और बैक्टीरिया की प्रजातियों में सबसे अधिक भिन्नता ताज इमेजिंग द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है, मध्य, और जड़ की नोक14 (चित्र 1में लाल बक्से द्वारा इंगित), इन क्षेत्रों इमेजिंग के बजाय पूर्ण जड़ इमेजिंग के लिए प्राथमिकता दी गई लंबाई. P. simiae-colanized A. thaliana जड़ों के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों में (चित्र 2), जड़ों और जड़ बालों की रूपरेखा कल्पना करने के लिए संभव है; हालांकि, उपनिवेशन के 18 एच पर, यह स्पष्ट रूप से ब्राइट-फील्ड छवियों का उपयोग कर गैर उपनिवेशित जड़ों बनाम उपनिवेशमें अंतर करने के लिए संभव नहीं है। जबकि पी simiae autofluorscence प्रदर्शित करता है, हम भी एक तनाव का इस्तेमाल किया एक पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर(YFP)19 उत्तेजना के साथ / 100x का आवर्धन ए thaliana जड़ों पर पी simiae कोशिकाओं के व्यक्तिगत और छोटे समुच्चय स्पष्ट रूप से पहचान करने के लिए पर्याप्त था। जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है, या तो उच्च-रिज़ॉल्यूशन confocal माइक्रोस्कोप या कम महंगी बेंचटॉप माइक्रोस्कोप तक पहुँच के साथ प्रयोगशालाओं दोनों की उपस्थिति और जड़ के साथ बैक्टीरिया के वितरण कल्पना कर सकते हैं.

जबकि स्थानिक वितरण के संदर्भ में जानकारीपूर्ण, माइक्रोस्कोपी छवियों जीवाणु कोशिकाओं के परिमाणीकरण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं. इस प्रकार हमने अल्ट्रासोनिकेशन का उपयोग करके जड़ों की सतह से बैक्टीरिया एकत्र किए , जैसा कि पहले वर्णित और मान्य9,20. 40 के आयाम पर ultrasonication21 के 12 s के तीन दौर जड़ अंकुर की बाहरी सतह को बाधित करने के लिए पर्याप्त थे (पूरक चित्र 1) और सभी बैक्टीरिया को दूर करते हुए जीवाणु व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करते. जीवाणु समुच्चय/बायोफिल्म्स के प्रसार को बेहतर ढंग से बढ़ावा देने के लिए मनका-बीटिंग विधियों9 के बजाय ध्वनिकरण का उपयोग किया गया था। उपनिवेशन के 18 एच और रखरखाव के एक अतिरिक्त 72 एच के बाद CFU/रूट की मात्रा से पता चला है कि पी simiae दोनों colonizes और हमारे hydroponic में ए thaliana की जड़ों पर बनाए रखा है, चल अंकुर प्रणाली (चित्र 3). किसी भी समय पर CFU/seedling की संख्या ने विभिन्न दिनों पर निष्पादित जैविक प्रतिकृतियां में अच्छी पुन: उत्पादनीयता दिखाई (चित्र 3)। देखा भिन्नता जड़ उपनिवेशन परख के बीच आम है22 और समय की मामूली विविधताओं के कारण होने की संभावना है, पर्यावरण की स्थिति, या संयंत्र जड़ आकार, यहां तक कि अंकुर के बीच एक ही समय में अंकुरित और आकार में समान होने के लिए चयनित. हम रखरखाव माध्यम में 72 एच के बाद CFU/बीज की संख्या में वृद्धि का निरीक्षण करते हैं, जबकि उत्तर उपनिवेशन 18 ज समयबिंदु पर देखी गई संख्याओं की तुलना में(चित्र3)। यह संयंत्र की जड़ पर उपनिवेशित बैक्टीरिया के सक्रिय विकास को इंगित करता है रखरखाव चरण के दौरान हुई.

व्यक्तिगत जीवाणु उपनिवेशन और रखरखाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस hydroponic परख की उपयोगिता के अलावा, यह भी संयंत्र जड़ों पर कई प्रजातियों के सहयोग की निगरानी के लिए लागू है. इसे प्रदर्शित करने के लिए, प्रयोगशाला परिस्थितियों में प्राकृतिक मिट्टी में उगाए गए ए थालियाना से अलग बैक्टीरिया की तीन प्रजातियों को20चुना गया। विभेद ों में आर्थ्रोबैक्टर निकोटिनोवोरन, माइक्रोबैक्टीरियम ओलिवोरेनऔर और कर्टोबैक्टीरियम महासागरीय अवसाद23के उपभेद थे। इस सरलीकृत समुदाय को इन प्रजातियों की हिला संस्कृति (अप्रकाशित डेटा) में तरल जीवाणु विकास मीडिया में एक साथ रहने की क्षमता के कारण चुना गया था। इसके अतिरिक्त, इन तीन प्रजातियों को कॉलोनी आकृति विज्ञान और रंग में अंतर के कारण एक्स-गल वाले मीडिया पर स्पष्ट रूप से विभेदित किया जा सकता है (चित्र 4क)। X-gal इन जीवाणु प्रजातियों (अप्रकाशित डेटा) में से किसी के सापेक्ष वृद्धि को प्रभावित नहीं करता है। एक्स-गल पर आकृति विज्ञान और कॉलोनी उपस्थिति में ये अंतर हमें एंटीबायोटिक चयन के बिना प्रत्येक प्रजाति के CFU /

A. निकोटिनोवोरन्स, एम ओलिवोरेन्स, और सी. महासागरीय अवसाद सभी उपनिवेशित और जड़ पर बनाए रखे गए थे, चाहे वे अकेले हों या जीवाणु सहसंस्कृति में (चित्र 4बी)। प्रत्येक प्रजाति के रुझान है कि विभिन्न जैविक और तकनीकी प्रतिकृति भर में समान थे दिखाया, यहां तक कि मिश्रित समुदायों के भीतर. यह दर्शाता है कि परख प्रोटोकॉल दोनों रिश्तेदार या कुल CFU / दिलचस्प है, जब अकेले हो, कोई व्यक्तिगत प्रजातियों के रखरखाव के चरण के दौरान बहुतायत में एक प्रशंसनीय वृद्धि दिखाई है, लेकिन संयुक्त समुदाय के समग्र CFU / अन्य उपभेदों का उपनिवेशन.

सभी प्रयोगों के लिए, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बैक्टीरिया के अलावा बिना तरल मीडिया में बड़े पौधों हमेशा शामिल थे. माइक्रोस्कोपी के दौरान इन नियंत्रण जड़ों पर कोई बैक्टीरिया दिखाई नहीं दे रहा था (चित्र 2), और न ही CFU (अप्रकाशित डेटा) के लिए चढ़ाना के माध्यम से किसी भी बैक्टीरिया का पता लगाया गया था। यह इंगित करता है कि बीज की नसबंदी और इस परख के दौरान बाँझ तकनीक का उपयोग करने के लिए पौधों axenic रखने के लिए पर्याप्त थे जब तक जानबूझकर उपनिवेश.

Figure 1
चित्र 1: ए thaliana जड़ों पर जीवाणु उपनिवेशन और रखरखाव के लिए परख. ए थालियाना अंकुर स्टरलाइज़्ड प्लास्टिक जाल पर उगाए गए बैक्टीरिया के लिए अनुकूलित विकास माध्यम [यहाँ, 0.1 एक्स एलबी (लुरिया ब्रोथ) लेनोक्स] में स्थानांतरित किए गए थे। बैक्टीरिया तो 18 एच पर जड़ उपनिवेश जबकि संयंत्र मिलाते हुए तरल में तैरा. एक कुल्ला के बाद, colonized फ्लोट एक विकास के लिए स्थानांतरित किया गया था पौधों के लिए अनुकूलित माध्यम (0.5x एमएस + एमईएस) 72 एच के लिए जड़ों पर बैक्टीरिया के रखरखाव के लिए परीक्षण करने के लिए. फ्लोट तो कुल्ला किया गया था, और किसी भी संलग्न रोगाणुओं के साथ संयंत्र विश्लेषण के लिए हटा दिया गया था (CFU/seedling या माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग की मात्रा). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ जड़ों के पी सिमियाई उपनिवेशन को विज़ुअलाइज़ करना। पी simiae (झूठे रंग का हरा) उपनिवेश ए thaliana जड़ों और संयंत्र विकास माध्यम के लिए स्थानांतरण के बाद जड़ पर बनाए रखा गया था. रूट क्राउन (बाएं), मध्य लंबाई (केंद्र), और 40x आवर्धन पर टिप (दाएं) चित्र 1में इंगित क्षेत्रों से दिखाए जाते हैं। शीर्ष दो पंक्तियों पी simiae द्वारा उपनिवेश जड़ों के उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियों को दिखाने के (एपिफ्लोरेसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि). एक ही जड़ों को भी एक confocal माइक्रोस्कोप (केंद्र दो पंक्तियों) द्वारा छवि थे. दो नीचे पंक्तियों में कोई-बैक्टीरिया नकारात्मक नियंत्रण कोई उपनिवेशन दिखाया. स्केल बार्स 50 m का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ए thaliana जड़ों पर पी simiae की मात्रा. पी simiae व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या ए thaliana अंकुर के बाद बरामद 18 ज उपनिवेशन या रखरखाव के 72 एच. तीन अलग-अलग जैविक प्रतिकृतियां दिखाई जाती हैं, प्रत्येक में फ्लोट प्रति दो पौध ों की तीन तकनीकी प्रतिकृतिएं होती हैं। दिखाया संख्या तकनीकी प्रतिकृति से मतलब है, जबकि सलाखों के साधन के मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ए thaliana जड़ों पर एक मिश्रित जीवाणु समुदाय के उपनिवेश और रखरखाव की मात्रा. (क) ए निकोटिनोवोरन, एम ओलिवोरेन्स और सी. महासागरीय अवसाद की कालोनियों को उपनिवेश आकृति विज्ञान और रंग द्वारा एक्स-गल युक्त आगर माध्यम पर विभेदित किया जा सकता है। (ख) 10 दिन पुराने अंकुरों की जड़ें तीन उपभेदों में से प्रत्येक के लगभग 3x105 CFU/एमएल के साथ टीका लगाए गए थे। दिखाया गया है कि कुल CFU/seedling उपनिवेशन के 18 एच या रखरखाव के 72 एच के बाद बरामद कर रहे हैं जब या तो अकेले या एक तीन सदस्य जीवाणु समुदाय में उपनिवेश. दो जैविक प्रतिकृतियां, प्रत्येक में दो तकनीकी प्रतिकृतियां प्रति फ्लोट दो अंकुर ोंय दर्शाए गए हैं। दिखाए गए नंबर दो तकनीकी प्रतिकृतिसे के साधन हैं, जबकि बार साधन के मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र ाााला 1: अल्ट्रासोनिकेशन जड़ की सतह को बाधित करता है। जड़ की सतह से बैक्टीरिया को उखाड़ने के लिए, पूरे पौधों sonicated थे, और बैक्टीरिया तरल में जारी किया गया था, जो क्रमिक पतला और CFU के परिमाण के लिए चढ़ाया गया था / (A) एक अक्षुण्ण अंकुर है (B) ultrasonication के बाद संरचनात्मक रूप से बाधित। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सभी वातावरण में पौधे हजारों लोगों के साथ विभिन्न बैक्टीरिया और कवक5,7 के साथ जुड़तेहैं. ये बातचीत या तो नकारात्मक और सकारात्मक फसल उपज और खाद्य उत्पादन पर संभावित प्रभाव के साथ, संयंत्र स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हैं. हाल के कार्यों से यह भी पता चलता है कि पीजीपीबी द्वारा फसलों के परिवर्तनीय उपनिवेशन से क्षेत्र परीक्षणों में अप्रत्याशित पौधों के आकार और फसल की उपज22हो सकती है . इन बातचीत के पीछे तंत्र को समझना हमें सीधे संयंत्र संबद्ध माइक्रोबियल समुदायों में हेरफेर करने के लिए स्वस्थ संयंत्र के विकास में सहायता करने के लिए, यहां तक कि तनाव24के तहत अनुमति दे सकता है.

क्योंकि जड़ों के जीवाणु उपनिवेशन और rhizosphere में उनके रखरखाव संयंत्र microbe बातचीत9के लिए महत्वपूर्ण है, हम एक प्रणाली का निर्माण करने के लिए reproducibly कल्पना और इन जीवाणु व्यवहार की मात्रा निर्धारित करना चाहता था. इस हाइड्रोपोनिक, फ्लोटिंग अंकुर विकास प्रणाली ए thalianaकी जड़ों पर सूक्ष्म इमेजिंग और जीवाणु आबादी के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है।

वर्णित संयंत्र सूक्ष्म बातचीत परख मौजूदा प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लाभकारी तत्वों को एकीकृत करता है. फ्लोटिंग मेश विधि उस पर आधारित थी हेनी एट अल13, जो स्थिर, फ्लोटिंग ए थालियाना अंकुरों पर पी सिमियाई WCS417r के प्रारंभिक उपनिवेशन को मापा जाता था। इस प्रणाली के मूल्यांकन में, पी simiae द्वारा ए thaliana जड़ों के मजबूत उपनिवेशन मान्य किया गया था, भले ही हैनी एट अल से एक अलग विकास माध्यम का उपयोग किया गया था और उपनिवेशन के दौरान कक्षीय मिलाते हुए शामिल थे. उपनिवेशन और रखरखाव दोनों के दौरान कक्षीय मिलाते हुए शामिल किए जाने से जीवाणु बातचीत की सुविधा होती हैजो स्थिर संस्कृति में नहीं हो सकती हैं, साथ ही एंऑक्सिक स्थितियों को कम करती हैं जो जीवाणु विकास और पौधे की जड़ के स्वास्थ्य को बाधित कर सकती हैं . हमने विभिन्न जीवाणु प्रजातियों8,15,25द्वारा पादप जड़ उपनिवेशन का समर्थन करने के लिए डिज़ाइन किए गए सूक्ष्म जीव विज्ञान-केंद्रित प्रोटोकॉल के पहलुओंकोभी एकीकृत किया है . यह जीवाणु उपनिवेशन के लिए अनुकूलित माध्यम से बाहर एक महत्वपूर्ण हस्तांतरण कदम और संयंत्र के विकास के लिए अनुकूलित एक माध्यम में शामिल थे. नए माध्यम के लिए यह हस्तांतरण भी जड़ों पर जीवाणु रखरखाव अंतर्निहित तंत्र को संबोधित करने के लिए शुरू करने की अनुमति देगा, एक दृष्टिकोण है कि क्षेत्र परीक्षण ों में पीजीपीबी के अनियमित रखरखाव में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं6.

इस परख कई नमूनों के तेजी से प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित किया गया था पर्यावरण चर और मिश्रित जीवाणु समुदायों के लिए अनुमति देने के लिए एक बहु अच्छी तरह से जैविक प्रतिकृति के भीतर परख. ultrasonication पहले व्यवधान और rhizosphere बैक्टीरिया के संग्रह के लिए पर्याप्त होने के लिए दिखाया गया है, जबकि 24 अच्छी तरह से प्लेट और बहु-प्रोंग सींग लगाव नमूना प्रसंस्करण तेज। जीवाणु उपस्थिति की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस सेल व्यवहार्यता गणना दृष्टिकोण द्वारा पूरित किया जा सकता है, या शामिल करने के लिए विस्तार, QPCR या MiSeQ 16S RNA जीन समुदाय रूपरेखा colonizing बैक्टीरिया के अधिक विविध समुदायों के रिश्तेदार बहुतायत निर्धारित करने के लिए 20. इसके अतिरिक्त, इमेजिंग के दौरान, प्रत्येक पौधे की जड़ के केवल तीन क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करने की उपयोगिता, जीवाणु उपस्थिति के दृश्य को गति देने और जड़ों पर स्थानीयकरण को उजागर करती है। इन विभिन्न रूट क्षेत्रों के उपनिवेशन से जीवाणु प्रजातियों में अंतर दिखाई दिया है14. इमेजिंग या तो स्वाभाविक रूप से autofluorescent बैक्टीरिया या आनुवंशिक रूप से पथ्य बैक्टीरिया एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर के साथ किया जा सकता है.

यहाँ वर्णित पद्धति पीजीपीबी बैक्टीरिया द्वारा रूट उपनिवेशन के तेजी से और पुन: उत्पादनीय मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, लेकिन इन प्रयोगों से तैयार किया जा सकता है कि निष्कर्ष के लिए सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, जड़ की ओर chemotax करने के लिए बैक्टीरिया के लिए क्षमता कई बैक्टीरिया प्रजातियों 'पौधों की जड़ों के उपनिवेशन के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है, लेकिन इस प्रक्रिया को इस मिलाते हुए टीका प्रणाली के भीतर की आवश्यकता नहीं हो सकता है. उस ने कहा, अध्ययन के लिए विशेष रूप से chemotaxis में रुचि रखते हैं, उपनिवेशन कदम स्थिर तरल संस्कृति में या एक नरम agar माध्यम की सतह पर प्रदर्शन किया जा सकता है, जहां बैक्टीरिया संयंत्र से दूर चढ़ाया जा सकता है, उन्हें सक्रिय रूप से की ओर ले जाने की आवश्यकता जड़. इसके अलावा, उपनिवेशन के दौरान एक अपेक्षाकृत समृद्ध विकास माध्यम जीवाणु विकास और संयंत्र लगाव को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया था; हालांकि, इन अपेक्षाकृत उच्च पोषक तत्व सांद्रता उपनिवेशन के दौरान संयंत्र व्युत्पन्न कार्बन के लिए जीवाणु उपयोग या प्रतिस्पर्धा की परीक्षा को प्रतिबंधित कर सकते हैं. फिर, बैक्टीरिया के विकास की आवश्यकताओं के आधार पर अध्ययन किया जा रहा है, उपनिवेशन माध्यम सबसे अच्छा विशिष्ट शोधकर्ताओं के विशेष अनुसंधान सवालों के अनुरूप करने के लिए अलग किया जा सकता है.

इस प्रणाली को आसानी से विभिन्न जीवाणु और संयंत्र विकास की स्थिति के लिए और विभिन्न पर्यावरणीय तनाव और timepoints के अलावा करने के लिए अनुकूल होने के लिए डिजाइन किया गया था. हालांकि, यहाँ वर्णित तरीके ए thaliana अंकुर की जड़ों के साथ जीवाणु बातचीत को मापने के लिए सबसे उपयुक्त हैं. संग्रह इस संयंत्र के लिए अनुकूलित किया गया है, और बड़े या अधिक संवेदनशील पौधों अस्थायी बहु अच्छी तरह से प्लेट प्रणाली में अट्रैक्ट्रैकेबल हो सकता है. अंत में, जबकि यहाँ इस्तेमाल ब्याज के बैक्टीरिया तरल संस्कृति में संयंत्र की जड़ उपनिवेश, अन्य बैक्टीरिया के लिए यह डुबकी टीका या एक ठोस agar माध्यम पर चढ़ाना द्वारा संयंत्र की जड़ों टीका करने के लिए आवश्यक हो सकता है19.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम ऊर्जा जैविक और पर्यावरण अनुसंधान विभाग (DOE-BER 0000217519 से ई.ए.एस.), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (ईएएस के लिए आईएसईआरआईईआरआईओएस-1343020) द्वारा प्रदान किए गए अनुसंधान निधियों द्वारा समर्थित किया गया था। SLH भी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था. हम जीवाणु उपभेदों और अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए डॉ जेफरी डांगल धन्यवाद। हम प्रयोगात्मक सुझावों के लिए डॉ एंड्रयू क्लेन और मैथ्यू जे शक्तियों धन्यवाद. अंत में, SLH हमें याद दिलाना है कि विज्ञान के प्रसार एक विशेषाधिकार और एक जिम्मेदारी है, विशेष रूप से रचनात्मक और सुलभ साधन के माध्यम से सामाजिक मीडिया पर कनेक्शन धन्यवाद करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes any N/A
24-well plates BD Falcon 1801343
Aeraseal Excel Scientific BE255A2
Autoclave any N/A
Bacteria of Interest any N/A Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar BD 2306428; REF 214010
bleach any N/A
Conviron any N/A Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic any N/A
Ethanol any N/A
Flame any N/A
Forceps any N/A
Incubator any N/A At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid any N/A
Lennox LB Broth RPI L24066-1000.0
Microcentrifuge any N/A
Micropipetters any N/A Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence) any N/A Could be light if best definition not important
MS Salts + MES RPI M70300-50.0
Orbital Plate Shaker any N/A Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes any N/A 50 mL total volume
Reservoirs any N/A
Spectrophotometer any N/A
Standard Hole Punch any N/A Approximately 7mm punch diameter
Sterile water any N/A
Surgical Tape 3M MMM1538-1
Teflon Mesh McMaster-Carr 1100t41
Ultrasonicator any N/A
Vortex Mixer any N/A
X-gal GoldBio x4281c other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment any N/A For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II Excel Scientific FE124F
Glass beads any N/A
Multipetter/Repetter any N/A
Sterile 96-well plates any N/A For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds any N/A We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017

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References

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Harris, S. L., Pelaez, C. A., Shank, … More

Harris, S. L., Pelaez, C. A., Shank, E. A. Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System. J. Vis. Exp. (147), e59517, doi:10.3791/59517 (2019).

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