Summary
Hier beschrijven we een hydroponische plantengroei test om de aanwezigheid van soorten te kwantificeren en de ruimtelijke verdeling van bacteriën te visualiseren tijdens de initiële kolonisatie van planten wortels en na hun overdracht in verschillende groei omgevingen.
Abstract
Bacteriën vormen complexe rizosfeer microbioom gevormd door het interageren van microben, grotere organismen en de abiotische omgeving. Onder laboratoriumomstandigheden kan de kolonisatie van rizosfeer door plantengroeibevorderende bacteriën (pgpb) de gezondheid of de ontwikkeling van gastheerplanten ten opzichte van ongekoloniseerde planten verhogen. In de veldinstellingen bieden bacteriële behandelingen met PGPB echter vaak geen substantiële voordelen voor gewassen. Een verklaring is dat dit kan te wijten zijn aan verlies van de PGPB tijdens interacties met endogene grond microben over de levensduur van de plant. Deze mogelijkheid was moeilijk te bevestigen, omdat de meeste studies zich richten op de initiële kolonisatie in plaats van het onderhoud van pgpb binnen rizosfeer communities. Het is hier veronderstelde dat de assemblage, coëxistentie, en het onderhoud van bacteriële Gemeenschappen worden gevormd door deterministische kenmerken van de rizosfeer micro omgeving, en dat deze interacties kunnen invloed hebben op de overleving van pgpb in native Settings. Om dit gedrag te bestuderen, wordt een hydrocultuur plant-growth assay geoptimaliseerd met behulp van Arabidopsis thaliana om de ruimtelijke verdeling van bacteriën te kwantificeren en te visualiseren tijdens de initiële kolonisatie van planten wortels en na overdracht naar verschillende groei Omgevingen. De reproduceerbaarheid en het nut van dit systeem worden vervolgens gevalideerd met de goed bestudeerde PGPB Pseudomonas simiae. Om te onderzoeken hoe de aanwezigheid van meerdere bacteriesoorten de kolonisatie en de onderhouds dynamiek op de wortel van de plant kan beïnvloeden, een model Gemeenschap van drie bacteriële stammen (een Arthrobacter, Curtobacteriumen micro bacterie soorten) oorspronkelijk geïsoleerd uit de A. thaliana rizosfeer is geconstrueerd. Het is aangetoond dat de aanwezigheid van deze verschillende bacteriesoorten kan worden gemeten met behulp van deze hydrocultuur plant-maintanence Assay, die een alternatief biedt voor op sequentiëren gebaseerde bacteriële Gemeenschaps studies. Toekomstige studies met behulp van dit systeem kunnen het begrip van bacterieel gedrag in diepte plant microbioom na verloop van tijd en in veranderende omgevingsomstandigheden verbeteren.
Introduction
Gewasvernietiging door bacteriële en schimmelziekten resulteert in een verlaagde voedselproductie en kan de mondiale stabiliteit ernstig verstoren1. Op basis van de ontdekking dat microben in onderdrukkende bodems verantwoordelijk zijn voor het verhogen van de plantengezondheid2, hebben wetenschappers gevraagd of de plant-microbiome kan worden ingezet om de plantengroei te ondersteunen door de aanwezigheid en overvloed van bepaalde bacteriesoorten3. Bacteriën gevonden om te helpen bij de groei van planten of ontwikkeling worden gezamenlijk genoemd plant groeibevorderende bacteriën (PGPB). Meer recentelijk zijn studies verschoven van het simpelweg identificeren van potentiële pgpb om te begrijpen hoe interkingdom-interacties in de bodem, rond wortels of in de rizosfeer (het gebied direct rond en inclusief het worteloppervlak) kunnen beïnvloeden pgpb activiteit4.
De kolonisatie van rhizosphere door PGPB kan de gezondheid of de ontwikkeling van gastheerplanten verhogen als reactie op diverse stressoren ten opzichte van ongekoloniseerde planten5. Echter, resultaten zijn vaak meer variabel in inheemse bodemomstandigheden in vergelijking met die waargenomen in de streng gecontroleerde kas en laboratorium instellingen6. Een hypothese voor dit verschil is dat de groei of het gedrag van pgpb kan worden geremd door inheemse bodembacteriën of schimmels in de velden7,8. Gunstige effecten door rizosfeer bacteriën in het algemeen afhangen van het vermogen van de bacteriën 1) lokaliseren en verplaatsen naar de wortel, 2) koloniseren de wortel door middel van biofilm vorming, en 3) interactie met de gastheerplant of pathogenen via de productie van kleine molecule de metabolieten7,9. Elk van deze kolonisatie gedrag kan worden beïnvloed door de aanwezigheid en de activiteit van naburige microben10.
We ontwierpen een systeem om deze verschillende bacteriële kolonisatie stadia van de rizosfeer te kwantificeren en te visualiseren (Figuur 1). Deze aanpak vergemakkelijkt studies die onderzoeken waarom het onderhoud op lange termijn van PGPB soms niet wordt waargenomen na de overdracht van planten in nieuwe omgevingen, zoals tijdens het planten van voorgeënt zaailingen. Arabidopsis thaliana as werden gekozen als een plant model als gevolg van het uitgebreide gebruik in laboratoriumonderzoek, evenals de ruime gegevens beschikbaar over de microbiële interacties11. Er zijn drie fasen in het systeem: 1) A. thaliana groei, 2) bacteriële kolonisatie, en 3) bacteriële onderhoud (Zie Figuur 1). Omdat a. thaliana een terrestrische plant is, was het belangrijk om ervoor te zorgen dat het niet onnodig waterstress leed in het hydroponische systeem12. Geïnspireerd door de methoden die Haney et al.13gebruikt, worden de zaailingen geteeld op kunststof gaas om de opname van het vloeistof groeimedium te scheiden. Dit systeem lijkt niet in gevaar te brengen de gezondheid en de ontwikkeling van de gastheer van de plant, en het verbetert A. thaliana groei in vloeistof11. Naarmate de plant zweeft boven het oppervlak, worden de wortels volledig blootgesteld aan kolonisatie door bacteriën geïnocculeerd in het vloeibare bacteriegroei medium. Dit maakt het mogelijk bacteriën van belang te worden onderzocht voor kolonisatie in voedingsstoffen die het meest bevorderlijk zijn voor groei, terwijl vervolgens verschuiving voorwaarden zodat de plant te blijven groeien in een nutriënt medium ontworpen om de groei te ondersteunen. Beide stadia omvatten gestage schudden om Anoxie van de wortel13te voorkomen. Bacteriën kunnen worden gevisualiseerd of becijferd vanaf de wortels van de plant na overdracht van ofwel de kolonisatie medium of het onderhouds medium. Dit hydroponische systeem is zeer flexibel, waardoor experimentele omstandigheden en toegepaste spanningen gemakkelijk kunnen worden gewijzigd, afhankelijk van de interesses van de onderzoekers.
Deze beschreven methode is belangrijk in de context van de grotere hoeveelheid literatuur over Plant-microbe interacties omdat het een robuust systeem biedt voor het bestuderen van deze interacties op het worteloppervlak, terwijl het ook aanpasbaar is aan de groei voorkeuren van verschillende bacteriën. Plant biologie Labs voeren vaak plantaardige kolonisatie experimenten uit op massieve agar, waardoor alleen planaire beweging (als dat) van bacteriën mogelijk is, terwijl ook de mogelijk destructieve manipulatie van planten tijdens de daaropvolgende overdracht nodig is. Microbiologie Labs daarentegen hebben vaak de gezondheid van de bacteriën in hun experimenten geprioriteerde, ten koste van de planten14,15. Deze verschillende prioriteiten van de plant-en microbiologie-gerichte laboratoria hebben het historisch moeilijk gemaakt om de resultaten tussen deze groepen te vergelijken, omdat elk de experimentele omstandigheden optimaliseert om hun organisme van belang15te optimaliseren. Het floating-mesh-plant-growth-systeem dat hier wordt beschreven, voorkomt volledige plant onderdompeling, een opmerkelijk voordeel van eerdere microbiologie georiënteerde studies, terwijl het ook tijdelijk de groei en overleving van bacteriën optimaliseert om de kolonisatie te vergemakkelijken. De test die we hier presenteren, kan dus betrekking hebben op de bezorgdheid van beide planten biologen (over overmatige hydratatie en tactiele manipulatie van de plant), terwijl ze voldoen aan de criteria van microbiologen (waardoor verschillende bacteriële groeiomstandigheden en meerdere interacties van soorten)7. Dit protocol is ontworpen om te worden aangepast voor gebruik met verschillende bacteriën, planten en omgevingscondities.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: de experimentele Setup wordt beschreven voor duidelijkheid en gebruikt voor het genereren van de representatieve resultaten die zijn opgenomen in dit rapport, maar de voorwaarden kunnen worden gewijzigd zoals gewenst. Alle stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van PBM en na institutionele en federale reccomendations voor de veiligheid, volgens de BSL status van de gebruikte bacteriën.
1. karakterisering van bacteriën
- Bepaal de morfologie van bacteriën op het groeimedium agar plaat. Respendeer cellen bij een geschatte OD600 = 0,5 en plaat een volume van 1 μL op een agar-medium naar keuze. Voeg X-gal toe aan agar-platen tot een uiteindelijke concentratie van 20 mg/mL om individuele leden van de specifieke bacteriële Gemeenschap beter te onderscheiden. Groei bij 24 °C of 30 °C tot kolonies vorm, neem dan foto's van en notities over de morfologie van de kolonie.
- Definieer de correlatie tussen de optische dichtheid van elke bacteriestam en het aantal CFU (kolonie vormende eenheden) per mL16. Resuspendeer bacteriën in 1 mL water in een 24-put plaat tot een geschatte OD600 = 5, Voer twee-voudige seriële verdunningen, monitor od600 van alle verdunningen en plaat elk om de levensvatbare kve/ml in elk monster te bepalen op meerdere optische dichtheden.
- Bepaal de maximale ultrasoonapparaattolerantie voor elke bacteriestam. Om dit te doen, aliquot cellen in een 24-put met vloeibare medium, het reserveren van sommige cellen als een niet-gesoniceerde controlemonster. Gebruik een ultrasonicator met een 24-Tip hoorn bevestiging, breng drie rondes van 12 s van sonicatie aan op 40 amp met 2 s pulsen.
Opmerking: het gebruik van een 24-goed ultrasonicator wordt geadviseerd om de downstream multiplexing van de verwerking plant monsters te vergemakkelijken, maar als een niet beschikbaar is, gebruik een ultrasonicator uitgerust met een microtip en voer elke sample sonicatie onafhankelijk. Draag altijd oorkappen die zijn geclassificeerd als minimaal 25 NRR-bescherming. - Voer 10-voudige seriële verdunningen van de gesoniceerde en ongesoniceerde monsters uit en spot op agar-platen. Bepaal of er een afname van levensvatbare cellen na sonicatie is. Als dat zo is, gebruik dan een nieuw monster en herhaal sonicatie stap met een gereduceerde totale ultrasoonapparaattijd of amplitude totdat de behandeling geen effect heeft op de uiteindelijke CFU/mL17.
2. bereiding van Arabidopsis thaliana zaailingen op een kunststof gaas
- Maak schijven van het plastic gaas met behulp van een standaard perforator.
- Verzamel de schijven in een glazen container met een losse afdekking van aluminiumfolie, en steriliseren met behulp van een autoclaaf ingesteld op een 20 min droge cyclus13.
- Gebruik vlamgesteriliseerde pincet en verdeel ongeveer 40 gesteriliseerde mesh-schijven in een enkele laag over het oppervlak van een plant-growth-medium agar-plaat. Gebruik 0,5 x Murashige en Skoog (MS) zouten, bevattende 500 mg/L MES buffer [2-(N-morpholino) ethanesulfoninezuur] en 1,5% Bacto agar, als plantengroei medium, met 50 μg/mL benomyl toegevoegd aan de limiet schimmel besmetting van de kiemplanten.
- Bereid Axenische zaden van A. thaliana zoals eerder beschreven17.
- Plaats ongeveer 100 – 300 zaden elk in afzonderlijke centrifugebuizen in een rek en plaats in een hersluitbaar glas of zware plastic container ("JAR") in een rook afzuigkap.
- Gebruik voorzichtig een bekerglas van 100 mL bleekwater in de pot, voeg 3 mL geconcentreerde HCl toe aan het bleekwater en sluit de pot onmiddellijk af en laat de dampen de zaden steriliseren gedurende ten minste 4 uur.
- Verwijder voorzichtig de buisjes van gesteriliseerde zaden van onder de pot en de afdichting.
- Plaats twee zaden in het midden van elk gaas. Afdichtings platen met chirurgische tape en incuberen gedurende 2 – 6 dagen bij 4 °C in de duisternis om zaden te vernaliseren.
- Om kiemplanten te ontkiemen en te kweken, plaatst u de plaat agar-zijde naar beneden in een plantengroei kamer voor 8 – 10 dagen onder korte daginstellingen: 9 h licht bij 21 °C en 15 uur donker bij 18 °C (Figuur 1, stap 2).
3. kolonisatie van planten in vloeibare bacteriegroei medium
- Voeg 1 mL bacteriegroei medium toe aan elk putje van een steriele 24-Wells plaat, met uitzondering van alleen media-controle putten. Gebruik Lennox Luria Bouillon (10 g Tryptone, 5 g gistextract, 5 g NaCl) als het bacteriegroei medium.
- Breng de gekierde zaailingen in gaas van agar-platen naar de vloeistof over (Figuur 1, stap 3a).
- Pel het gaas met twee gekiende zaailingen voorzichtig van de agar plaat met behulp van een met vlam gesteriliseerde Tang. Kies mesh met even grote en onbeschadigde zaailingen.
- Als het verwijderen uit de agar niet glad is, gooi dat net en plant dan weg. Breng een vlotter naar elke put van bacteriële groei vloeistof, wortel zijde naar beneden.
- Inoculeren bacteriën in putten met zwevende zaailingen.
- Respendeer bacteriën die 's nachts worden gekweekt op agar-platen tot een OD600 overeenkomend met 108 kve/ml in de bacteriegroei mediumvloeistof. Voeg 10 μL bacteriële suspensie toe aan elk goed voor een uiteindelijke concentratie van 106 CFU-bacteriën per put.
- Als de bereiding van een mengsel van bacteriën, hervatten elk aan de OD600 equivalent aan 108 CFU/ml, Meng in gelijke verhoudingen, en voeg 10 μL van de laatste mix per put van vloeistof.
- Verzegel de plaat voor steriele groei. Zonder de kleefzijde aan te raken, druk de gasdoorlatbare film voorzichtig over de plaat. Zorg ervoor dat elke put individueel is verzegeld door de druk rond elk van de ringen gemaakt door de putjes toe te passen. Vervang het plastic deksel van de plaat over de plaat en de gasdoorlatbare film (Figuur 1, stap 3b).
- Inbroed de platen voor 18 h in een plantengroei kamer, onder dezelfde omstandigheden als de zaailingen oorspronkelijk ontkiemen, behalve op een orbitale plaat Shaker ingesteld op 220 rpm.
4. instandhouding van bacteriële kolonisatie
- Om alle drijvers (planten op gaas) te spoelen, voeg 1 mL steriel water toe aan putjes van een nieuwe 24-Wells plaat. Verwijder gasdoorlatbare folie. Met behulp van steriele Tang, drijvers naar putten met water (Figuur 1, stap 4a). Afspoelen door 10 min. bij kamertemperatuur (RT) te rusten zonder roeren.
Opmerking: om te bepalen bacteriële kolonisatie efficiëntie van wortels in plaats van hun vermogen om kolonisatie te handhaven na verloop van tijd, planten kunnen worden geofferd in deze stap door ze rechtstreeks naar stap 5,1. - Vul de putjes van een nieuwe 24-putplaat met 1 mL plantengroei medium. Breng een mesh over naar elke put. Afdekking met een gasdoorlatbare afdichting en incuberen voor 72 u op de orbitale plaat Shaker bij 220 rpm in de plantengroei kamer (Figuur 1, stap 4b).
- Herhaal het spoelen zoals uitgevoerd in stap 4,1 met drijvers na de incubatieperiode van 72 uur.
5. inzameling van bacteriën voor levensvatbare celtellingen
Opmerking: het aantal bacteriën per kiem wortel kan worden bepaald op elk incubatietijd punt. De kolonisatie kan tussen 0 uur en 18 uur worden bewaakt, terwijl het onderhoud vanaf 18 uur kan worden bewaakt. Planten die bestemd zijn voorbeeld vorming kunnen rechtstreeks overgaan tot sectie 6.
- Verwijder de zaailingen van het gaas (Figuur 1, stap 5). Plaats de vlam gesteriliseerde pincet voorzichtig onder de bladeren (maar aan de bladzijde van het gaas) en Knijp zachtjes in de steel. Beweeg de zaailingen omhoog en weg van het gaas om de wortel af te breken zonder deze te verbreken. Als de wortel breekt, schrag dan zachtjes de onderkant van het gaas om de volledige lengte te verzamelen.
- Verwijder bacteriën uit planten wortels. Breng de bacteriën over in putjes van een 24-putplaat met 1 mL ddH20. Sonicate de monsters zoals beschreven in stap 1,3.
Opmerking: Zoek met behulp van een Microscoop naar eventuele overgebleven bacteriën op het worteloppervlak op een gesoniceerd monster. Als bacteriën blijven, Verhoog de totale ultrasoonapparaattijd of intensiteit totdat er geen bacteriën gebonden blijven, tot het hoogste niveau van sonicatie die geen invloed heeft op levensvatbare celtellingen zoals bepaald in sectie 1. - Kwantificeer de bacteriën op wortels.
- Voer seriële 10-voudige verdunningen van de gesoniceerde monsters uit tot een 10-6 verdunning in het bacteriële groeimedium. Voeg 50 μL van elke verdunning toe aan afzonderlijke agar-platen en verdeel met steriele glas parels (of bacteriële strooier). Incuberen de platen op de optimale temperatuur voor bacteriën totdat de afzonderlijke kolonies aftelbaar zijn.
- Eenmaal onderscheidbaar, Tel het aantal van elke kolonie morfologie (zoals bepaald in sectie 1), en bereken CFU van elke bacteriesoort per zaailing. Gooi eventuele monsters met verontreiniging weg, aangezien verontreiniging tijdens de kolonisatie of het onderhoud de aanwezigheid van bacteriën kan aantasten.
6. verzameling van intacte plantwortels voor microscopie
- Met behulp van een tang, verwijder de zaailingen van mesh zoals in rubriek 5.
- Breng elke plant over naar Microscoop-dia's.
- Plaats de punt van de wortel op de dia en sleep weg van de tip om de shoot down flush met de dia, zorgen voor een rechtgetrokken wortel voor de beste beeldvorming. Voeg een druppel water of steriel plantengroei medium toe aan de monsters om de interfaces tussen de afdekplaten en dia's te hydrateren.
- Plaats een glazen afdekplaat net boven de wortel kroon (bovenste boxed regio in Figuur 1) en onder de schiet bladeren om te voorkomen dat de dekslip scheert (om wortel kroon beeldvorming mogelijk te maken) en druk zachtjes op17.
- Bij het gebruik van fluorescerende bacteriën, afbeelding met behulp van geschikte excitatie/emissie filters om te differentiëren bacteriën van elkaar en de plant wortel18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De goed gekarakteriseerde PGPB P. simiae WCS417r staat erom bekend de wortels van A. thaliana te koloniseren in de hydroponische cultuur. Deze natuurlijk fluorescerende bacterie kan gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van microscopie op de wortels van zaailingen na kolonisatie (Figuur 2). Hoewel het mogelijk is om de volledige lengte van deze A. thaliana zaailingen ' (4 – 6 mm lengte) wortels te maken, zou dit voor veel planten een prohibitieve hoeveelheid tijd in beslag nemen. Omdat de meeste variatie tussentijd punten en soorten bacteriën kunnen worden vastgelegd door de kroon, het midden en de punt van de wortel14 (aangegeven door rode dozen in Figuur 1), werden deze regio's geprioriteerde voor imaging in plaats van volledige root van Imaging Lengtes. In de helder-veld beelden van P. simiae-gekoloniseerd A. thaliana wortels (Figuur 2), is het mogelijk om de omtrek van de wortels en wortelharen te visualiseren; echter, bij 18 h van de kolonisatie, is het niet mogelijk om de gekoloniseerde versus niet-gekoloniseerde wortels duidelijk te onderscheiden met behulp van helder-veld beelden. Terwijl P. simiae auto fluorescentie weergeeft, gebruikten we een stam die ook is ontwikkeld om een geel fluorescerende proteïne (yfp)19 uit te drukken met een excitatie/emissie golflengte van 490-510/520-550 nm18. Een vergroting van 100x was voldoende om individuele en kleine aggregaten van P. simiae -cellen duidelijk te identificeren op een. thaliana -wortels. Zoals weergegeven in Figuur 2, kunnen laboratoria met toegang tot hoge-resolutie confocale microscopen of goedkopere tafel-microscopen zowel de aanwezigheid als de verdeling van bacteriën in de wortel visualiseren.
Hoewel informatief in termen van ruimtelijke distributie, zijn microscopie beelden niet goed geschikt voor de kwantificering van bacteriële cellen. We hebben dus bacteriën verzameld van het oppervlak van wortels met behulp van ultrasone trillingen zoals eerder beschreven en gevalideerd9,20. Drie rondes van 12 s van ultrasone trillingen21 met een amplitude van 40 waren voldoende om het buitenoppervlak van de wortel zaailingen te verstoren (aanvullend figuur 1) en alle bacteriën te verwijderen, terwijl de bacteriële levensvatbaarheid niet wordt beïnvloed. Sonicatie werd gebruikt in plaats van kraal-kloppende methoden9 om dispertie van bacteriële aggregaten/biofilms beter te bevorderen. Het kwantificeren van CFU/wortel na 18 h van de kolonisatie en een extra 72 h van onderhoud toonde aan dat P. simiae beide koloniseren en wordt gehandhaafd op de wortels van A. thaliana in onze Hydroponic, drijvend zaailing systeem (Figuur 3). Het aantal CFU/zaailing op beide tijdspunten vertoonde een goede reproduceerbaarheid tussen biologische replicaten die op verschillende dagen werden uitgevoerd (Figuur 3). De waargenomen variatie is gebruikelijk bij de wortel kolonisatie assays22 en is waarschijnlijk te wijten aan kleine variaties van timing, omgevingscondities, of plant wortel grootte, zelfs tussen zaailingen ontkierd op hetzelfde moment en geselecteerd om te worden vergelijkbaar in grootte. We observeren een toename van het aantal KVE/zaailing na 72 h in het onderhouds medium in vergelijking met de aantallen die zijn waargenomen bij de post-kolonisatie 18 uur tijdpunt (Figuur 3). Dit geeft aan dat de actieve groei van de gekoloniseerde bacteriën op de wortel van de plant is opgetreden tijdens de onderhoudsfase.
Naast het nut van deze hydroponische assay om individuele bacteriële kolonisatie en onderhoud te kwantificeren, is het ook van toepassing op het monitoren van de vereniging van meerdere soorten op planten wortels. Om dit te demonstreren, werden drie soorten bacteriën geïsoleerd uit A. thaliana geteeld in natuurlijke bodem onder laboratoriumomstandigheden gekozen20. De isolaten waren stammen van Arthrobacter nicotinovoranen, microbacterium oleivorans en curtobacterium oceanosedimentum23. Deze vereenvoudigde Gemeenschap werd gekozen als gevolg van het vermogen van deze soorten om naast elkaar te bestaan in vloeibare bacteriële groeimedia in schud cultuur (niet-gepubliceerde gegevens). Bovendien kunnen deze drie soorten duidelijk worden gedifferentieerd op media met X-gal als gevolg van verschillen in kolonie morfologie en kleur (figuur 4a). De X-gal heeft geen invloed op de relatieve groei van een van deze bacteriesoorten (niet-gepubliceerde gegevens). Deze verschillen in morfologie en kolonie verschijning op X-gal lieten ons toe om de kve/zaailing van elke soort te tellen zonder antibiotica selectie, zelfs in multi-species cocultuur.
A. nicotinovoranen, M. oleivorans en C. oceanosedimentum werden allemaal gekoloniseerd en gehandhaafd op de wortel, alleen of in bacteriële Cocultuur (figuur 4b). Elke soort toonde trends die vergelijkbaar waren over verschillende biologische en technische replicaten, zelfs binnen gemengde Gemeenschappen. Hieruit blijkt dat het assay-protocol kan worden gebruikt om zowel de relatieve als de totale kve/wortel van elke soort te meten. Interessant, wanneer alleen geteeld, geen enkele individuele soorten toonde een merkbaar toename van de overvloed tijdens de onderhoudsfase, maar de algehele kve/wortel van de gecombineerde Gemeenschap toegenomen in coculturen, waaruit blijkt dat deze bacteriën niet verbieden de kolonisatie van de andere stammen.
Voor alle experimenten, planten geteeld in vloeibare media zonder toevoeging van bacteriën als negatieve controles waren altijd opgenomen. Geen bacteriën waren zichtbaar op deze controle wortels tijdens microscopie (Figuur 2), noch werden bacteriën gedetecteerd via plating voor CFU (niet-gepubliceerde gegevens). Dit geeft aan dat sterilisatie van zaden en het gebruik van de steriele technieken tijdens deze test voldoende waren om planten Axenische te houden tenzij ze opzettelijk gekoloniseerd werden.
Figuur 1: bepaling voor bacteriële kolonisatie en onderhoud op een. thaliana -wortels. A. thaliana zaailingen geteeld op gesteriliseerd plastic gaas werden overgebracht naar een groeimedium geoptimaliseerd voor bacteriën [hier, 0,1 x lb (Luria Broth) Lennox]. Bacteriën koloniseerde vervolgens de wortel over 18 h terwijl de plant zwekte in schudden vloeistof. Na een spoeling werd de gekoloniseerde vlotter overgebracht naar een groeimedium dat is geoptimaliseerd voor planten (0,5 x MS + MES) voor 72 h om te testen op het onderhoud van bacteriën op de wortels. De vlotter werd vervolgens gespoeld en de plant met eventuele bijgevoegde microben werd verwijderd voor analyse (kwantificering van kve/zaailing of beeldvorming door microscopie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: visualisering van P. simiae kolonisatie van wortels met fluorescerende microscopie. P. simiae (false-gekleurd groen) gekoloniseerd A. thaliana wortels en werd gehandhaafd op de wortel na overdracht naar plant-groeimedium. De wortel kroon (links), de middelste lengte (midden) en de punt (rechts) bij een vergroting van 40x worden weergegeven in de gebieden die zijn aangegeven in Figuur 1. De bovenste twee rijen tonen de helder-veld en fluorescerende beelden van wortels gekoloniseerd door P. simiae (imaged door epifluorescerende microscopie). Dezelfde wortels werden ook gefotografeerd door een confocale Microscoop (midden twee rijen). De No-bacteriën negatieve controle in de twee onderste rijen toonde geen kolonisatie. Schaal staven vertegenwoordigen 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: kwantificering van P. simiae op A. thaliana wortels. Totaal aantal P. simiae levensvatbare cellen hersteld per A. thaliana zaailing na 18 h van de kolonisatie of 72 h van onderhoud. Drie individuele biologische replicaten worden getoond, elk met drie technische duplo's van twee zaailingen per vlotter. De getoonde cijfers zijn de middelen van de technische replicaten, terwijl staven standaardfouten van de middelen vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: kwantificering van de kolonisatie en het onderhoud van een gemengde bacterie Gemeenschap op de wortels van a. thaliana . A ) kolonies van A. Nicotinovorans, M. oleivorans en C. oceanosedimentum kunnen worden gedifferentieerd op X-gal-bevattende agar-medium door kolonie morfologie en kleur. B) de wortels van tien dagen oude zaailingen werden geënt met ongeveer 3x105 kve/ml van elk van de drie stammen. Aangetoond zijn totale kve/zaailing van elke soort na 18 h van de kolonisatie of 72 h van onderhoud wanneer gekoloniseerd hetzij alleen of in een drie-lid bacteriële Gemeenschap. Twee biologische replicaten, elk bestaande uit twee technische duplo's van twee zaailingen per vlotter, worden weergegeven. De getoonde cijfers zijn de middelen van de twee technische duplo's, terwijl staven standaardfouten van de middelen vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: met ultrasone trillingen verstoort het worteloppervlak. Om bacteriën uit het oppervlak van de wortel te Verdoe-den, werden hele planten gesoniceerd, en de bacteriën werden in de vloeistof gebracht, die sereen werd verdund en verguld voor de kwantificering van kve/zaailing. A) een intacte zaailing is (B) structureel verstoord na met ultrasone trillingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Planten in alle omgevingen communiceren met duizenden tot miljoenen verschillende bacteriën en schimmels,5,7. Deze interacties kunnen een negatieve en positieve invloed hebben op de gezondheid van de plant, met potentiële effecten op gewasopbrengst en voedselproductie. Recent werk suggereert ook dat een variabele kolonisatie van gewassen door PGPBs kan duiden op onvoorspelbare plantgrootte en gewasopbrengst in veldproeven22. Het begrijpen van de mechanismen achter deze interacties kunnen ons toelaten om de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen rechtstreeks te manipuleren om te helpen bij een gezonde plantontwikkeling, zelfs onder stress24.
Omdat bacteriële kolonisatie van wortels en hun onderhoud in de rizosfeer is van cruciaal belang voor de Plant-microbe interacties9, we wilden een systeem te bouwen om reproduceerbare visualisering en kwantificeren van deze bacteriële gedragingen. Dit hydroponische, zwevende zaailing groei systeem zorgt voor microscopische beeldvorming en kwantificering van bacteriële populaties op de wortels van A. thaliana.
De beschreven Plant-microbe interaction assay integreert gunstige elementen van bestaande experimentele protocollen. De zwevende mesh-methode was gebaseerd op die van Haney et al.13, die de initiële kolonisatie van P. simiae WCS417r op statische, drijvende A. thaliana zaailingen afgemeten. Bij de evaluatie van dit systeem werd de sterke kolonisatie van A. thaliana roots door P. simiae gevalideerd, hoewel een ander groeimedium van Haney et al. werd gebruikt en omvatte orbitaal schudden tijdens de kolonisatie. De opneming van orbitaal schudden tijdens zowel kolonisatie en onderhoud vergemakkelijkt bacteriële interacties die mogelijk niet voorkomen in statische cultuur, evenals het verminderen van anoxische voorwaarden die zowel bacteriële groei en plant wortel gezondheid kunnen remmen13. We integreerden ook aspecten van microbiologie-gerichte protocollen ter ondersteuning van de plant wortel kolonisatie door verschillende bacteriesoorten8,15,25. Dit omvatte een cruciale Transfer stap uit het medium geoptimaliseerd voor bacteriële kolonisatie en in een medium dat is geoptimaliseerd voor plantengroei. Deze overdracht naar Fresh medium zal ook toelaten dat de mechanismen die ten grondslag liggen aan bacterieel onderhoud aan wortels worden aangepakt, een aanpak die inzicht kan geven in het grillige onderhoud van PGPB in veldproeven6.
Deze test werd geoptimaliseerd voor een snelle verwerking van meerdere monsters, zodat omgevingsvariabelen en gemengde bacteriële gemeenschappen kunnen worden getest binnen één Multi-well biologisch replicaat. Terwijl met ultrasone trillingen eerder is aangetoond dat ze voldoende zijn voor verstoring en verzameling van rizosfeer-bacteriën, de 24-goed plaat en de multi-Prong Horn-bijlage versnelt de monsterverwerking. Deze methode voor de berekening van de levensvatbaarheid van cellen voor het kwantificeren van bacteriële aanwezigheid kan worden aangevuld met, of uitgebreid met, qPCR of MiSeq 16S rRNA Gene Gemeenschap profilering om de relatieve overvloed van meer diverse gemeenschappen van koloniserende bacteriën te bepalen 20. Bovendien, tijdens de beeldvorming, het nut van de focus op slechts drie regio's van elke plant wortel te versnellen de visualisatie van bacteriële aanwezigheid en lokalisatie op de wortels is gemarkeerd. De kolonisatie van deze verschillende wortel gebieden is aangetoond dat ze verschillen tussen bacteriesoorten14. Beeldvorming kan worden uitgevoerd met natuurlijk autofluorescerende bacteriën of genetisch Tractable bacteriën die zijn ontworpen om een fluorescerende proteïne uit te drukken.
De hier beschreven methodologie zorgt voor een snelle en reproduceerbare evaluatie van de wortel kolonisatie door PGPB bacteriën, maar er zijn beperkingen aan de conclusies die kunnen worden getrokken uit deze experimenten. Bijvoorbeeld, het vermogen voor bacteriën om chemotax naar de wortel is bekend dat belangrijk voor veel bacteriële soorten ' kolonisatie van planten wortels, maar dit proces kan niet vereist binnen dit schudden inoculatie systeem. Dat gezegd hebbende, voor studies die specifiek geïnteresseerd zijn in chemotaxis, kon de kolonisatie stap worden uitgevoerd in statische vloeistof cultuur of op het oppervlak van een zacht agar-medium, waar bacteriën ver van de plant konden worden geplateerd, waardoor ze actief naar de Root. Bovendien, een relatief rijke groeimedium tijdens de kolonisatie werd gebruikt ter bevordering van bacteriële groei en planten gehechtheid; deze relatief hoge concentraties van nutriënten kunnen echter het onderzoek van het bacteriële gebruik van of de concurrentie voor plantaardige koolstof tijdens de kolonisatie verbieden. Opnieuw, afhankelijk van de groei-eisen van de bacteriën worden bestudeerd, de kolonisatie medium kan worden gevarieerd om het beste passen bij de specifieke onderzoeksvragen van specifieke onderzoekers.
Dit systeem is ontworpen om gemakkelijk te kunnen worden vatbaar voor verschillende bacteriële en plantaardige groeiomstandigheden en voor de toevoeging van verschillende milieustressoren en tijdpunten. De hier beschreven methoden zijn echter het meest geschikt voor het meten van bacteriële interacties met de wortels van A. thaliana zaailingen. Collectie is geoptimaliseerd voor deze plant, en grotere of meer gevoelige planten kunnen hardnekloos zijn in het zwevende multi-well-plate systeem. Ten slotte, terwijl de bacteriën van belang gebruikt hier koloniseren de wortel van de plant in vloeibare cultuur, voor andere bacteriën kan het nodig zijn om de wortels van de plant te enten door middel van DIP-inoculatie of plating op een solide agar medium plaats19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door onderzoeksfondsen van het departement energie-biologisch en milieu onderzoek (DOE-BER 0000217519 tot E.A.S.), de National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 tot E. A. S). SLH werd ook gesteund door het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. We danken Dr. Jeffery Dangl voor het verstrekken van bacteriële stammen en waardevol inzicht. We danken Dr. Andrew klein en Matthew J. Powers voor experimentele suggesties. Ten slotte wil SLH connecties op sociale media bedanken om ons eraan te herinneren dat het verspreiden van wetenschap een voor recht en een verantwoordelijkheid is, vooral via creatieve en toegankelijke middelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
