Summary
Qui descriviamo un test di crescita delle piante idroponica per quantificare la presenza delle specie e visualizzare la distribuzione spaziale dei batteri durante la colonizzazione iniziale delle radici delle piante e dopo il loro trasferimento in diversi ambienti di crescita.
Abstract
I batteri formano microbiomi di rizosfera complessi modellati da microbi interagenti, organismi più grandi e l'ambiente abiotico. In condizioni di laboratorio, la colonizzazione della rizosfera da batteri che promuovono la crescita delle piante (PGPB) può aumentare la salute o lo sviluppo di piante ospiti rispetto alle piante non colonizzate. Tuttavia, nelle impostazioni di campo, i trattamenti batterici con PGPB spesso non forniscono benefici sostanziali alle colture. Una spiegazione è che questo può essere dovuto alla perdita del PGPB durante le interazioni con microbi del suolo endogeni durante la durata della vita della pianta. Questa possibilità è stata difficile da confermare, dal momento che la maggior parte degli studi si concentra noto sulla colonizzazione iniziale piuttosto che sul mantenimento del PGPB all'interno delle comunità di rizosfera. Si ipotizza qui che l'assemblaggio, la coesistenza e il mantenimento delle comunità batteriche siano modellati da caratteristiche deterministiche del microambiente di rizosfera, e che queste interazioni possano influenzare la sopravvivenza di PGPB in ambienti nativi. Per studiare questi comportamenti, un saggio idroponico della crescita vegetale è ottimizzato utilizzando l'Arabidopsis thaliana per quantificare e visualizzare la distribuzione spaziale dei batteri durante la colonizzazione iniziale delle radici delle piante e dopo il trasferimento a una crescita diversa Ambienti. La riproducibilità e l'utilità di questo sistema vengono quindi convalidate con la ben studiata PGPB Pseudomonas simiae. Per studiare come la presenza di più specie batteriche può influenzare la colonizzazione e la dinamica di manutenzione sulla radice della pianta, una comunità modello da tre ceppi batterici (un Arthrobacter, Curtobacterium, e Microbacterium specie) originariamente isolata dalla rizosfera A. thaliana. È dimostrato che la presenza di queste diverse specie batteriche può essere misurata utilizzando questo saggio idroponico di pianta-maintanence, che fornisce un'alternativa agli studi della comunità batterica basata sul sequenziamento. Studi futuri che utilizzano questo sistema possono migliorare la comprensione del comportamento batterico nei microbiomi vegetali multispecie nel tempo e nelle mutevoli condizioni ambientali.
Introduction
La distruzione delle colture da malattie batteriche e fungine comporta una riduzione della produzione alimentare e può interrompere gravemente la stabilità globale1. Sulla base della scoperta che i microbi nei suoli soppressivi sono responsabili dell'aumento della salute delle piante2,gli scienziati hanno chiesto se il microbioma vegetale possa essere sfruttato per sostenere la crescita delle piante modificando la presenza e l'abbondanza di particolari specie batteriche3. I batteri trovati per aiutare nella crescita o nello sviluppo delle piante sono collettivamente rilegati ai batteri che promuovono la crescita delle piante (PGPB). Più recentemente, gli studi sono passati dalla semplice identificazione di potenziali PGPB alla comprensione di come le interazioni interkingdome nel suolo, intorno alle radici o nella rizosfera (l'area che circonda direttamente e comprende la superficie della radice) possono avere un impatto pgPB attività4.
La colonizzazione della rizosfera da parte del PGPB può aumentare la salute o lo sviluppo di piante ospiti in risposta a diversi fattori di stress rispetto alle piante non colonizzate5. Tuttavia, i risultati sono spesso più variabili nelle condizioni del suolo nativo rispetto a quelli osservati nelle impostazioni strettamente controllate della serra e del laboratorio6. Un'ipotesi per questa differenza è che la crescita o il comportamento di PGPB può essere inibito da batteri del suolo nativo o funghi nei campi7,8. Gli effetti benefici dei batteri di rizosfera dipendono generalmente dalla capacità dei batteri a 1) individuare e spostarsi verso la radice, 2) colonizzare la radice attraverso la formazione di biofilm e 3) interagire con la pianta o gli agenti patogeni ospiti attraverso la produzione di piccole molecole metaboliti7,9. Ognuno di questi comportamenti di colonizzazione può essere influenzato dalla presenza e dall'attività dei microbi vicini10.
Abbiamo progettato un sistema per quantificare e visualizzare queste distinte fasi di colonizzazione batterica della rizosfera (Figura 1). Questo approccio faciliterà gli studi sul motivo per cui la manutenzione PGPB a lungo termine non viene talvolta osservata dopo il trasferimento di piante in nuovi ambienti, ad esempio durante la semina di piantine pre-inocupate. Arabidopsis thaliana come sono stati scelti come un modello vegetale a causa del suo ampio uso in studi di laboratorio, nonché gli ampi dati disponibili sulle sue interazioni microbiche11. Ci sono tre fasi nel sistema: 1) A. thaliana crescita, 2) colonizzazione batterica, e 3) la manutenzione batterica (vedi Figura 1). Poiché A. thaliana è una pianta terrestre, era importante assicurarsi che non soffrisse indebitamente lo stress idrico nel sistema idroponico12. Ispirate ai metodi utilizzati da Haney et al.13, le piantine vengono coltivate su rete di plastica per separare il tiro dal mezzo di crescita liquido. Questo sistema non sembra compromettere la salute e lo sviluppo dell'ospite della pianta, e migliora la crescita di A. thaliana nel liquido11. Come il germoglio pianta galleggia sopra la superficie, le radici sono completamente esposti alla colonizzazione da batteri inoculati nel mezzo di crescita batterica liquida. Questo permette ai batteri di interesse di essere esaminati per la colonizzazione in sostanze nutritive che sono più favorevoli alla crescita, mentre poi spostando le condizioni per consentire alla pianta di continuare a crescere in un mezzo nutritivo progettato per sostenere la sua crescita. Entrambe le fasi includono agitazione costante per prevenire l'anossia della radice13. I batteri possono essere visualizzati o quantificati dalle radici delle piante dopo il trasferimento dal mezzo di colonizzazione o dal mezzo di manutenzione. Questo sistema idroponico è molto flessibile, consentendo di modificare facilmente le condizioni sperimentali e le sollecitazioni applicate a seconda degli interessi dei ricercatori.
Questo metodo descritto è importante nel contesto della più ampia letteratura sulle interazioni pianta-microbo perché fornisce un sistema robusto per studiare queste interazioni sulla superficie della radice, pur essendo personalizzabile alle preferenze di crescita di batteri diversi. I laboratori di biologia vegetale spesso eseguono esperimenti di colonizzazione pianta-microbo su agar solido, consentendo solo il movimento planare (se questo) di batteri, richiedendo anche la manipolazione potenzialmente distruttiva delle piante durante il successivo trasferimento. Al contrario, i laboratori di microbiologia hanno spesso dato priorità alla salute dei batteri all'interno dei loro esperimenti, a scapito delle piante14,15. Queste diverse priorità dei laboratori incentrati sulle piante e la microbiologia hanno storicamente reso storicamente difficile confrontare i risultati tra questi gruppi, poiché ognuno in genere ottimizza le condizioni sperimentali per ottimizzare il loro organismo di interesse15. Il sistema di crescita delle piante a maglie galleggianti descritto qui previene l'immersione totale delle piante, un notevole vantaggio per i precedenti studi orientati alla microbiologia, ottimizzando anche temporaneamente la crescita e la sopravvivenza dei batteri per facilitare la colonizzazione. Così, il test che presentiamo qui può affrontare le preoccupazioni sia dei biologi delle piante (circa l'eccessiva idratazione e la manipolazione tattile della pianta) soddisfacendo i criteri dei microbiologi (consentendo diverse condizioni di crescita batterica e molteplici interazioni delle specie)7. Questo protocollo è progettato per essere adattabile per l'uso con vari batteri, piante e condizioni ambientali.
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Protocol
NOTA: la configurazione sperimentale viene descritta per chiarezza e utilizzata per generare i risultati rappresentativi inclusi in questo report, ma le condizioni possono essere modificate come desiderato. Tutte le misure devono essere eseguite utilizzando PPE e seguendo le ricattie istituzionali e federali per la sicurezza, secondo lo stato BSL dei batteri utilizzati.
1. Caratterizzazione dei batteri
- Determinare la morfologia dei batteri sulla piastra di agar medio di crescita. Risospendere le celle a un valore approssimativo Di OD600 - 0,5 e placcare un volume di 1 ll sul mezzo di agar di scelta. Aggiungere X-gal alle piastre di agar ad una concentrazione finale di 20 mg/mL per differenziare meglio i singoli membri della specifica comunità batterica. Coltivare a 24 o 30 gradi centigradi fino a formare colonie, quindi scattare foto e note sulla morfologia della colonia.
- Definire la correlazione tra la densità ottica di ogni ceppo batterico e il numero di CFU (unità formanti colonia) per mL16. Risospendere i batteri in 1 mL di acqua in una piastra di 24 pozze a un approssimativo OD600 x 5, eseguire diluizioni seriali bi-piegate, monitorare OD600 di tutte le diluizioni e piastra ciascuna per determinare la CFU/mL praticabile in ogni campione a più densità ottiche.
- Determinare la tolleranza massima di sonicazione per ogni ceppo batterico. Per fare questo, aliquota cellule in una piastra 24-po 'contenente mezzo liquido, riservando alcune cellule come un campione di controllo non sonoro. Utilizzando un ultrasonicatore con un attacco a clacson a 24 punta, applicare tre giri di sonicazione a 40 amplificatore con impulsi 2 s.
NOTA: Si consiglia l'uso di un ultrasonica 24-well per facilitare il multiplexing a valle dei campioni dell'impianto di lavorazione, ma se non disponibile, utilizzare un ultrasonicatore dotato di un microtip ed eseguire ogni sonicazione campione in modo indipendente. Indossare sempre le braccia con classificazione ad almeno 25 protezione NRR. - Eseguire diluizioni seriali di 10 volte dei campioni sonicati e non sonicati e individuare sulle piastre di agar. Determinare se c'è una riduzione delle cellule vitali dopo la sonicazione. In tal caso, utilizzare un campione fresco e ripetere la fase di sonicazione utilizzando un tempo di sonicazione totale ridotto o un'ampiezza fino a quando il trattamento non ha alcun effetto sulla finale CFU/mL17.
2. Preparazione delle piantine di talidopsis thaliana su una rete di plastica
- Creare dischi della rete di plastica utilizzando un perforatore standard.
- Raccogliere i dischi in un contenitore di vetro con una copertura sciolta di foglio di alluminio, e sterilizzare utilizzando un autoclave impostato su un ciclo secco 20 min13.
- Utilizzando pinzette sterilizzate a fiamma, distribuire circa 40 dischi mesh sterilizzati in un unico strato sulla superficie di una piastra di agar medio-crescita vegetale. Utilizzare 0,5 x sali di Murashige e Skoog (MS), contenenti 500 mg/l di MES buffer [2-(N-morpholino)ethanesulnic acid] e 1.5% Bacto agar, come mezzo di crescita vegetale, con 50 g/mL benomyl aggiunti al limite di contaminazione fungina delle piantine.
- Preparare i semi axenic di A. thaliana come descritto in precedenza17.
- Mettere circa 100-300 semi ciascuno in singoli tubi di centrifuga in un rack e metterli in un vetro rissigillo o contenitore di plastica pesante ("jar") in un cappuccio fume.
- Con cautela, mettere un becher di 100 mL di candeggina nel barattolo, aggiungere 3 mL di HCl concentrato alla candeggina, e sigillare immediatamente il barattolo e consentire ai fumi di sterilizzare i semi per almeno 4 h.
- Rimuovere con attenzione i tubi di semi sterilizzati da sotto il vaso e sigillare.
- Posizionare due semi al centro di ogni mesh. Sigillare le lastre con nastro chirurgico e incubare per 2-6 giorni a 4 gradi centigradi al buio per vernalizzare i semi.
- Per germinare e coltivare piantine, posizionare il lato del piatto in una camera di crescita della pianta per 8-10 giorni in brevi impostazioni di giorno: 9 h di luce a 21 gradi centigradi e 15 h di scuro a 18 gradi centigradi (Figura1, passo 2).
3. Colonizzazione delle piante nel mezzo di crescita batterica liquida
- Aggiungere 1 mL di mezzo di crescita batterica a ogni pozzo di una piastra sterile da 24 pozze, fatta eccezione per i pozzi di controllo solo dei media. Utilizzare Lennox Luria Brodo (10 g di tryptone, 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl) come mezzo di crescita batterica.
- Trasferire le piantine germinate incorporate nella rete dalle piastre di agar al liquido (Figura 1, passo 3a).
- Sbucciare delicatamente la rete contenente due piantine germinarate su e giù per la piastra di agar utilizzando pinze sterilizzate dalla fiamma. Scegliere mesh con piantine di dimensioni uguali e non danneggiate.
- Se la rimozione dall'agar non è liscia, scartare quella rete e pianta. Trasferire un galleggiante ad ogni pozzo di liquido di crescita batterica, lato radice verso il basso.
- Inoculare i batteri in pozzi contenenti piantine galleggianti.
- Risospendere i batteri coltivati durante la notte su piastre di agar a un OD600 equivalente a 108 CFU/mL nel liquido medio di crescita batterica. Aggiungete 10 gradi di sospensione batterica ad ogni pozzo per una concentrazione finale di 106 batteri CFU per pozzo.
- Se si prepara un mix di batteri, risospendere ciascuno all'OD600 equivalente a 108 CFU/mL, mescolare in proporzioni uguali e aggiungere 10 l del mix finale per pozzo di liquido.
- Sigillare la piastra per una crescita sterile. Senza toccare il lato appiccicoso, premere con attenzione la pellicola permeabile a gas attraverso la piastra. Assicurarsi che ogni pozzo sia stato sigillato individualmente applicando pressione intorno a ciascuno degli anelli realizzati dai pozze. Sostituire il coperchio di plastica della piastra sopra la piastra e la pellicola permeabile al gas (Figura1, step 3b).
- Incubare le piastre per 18 h in una camera di crescita vegetale, nelle stesse condizioni in cui le piantine sono state originariamente germinate, ad eccezione di uno shaker di placche orbitali impostato a 220 rpm.
4. Manutenzione della colonizzazione batterica
- Per sciacquare tutti i galleggianti (piante su rete), aggiungere 1 mL di acqua sterile ai pozzi di una nuova piastra di 24 pozze. Rimuovere la pellicola permeabile al gas. Utilizzando pinze sterili, trasferimento galleggia su pozzi con acqua (Figura1, passo 4a). Risciacquare riposando per 10 min a temperatura ambiente (RT) senza agitazione.
NOTA: Per determinare l'efficienza di colonizzazione batterica delle radici piuttosto che la loro capacità di mantenere la colonizzazione nel tempo, le piante possono essere sacrificate a questo passaggio portandole direttamente al passo 5.1. - Riempire i pozze di una nuova piastra di 24 pozze con 1 mL di mezzo di crescita vegetale. Trasferire una mesh in ogni pozzo. Coprire con una guarnizione a gas permeabile e incubare per 72 h sullo shaker di piastra orbitale a 220 rpm nella camera di crescita delle piante (Figura 1, passo 4b).
- Ripetere il risciacquo eseguito al punto 4.1 con galleggianti dopo il periodo di incubazione di 72 h.
5. Raccolta di batteri per il numero di cellule vitali
NOTA: Il numero di batteri per radice di piantina può essere determinato in qualsiasi momento di incubazione. La colonizzazione può essere monitorata tra 0 h e 18 h, mentre la manutenzione può essere monitorata da 18 h in poi. Le piante destinate all'imaging possono procedere direttamente alla sezione 6.
- Rimuovere le piantine dalla rete (Figura1, passaggio 5). Posizionare delicatamente le pinze sterilizzate dalla fiamma sotto le foglie (ma sul lato foglia della rete) e pizzicare leggermente il gambo. Muovi le piantine su e giù dalla rete per spostare la radice senza romperla. Se la radice si rompe, raschiare delicatamente il fondo della maglia per raccogliere l'intera lunghezza.
- Rimuovere i batteri dalle radici delle piante. Trasferire i batteri in pozze di una piastra di 24 pozze contenenti 1 mL di ddH20. Sonicare i campioni come descritto nel passaggio 1.3.
NOTA: Utilizzando un microscopio, cercare eventuali batteri rimanenti sulla superficie della radice su un campione sonicato. Se i batteri rimangono, aumentare il tempo totale di sonicazione o intensità fino a quando nessun batterio rimane legato, fino al più alto livello di sonicazione che non influisce sui conteggi delle cellule vitali come determinato nel paragrafo 1. - Quantificare i batteri sulle radici.
- Eseguire diluizioni seriali di 10 volte dei campioni sonicati fino a una diluizione 10-6 nel mezzo di crescita batterica. Aggiungere 50 l di ogni diluizione a singoli placchi di agar e spalmati con perline di vetro sterili (o spalmatore batterico). Incubapi alla temperatura ottimale per i batteri fino a quando le singole colonie non sono numerabili.
- Una volta distinguibile, contare il numero di morfologia di ogni colonia (come determinato nella sezione 1), e calcolare la CFU di ogni specie batterica per piantità. Eliminare eventuali campioni che mostrano contaminazione, poiché la contaminazione durante la colonizzazione o la manutenzione può influire sulla presenza batterica.
6. Raccolta di radici vegetali intatte per la microscopia
- Utilizzando le pinze, rimuovere le piantine dalla mesh come nella sezione 5.
- Trasferire ogni pianta a vetrini al microscopio.
- Posizionare la punta della radice sulla diapositiva e trascinare lontano dalla punta per impostare l'abbattimento a filo con la diapositiva, assicurando una radice raddrizzato per la migliore immagine. Aggiungere una goccia d'acqua o un mezzo sterile di crescita delle piante ai campioni per idratare le interfacce tra i copricopertine e i vetrini.
- Posizionare una vetrina di vetro appena sopra la corona principale (regione in scatola superiore in Figura 1) e sotto le foglie di tiro per evitare di oltrarsi del coperchio (per consentire l'imaging della corona radice), e premere delicatamente17.
- Se si utilizzano batteri fluorescenti, immagine utilizzando appropriati filtri di eccitazione/emissione per differenziare i batteri l'uno dall'altro e la radice della pianta18.
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Representative Results
Il ben caratterizzato PGPB P. simiae WCS417r è noto per colonizzare le radici di A. thaliana nella cultura idroponica. Questo batterio naturalmente fluorescente può essere facilmente visualizzato utilizzando la microscopia sulle radici delle piantine dopo la colonizzazione (Figura 2). Anche se è possibile immaginare l'intera lunghezza di queste radici di a. thaliana (lunghezza 4-6 mm), farlo per molte piante richiederebbe una quantità proibitiva di tempo. Poiché la maggior parte delle variazioni nei tempi e nelle specie di batteri può essere catturata mediante l'imaging della corona, del centro e della punta della radice14 (indicata dalle caselle rosse nella Figura1), queste regioni hanno avuto la priorità per l'imaging piuttosto che per l'imaging della radice completa Lunghezze. Nelle immagini di campo luminoso di P. simiae-colonizzato Radici A. thaliana ( Figura2), è possibile visualizzare il contorno delle radici e dei peli delle radici; tuttavia, a 18 h di colonizzazione, non è possibile distinguere chiaramente le radici colonizzate rispetto a quelle non colonizzate usando immagini di campo luminoso. Mentre P. simiae visualizza l'autofluorescenza, abbiamo utilizzato un ceppo progettato anche per esprimere una proteina fluorescente gialla (YFP)19 con lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 490-510/520-550 nm18. Un ingrandimento di 100x è stato sufficiente per identificare chiaramente singoli e piccoli aggregati di cellule P. simiae sulle radici di A. thaliana. Come mostrato nella Figura 2, i laboratori con accesso a microscopi confocali ad alta risoluzione o a microscopi da banco meno costosi possono entrambi visualizzare la presenza e la distribuzione di batteri lungo la radice.
Sebbene siano informative in termini di distribuzione spaziale, le immagini microscopia non sono adatte per la quantificazione delle cellule batteriche. Abbiamo così raccolto batteri dalla superficie delle radici utilizzando l'ultrasuonio come descritto in precedenza e convalidato9,20. Tre giri di 12 s di ultrasuoni21 ad un'ampiezza di 40 sono stati sufficienti a disturbare la superficie esterna delle piantine radice ( Figura supplementare1) e rimuovere tutti i batteri senza influire sulla vitalità batterica. La Sonicazione è stata usata piuttosto che metodi di perline9 per promuovere meglio la dispersione di aggregati batterici/biofilm. Quantificando CFU/root dopo 18 h di colonizzazione e altri 72 h di manutenzione ha mostrato che P. simiae sia colonizza e viene mantenuto sulle radici di A. thaliana nel nostro idroponico, sistema di piantine galleggiante (Figura 3). Il numero di CFU/seedling in entrambi i momenti ha mostrato una buona riproducibilità tra le repliche biologiche eseguite in giorni diversi (Figura 3). La variazione osservata è comune tra i test di colonizzazione delle radici22 ed è probabilmente dovuta a piccole variazioni di tempistica, condizioni ambientali o dimensioni delle radici delle piante, anche tra piantine germogliate allo stesso tempo e selezionate per essere di dimensioni simili. Osserviamo un aumento del numero di CFU/seeding dopo 72 h nel mezzo di manutenzione rispetto ai numeri osservati al momento successivo alla colonizzazione 18 h (Figura 3). Ciò indica la crescita attiva dei batteri colonizzati sulla radice della pianta si è verificato durante la fase di manutenzione.
Oltre all'utilità di questo saggio idroponico per quantificare la colonizzazione batterica individuale e la manutenzione, è applicabile anche al monitoraggio dell'associazione di più specie sulle radici delle piante. Per dimostrarlo, sono state scelte tre specie di batteri isolati da A. thaliana coltivati in terreno naturale in condizioni di laboratorio20. Gli isolati erano ceppi di Arthrobacter nicotinovorans, Microbacterium oleivorans, e Curtobacterium oceanosedimentum23. Questa comunità semplificata è stata scelta a causa della capacità di queste specie di coesistere nei media della crescita batterica liquida nella cultura tremante (dati inediti). Inoltre, queste tre specie possono essere chiaramente differenziate su supporti contenenti X-gal a causa delle differenze nella morfologia e nel colore delle cocrostate (Figura 4A). L'X-gal non influisce sulla crescita relativa di nessuna di queste specie batteriche (dati inediti). Queste differenze nella morfologia e nell'aspetto delle conate su X-gal ci hanno permesso di contare la CFU/seedling di ogni specie senza selezione antibiotica, anche nella cocultura multispecie.
A. nicotinovorani, M. oleivorani, e C. oceanosedimentum sono stati tutti colonizzati e mantenuti sulla radice, sia da soli che in cocultura batterica (Figura 4B). Ogni specie ha mostrato tendenze simili tra diverse repliche biologiche e tecniche, anche all'interno di comunità miste. Ciò dimostra che il protocollo di analisi può essere utilizzato per misurare sia la CFU/radice relativa che totale di ciascuna specie. È interessante notare che, quando sono cresciute da sole, nessuna singola specie ha mostrato un notevole aumento di abbondanza durante la fase di manutenzione, ma la CFU/radice complessiva della comunità combinata è aumentata nelle coculture, indicando che questi batteri non vietano colonizzazione degli altri ceppi.
Per tutti gli esperimenti, le piante coltivate in supporti liquidi senza l'aggiunta di batteri come controlli negativi sono stati sempre inclusi. Nessun batterio era visibile su queste radici di controllo durante la microscopia (Figura 2), né sono stati rilevati batteri tramite placcatura per CFU (dati inediti). Ciò indica che la sterilizzazione dei semi e l'utilizzo delle tecniche sterili durante questo saggio erano sufficienti per mantenere le piante axenica a meno che non appositamente colonizzato.
Figura 1: Saggio per la colonizzazione batterica e la manutenzione sulle radici A. thaliana. A. le piantine di thaliana coltivate su reti di plastica sterilizzate sono state trasferite in un mezzo di crescita ottimizzato per i batteri [qui, 0,1 lB (Luria Broth) Lennox]. I batteri colonizzarono la radice su 18 h mentre la pianta galleggiava nel liquido tremante. A seguito di un risciacquo, il galleggiante colonizzato è stato trasferito a un mezzo di crescita ottimizzato per le piante (0,5x MS e MES) per 72 h per testare il mantenimento dei batteri sulle radici. Il galleggiante è stato poi sciacquato, e la pianta con qualsiasi microbi collegati è stata rimossa per l'analisi (quantificazione della CFU/semina o imaging mediante microscopia). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Visualizzazione della colonizzazione p. simiae delle radici con microscopia fluorescente. P. simiae (verde falso) colonizzò le radici di A. thaliana e fu mantenuto sulla radice dopo il trasferimento al mezzo di crescita delle piante. Corona radice (sinistra), metà lunghezza (al centro) e punta (destra) all'ingrandimento 40x sono mostrati dalle aree indicate nella figura 1. Le prime due file mostrano le immagini a campo luminoso e fluorescenti delle radici colonizzate da P. simiae (immagini di microscopia epifluorescente). Le stesse radici sono state anche immagini da un microscopio confocale (centro due file). Il controllo negativo no-batteri nelle due righe inferiori non ha mostrato colonizzazione. Le barre della scala rappresentano 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione di P. simiae sulle radici Di. thaliana. Numero totale di cellule vitali P. simiae recuperate per la piantina di A. thaliana dopo 18 h di colonizzazione o 72 h di manutenzione. Vengono mostrate tre repliche biologiche individuali, ognuna contenente tre repliche tecniche di due piantine per float. I numeri mostrati sono i mezzi delle repliche tecniche, mentre le barre rappresentano errori standard dei mezzi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione della colonizzazione e del mantenimento di una comunità batterica mista sulle radici di A. thaliana. (A) Le colonie di A. nicotinovorani, M. oleivorani e C. oceanosedimentum possono essere differenziate su X-gal-contenente agar medium da morfologia colonia e colore. (B) Radici di 10 piantine di 10 giorni sono state inocucate con circa 3x105 CFU/mL di ciascuno dei tre ceppi. Sono mostrati cFU/seeding totali recuperati di ogni specie dopo 18 h di colonizzazione o 72 h di manutenzione quando colonizzati da soli o in una comunità batterica a tre membri. Vengono mostrati due repliche biologiche, ognuna delle quali comprende due repliche tecniche di due piantine per galleggiante. I numeri mostrati sono i mezzi delle due repliche tecniche, mentre le barre rappresentano errori standard dei mezzi . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: L'ultrasuono interrompe la superficie della radice. Per allontanare i batteri dalla superficie della radice, intere piante sono state sonicate, e i batteri sono stati rilasciati nel liquido, che è stato diluito in serie e placcato per la quantificazione della CFU/ seminatori. (A) Una piantina intatta è (B) strutturalmente interrotta dopo l'ultramionne. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Le piante in tutti gli ambienti interagiscono con migliaia a milioni di diversi batteri e funghi5,7. Queste interazioni possono avere un impatto negativo e positivo sulla salute delle piante, con potenziali effetti sulla resa delle colture e sulla produzione alimentare. Lavori recenti suggeriscono anche che la colonizzazione variabile delle colture da parte dei PGPB può spiegare le dimensioni imprevedibili delle piante e la resa delle colture nelle prove sul campo22. Comprendere i meccanismi alla base di queste interazioni potrebbe permetterci di manipolare direttamente le comunità microbiche associate alle piante per aiutare nello sviluppo sano delle piante, anche sotto stress24.
Poiché la colonizzazione batterica delle radici e il loro mantenimento nella rizosfera è fondamentale per le interazioni pianta-microbo9, abbiamo voluto costruire un sistema per visualizzare e quantificare riproducibilmente questi comportamenti batterici. Questo sistema di crescita delle piantine idroponica e galleggiante consente l'imaging microscopico e la quantificazione delle popolazioni batteriche sulle radici di A. thaliana.
Il saggio di interazione pianta-microbo descritto integra elementi benefici dei protocolli sperimentali esistenti. Il metodo della maglia galleggiante era basato su quello di Haney et al.13, che misurava la colonizzazione iniziale di P. simiae WCS417r su piantine a statiche galleggianti A. thaliana. Nel valutare questo sistema, è stata convalidata una forte colonizzazione delle radici di A. thaliana da parte di P. simiae, anche se un mezzo di crescita diverso da Haney et al. è stato utilizzato e ha incluso agitazioni orbitali durante la colonizzazione. L'inclusione di scosse orbitali durante la colonizzazione e la manutenzione facilita le interazioni batteriche che potrebbero non verificarsi nella coltura statica, oltre a ridurre le condizioni anossiche che possono inibire sia la crescita batterica che la salute delle radici delle piante13. Abbiamo anche integrato aspetti dei protocolli incentrati sulla microbiologia progettati per supportare la colonizzazione delle radici delle piante da varie specie batteriche8,15,25. Questo ha incluso un passaggio di trasferimento cruciale dal mezzo ottimizzato per la colonizzazione batterica e in un mezzo ottimizzato per la crescita delle piante. Questo trasferimento al mezzo fresco permetterà anche di affrontare i meccanismi alla base della manutenzione batterica sulle radici, un approccio che può fornire approfondimenti sulla manutenzione irregolare del PGPB nelle prove sul campo6.
Questo test è stato ottimizzato per l'elaborazione rapida di più campioni per consentire di testare le variabili ambientali e le comunità batteriche miste all'interno di un unico replica biologico multi-bene. Mentre l'ultrasuonizzazione è stata precedentemente dimostrata essere sufficiente per la rottura e la raccolta di batteri di rizosfera, la piastra 24-po e l'attacco di corno multi-prong accelera l'elaborazione del campione. Questo approccio di calcolo della fattibilità cellulare per quantificare la presenza batterica potrebbe essere completato o ampliato per includere qPCR o MiSeq 16S rRNA gene community profilazione per determinare l'abbondanza relativa di comunità più diverse di batteri colonizzanti 20.Inoltre, durante l'imaging, viene evidenziata l'utilità di concentrarsi solo su tre regioni di ogni radice vegetale per accelerare la visualizzazione della presenza batterica e la localizzazione sulle radici. La colonizzazione di queste diverse regioni principali ha dimostrato di differire tra le specie batteriche14. L'imaging può essere eseguito sia con batteri naturalmente autofluorescenti che con batteri geneticamente retmarcatori progettati per esprimere una proteina fluorescente.
La metodologia qui descritta consente una valutazione rapida e riproducibile della colonizzazione delle radici da parte dei batteri PGPB, ma ci sono limitazioni alle conclusioni che possono essere tratte da questi esperimenti. Per esempio, la capacità per i batteri di chemiotassa verso la radice è nota per essere importante per la colonizzazione delle radici delle piante da parte di molte specie batteriche, ma questo processo potrebbe non essere necessario all'interno di questo sistema di inoculazione accomodante. Detto questo, per gli studi specificamente interessati alla chemiotassi, la fase di colonizzazione potrebbe essere eseguita nella coltura liquida statica o sulla superficie di un mezzo di agar morbido, dove i batteri potrebbero essere placcati lontani dalla pianta, richiedendo loro di muoversi attivamente verso il radice. Inoltre, un mezzo di crescita relativamente ricco durante la colonizzazione è stato utilizzato per promuovere la crescita batterica e l'attaccamento delle piante; tuttavia, queste concentrazioni di nutrienti relativamente elevate possono vietare l'esame dell'utilizzo batterico o della concorrenza per il carbonio di origine vegetale durante la colonizzazione. Ancora una volta, a seconda dei requisiti di crescita dei batteri studiati, il mezzo di colonizzazione può essere variato per soddisfare al meglio le particolari domande di ricerca di ricercatori specifici.
Questo sistema è stato progettato per essere facilmente suscettibile di diverse condizioni batteriche e di crescita delle piante e per l'aggiunta di diversi fattori di stress e tempi ambientali. Tuttavia, i metodi qui descritti sono più adatti per misurare le interazioni batteriche con le radici delle piantine di A. thaliana. La raccolta è stata ottimizzata per questa pianta e le piante più grandi o più sensibili possono essere intrattabili nel sistema galleggiante a più piastre. Infine, mentre i batteri di interesse utilizzati qui colonizzano la radice della pianta in coltura liquida, per altri batteri potrebbe essere necessario inoculare le radici delle piante da dip-inoculazione o placcatura su un solido mezzo di agar invece19.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di ricerca forniti dal Dipartimento di Ricerca Biologica e Ambientale Dell'Energia (DOE-BER 0000217519 a E.A.S.), dalla National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 a E.A.S.). SLH è stata anche sostenuta dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. Ringraziamo il Dottor Jeffery Dangl per aver fornito ceppi batterici e informazioni preziose. Ringraziamo il Dottor Andrew Klein e Matthew J. Powers per i suggerimenti sperimentali. Infine, SLH desidera ringraziare le connessioni sui social media per ricordarci che diffondere la scienza è un privilegio e una responsabilità, soprattutto attraverso mezzi creativi e accessibili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
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