Summary
Her beskriver vi en hydroponiske plantevækst assay til at kvantificere arter tilstedeværelse og visualisere den rumlige fordeling af bakterier under indledende kolonisering af planterødder og efter deres overførsel i forskellige vækst miljøer.
Abstract
Bakterier danner komplekse rhizosfæren mikrobiomer formet ved at interagere mikrober, større organismer, og det abiotiske miljø. Under laboratorieforhold, rhizosfæren kolonisering af plantevækst fremmende bakterier (pgpb) kan øge sundheden eller udviklingen af værtsplanter i forhold til uncolonized planter. Men i Feltindstillinger, bakterie behandlinger med PGPB ofte ikke giver betydelige fordele for afgrøder. En forklaring er, at dette kan skyldes tab af PGPB under interaktioner med endogene jord mikrober i løbet af anlæggets levetid. Denne mulighed har været vanskeligt at bekræfte, da de fleste undersøgelser fokuserer på den oprindelige kolonisering snarere end vedligeholdelse af pgpb inden rhizosfæren samfund. Det er en hypotese her, at forsamlingen, sameksistens, og vedligeholdelse af bakterie samfund er formet af deterministiske funktioner i rhizosfæren mikromiljø, og at disse interaktioner kan påvirke pgpb overlevelse i native indstillinger. For at studere disse adfærd, en hydroponiske plante-vækst assay er optimeret ved hjælp af Arabidopsis thaliana at kvantificere og visualisere den rumlige fordeling af bakterier under indledende kolonisering af planterødder og efter overførsel til forskellige vækst Miljøer. Dette Systems reproducerbarhed og anvendelighed valideres derefter med den studerede pgpb Pseudomonas simiae prosimiae. At undersøge, hvordan tilstedeværelsen af flere bakterielle arter kan påvirke kolonisering og vedligeholdelse dynamik på planten roden, en model samfund fra tre bakterielle stammer (en Arthrobacter, Curtobacterium, og microbacterium arter) oprindeligt isoleret fra a. thaliana rhizosfæren er konstrueret. Det er påvist, at tilstedeværelsen af disse forskellige bakteriearter kan måles ved hjælp af denne hydroponiske plante-maintanence assay, som giver et alternativ til Sequencing-baserede bakterielle fællesskabsundersøgelser. Fremtidige undersøgelser ved hjælp af dette system kan forbedre forståelsen af bakteriel adfærd i multi arter plante mikrobiomer over tid og i skiftende miljømæssige forhold.
Introduction
Afgrøde ødelæggelse af bakterielle og svampesygdomme resulterer i sænket fødevareproduktion og kan alvorligt forstyrre den globale stabilitet1. Baseret på opdagelsen af, at mikrober i suppressiv jord er ansvarlige for at øge plantesundheden2, har forskerne spurgt, om plante mikrobiomet kan udnyttes til at støtte plantevækst ved at ændre tilstedeværelsen og overflod af særlige bakteriearter3. Bakterier fundet at støtte i plantevækst eller udvikling er kollektivt betegnes plantevækst fremmende bakterier (PGPB). For nylig har undersøgelser skiftet fra blot at identificere potentielle PGPB til at forstå, hvordan interkingdom interaktioner i jorden, omkring rødder, eller i rhizosfæren (området direkte omgivende og herunder rodoverfladen) kan påvirke PGPB aktivitet4.
Rhizosphere kolonisering af PGPB kan øge sundheden eller udviklingen af værtsplanter som reaktion på forskellige stressorer i forhold til uncolonized planter5. Men, resultaterne er ofte mere variabel i indfødte jordforhold sammenlignet med dem, der er observeret i de nøje kontrollerede drivhus og laboratorie indstillinger6. En hypotese for denne forskel er, at vækst eller opførsel af pgpb kan hæmmes af indfødte jord bakterier eller svampe i markerne7,8. Gavnlige virkninger af rhizosfæren bakterier generelt afhænge af bakteriernes evne til 1) lokalisere og bevæge sig mod roden, 2) kolonisere roden gennem biofilm dannelse, og 3) interagere med værts planten eller patogener via produktion af små molekyle metabolitter7,9. Enhver af disse kolonisering adfærd kan blive påvirket af tilstedeværelsen og aktiviteten af tilstødende mikrober10.
Vi har designet et system til at kvantificere og visualisere disse særskilte bakterielle kolonisation stadier af rhizosfæren (figur 1). Denne fremgangsmåde vil gøre det lettere at undersøge, hvorfor langtids vedligeholdelse af PGPB undertiden ikke observeres efter overførsel af planter til nye miljøer, såsom ved plantning af præ-inokulerede planter. Arabidopsis thaliana som blev valgt som en plante model på grund af sin omfattende brug i laboratorieundersøgelser samt de rigelige data tilgængelige om dens mikrobielle interaktioner11. Der er tre stadier i systemet: 1) A. thaliana vækst, 2) bakteriel kolonisering, og 3) bakteriel vedligeholdelse (Se figur 1). Fordi a. thaliana er et jordbaseret anlæg, var det vigtigt at sikre, at det ikke var udsat for unødig vand stress i det hydroponiske system12. Inspireret af de metoder, der anvendes af Haney et al.13, dyrkes frøplanterne på plastik mesh for at adskille skuddet fra det flydende vækstmedium. Dette system synes ikke at kompromittere sundhed og udvikling af anlægget vært, og det forbedrer en. thaliana vækst i flydende11. Som planten skyde flyder over overfladen, rødderne er fuldt udsat for kolonisering af bakterier inokuleret i den flydende bakterielle vækstmedium. Dette tillader bakterier af interesse at blive undersøgt for kolonisering i næringsstoffer, der er mest befordrende for vækst, mens derefter skiftende betingelser for at gøre det muligt for planten at fortsætte med at vokse i et næringsstof medium designet til at støtte sin vækst. Begge stadier omfatter konstant rystning for at forhindre anoxia af roden13. Bakterier kan visualiseres eller kvantificeres fra plantens rødder efter overførsel fra enten koloniserings mediet eller vedligeholdelses mediet. Dette hydroponiske system er meget fleksibelt, hvilket tillader eksperimentelle betingelser og anvendte belastninger, der let kan ændres afhængigt af forskernes interesser.
Denne beskrevne metode er vigtig i forbindelse med den større mængde litteratur om plante mikrobe interaktioner, fordi den giver et robust system til at studere disse interaktioner på rodoverfladen, samtidig med at de kan tilpasses til vækst præferencerne for forskellige bakterier. Plant biologi Labs ofte udføre plante-Microbe kolonisering eksperimenter på solid agar, giver mulighed for kun planar bevægelse (hvis det) af bakterier, samtidig med at der kræves en potentielt destruktiv manipulation af planter under efterfølgende overførsel. I modsætning hertil har mikrobiologiske laboratorier ofte prioriteret sundhed bakterier i deres eksperimenter, til skade for planterne14,15. Disse forskellige prioriteringer af plante-og Mikrobiologi-fokuserede laboratorier har historisk gjort det vanskeligt at sammenligne resultater mellem disse grupper, da hver typisk optimerer eksperimentelle betingelser for at optimere deres organisme af interesse15. Den flydende-mesh-plante-vækst system, der er beskrevet her forhindrer fuld plante nedsænkning, en bemærkelsesværdig fordel til tidligere mikrobiologiske-orienterede undersøgelser, mens også midlertidigt at optimere vækst og overlevelse af bakterier til at lette kolonisering. Således kan den analyse, vi præsenterer her, behandle bekymringer fra både plante biologer (om over-hydrering og taktile manipulation af planten), mens opfylder kriterierne for mikrobiologer (giver mulighed for forskellige bakterielle vækstbetingelser og flere Arts interaktioner)7. Denne protokol er designet til at kunne tilpasses til brug med forskellige bakterier, planter og miljøforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: den eksperimentelle opsætning er beskrevet for klarhed og bruges til at generere de repræsentative resultater, der er inkluderet i denne rapport, men betingelserne kan ændres som ønsket. Alle trin skal udføres ved hjælp af PV og efter institutionelle og føderale reccomendations for sikkerhed, i henhold til BSL status for de anvendte bakterier.
1. karakterisering af bakterier
- Bestem morfologien af bakterier på vækstmedium agar pladen. Gensuspender cellerne med en omtrentlig OD600 = 0,5 og plade en 1 μl volumen på agar medium valg. Tilsæt X-gal til agar plader til en endelig koncentration på 20 mg/mL for bedre at differentiere individuelle medlemmer af det specifikke bakterie samfund. Vokse ved 24 °C eller 30 °C indtil kolonier form, derefter tage billeder af og noter om koloni morfologi.
- Definer korrelationen mellem hver bakteriestamme optiske tæthed og antallet af CFU (kolonidannende enheder) pr. mL16. Resuspension af bakterier i 1 mL vand i en 24-brønd plade til en omtrentlig OD600 = 5, udføre to-fold serielle fortyndinger, overvåge OD600 af alle fortyndinger, og plade hver for at bestemme den levedygtige CFU/ml i hver prøve ved flere optiske tætheder.
- Bestem den maksimale sonikering tolerance for hver bakteriel stamme. For at gøre dette, alikvot celler i en 24-brønd plade indeholdende flydende medium, forbeholde nogle celler som en usoniseret kontrolprøve. Ved hjælp af en ultrasonicator med en 24-tip horn vedhæftet fil, anvende tre runder af 12 s af sonikering på 40 amp med 2 s pulser.
Bemærk: brugen af en 24-brønd ultrasonicator tilrådes at lette downstream multiplexing af forarbejdningsanlæg prøver, men hvis man ikke er tilgængelig, bruge en Ultralydapparat udstyret med en mikrotip og udføre hver prøve sonikering uafhængigt. Brug altid øremuffer, som er klassificeret til mindst 25 NRR-beskyttelse. - Udfør 10-fold serielle fortyndinger af de soniksholdige og ulydløse prøver og spot på agar plader. Afgøre, om der er en reduktion i levedygtige celler efter sonikering. Hvis det er tilfældet, skal du bruge en frisk prøve og gentage sonikering trin ved hjælp af en reduceret total sonikering tid eller amplitude, indtil behandlingen ikke har nogen effekt på Final CFU/mL17.
2. forberedelse af Arabidopsis thaliana frøplanter på en plastik mesh
- Opret diske af plastik mesh ved hjælp af en standard hul Puncher.
- Saml diskene i en glasbeholder med et løst dæksel af aluminiumsfolie, og sterilisere ved hjælp af en autoklave indstillet til en 20 min tørre cyklus13.
- Brug flamme steriliserede pincet til at distribuere ca. 40 steriliserede mesh-diske i et enkelt lag over overfladen af en plante-vækst-medium agar plade. Brug 0,5 x Murashige og Skoog (MS) salte, indeholdende 500 mg/L af MES buffer [2-(N-morpholino) ethansulfonsyre] og 1,5% Bacto agar, som plantevækst medium, med 50 μg/mL benomyl tilsat til grænseværdien svampe forurening af frøplanterne.
- Forbered axeniske frø af A. thaliana som tidligere beskrevet17.
- Anbring ca. 100 – 300 frø i et enkelt centrifugeglas i et rack, og Placer det i et resealable Glass eller en tung plastikbeholder ("krukke") i en udsugnings hætte.
- Brug forsigtighed, Anbring et bægerglas på 100 mL blegemiddel i glasset, tilsæt 3 mL koncentreret HCl til blegemiddel, og forsegl straks glasset, og lad dampene sterilisere såsæd i mindst 4 timer.
- Fjern forsigtigt rørene af steriliserede frø fra under krukken og forsegle.
- Placer to frø i midten af hver maske. Forsegl plader med kirurgisk tape og Inkuber i 2 – 6 dage ved 4 °C i mørke for at vernalize frø.
- For at spire og dyrke frøplanter, Placer pladen agar side ned i en plantevækst kammer for 8-10 dage under korte dag indstillinger: 9 h lys ved 21 °C og 15 h mørke ved 18 °C (figur 1, trin 2).
3. kolonisering af planter i flydende bakteriel vækstmedium
- Tilsæt 1 mL bakterievækst medium til hver brønd af en steril 24-brønd plade, bortset fra medier-kun kontrol brønde. Brug Lennox Luria bouillon (10 g tryptone, 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl) som bakterievækst medium.
- De spire planter, som er indlejret i mesh, overføres fra agarplader til væsken (figur 1, trin 3a).
- Skræl forsigtigt masken, der indeholder to spilede frøplanter op og ud af agar pladen ved hjælp af flamme steriliseret tang. Vælg mesh med lige store og ubeskadigede frøplanter.
- Hvis fjernelse fra agar ikke er glat, kassere, at mesh og plante. Overfør en flyde til hver brønd af bakteriel vækst væske, rod side ned.
- Inokulere bakterier i brønde, der indeholder flydende frøplanter.
- Resuspension bakterier dyrket natten på agar plader til en OD600 svarende til 108 CFU/ml i bakterievækst medium væske. Tilsæt 10 μL bakteriel suspension til hver brønd for en endelig koncentration på 106 CFU bakterier per brønd.
- Hvis der forberedes en blanding af bakterier, resuspension hver til OD600 svarende til 108 CFU/ml, blandes ligeligt, og tilsæt 10 μl af den endelige blanding pr. brønd af væske.
- Forsegl pladen for steril vækst. Uden at røre den klæbrige side, tryk forsigtigt den gasgennemtrængelige film på tværs af pladen. Sørg for, at hver brønd er blevet individuelt forseglet ved at lægge pres omkring hver af de ringe, der er lavet af brøndene. Udskift pladens plastik låg snuggly over pladen og gas-permeable film (figur 1, trin 3b).
- Pladerne inkuberes i 18 timer i et plantevækst kammer under de samme betingelser, som frøplanterne oprindeligt blev spire, undtagen på en omløbs plade, der var indstillet til 220 rpm.
4. opretholdelse af bakteriel kolonisering
- For at skylle alle flåd (planter på mesh) tilsættes 1 mL sterilt vand til brønde af en ny 24-brønd plade. Fjern gas-permeabel film. Ved hjælp af sterile pincet overføres flyder til brønde med vand (figur 1, trin 4a). Skyl ved at hvile i 10 minutter ved stuetemperatur (RT) uden agitation.
Bemærk: for at bestemme bakteriel kolonisering effektivitet af rødder snarere end deres evne til at opretholde kolonisering over tid, planter kan ofres på dette trin ved at tage dem direkte til trin 5,1. - Fyld brøndene på en ny 24-brønd plade med 1 mL plantevækst medium. Overfør en maske til hver brønd. Dæk med en gasgennemtrængelig forsegling og Inkubér i 72 h på omløbs pladens shaker ved 220 rpm i plantevækst kammeret (figur 1, trin 4b).
- Gentag skylningen som udført i trin 4,1 med flåd efter 72 h inkubationsperioden.
5. indsamling af bakterier til levedygtige celletal
Bemærk: antallet af bakterier pr. frøplante rod kan bestemmes ved ethvert inkubations tidspunkt. Kolonisering kan overvåges mellem 0 h og 18 timer, mens vedligeholdelsen kan overvåges fra 18 timer og fremefter. Planter bestemt til billeddannelse kan gå direkte til afsnit 6.
- Fjern frøplanterne fra masken (figur 1, trin 5). Placer forsigtigt flamme steriliserede Tang under bladene (men på blad siden af masken), og klem let stammen. Vrikke frøplanterne op og væk fra masken for at fjerne roden uden at bryde den. Hvis roden bryder, forsigtigt skrabe mesh bunden for at indsamle den fulde længde.
- Fjerne bakterier fra planterødder. Bakterierne overføres til brønde af en 24-brønd plade, der indeholder 1 mL ddH20. Prøverne sonipler som beskrevet i trin 1,3.
Bemærk: Brug et mikroskop, se efter eventuelle resterende bakterier på rodoverfladen på en soniseret prøve. Hvis bakterier forbliver, øge den samlede sonikering tid eller intensitet, indtil ingen bakterier forbliver bundet, op til det højeste niveau af sonikering, der ikke påvirker levedygtige celletal som bestemt i afsnit 1. - Kvantificere bakterierne på rødder.
- Udfør serielle 10-fold fortyndinger af de soniksholdige prøver op til en 10-6 fortynding i bakteriel vækstmedium. Tilsæt 50 μL af hver fortynding til individuelle agar plader og spredes med sterile glasperler (eller bakterie sprederen). Inkuber pladerne ved den optimale temperatur for bakterier, indtil de enkelte kolonier er tælerbare.
- Når skelne, tælle antallet af hver koloni morfologi (som bestemt i afsnit 1), og beregne CFU af hver bakteriearter pr frøplanter. Alle prøver, der viser kontaminering, kasseres, da kontaminering under kolonisering eller vedligeholdelse kan påvirke forekomsten af bakterier.
6. indsamling af intakte planterødder til mikroskopi
- Brug pincet til at fjerne frøplanterne fra mesh som i afsnit 5.
- Overfør hvert anlæg til mikroskop slides.
- Placer spidsen af roden på diaset, og træk væk fra spidsen for at indstille nedskydning med diaset, hvilket sikrer en rettet rod for bedste billeddannelse. Tilsæt en dråbe vand eller sterilt plantevækst medium til prøverne for at fugte grænsefladerne mellem dæksedlerne og gliderne.
- Placer en glas dækseddel lige over rodkronen (øverste boxed region i figur 1) og under skyde bladene for at undgå skrå af dæksedlen (for at give mulighed for root Crown Imaging), og tryk forsigtigt ned17.
- Hvis du bruger fluorescerende bakterier, billede ved hjælp af passende excitation/emission filtre til at skelne bakterier fra hinanden og planten roden18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den velkarakteriserede pgpb P. simiae prosimiae WCS417r er kendt for at kolonisere rødderne af A. thaliana i hydroponiske kultur. Denne naturligt fluorescerende bakterie kan nemt visualiseres ved hjælp af mikroskopi på rødderne af frøplanter efter kolonisering (figur 2). Selv om det er muligt at billede den fulde længde af disse A. thaliana frøplanter ' (4 – 6 mm længde) rødder, gør det for mange planter ville tage en prohibitiv mængde tid. Fordi de fleste variationer på tværs af tidspunkter og arter af bakterier kan fanges ved billeddannelse kronen, midten, og spidsen af roden14 (indikeret med røde bokse i figur 1), disse regioner blev prioriteret for Imaging snarere end Imaging fuld rod Længder. I de lyse feltbilleder af P. simiae prosimiae-koloniseret A. thaliana rødder (figur 2), er det muligt at visualisere omridset af rødderne og rod hår; men ved 18 h kolonisering er det ikke muligt klart at differentiere koloniseret versus ikke-koloniserede rødder ved hjælp af lyse feltbilleder. Mens P. simiae prosimiae viser autofluorescens, brugte vi en stamme, der også var konstrueret til at udtrykke et gult fluorescerende protein (yfp)19 med excitation/emission bølgelængder på 490-510/520-550 nm18. En forstørrelse på 100x var tilstrækkelig til klart at identificere individuelle og små aggregater af P. simiae prosimiae celler på A. thaliana rødder. Som vist i figur 2, laboratorier med adgang til enten høj opløsning konfokale mikroskoper eller billigere stationære mikroskoper kan både visualisere tilstedeværelsen og fordelingen af bakterier langs roden.
Mens informativ i form af rumlig fordeling, mikroskopi billeder er ikke velegnet til kvantificering af bakterieceller. Vi indsamlede således bakterier fra overfladen af rødder ved hjælp af ultralydbehandling som tidligere beskrevet og valideret9,20. Tre runder af 12 s af ultralydbehandling21 ved en amplitude på 40 var tilstrækkelige til at forstyrre den ydre overflade af roden frøplanter (supplerende figur 1) og fjerne alle bakterier, mens ikke påvirker den bakterielle levedygtighed. Sonikering blev brugt snarere end perle-slå metoder9 for bedre at fremme spredning af bakterielle aggregater/biofilms. Kvantificering af CFU/root efter 18 h kolonisering og yderligere 72 h vedligeholdelse viste, at P. simiae prosimiae både koloniserer og vedligeholdes på rødderne af A. thaliana i vores hydroponiske, flydende frøkings system (figur 3). Antallet af CFU/frøplanter på begge tidspunkt viste god reproducerbarhed på tværs af biologiske replikater udført på forskellige dage (figur 3). Variationen observeret er udbredt blandt root kolonisering assays22 og er sandsynligvis på grund af mindre variationer af timing, miljømæssige forhold, eller plante rod størrelse, selv blandt frøplanter spire på samme tid og udvalgt til at være ens i størrelse. Vi observerer en stigning i antallet af CFU/frøplanter efter 72 h i vedligeholdelses medium i forhold til antallet observeret ved post-kolonisering 18 timer tidspunkt (figur 3). Dette indikerer aktiv vækst af de koloniserede bakterier på planten roden opstod under vedligeholdelses stadiet.
Ud over nytten af denne hydroponiske assay til at kvantificere individuel bakteriel kolonisering og vedligeholdelse, det gælder også for overvågning af sammenslutningen af flere arter på planterødder. For at demonstrere dette, tre arter af bakterier isoleret fra A. thaliana dyrket i naturlig jord under laboratorieforhold blev valgt20. Isolaterne var stammer af Arthrobacter nicotinovorans, Microbacterium oleivorans, og Curtobacterium oceanosedimentum23. Dette forenklede fællesskab blev valgt på grund af disse arters evne til at sameksistere i flydende bakterievækst medier i ryste kultur (ikke-offentliggjorte data). Desuden kan disse tre arter være klart differentieret på medier, der indeholder X-gal på grund af forskelle i koloni morfologi og farve (figur 4a). X-gal påvirker ikke den relative vækst af nogen af disse bakteriearter (ikke-offentliggjorte data). Disse forskelle i morfologi og koloni udseende på X-gal tillod os at tælle CFU/Seedling af hver art uden antibiotika udvælgelse, selv i multi-Arts coculture.
A. nicotinovorans, M. oleivorans, og C. oceanosedimentum blev alle koloniseret og vedligeholdt på roden, enten alene eller i bakteriel Coculture (figur 4b). Hver art viste tendenser, der var ens på tværs af forskellige biologiske og tekniske replikater, selv inden for blandede samfund. Dette viser, at analyse protokollen kan anvendes til at måle både relativ eller total CFU/roden af hver art. Interessant, når de dyrkes alene, ingen individuelle arter viste en mærkbar stigning i overflod i vedligeholdelsesfasen, men den samlede CFU/roden af det kombinerede samfund steg i kokult urer, hvilket indikerer, at disse bakterier ikke forbyder kolonisering af de andre stammer.
For alle eksperimenter, planter dyrket i flydende medier uden tilsætning af bakterier som negative kontroller var altid inkluderet. Ingen bakterier var synlige på disse kontrol rødder under mikroskopi (figur 2), og der blev heller ikke påvist nogen bakterier via plating for CFU (ikke-offentliggjorte data). Dette indikerer, at sterilisering af frø og ved hjælp af de sterile teknikker i løbet af denne analyse var tilstrækkelige til at holde planter axeniske medmindre med vilje koloniseret.
Figur 1: assay for bakteriel kolonisering og vedligeholdelse på en. thaliana rødder. A. thaliana frøplanter dyrket på steriliseret plastik mesh blev overført til et vækstmedium optimeret til bakterier [her, 0,1 x lb (Luria bouillon) Lennox]. Bakterier derefter koloniseret roden over 18 h, mens planten flated i ryste væske. Efter en skylning blev den koloniserede float overført til et vækstmedium optimeret til planter (0,5 x MS + MES) til 72 h for at teste for vedligeholdelse af bakterier på rødderne. Flyde blev derefter skyllet, og planten med eventuelle vedhæftede mikrober blev fjernet til analyse (kvantificering af CFU/frøplanter eller billeddannelse ved mikroskopi). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: visualisering af P. simiae prosimiae kolonisering af rødder med fluorescerende mikroskopi. P. simiae prosimiae (falsk farvet grøn) koloniseret A. thaliana rødder og blev opretholdt på roden efter overførsel til plante-vækstmedium. Root Crown (venstre), Mid-længde (midten) og spids (højre) ved 40x forstørrelse vises fra de områder, der er angivet i figur 1. De øverste to rækker viser det lyse felt og fluorescerende billeder af rødder koloniseret af P. simiae prosimiae (imaged af epifluorescerende mikroskopi). De samme rødder blev også afbildet af en Konfokal mikroskop (Center to rækker). Nej-bakteriernes negative kontrol i de to nederste rækker viste ingen kolonisering. Skala søjler repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kvantificering af P. simiae prosimiae på rødder af A. thaliana . Samlet antal levedygtige celler af P. simiae prosimiae , der er inddrevet pr . thaliana -frøplante efter 18 timer kolonisering eller 72 h vedligeholdelse. Der vises tre individuelle biologiske replikater, som hver indeholder tre tekniske replikater af to frøplanter pr. float. De viste tal er midlerne fra de tekniske replikater, mens søjlerne repræsenterer standardfejl på midlerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: kvantificering af koloniseringen og vedligeholdelsen af et blandet bakterie fællesskab på a. thaliana rødder. (A) kolonier af A. Nicotinovorans, M. oleivorans, og C. oceanosedimentum kan differentieres på X-gal-holdige agar medium ved koloni morfologi og farve. (B) rødder af 10 daggamle frøplanter blev inokuleret med ca. 3x105 CFU/ml af hver af de tre stammer. Vist er total CFU/Seedling genvundet af hver art efter 18 h kolonisering eller 72 h af vedligeholdelse, når koloniseret enten alene eller i en tre-medlem bakterie samfund. To biologiske replikater, der hver består af to tekniske replikater af to frøplanter pr. float, vises. De viste tal er midlerne fra de to tekniske replikater, mens søjler repræsenterer standardfejl på midlerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: ultralydbehandling forstyrrer rodoverfladen. For at opløse bakterier fra overfladen af roden, blev hele planter soniseret, og bakterierne blev frigivet i væsken, som blev serielt fortyndet og belagt til kvantificering af CFU/frøplanter. A) en intakt frøning er (B) strukturelt forstyrret efter ultralydbehandling. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Planter i alle miljøer interagerer med tusinder til millioner af forskellige bakterier og svampe5,7. Disse interaktioner kan enten have en negativ og positiv indvirkning på plantesundheden med potentielle virkninger på afgrødeudbyttet og fødevareproduktionen. Det seneste arbejde antyder også, at variabel kolonisering af afgrøder fra PGPBs kan være en uforudsigelig plante størrelse og afgrødeudbytte i feltforsøg22. Forståelse mekanismerne bag disse interaktioner kan give os mulighed for direkte at manipulere plante-associerede mikrobielle samfund til støtte i sund plante udvikling, selv under stress24.
Fordi bakteriel kolonisering af rødder og deres vedligeholdelse i rhizosfæren er afgørende for plante-Microbe interaktioner9, vi ønskede at opbygge et system til reproducerbare visualisere og kvantificere disse bakterielle adfærd. Dette hydroponiske, flydende frøplante vækst system giver mulighed for mikroskopisk billeddannelse og kvantificering af bakterielle populationer på rødderne af A. thaliana.
Den beskrevne plante mikrobe interaktions analyse integrerer gavnlige elementer i eksisterende forsøgsprotokoller. Den flydende mesh metode var baseret på, at fra Haney et al.13, som målte indledende kolonisering af P. simiae prosimiae WCS417r på statiske, flydende A. thaliana frøplanter. Ved vurderingen af dette system blev en stærk kolonisering af A. thaliana rødder af P. simiae prosimiae valideret, selv om et andet vækstmedium fra Haney et al. blev udnyttet og inkluderet orbital omrystning under koloniseringen. Inddragelsen af orbital omrystning under både kolonisering og vedligeholdelse letter bakterielle interaktioner, der ikke kan forekomme i statisk kultur, samt reducere anoxiske betingelser, der kan hæmme både bakteriel vækst og plante rod sundhed13. Vi har også integreret aspekter af Mikrobiologi-fokuserede protokoller designet til at støtte plante rod kolonisering af forskellige bakteriearter8,15,25. Dette omfattede en afgørende overførsel skridt ud af mediet optimeret til bakteriel kolonisering og ind i et medium optimeret til plantevækst. Denne overførsel til fersk medium vil også gøre det muligt for de mekanismer underliggende bakteriel vedligeholdelse på rødder til at begynde at blive behandlet, en tilgang, der kan give indsigt i den uregelmæssige vedligeholdelse af PGPB i feltforsøg6.
Denne analyse blev optimeret til hurtig behandling af flere prøver for at gøre det muligt for miljømæssige variabler og blandede bakterie samfund at blive analyseret inden for en multi-Well biologisk replikat. Mens ultralydbehandling tidligere har vist sig at være tilstrækkelig til afbrydelse og indsamling af rhizosfæren bakterier, 24-brønden plade og multi-Prong horn vedhæftet fil levendegør prøve behandling. Denne cellelevedygtighed beregning tilgang til kvantificering af bakteriel tilstedeværelse kunne suppleres med, eller udvides til at omfatte, qPCR eller MiSeq 16S rRNA gen community profilering til at bestemme den relative overflod af mere forskelligartede samfund af koloniserende bakterier 20. Hertil kommer, under Imaging, nytten af at fokusere på blot tre regioner i hver plante rod til at fremskynde visualisering af bakteriel tilstedeværelse og lokalisering på rødderne er fremhævet. Koloniseringen af disse forskellige rodregioner har vist sig at være forskellig blandt bakterie arterne14. Billeddannelse kan udføres med enten naturligt Auto-luorescent bakterier eller genetisk Tractable bakterier konstrueret til at udtrykke et fluorescerende protein.
Den metode, der er beskrevet her, giver mulighed for hurtig og reproducerbar evaluering af root-koloniseringen af PGPB-bakterier, men de konklusioner, der kan drages af disse eksperimenter, er begrænsede. For eksempel, evnen til bakterier til chemotax mod roden er kendt for at være vigtigt for mange bakterielle arter ' kolonisering af planterødder, men denne proces kan ikke kræves inden for denne ryster inokulation system. Når det er sagt, for undersøgelser specielt interesseret i chemotaxis, kan koloniserings trinnet udføres i statisk flydende kultur eller på overfladen af et blødt agar medium, hvor bakterier kan blive belagt fjernt fra planten, hvilket kræver, at de aktivt bevæger sig mod Rod. Desuden blev et relativt rigt vækstmedium under koloniseringen brugt til at fremme bakterievækst og anlæg fastgørelse; disse forholdsvis høje næringsstofkoncentrationer kan dog forbyde undersøgelse af bakteriel udnyttelse af eller konkurrence for vegetabilsk afledt kulstof under koloniseringen. Igen, afhængigt af vækst behovet for de bakterier, der undersøges, koloniserings mediet kan varieres til bedst passer til de særlige forskningsspørgsmål af specifikke forskere.
Dette system var designet til at være let modtagelig for forskellige bakterie-og plantevækst betingelser og til tilsætning af forskellige miljømæssige stressorer og tidspunkter. Men de metoder, der er beskrevet her, er bedst egnet til måling af bakterielle interaktioner med rødderne af A. thaliana frøplanter. Samlingen er blevet optimeret til dette anlæg, og større eller mere følsomme planter kan være intraktable i det flydende multi-Well-Plate system. Endelig, mens de bakterier af interesse, der anvendes her kolonisere planten roden i flydende kultur, for andre bakterier kan det være nødvendigt at inokulere planterødder ved dip-inokulering eller plating på en solid agar medium i stedet19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskningsmidler fra Institut for energi biologisk og miljømæssig forskning (DOE-BER 0000217519 til E.A.S.), National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 til E. A. S). SLH blev også støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship program. Vi takker Dr. Jeffery Dangl for at give bakterielle stammer og uvurderlig indsigt. Vi takker Dr. Andrew Klein og Matthew J. Powers for eksperimentelle forslag. Endelig vil SLH gerne takke forbindelserne på de sociale medier for at minde os om, at udbredelse af videnskab er et privilegium og et ansvar, især gennem kreative og tilgængelige midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
