Summary
Wir beschreiben einen Ansatz zur zuverlässigen Generierung von chimeric antigen receptor (CAR) T-Zellen und testen deren Differenzierung und Funktion in vitro und in vivo.
Abstract
Die Adoptivimmuntherapie verspricht die Behandlung von Krebs und Infektionskrankheiten. Wir beschreiben einen einfachen Ansatz, um primäre menschliche T-Zellen mit chimärem Antigenrezeptor (CAR) zu transduzieren und ihre Nachkommen ex vivo zu erweitern. Wir umfassen Assays zur Messung des CAR-Ausdrucks sowie Differenzierung, Proliferativfähigkeit und zytolytische Aktivität. Wir beschreiben Assays zur Messung der Cytokinproduktion und der entzündlichen Zytokinsekretion in CAR-T-Zellen. Unser Ansatz bietet eine zuverlässige und umfassende Methode zur Kultur von CAR-T-Zellen für präklinische Modelle der Adoptivimmuntherapie.
Introduction
Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) bieten einen vielversprechenden Ansatz, um T-Zellen gegen verschiedene Tumorantigene umzuleiten. CARs sind synthetische Rezeptoren, die ein Antigenziel binden. Obwohl ihre genaue Zusammensetzung variabel ist, enthalten CARs im Allgemeinen 3 verschiedene Domänen. Die extrazelluläre Domäne leitet die Bindung an ein Zielantigen und besteht in der Regel aus einem einkettigen Antikörperfragment, das über ein extrazelluläres Scharnier mit dem CAR verknüpft ist. Die zweite Domäne, die üblicherweise von der CD3-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes (TCR) abgeleitet wird, fördert die T-Zellaktivierung nach CAR-Eingriff. Eine dritte Costimulatorische Domäne ist enthalten, um T-Zell-Funktion zu verbessern, Transplantation, Stoffwechsel, und Persistenz. Der Erfolg der CAR-T-Zelltherapie bei verschiedenen hämatopoetischen Malignomen, einschließlich akuter lymphatischer Leukämie (ALL), chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) und multiplem Myelom, unterstreicht das therapeutische Versprechen dieses Ansatzes1,2,3,4,5,6. Die jüngsten Zulassungen der Food and Drug Administration (FDA) für zwei CD19-spezifische CAR-T-Zelltherapien, Tisagenlecleucel für pädiatrische und junge Erwachsene ALL und Axicabtagene ciloleucel für diffuses großes B-Zell-Lymphom, verstärken den translationalen Wert der CAR T-Zelltherapie.
CAR T-basierte Ansätze beinhalten die Isolierung von T-Zellen aus peripherem Blut, Aktivierung, genetische Veränderung und Expansion ex vivo. Die Differenzierung ist ein wichtiger Parameter, der die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen reguliert. Dementsprechend verbessert die Einschränkung der T-Zell-Differenzierung während der Ex-vivo-Kultur die Fähigkeit des infundierten Produkts, sich zu engrafieren, zu erweitern und fortzubestehen, was eine langfristige Immunüberwachung nach derAdoption2,7,8,9bietet. T-Zellen bestehen aus mehreren unterschiedlichen Teilmengen, darunter: naive T-Zellen (Tn), Zentralgedächtnis (Tcm), Effektorspeicher (Tem), Effektor differenziert (Tte) und Stammzellgedächtnis (Tscm). Effektor differenzierte T-Zellen haben starke zytolytische Fähigkeit; jedoch sind sie kurzlebig und veredeln schlecht10,11,12. Im Gegensatz dazu weisen T-Zellen mit einem weniger differenzierten Phänotyp, einschließlich naiver T-Zellen und Tcm, nach der Adoptivzellübertragung13,14,15,16,17,18eine überlegene Engraftmentierung und proliferative Fähigkeiten auf. Die Zusammensetzung der gesammelten T-Zellen im vorgefertigten Produkt kann von Patient zu Patient variieren und korreliert mit dem therapeutischen Potenzial von CAR-T-Zellen. Der Anteil der T-Zellen mit einem naiven Immunophenotyp im Ausgangsapherese-Produkt ist stark korreliert mit der Transplantation und dem klinischen Ansprechen19.
Die Kulturdauer ist ein wichtiger Parameter, der die Differenzierung in CAR-T-Zellen beeinflusst, die für die Adoptivübertragung vorbereitet sind. Wir haben vor kurzem einen Ansatz entwickelt, um CAR-T-Zellen von höchster Qualität mit einem abgekürzten Kulturparadigma20zu erzeugen. Mit unserem Ansatz zeigten wir, dass eine begrenzte Kultur zu CAR-T-Zellen mit überlegener Effektorfunktion und Persistenz nach Derisübertragung bei Xenograft-Modellen von Leukämie führt. Hier stellen wir die Ansätze zur zuverlässigen Generierung von CART19-Zellen vor (autologe T-Zellen, die entwickelt wurden, um Anti-CD19-SCFv auszudrücken, die an CD3- und die 4-1BB-Signal-Domains angehängt sind) und enthalten eine detaillierte Beschreibung der Assays, die Einblicke in car T Bioaktivität und Wirksamkeit vor der Adoptionsübertragung geben.
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Protocol
Alle Tierstudien werden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania genehmigt.
1. T-Zellaktivierung, Transduktion und Erweiterung
- Aktivieren Sie frische oder kryokonservierte primäre menschliche T-Zellen, indem Sie mit Anti-CD3/CD28-Magnetperlen (z. B. Dynabeads) im Verhältnis 3 Perlen pro T-Zelle in 6-Well-Zellkulturschalen mischen. Kultur-T-Zellen in X-VIVO 15 Medium ergänzt mit 5% normalem humanem AB-Serum, 2 mM L-Glutamin, 20 mM HEPES und IL2 (100 Einheiten/ml). Halten Sie T-Zellen bei einer Konzentration von 106 T-Zellen/ml während der Expansion. Kultur-T-Zellen bei 37 °C, 20%O2und 95% Luftfeuchtigkeit mit 5%CO2.
- Nach der nächtlichen Stimulation lentiviralen Überstand zu aktivierten T-Zellen hinzufügen. Berechnen Sie das Volumen des Überstandes, der notwendig ist, um eine Vielzahl von Infektionen (MOI) von 3-5 zu erreichen.
HINWEIS: Das CD19-BB-CAR-Lentivirus-Plasmid besteht aus einem CD8-Scharnier, einer 4-1BB-Costimulatorei und einer CD3-Signalisierungsdomäne21. Cd19-BB-Lentiviralüberstand wurde wie zuvor beschrieben21erzeugt. - Sammeln Sie am 3. Tag ein repräsentatives Aliquot von Zellen zur Kryokonservierung. Entfernen Sie vor der Kryokonservierung die magnetischen Perlen durch sanfte Pipettierung und magnetische Trennung. Gefriermedium mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) mit 0,5 % Dimethylsulfoxid (DMSO) zubereiten und bis zur Verwendung in 4 °C lagern.
- Zentrifugen-T-Zellen bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 5 ml PBS hinzu. Zentrifugenzellen bei 300 x g für 5 min und entsorgen die PBS.
- Das Zellpellet in 1 ml kaltem Kryokonservierungsmedium wieder aufhängen. T-Zellen in einem gekühlten Gefrierbehälter einfrieren und bei -80 °C für 48 h lagern. Die gefrorenen Zellen in flüssigen Stickstoff übertragen.
- Waschen Sie den Rest der T-Zellen einmal in 5 ml PBS, um den Restvektor zu eliminieren. Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min. Dekantieren Sie das PBS und setzen Sie das Zellpellet in T-Zellkulturmedium in einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml wieder auf.
- Teilen Sie die T-Zellen in zwei Kulturen auf, die für Tag 5 und Tag 9 bestimmt sind. Zähl-T-Zellen nach Durchflusszytometrie mit Zählperlen (Materialtabelle) und monoklonalen Antikörpern gegen menschliche CD4 und CD8 sowie einem Lebensfähigkeitsfarbstoff (Materialtabelle).
- Zur Messung der T-Zellkonzentration können Sie einen Master-Mix mit 500 l PBS, 5 l Zählperlen, 10 l 7-Amino-Actinomycin D-Zelllebensfähigkeitslösung, 4 l CD4-FITC und 4 l CD8-APC, vorbereiten. Fügen Sie dem Master-Mix 40 L T-Zellen hinzu und messen Sie die Zellkonzentration anhand der Durchflusszytometrie basierend auf der Anzahl der lebenden T-Zellen/Perlenzahlen. Refeed, um die Kulturen in einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml jeden zweiten Tag zu erhalten.
- Zählen Sie am 5. Tag die Kulturen des 5. Tages, wie in den Schritten 1.3 und 1.5 beschrieben.
- Waschen Sie am 7. Tag 0,5 x 106 T-Zellen in PBS und setzen Sie sie in 100 l Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierungspuffer (FACS) wieder auf. Detektieren Sie die EXPRESSION von CAR-Oberflächenproteinen durch Immunfärbung mit einem fluoreszierend konjugierten Anti-CAR19-Idiotyp durch Durchflusszytometrie.
- Zählen Sie am 9. Tag die Kulturen und das Kryokonserven, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
2. Phänotypische Beurteilung der T-Zell-Differenzierung
- Vorbereiten eines Master-Mix mit vortitierten Antikörpern für Anti-CD3-BV605 (Klon OKT3), Anti-CD14-Pacific Blue (PB) (Klon HCD14), Anti-CD19-PB (Klon HIB19), Anti-CD4-BV510 (Klon OKT4), Anti-CD8–H7APC (Klon SK1), Anti-CCR7–FITC (Klon 150503), Anti-CD45RO-PE (Klon UCHL1), Anti-CD27–PE-Cy7 (Klon 1A4CD27), Anti-CD95–PerCP-Cy5.5 (Clone DX2) und anti-CAR19-APC.
- Bereiten Sie individuelle Fluoreszenz-Minus-Eins-Steuerungen (FMO) für Anti-CD45RO-PE, Anti-CCR7-FITC, Anti-CD27-PE-Cy7 und Anti-CD95-PerCP-Cy5.5 vor, um positiv gefärbte Zellen vom Hintergrund zu unterscheiden.
- Bereiten Sie tote Zell-Färbung Lösung durch Verdünnen leben / tote Lager Reagenz (Tabelle der Materialien) 1:10,000 in PBS.
- Tauen Tag 3, Tag 5, und Tag 9 T-Zellen, die zuvor kryokonserviert waren. Zentrifuge 1 x 106 T Zellen aus jeder Gruppe bei 300 x g für 3 min. Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 3 min und entsorgen Sie die PBS.
- Mischen Sie T-Zellen mit abgestorbener Färbelösung für 15 min bei Raumtemperatur (RT), geschützt vor dem Licht.
- Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu, um den Färber farbstoff für tote Zellen zu löschen. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 3 min den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 100 l FACS-Puffer mit dem in Schritt 2.1 und 2.2 beschriebenen Antikörpercocktail wieder auf. 1 h bei 4 °C inkubieren.
- Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer und Zentrifuge bei 300 x g für 3 min hinzu, um ungebundenen Antikörper abzuwaschen. Wiederholen Sie dies dreimal mit dem FACS-Puffer.
- Zellen in 1% Paraformaldehyd (PFA) aussetzen und bei 4 °C lagern.
- Wenn die CD45RO-Expression nach der Fixierung abnimmt, analysieren Sie die Proben nach der Immunfärbung durch Durchflusszytometrie. Zur Beurteilung der Differenzierung, Gate in der folgenden Reihenfolge: Singlets (FSC-H vs FSC-A), Live CD3+ T Zellen (Dump [live-dead violet, CD14-PB und CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). In CD4+ und CD8+ Teilmengen, Gate auf CD45RO-PE vs CCR7-FITC naiv-ähnliche T-Zellen zu definieren (CD45RO-CCR7+), Tcm (CD45RO+CCR7+), Tem (CD45RO+CCR7-), und Tte (CD45RO-CCR7-). Um Tscm zu identifizieren, Gate auf CD27+ T-Zellen in naiven T-Zellen Population. In diesem Fach sind Tscm CD95+ und Tn cd95-.
3. In-Vitro-Funktionsanalyse
- CAR T Zellproliferation und Zytokinsekretion
- Überprüfen Sie die CAR-Expression sowie die Zelllebensfähigkeit, wie in den Schritten 1.5 und 1.7 beschrieben, durch Durchflusszytometrie.
- 5 x 106 T-Zellen aus jeder Gruppe (Tag 3, Tag 5 und Tag 9) mit PBS waschen und in einer 1-M-Lösung von Carboxyfluorescein-Diacetat-Präparaten (CFSE) in PBS für 3,5 min bei RT resuspendieren.
- Fügen Sie sofort 10 ml PBS mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) hinzu, um die Reaktion zu löschen.
- Zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 x g für 3 min. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Zählen Sie die Zellen am Ende der CFSE-Färbung mit einem Coulter-Zähler (Materialtabelle).
- CFSE-gefärbte Zellen (unstimuliert) ernten, in 1% PFA wieder aussetzen und bei 4 °C zur Analyse durch Durchflusszytometrie lagern.
- Inkubieren Sie die gewünschte Anzahl von CFSE-gebeizten CAR-T-Zellen mit bestrahltem K562-CD19 (Ziel) sowie K562-Wild-Typ (Kontroll)-Zellen im Verhältnis 1:1 für 120 h in zytokinfreien Medien- und Kulturbedingungen, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
- Nach 24 h zentrieren Sie das Kulturgefäß bei 300 x g für 5 min. Sammeln Sie 120 l zellulären Überstand. Bewerten Sie die aktivierungsabhängige Produktion von IL2- und IFN-, TNF-, GM-CSF- und anderen entzündlichen Zytokinen (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 und IL10) durch Luminex-Analysen gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
- Ersetzen Sie das in Schritt 3.1.7 gesammelte Überstandvolumen durch ein entsprechendes Volumen (120 l) frisches Medium.
- An Tag 3 (d.h. nach 96 h) zählen und re-feed in einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml mit Perlen-basierter Durchflusszytometrie wie zuvor in Schritt 1.5.
- Zählen Sie am 5. Tag die Live-CD3+ Zellen und berechnen Sie die Faltenänderung der lebenden T-Zellen relativ zur Anzahl der lebenden T-Zellen an Tag 0.
- Führen Sie eine umfassende Analyse der CFSE-Verdünnung durch, indem Sie CAR T-Zellen mithilfe der FlowJo-Software teilen, um aufeinanderfolgende Runden der Zellteilung hervorzuheben.
HINWEIS: Proliferationstests sind im FlowJo-Handbuch gut beschrieben.
- Zytotoxizitätstest
HINWEIS: Die Fähigkeit von CART19-Zellen, Zielzellen zu töten, die CD19 exdrücken, wird mit einem 51Cr-Release-Assay ausgewertet.- Beschriften Sie die Zielzellen durch Mischen von 5 x 105 K562-CD19, K562-Wild-Typ-Kontrollzellen oder NALM6-Leukämiezellen mit 50 l Na251CrO4 und 0,5 ml RPMI, ergänzt mit 10% FBS für 90 min im Inkubator bei 37 °C.
- Zentrifugenzellen bei 300 x g für 2,5 min. Entsorgen Sie den radioaktiven Überstand in geeigneten Entsorgungsbehältern und waschen Sie die Zielzellen in 5 ml PBS. Wiederholen Sie die Waschschritte zweimal.
- Setzen Sie die Zielzellen in phenolrot-freiem Medium mit 5% FBS aus. Verwenden Sie dieses Medium für den Rest der Prozedur, um den Hintergrund zu reduzieren.
- Nach Auswertung der CAR-Expression und Zelllebensfähigkeit durch Durchflusszytometrie (wie in Abschnitt 5.1 beschrieben) mischen SIE CAR-T-Zellen mit beschrifteten Zielzellen bei Effektor:Target(E:T)-Verhältnissen von 10:1, 3:1 und 1:1 in Dreifachform. Transfer auf eine 96-Well U Bodenplatte.
- Parallel dazu umfassen Sie Zielzellen allein und Zielzellen mit 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), um die spontane (S) und maximale (M) 51Cr-Freisetzung zu bestimmen.
- Zentrifugenzellen bei 300 x g für 5 min und inkubieren für 4 h oder 20 h in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2.
- Zentrifugieren Sie nach der vorgesehenen Zeit das Kulturgefäß bei 300 x g für 5 min. Sammeln Sie 35 L Zellüberstand und übertragen Sie es auf eine Leseplatte. Vermeiden Sie Blasen. Lassen Sie die Platte über Nacht trocknen.
- Versiegeln Sie die Platte mit einer Standardplattendichtung und zählen Sie mit einem flüssigen Szintillationszähler. Chromüberfluss im Überstand bietet einen Proxy für die Tötung von Zielzellen. Berechnen Sie den Prozentsatz der spezifischen Lyse wie folgt: 100 x (Zählungen pro Minute [cpm] experimentelle Veröffentlichung – cpm S Release)/ (cpm M release – cpm S release).
4. In Vivo Funktionsanalyse
- Erhalten Sie 6-10 Wochen alte NOD-SCID-Mäuse , die kein adaptives Immunsystem haben, und weisen Sie sie nach dem Zufallsprinzip der Behandlungs-/Kontrollgruppe zu.
- Injizieren Sie Tiere intravenös über Schwanzvene mit 1 x 106 NALM6 Zellen in 0,1 ml sterile PBS.
- Nach 5 bis 7 Tagen die Tumorengraftment durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) bestätigen. Injizieren Sie 150 mg/kg D-Luziferin an Mäuse, die mit Isofluran anbesstattet wurden (Das Volumen ist abhängig von der Körpermasse).
- Messen Sie Biolumineszenzwerte mit einem Bildgebungssystem. Quantifizieren Sie den Gesamtfluss mit der entsprechenden Software, indem Sie Rechtecke mit identischer Fläche um Mäuse zeichnen, die vom Kopf bis zu 50 % der Schwanzlänge reichen. Subtrahieren Sie den Hintergrund für jedes Bild einzeln.
- Nach der Leukämie-Infektion 3 x 106 Tag 9 CART19-Zellen, 0,5 x 106 Tage 3 CAR-T-Zellen oder entsprechende nicht transducierte (NTD) menschliche T-Zellen über Schwanzvene in einem Volumen von 100 l sterilen PBS/Ca2+injizieren.
HINWEIS: Da die Bioaktivität der Zellen, die in verschiedenen Intervallen während des Kulturprozesses geerntet werden, unterschiedlich ist, ist die gewählte Konzentration von Tag-3-Zellen niedriger als Tag 9. - Um das Fortschreiten der Krankheit zu bestimmen, messen Sie die Biolumineszenzwerte zweimal pro Woche, wie oben in Schritt 4.3 beschrieben.
- Um die CAR-T-Zellengraftierung zu bestimmen, sammeln Sie 75 L Blut durch retroorbitale Blutungen in einem EDTA-beschichteten Röhrchen. Übertragen Sie 50 l Blut in absolute Zählröhrchen.
- Blut mit Antikörpern gegen CD45, CD4, CD8 und CAR 30 min bei RT färben. Fügen Sie den Röhrchen und Wirbeln 400 l 1x FACS-Lysinglösung gründlich hinzu. Analysieren Sie nach der Färbung den Oberflächenmarkerausdruck durch Durchflusszytometrie.
HINWEIS: Andere Oberflächenmarker können verwendet werden, um den Differenzierungs- und Erschöpfungsstatus der T-Zellen im Blut zu bewerten. - Um den Zytokinspiegel im Blut zu messen, zentrifugieren Sie das Blut bei 1.200 x g für 30 min bei 4 °C, um Serum von der oberen Blutschicht zu trennen.
- Serum sammeln und die Zytokine mit einer bestimmten Leseplatte gemäß den Anweisungen des Herstellers messen.
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Representative Results
Mit den oben beschriebenen Methoden stimulierten und erweiterten wir T-Zellen für 3 oder 9 Tage(Abbildung 1A,B). Wir analysierten auch ihr Differenzierungsprofil, wie in der in Abbildung 1Cbeschriebenen Gating-Strategie angegeben, indem wir die Häufigkeit von verschiedenen Glykoproteinen, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, gemessen haben. Wir zeigen eine fortschreitende Verschiebung hin zur Effektordifferenzierung im Laufe der Zeit während der ex vivo Kultur (Abbildung 1D). Wir bewerteten die Effektorfunktion und die proliferative Kapazität der CAR-T-Zelle als Reaktion auf Antigen. Wir zeigen, dass Zellen, die weniger erweitert wurden (früher geerntet), funktionell überlegen waren als die Zellen, die über eine längere Dauer ausgiebig kultiviert wurden. Tag 3 CART19-Zellen haben eine verbesserte proliferative und zytolytische Fähigkeit bei Restimulation mit ihrem Cognate Ligand relativ zu Tag 9 (Abbildung 2A,B).
In einem menschlichen Xenograft-Moue-Modell von ALL verglichen wir die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die nach 3 Tagen geerntet wurden, mit 9 Tagen(Abbildung 3A). Wir zeigten eine dosisabhängige antileukämische Reaktion für die CART19-Zellen, die 9 Tage lang mit einer vollständigen Reaktion auf eine hohe Dosis von 3 x 106 und einem Verlust der Wirksamkeit für die niedrige Dosis von 0,5 x 106erzeugt wurden. Der Tag 3 CART19 Zellen zeigten eine anhaltende Tumorkontrolle sowohl in hohen als auch in niedrigen Dosen von CART19-Zellen (Abbildung 3B). Diese Reaktion war mit der absoluten Anzahl von CART19 im peripheren Blut von Mäusen (Abbildung 3C) verbunden, die auf der Grundlage des oben beschriebenen Protokolls analysiert wurde. Diese Ergebnisse aus unserer umfassenden Bewertung der CAR-T-Funktion belegen, dass DIE früher geernteten CAR-T-Zellen (Tag 3) die am 9. Tag geernteten CAR-T-Zellen übertreffen.
Abbildung 1: Repräsentatives Proliferations- und Differenzierungsprofil von CAR-T-Zellen. (A) CART19 Zellexpansion nach Stimulation mit Anti-CD3/CD28 magnetischen Perlen. (B) Die Zellgröße wurde durch Coulter-Analysen in der gesamten Kultur bewertet. (C) Repräsentative Gating-Strategie für die phänosepic Analyse von T-Zellen. (D) Zeitliche Analyse der T-Zelldifferenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Tag 3 CART19-Zellen zeigen eine verbesserte Effektorfunktion und Proliferation relativ zu Tag 9 Zellen. (A) CART19-Zellen wurden am Tag 3 und 9 geerntet und im angegebenen E:T-Verhältnis mit CD19-exemitten K562-Zellen (K562-19) oder Wildtyp K562 (K562-Wild-Typ) mitkultiviert. Die spezifische Zytotoxizität wurde mit 51Cr-Freisetzung nach 4 h gemessen. (B) CSFE-markierte CART19-Zellen wurden mit K562-19, K562-Wild-Typ oder Medium nur für 120 h bei einem 1:1 E:T-Verhältnis kokultiviert. Die Zellen wurden zu angegebenen Zeitpunkten geerntet. Absolute Zählungen wurden durch Durchflusszytometrie bewertet. Relative Faltenänderungen der Live-T-Zellzahl, normalisiert auf T-Zellanzahl am Tag 0, werden angezeigt. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt, Standardabweichung (SD). P < 0.001 Vergleich von Tag 3 mit Tag 9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Tag 3 CART19-Zellen sind in vivo stärker als Tageszellen. (A) Schematic des Xenograft-Modells und der CART19-Zellbehandlung. Tag 3 und 9 CART19 Zellen oder Kontroll-T-Zellen (UTD) wurden in Mäusen 5-7 Tage nach DerAlm6-Injektion IV-injiziert. (B) Quantifizierung der Tumorbelastung durch Biolumineszenzbildgebung am 38. Tag bei Mäusen, die mit CART19-Zellen behandelt wurden, die am 3. und 9. Tag geerntet wurden. Symbole stellen jeweils eine Maus dar. Horizontale schwarze Linie: Mittelwert jeder Gruppe. (C) Absolute periphere Blut-CD45+ T-Zellzahl wurde alle zwei Wochen nach CART19-Zellinjektion gemessen und am Ende des Experiments mit einer geeigneten Zählmethode (wie TruCount) Ungepaartmann-Whitney-Test, zweischwanzig verwendet. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier beschreiben wir Ansätze zur Messung der Funktion und Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die in unterschiedlichen Intervallen in der Ex-vivo-Kultur geerntet werden. Unsere Methoden bieten umfassende Einblicke in Assays zur Beurteilung der Proliferativen Kapazität sowie der Effektorfunktion in vitro. Wir beschreiben, wie man die AKTIVITÄT von CAR T-Zellen nach Stimulation durch die CAR misst und Xenograft-Modelle von Leukämie mit CAR-T-Zellen detailliert beschreibt, die am Tag 3 gegen Tag 9 ihrer logarithmischen Expansionsphase geerntet wurden.
Es gibt inhärente Herausforderungen beim Vergleich der Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die während der Ex-vivo-Expansion zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet werden. Da die Menge der T-Zellen, die über eine 3-Tage-Kulturdauer erzeugt werden, gering ist, kann es zu wenig Zahlen geben, um eine umfassende Bewertung der Funktion durchzuführen. Dies wird im Zusammenhang mit Patienten-T-Zellen verschärft, deren proliferative Fähigkeit oft durch extrinsische und intrinsische Faktoren vermindert wird20.
Wie viele CAR-T-Zellen sollten infundiert werden, wenn man bedenkt, dass Tag 3 Zellen eine verbesserte metabolische und proliferative Fähigkeit aufweisen, verglichen mit ihren Tag 9 Pendants, die ihre logarithmische proliferative Phase verlassen? Wir schätzten, welche Anzahl von Tag 3 CAR T-Zellen 3 x 106 erreichen würden, wenn sie für weitere 6 Tage in der Kultur erweitert würden. Wir verwendeten diese Schätzung, um zu informieren, wie viele Tag 3 CAR T-Zellen infundiert werden sollten (0,5 x 106), um äquivalent zu Tag 9 zu vergleichen. Dementsprechend wenden wir den "Stresstest"-Ansatz an, um die Bioaktivität, Wirksamkeit und Persistenz von infundierten CAR-T-Zellen zu vergleichen. Die Verringerung der Anzahl der infundierten CAR-T-Zellen von 3 x 106 auf 0,5 x 106 zeigt Unterschiede, die andernfalls durch die Sättigung der Zahlen verdeckt würden. Mechanistisch beruht die Tumorkontrolle auf der Anhäufung ausreichender Effektorzellen, um ihre entsprechenden Zielzellen zu lysieren. Bei hohen Infusionszahlen weisen sowohl Tag 3 als auch Tag 9 CAR T-Zellen funktionelle Kompetenz auf.
Eine weitere Herausforderung bei der Arbeit mit Tag 3 CAR T-Zellen ist ihre feste Bindung an die stimulierende Oberfläche. Sie von den magnetischen Perlen zu verdrängen erfordert sich wiederholendes Pipettieren, um sie mechanisch zu trennen und ihre Erholung von der Kultur zu verbessern. Im Gegensatz dazu haben Tag 9 Zellen bereits 1) von den Perlen gelöst, und 2) verdünnt die Perlen in einem solchen Ausmaß, dass sie mit relativer Leichtigkeit geerntet werden können.
Eine weitere wichtige Variable im CAR T-Zellherstellungsprozess ist die Wahl des Zellkulturmediums. RPMI-basiertes Medium, das mit FBS ergänzt wurde, wird häufig für experimentelle Zwecke verwendet. Im Gegensatz dazu werden entweder X-VIVO 15 oder OpTmizer, ergänzt mit humanem Serum, in klinischen Anwendungen bevorzugt. Diese sind zwar weniger charakterisiert, können aber Komponenten enthalten, die die T-Zellexpansion in einem kürzeren Zeitraum erleichtern. Ihre Auswirkungen auf die Differenzierung sind unbekannt. Zusätzlich beeinflusst die Zugabe von Zytokinen Wachstum, Überleben und Phänotyp. Während IL-2 die schnelle Proliferation und Differenzierung in Effektorzellen antreibt, verbessern IL-7 und IL-15, die ihren Ursprung im Lymphknoten haben und bekannte Rollen in der otostatischen Persistenz haben, die Expansion von T-Zellen und fördern einen Memory-Stamm/Zentralgedächtnis-Phänotyp22,23,24,25.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Finanzierung durch Novartis Pharmaceuticals durch eine Forschungsallianz mit der University of Pennsylvania (Michael C. Milone) sowie den St. Baldrick es Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
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