Articolo metodologico

Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per l'immunoterapia adottiva

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DOI:

10.3791/59949

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17 dicembre 2019

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un approccio per generare in modo affidabile le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) e testare la loro differenziazione e funzione in vitro e in vivo.

Abstract

L'immunoterapia adottiva promette per il trattamento del cancro e delle malattie infettive. Descriviamo un semplice approccio per trasdurre le cellule T umane primarie con il recettore dell'antigene chimerico (CAR) ed espandere la loro progenie ex vivo. Includiamo saggi per misurare l'espressione CAR, nonché la differenziazione, la capacità proliferare e l'attività citolitica. Descriviamo i saggi per misurare la produzione di citochine e la secrezione infiammatoria di citochina nelle cellule CAR T. Il nostro approccio fornisce un metodo affidabile e completo per la coltura delle cellule T CAR per modelli preclinici di immunoterapia adottiva.

Introduzione

I recettori degli antigeni chimerici (CAT) forniscono un approccio promettente per reindirizzare le cellule T contro antigeni tumorali distinti. I CR sono recettori sintetici che legano un bersaglio dell'antigene. Mentre la loro composizione precisa è variabile, i CAR contengono generalmente 3 domini distinti. Il dominio extracellulare dirige il legame verso un antigene bersaglio ed è in genere costituito da un frammento di anticorpo a catena singola collegato alla CAR tramite una cerniera extracellulare. Il secondo dominio, comunemente derivato dalla catena CD3 del complesso del recettore delle cellule T (TCR), promuove l'attivazione delle cellule T in seguito al coinvolgimento della CAR. Un terzo dominio costimulatory è incluso per migliorare la funzione delle cellule T, innesto, metabolismo, e la persistenza. Il successo della terapia cellulare CAR T in varie neoplasie ematopoietiche tra cui la leucemia linfoblastica acuta a cellule B (ALL), la leucemia linfocitica cronica (CLL) e il mieloma multiplo evidenziano la promessa terapeutica di questo approccio1,2,3,4,5. Le recenti approvazioni della Food and Drug Administration (FDA) per due terapie cellulari CAR T specifiche per CD19, tisagenlecleucel per bambini e giovani adulti ALL e axicabtagene ciloleucel per il linfoma diffuso a grandi cellule B, rafforza il merito traslazionale della terapia cellulare CAR T.

Gli approcci basati su CAR T prevedono l'isolamento delle cellule T dal sangue periferico, l'attivazione, la modificazione genetica e l'espansione ex vivo. La differenziazione è un parametro importante che regola l'efficacia delle cellule CAR T. Di conseguenza, limitare la differenziazione delle cellule T durante la coltura ex vivo migliora la capacità del prodotto infuso di innestare, espandere e persistere, fornendo un'immunosorveglianza a lungo termine dopo il trasferimento adottivo2,7,8,9. Le cellule T sono costituite da diversi sottoinsiemi distinti, tra cui: cellule T ingenue (Tn), memoria centrale (Tcm), memoria efsiatrice (Tem), effettore differenziato (Tte) e memoria delle cellule staminali (Tscm). Le cellule T differenziate dell'effetto hanno una potente capacità citolitica; tuttavia, sono di breve durata e ne innestano male10,11,12. Al contrario, le cellule T con un fenotipo meno differenziato, comprese le cellule T ingenue e Tcm, presentano capacità di innesto e proliferazione superiori dopo il trasferimento delle cellule adottive13,14,15,16,17,18. La composizione delle cellule T raccolte nel prodotto prefabbricato può variare tra i pazienti e correlata al potenziale terapeutico delle cellule T CAR. La proporzione di cellule T con un immunofenotipo ingenuo nel prodotto dell'aferesi iniziale è altamente correlata sia con l'innesto che con la risposta clinica19.

La durata della coltura è un parametro importante che influenza la differenziazione nelle cellule T CAR preparate per il trasferimento adottivo. Recentemente abbiamo sviluppato un approccio per generare cellule CAR T di qualità superiore utilizzando un paradigma di coltura abbreviato20. Utilizzando il nostro approccio, abbiamo dimostrato che una cultura limitata dà origine a cellule CAR T con funzione efsiatrice superiore e persistenza dopo il trasferimento adottivo in modelli di xenotrapianto di leucemia. Qui presentiamo gli approcci per generare in modo affidabile cellule CART19 (cellule T autologhe progettate per esprimere anti-CD19 scFv collegate al CD3 e ai domini di segnalazione 4-1BB) e includiamo una descrizione dettagliata dei saggi che forniscono informazioni sulla bioattività e sull'efficacia di CAR T prima del trasferimento adottivo.

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Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono approvati dal Comitato Istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Pennsylvania.

1. Attivazione, trasduzione ed espansione delle cellule T

  1. Attivare le cellule T umane primarie fresche o crioconservate mescolando con perline magnetiche anti CD3/CD28 (ad esempio, dinaline) a un rapporto di 3 perline per cellula T in piatti di coltura cellulare a 6 pozzetti. Cellule T di coltura nel mezzo X-VIVO 15 integrate con 5% siero umano normale AB, 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, e IL2 (100 unità/mL). Mantenere le cellule T a una concentrazione di 106 cellule T/mL durante l'espansione. Cellule T di coltura a 37 gradi centigradi, 20% O2e 95% di umidità con 5% CO2.
  2. Dopo la stimolazione notturna, aggiungere il supernnatale lentivirale alle cellule T attivate. Calcolare il volume di supernatante necessario per ottenere una molteplicità di infezione (MOI) di 3/5.
    NOT: Il plasmide di lentivirus CD19-BB-CAR è costituito da una cerniera CD8, un dominio coscultore 4-1BB e da un dominio di segnalazioneCD3 , 21. Il supernatante lentivirale CD19-BB è stato generato come descritto in precedenza21.
  3. Il terzo giorno, raccogliere un aliquota rappresentativa di cellule per la crioconservazione. Prima della crioconservazione, rimuovere le perline magnetiche mediante pipettaggio delicato e separazione magnetica. Preparare il mezzo di congelamento contenente la salina con buffer fosfato (PBS) con 0,5% di zolfo dimetile (DMSO) e conservarlo a 4 gradi centigradi fino all'uso.
    1. Centrifugare le cellule T a 300 x g per 5 min. Scartare il supernatante e aggiungere 5 mL di PBS. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min e scartare il PBS.
    2. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo di crioconservazione a freddo. Congelare le cellule T in un contenitore di congelamento refrigerato e conservarle a -80 gradi centigradi per 48 h. Trasferire le cellule congelate in azoto liquido.
  4. Lavare il resto delle cellule T una volta in 5 mL di PBS per eliminare il vettore residuo. Centrifuga a 300 x g per 5 min. Decant il PBS e rimettere in sospensione il pellet cellulare nel mezzo di coltura delle cellule T ad una concentrazione di 0,5 x 106 cellule / mL.
  5. Dividere le cellule T in due colture, designate per il giorno 5 e il giorno 9. Contare le cellule T per citometria di flusso utilizzando perline di conteggio (Tabella dei materiali) e anticorpi monoclonali per cd4 e CD8 umani, nonché un colorante di fattibilità ( Tabella deimateriali).
    1. Per misurare la concentrazione delle cellule T, preparare una miscela master contenente 500 , l'l di PBS, 5 - L di perline di conteggio, 10 - L di 7-Amino-actinomycin D sistema di fattibilità cellulare, 4 - L di CD4-FITC e 4 - L di CD8-APC. Aggiungere 40 celle T al mix master e misurare la concentrazione cellulare per citometria di flusso in base al numero di cellule T vive/conteggi di perline. Eseguire il refeed per mantenere le colture a una concentrazione di 0,5 x 106 cellule/mL ogni altro giorno.
  6. Il giorno 5, contare e crioconservare giorno 5 culture come descritto nei passaggi 1.3 e 1.5.
  7. Il giorno 7, lavare 0,5 x 106 celle T in PBS e risospendere in 100 - L di fluorescenza attivato tampone di smistamento cellulare (FACS). Rileva l'espressione della proteina superficiale CAR immunostaining con un idiotipo anti-CAR19 fluorescente da citometria di flusso.
  8. Il giorno 9, conta le culture del giorno 9 e criopreserve come descritto al punto 1.3.

2. Valutazione fenotipica della differenziazione delle cellule T

  1. Preparare un mix master contenente anticorpi pre-titolati per anti-CD3–BV605 (clone OKT3), anti-CD14–Pacific Blue (PB) (clone HCD14), anti-CD19–PB (clone HIB19), anti-CD4–BV510 (clone OKT4), anti-CD8–H7APC (clone SK1), anti-CCR7–C anti-CD45RO-PE (clone UCHL1), anti-CD27-PE-Cy7 (clone 1A4CD27), anti-CD95–PerCP-Cy5.5 (clone DX2) e anti-CAR19-APC.
  2. Preparare i controlli a fluorescenza individuale meno uno (FMO) per le cellule color-acqua anti-CD45RO-PE, anti-CCR7-FITC, anti-CD27-PE-Cy7 e anti-CD95-PerCP-Cy5.5 alle cellule coloracquarizzate dallo sfondo.
  3. Preparare la soluzione di colorazione delle cellule morte diluindo il reagente di stock vivo /morto (Tabella dei materiali) 1:10.000 in PBS.
  4. Scongelare giorno 3, giorno 5 e giorno 9 cellule T che erano precedentemente crioconservate. Centrifuga 1 x 106 cellule T da ogni gruppo a 300 x g per 3 min. Scartare il supernatante. Lavare le cellule una volta con PBS. Centrifuga a 300 x g per 3 min e scartare il PBS.
  5. Mescolare le cellule T con una soluzione di colorazione morta per 15 min a temperatura ambiente (RT), protetta dalla luce.
  6. Aggiungere 1 mL di buffer FACS per dissetare il colorante di colorazione della cella morta. Centrifuga a 300 x g per 3 min, scartare il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 100 . Incubare per 1 h a 4 gradi centigradi.
  7. Aggiungere 1 mL di tampone e centrifuga FACS a 300 x g per 3 min per lavare gli anticorpi non legati. Ripetere tre volte con il buffer FACS.
  8. Risospendere le cellule in paraformaldeide dell'1% (PFA) e conservarle a 4 gradi centigradi.
  9. Quando l'espressione CD45RO diminuisce dopo la fissazione, analizzare i campioni per citometria di flusso dopo l'immunostaining. Per valutare la differenziazione, gate nel seguente ordine: singlets (FSC-H vs FSC-A), cellule CD3- T live (Dump [live-dead violet, CD14-PB e CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). InCD4 ecd8, i sottoinsiemi, gate su CD45RO-PE vs CCR7-FITC per definire cellule T simili a nai (CD45RO-CCR7), Tcm (CD45RO),Tem (CD45RO)- CCR7-) e Tte (CD45RO-CCR7-). Per identificare Tscm, cancello su CD27- cellule T in popolazione di cellule T ingenui. In questo scomparto, Tscm sono CD95e Tn sono CD95-.

3. Analisi funzionale in vitro

  1. Proliferazione delle cellule Car T e secrezione di citochine
    1. Verificare l'espressione CAR e la fattibilità delle celle come descritto nei passaggi 1.5 e 1.7, per citometria di flusso.
    2. Lavare 5 x 106 cellule T da ogni gruppo (giorno 3, giorno 5 e giorno 9) con PBS e risospendere in una soluzione da 1 M di carboxyfluorescein diacenimidyl ester (CFSE) in PBS per 3,5 min a RT.
    3. Aggiungere immediatamente 10 mL di PBS contenente 10% siero bovino fetale (FBS) per placare la reazione.
    4. Centrifugare la soluzione a 300 x g per 3 min. Scartare il supernatante e ripetere questa fase di lavaggio tre volte. Contare le celle alla fine della colorazione CFSE utilizzando un contatore Coulter (Tabella dei materiali).
    5. Raccogliere le cellule macchiate di CFSE (non stimolate), riutilizzare in 1% PFA e conservare a 4 gradi centigradi per l'analisi per citometria di flusso.
    6. Incubare il numero desiderato di cellule CAR CAR macchiate di CFSE con celle di coltura K562-CD19 (bersaglio) irradiate e K562-wild type (controllo) con un rapporto di 1:1 per 120 h in condizioni di coltura libera citochina, come descritto nel passaggio 1.1.
    7. Dopo 24 h, centrifugare il recipiente di coltura a 300 x g per 5 min. Raccogliere 120 l di supernatante cellulare. Valutare la produzione dipendente dall'attivazione di IL2, IFNz, TNF, GM-CSF e altre citochine infiammatorie (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 e IL10) mediante analisi di Luminex in conformità con le raccomandazioni del produttore.
    8. Sostituire il volume di supernatant che è stato raccolto nel passaggio 3.1.7 con un volume equivalente (120 l) di mezzo fresco.
    9. Il giorno 3 (cioè dopo 96 h), contare e ri-alimentare ad una concentrazione di 0,5 x 106 cellule / mL utilizzando citometria di flusso a base di perline come in precedenza nel passaggio 1.5.
    10. Il giorno 5, contare il CD3 livee calcolare la modifica di piegatura delle cellule T vive rispetto al numero di cellule T in tempo reale al giorno 0.
    11. Eseguire un'analisi completa della diluizione CFSE nella divisione delle celle CAR T utilizzando il software FlowJo per evidenziare cicli successivi di divisione cellulare.
      NOTA: i saggi di proliferazione sono ben descritti nel manuale FlowJo.
  2. Ansaggio della citotossicità
    NOT: La capacità delle cellule CART19 di uccidere le cellule bersaglio che esprimono CD19 viene valutata utilizzando un'ipotesi di rilascio di 51Cr.
    1. Etichettare le cellule bersaglio mescolando 5 x 105 K562-CD19, cellule di controllo del tipo K562- wild, o cellule di leucemia NALM6 con 50 .L di551 CrO4 e 0.5 mL di RPMI integrato con 10% FBS per 90 min in incubatrice a 37 .
    2. Centrifuga refusione di cellule a 300 x g per 2,5 min. Scartare il supernatante radioattivo in opportuni contenitori di smaltimento e lavare le cellule bersaglio in 5 mL di PBS. Ripetere i passaggi di lavaggio due volte.
    3. Risospendere le cellule bersaglio nel mezzo privo di rosso fenolo contenente il 5% di FBS. Utilizzare questo supporto per il resto della procedura per ridurre lo sfondo.
    4. Dopo aver valutato l'espressione CAR e la fattibilità delle cellule in base alla citometria di flusso (come descritto nella sezione 5.1), mescolare le celle CAR T con le celle bersaglio etichettate in corrispondenza dei rapporti etsuo:target (E:T) di 10:1, 3:1 e 1:1, in triplice copia. Trasferire su una piastra inferiore U di 96 pozze.
    5. Parallelamente, includere le cellule bersaglio da sole, e le cellule bersaglio con 1% solfato di sodecyl di sodio (SDS), per determinare spontaneo (S) e massimo (M) 51Cr rilascio, rispettivamente.
    6. Centrifuga a 300 x g per 5 min e incubazione per 4 h o 20 h in un'incubatrice 37 C con 5% CO2.
    7. Dopo il tempo prestabilito, centrificare il recipiente di coltura a 300 x g per 5 min. Raccogliere 35 -L di supernatante cellulare e trasferirlo su una piastra di lettura. Evitare le bolle. Lasciare asciugare il piatto durante la notte.
    8. Sigillare la piastra con un sigillo a piastre standard e contare con un contatore di scintillio liquido. L'abbondanza di cromo nel supernatante fornisce un proxy di uccisione di cellule bersaglio. Calcolare la percentuale di lisi specifica come segue: 100 x (conteggi al minuto [cpm] versione sperimentale – cpm S release)/ (cpm M release – cpm S release).

4. Analisi funzionale in vivo

  1. Ottenere topi NOD-SCID-c– (NSG) di 6-10 settimane, che non dispongono di un sistema immunitario adattivo, e assegnarli casualmente al gruppo di trattamento/controllo.
  2. Iniettare gli animali per via endovenosa attraverso la vena della coda con 1 x 106 cellule NALM6 in PBS sterile da 0,1 mL.
  3. Dopo 5/7 giorni, confermare l'innesto tumorale mediante l'imaging di bioluminescenza (BLI). Iniettare 150 mg/kg di D-lucidferina ai topi che sono stati anestesizzati con isoflurane (il volume dipende dalla massa corporea).
  4. Misurare i valori di bioluminescenza utilizzando un sistema di imaging. Quantifica il flusso totale utilizzando il software corrispondente disegnando rettangoli di area identica intorno ai topi, raggiungendo dalla testa al 50% della lunghezza della coda. Sottrarre singolarmente lo sfondo per ogni immagine.
  5. Dopo aver stabilito la leucemia, iniettare 3 x 106 celle CART19 giorno, 0,5 x 106 celle CAR T, o corrispondenti cellule T umane non trasdotte (NTD) tramite vena posteriore in un volume di 100L di sterile PBS/ Ca2.
    NOT: Poiché la bioattività delle cellule raccolte a vari intervalli durante il processo di coltura è diversa, la concentrazione scelta delle cellule del giorno 3 è inferiore al giorno 9.
  6. Per determinare la progressione della malattia, misurare i valori di bioluminescenza due volte alla settimana, come descritto in precedenza nel passaggio 4.3.
  7. Per determinare l'innesto di cellule CAR T, raccogliere 75 sangue con sanguinamento retroorbitale in un tubo rivestito EDTA. Trasferire 50 - L di sangue su tubi di conteggio assoluti.
  8. Macchiare il sangue con anticorpi contro CD45, CD4, CD8 e CAR per 30 min a RT. Aggiungere 400 l di 1x soluzione liscile FACS ai tubi e vortice accuratamente. Dopo la colorazione, analizzare l'espressione del marcatore di superficie per citometria di flusso.
    NOT: Altri indicatori di superficie possono essere utilizzati per valutare la differenziazione e lo stato di esaurimento dei cellule T nel sangue.
  9. Per misurare i livelli di citochine nel sangue, centrifugare il sangue a 1.200 x g per 30 min a 4 gradi centigradi per separare il siero dallo strato superiore di sangue.
  10. Raccogliere il siero e misurare le citochine con una piastra di lettura designata secondo le istruzioni del produttore.

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Risultati

Utilizzando i metodi descritti sopra, abbiamo stimolato e ampliato le cellule T per 3 o 9 giorni (Figura 1A,B). Abbiamo anche analizzato il loro profilo di differenziazione, come indicato dalla strategia di gating delineata nella Figura 1C, misurando l'abbondanza di glicoproteine distinte espresse sulla superficie cellulare. Mostriamo un progressivo spostamento verso la differenziazione degli effetti nel tempo durante la cultura...

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Discussione

Qui descriviamo gli approcci per misurare la funzione e l'efficacia delle cellule CAR T raccolte a intervalli variabili in tutta la coltura ex vivo. I nostri metodi forniscono una visione completa dei saggi progettati per valutare la capacità proliferaria e la funzione degli effetti in vitro. Descriviamo come misurare l'attività delle cellule CAR T dopo la stimolazione attraverso la CAR e i modelli di xenotrapianto dettagliati della leucemia utilizzando cellule CAR T raccolte al giorno 3 contro il giorno 9 della loro fas...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte attraverso il finanziamento fornito da Novartis Pharmaceuticals attraverso un'alleanza di ricerca con l'Università della Pennsylvania (Michael C. Milone) e il premio St. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti CD3 / CD28 dynabeadsThermo Fisher40203D
APC Topo Anti-Umano CD8BD Biosciences555369RRID:AB_398595
APC-H7 Topo anti-umano CD8 Anticorpo BDBiosciences560179RRID:AB_1645481
BD FACS Soluzione di lisi 10X ConcentratoBD Biosciences349202
BD Trucount Provette di conteggio assolutoBD Biosciences340334
Brilliant Violet 510 anticorpo CD4BioLegend317444RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anticorpo CD3 umanoBioLegend317322RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Kit di proliferazione cellulareLife TechnolohgiesC34554
CountBright Absolute Counting Beads,InvitrogenC36950
FITC anti-umano CD197 (CCR7) AnticorpoBD Pharmingen561271RRID:AB_10561679
FITC Topo anti-umano CD4BD Biosciences555346RRID:AB_395751
HEPESGibco15630-080
Siero umanoAB Valley BiomedicalHP1022
Umano IL-2 IS, grado premium Miltenyi130-097-744
L-glutamminaGibco28030-081
Contatore a scintillazione liquida, MicroBeta triluxPerkin Elmer
LIVE/DEAD SondemolecolariL34964
Multisizer Coulter CounterBeckman Coulter
Na251CrO4Perkin ElmerNEZ030S001MC
Pacific Anticorpo CD14 blu BioLegend325616RRID:AB_830689
Anticorpo CD19 anti-umano blu del PacificoBioLegend302223
PE anti-umano CD45RO AnticorpoBD Biosciences555493RRID:AB_395884
PE/Cy5 anti-umano CD95 (Fas) AnticorpoBioLegend305610RRID:AB_493652
PE/Cy7 anti-umano CD27 AnticorpoBeckman ColtroA54823
Mezzo privo di rosso fenoloGibco10373-017
Soluzione SDS UltraPure, 10%Invitrogen15553027
Via-ProbeBD Biosciences555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ SaltPerkin Elmer122799
umano viola fissabili

Riferimenti

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