Summary
Describimos un enfoque para generar de forma fiable células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) y probar su diferenciación y función in vitro e in vivo.
Abstract
La inmunoterapia adoptiva es prometedora para el tratamiento del cáncer y las enfermedades infecciosas. Describimos un enfoque simple para transducir células T humanas primarias con receptor de antígeno quimérico (CAR) y expandir su progenie ex vivo. Incluimos ensayos para medir la expresión CAR, así como la diferenciación, la capacidad proliferativa y la actividad citolítica. Describimos ensayos para medir la producción de citoquinas efector y la secreción inflamatoria de citoquinas en células CAR T. Nuestro enfoque proporciona un método fiable y completo para el cultivo de células T CAR para modelos preclínicos de inmunoterapia adoptiva.
Introduction
Los receptores de antígeno quimérico (CAR) proporcionan un enfoque prometedor para redirigir las células T contra antígenos tumorales distintos. Los CAR son receptores sintéticos que unen un objetivo de antígeno. Aunque su composición precisa es variable, los RCA generalmente contienen 3 dominios distintos. El dominio extracelular dirige la unión a un antígeno objetivo y normalmente se compone de un fragmento de anticuerpo de cadena única vinculado a la CAR a través de una bisagra extracelular. El segundo dominio, comúnmente derivado de la cadena CD3 del complejo del receptor de células T (TCR), promueve la activación de la célula T después de la participación de la CAR. Un tercer dominio coestimulante se incluye para mejorar la función de las células T, injerto, metabolismo, y la persistencia. El éxito de la terapia con células T CAR en diversas neoplasias malignas hematopoyéticas incluyendo leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC) y mieloma múltiple pone de relieve la promesa terapéutica de este enfoque1,2,3,4,5,6. Las recientes aprobaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para dos terapias de células T CAR específicas de CD19, tisagenlecleucel para ADULTOs pediátricos y jóvenes adultos ALL y axicabtagene ciloleucel para linfoma difuso de células B grandes, refuerza el mérito traslacional de la Terapia de células T CAR.
Los enfoques basados en T DE CAR implican el aislamiento de los glóbulos T de la sangre periférica, la activación, la modificación genética y la expansión ex vivo. La diferenciación es un parámetro importante que regula la eficacia de las células T de la CAR. En consecuencia, la restricción de la diferenciación de células T durante el cultivo ex vivo mejora la capacidad del producto infundido para injertar, expandir y persistir, proporcionando inmunovigilancia a largo plazo después de la transferencia adoptiva2,7,8,9. Las células T consisten en varios subconjuntos distintos, incluyendo: células T ingenuas (Tn), memoria central (Tcm), memoria del efector (Tem), efector diferenciado (Tte) y memoria de células madre (Tscm). Los células T diferenciadas por efector tienen una potente capacidad citolítica; sin embargo, son de corta duración y injertan mal10,11,12. Por el contrario, las células T con un fenotipo menos diferenciado, incluidas las células T ingenuas y Tcm, presentan capacidades superiores de injerto y proliferación tras la transferencia celular adoptiva13,14,15,16,17,18. La composición de las células T recogidas en el producto prefabricado puede variar entre los pacientes y se correlaciona con el potencial terapéutico de las células T CAR. La proporción de células T con un inmunofenotipo de forma ingenua en el producto de aféresis inicial está altamente correlacionada con el injerto y la respuesta clínica19.
La duración del cultivo es un parámetro importante que influye en la diferenciación en las células T CAR preparadas para la transferencia adoptiva. Recientemente desarrollamos un enfoque para generar células T CAR de calidad superior utilizando un paradigma de cultivo abreviado20. Utilizando nuestro enfoque, mostramos que el cultivo limitado da lugar a células T CAR con función efectora superior y persistencia después de la transferencia adoptiva en modelos de xenoinjerto de leucemia. Aquí, presentamos los enfoques para generar confiablemente células CART19 (células T autólogas diseñadas para expresar scFv anti-CD19 conectados a CD3 y los dominios de señalización 4-1BB) e incluir una descripción detallada de los ensayos que proporcionan información sobre la bioactividad y eficacia de CAR T antes de la transferencia adoptiva.
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Protocol
Todos los estudios en animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.
1. Activación, transducción y expansión de células T
- Active células T humanas primarias frescas o crioconservadas mezclando con cuentas magnéticas anti CD3/CD28 (por ejemplo, cuentas de dinadas) a una proporción de 3 perlas por célula T en platos de cultivo celular de 6 polos. Células T de cultivo en x-VIVO 15 medio suplementado con 5% de suero AB humano normal, 2 mM de L-glutamina, 20 mM HEPES e IL2 (100 unidades/ml). Mantenga las células T a una concentración de 106 células T/ml durante la expansión. Cultivo de células T a 37oC, 20% O2y 95% de humedad con 5%CO2.
- Después de la estimulación durante la noche, agregue el sobrenadante lentiviral a las células T activadas. Calcular el volumen de sobrenadante necesario para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 3 a 5.
NOTA: El plásmido de lentivirus CD19-BB-CAR consta de una bisagra CD8, un dominio coestimulador 4-1BB y un dominio de señalización CD3-21. CD19-BB- Supernadante lentiviral se generó como se describió anteriormente21. - En el día 3, recoger una alícuota representativa de células para la criopreservación. Antes de la criopreservación, retire las perlas magnéticas mediante un suave pipeteo y separación magnética. Preparar el medio de congelación que contenga solución salina tamponada de fosfato (PBS) con 0,5% de dimetilsulfóxido (DMSO) y almacenar en 4 oC hasta su uso.
- Centrifugar las células T a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y agregue 5 ml de PBS. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min y desechar el PBS.
- Resuspender el pellet celular en 1 ml de medio de criopreservación en frío. Congele las células T en un recipiente de congelación refrigerado y guárdelas a -80 oC durante 48 h. Transfiera las células congeladas a nitrógeno líquido.
- Lave el resto de las células T una vez en 5 ml de PBS para eliminar el vector residual. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Decantar el PBS y resuspender el pellet celular en el medio de cultivo de células T a una concentración de 0,5 x 106 células/ml.
- Divida las células T en dos cultivos, designados para el día 5 y el día 9. Contar las células T por citometría de flujo utilizando cuentas de recuento(Tabla de materiales)y anticuerpos monoclonales para CD4 y CD8 humanos, así como un tinte de viabilidad (Tabla de materiales).
- Para medir la concentración de células T, prepare una mezcla maestra que contenga 500 ml de PBS, 5 l de perlas de conteo, 10 ml de la solución de viabilidad celular D de 7-Amino-actinomicina, 4 ml de CD4-FITC y 4 l de CD8-APC. Agregue 40 sl de células T a la mezcla maestra y mida la concentración de células por citometría de flujo en función del número de celdas T activas/recuentos de cuentas de cuentas. Realimentar para mantener los cultivos a una concentración de 0,5 x 106 células/ml cada dos días.
- El día 5, cuente y criopreserve las culturas del día 5 como se describe en los pasos 1.3 y 1.5.
- En el día 7, lave 0,5 x 106 células T en PBS y resuspenda en 100 l de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS). Detectar la expresión de proteína superficial CAR mediante inmunomanchacon un idiotipo anti-CAR19 conjugado fluorescentemente por citometría de flujo.
- El día 9, cuente las culturas del día 9 y criopreserve como se describe en el paso 1.3.
2. Evaluación fenotípica de la diferenciación de células T
- Preparar una mezcla maestra que contenga anticuerpos pretitrados para anti-CD3-BV605 (clon OKT3), anti-CD14–Pacific Blue (PB) (clon HCD14), anti-CD19–PB (clon HIB19), anti-CD4–BV510 (clon OKT4), anti-CD8–H7APC (clon SK1), anti-CCR-7-FITC (clon 15053), anti-CD45RO-PE (clon UCHL1), anti-CD27–PE-Cy7 (clon 1A4CD27), anti-CD95-PerCP-Cy5.5 (Clon DX2) y anti-CAR19-APC.
- Preparar controles individuales de fluorescencia menos uno (FMO) para controles anti-CD45RO–PE, anti-CCR7–FITC, anti-CD27–PE-Cy7 y anti-CD95–PerCP-Cy5.5 para distinguir las células manchadas positivamente del fondo.
- Prepare la solución de tinción de células muertas diluyendo el reactivo vivo/muerto(Tabla de materiales)1:10.000 en PBS.
- Descongelar el día 3, día 5, y día 9 Células T que fueron previamente crioreservados. Centrifugar 1 x 106 células T de cada grupo a 300 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante. Lave las células una vez con PBS. Centrifugar a 300 x g durante 3 min y desechar el PBS.
- Mezclar las células T con la solución de tinción muerta durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT), protegida de la luz.
- Agregue 1 ml de tampón FACS para apaciar el tinte de tinción de células muertas. Centrifugar a 300 x g durante 3 min, desechar el sobrenadante y resuspender el gránulos celulares en 100 ml de tampón FACS que contenga el cóctel de anticuerpos descrito en los pasos 2.1 y 2.2. Incubar durante 1 h a 4oC.
- Añadir 1 ml de tampón FACS y centrífuga a 300 x g durante 3 min para lavar el anticuerpo no unido. Repita tres veces con el búfer FACS.
- Resuspender las células en 1% de paraformaldehida (PFA) y almacenar a 4 oC.
- A medida que la expresión CD45RO disminuye después de la fijación, analice las muestras por citometría de flujo después de la inmunomancha. Para evaluar la diferenciación, puerta en el siguiente orden: singlets (FSC-H vs FSC-A), células CD3+ T en vivo (Dump [violeta vivo-muerto, CD14-PB y CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). En CD4+ y CD8+ subconjuntos, puerta en CD45RO-PE vs CCR7-FITC para definir células T ingenuas (CD45RO-CCR7+), Tcm (CD45RO+CCR7+), Tem (CD45RO+CCR7-) y Tte (CD45RO-CCR7-). Para identificar El Tscm, la puerta en las células CD27+ T en la población de células T ingenuas. En este compartimiento, Tscm son CD95+ y Tn son CD95-.
3. Análisis Funcional In Vitro
- Proliferación de células T CAR y secreción de citoquinas
- Verifique la expresión CAR así como la viabilidad de la célula como se describe en los pasos 1.5 y 1.7, por la citometría de flujo.
- Lavar 5 x 106 células T de cada grupo (día 3, día 5 y día 9) con PBS y resuspender en una solución de 1 M de solución de diacetato de carboxifluoresceína éster de succinimidil (CFSE) en PBS durante 3,5 min a RT.
- Añadir inmediatamente 10 ml de PBS que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS) para saciar la reacción.
- Centrifugar la solución a 300 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y repita este paso de lavado tres veces. Cuente las celdas al final de la tinción CFSE utilizando un contador Coulter (Tabla de Materiales).
- Cosecha células teñidas cfSE (no estimuladas), resuspenden en 1% de PFA y almacenar a 4 oC para su análisis por citometría de flujo.
- Incubar el número deseado de células CAR T teñidas con CFSE con células de tipo K562-CD19 (objetivo) irradiadas, así como de tipo K562-wild (control) en una proporción de 1:1 para 120 h en medio de cultivo libre de citoquinas y condiciones de cultivo como se describe en el paso 1.1.
- Después de 24 h, centrifugar el recipiente de cultivo a 300 x g durante 5 min. Recoger 120 l de sobrenadante celular. Evaluar la producción dependiente de la activación de IL2, IFN, TNF, GM-CSF y otras citoquinas inflamatorias (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 e IL10) por luminex analiza de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
- Sustituya el volumen de sobrenadante que se recopiló en el paso 3.1.7 por un volumen equivalente (120 l) de medio fresco.
- En el día 3 (es decir, después de 96 h), cuente y vuelva a alimentar a una concentración de 0,5 x 106 celdas/ml utilizando citometría de flujo basada en perlas como se ha incluido anteriormente en el paso 1.5.
- En el día 5, cuente el CD3vivo + las células y calcule el cambio de plegado de las células T vivas en relación con el recuento de células T vivas en el día 0.
- Realizar un análisis exhaustivo de la dilución CFSE en la división de células T CAR utilizando el software FlowJo para resaltar rondas sucesivas de la división celular.
NOTA: Los ensayos de proliferación están bien descritos en el manual de FlowJo.
- Ensayo de citotoxicidad
NOTA: La capacidad de las células CART19 para eliminar las células objetivo que expresan CD19 se evalúa mediante un ensayo de liberación de 51Cr.- Etiquete las células diana mezclando 5 x 105 K562-CD19, células de control de tipo K562-wild, o células de leucemia NALM6 con 50 s de Na251CrO4 y 0,5 ml de RPMI suplementadas con 10% de FBS para 90 min en la incubadora a 37 oC.
- Células centrífugas a 300 x g durante 2,5 min. Deseche el sobrenadante radiactivo en recipientes de eliminación adecuados y lave las células diana en 5 ml de PBS. Repita los pasos de lavado dos veces.
- Resuspenda las células diana en un medio libre de rojo fenol que contenga un 5% de FBS. Utilice este medio para el resto del procedimiento para reducir el fondo.
- Después de evaluar la expresión CAR y la viabilidad celular por citometría de flujo (como se describe en la sección 5.1), mezcle las células T CAR con las celdas de destino etiquetadas en las relaciones effector:target (E:T) de 10:1, 3:1 y 1:1, por triplicado. Transfiera a una placa inferior U de 96 pocillos.
- Paralelamente, incluya las células diana solas y las células diana con 1% de sulfato de dodecilo sódico (SDS), para determinar la liberación espontánea (S) y máxima (M) 51Cr, respectivamente.
- Células centrífugas a 300 x g durante 5 min e incubar durante 4 h o 20 h en una incubadora de 37oC con 5% deCO2.
- Después de la hora designada, centrifugar el recipiente de cultivo a 300 x g durante 5 min. Recoger 35 l de sobrenadante celular y transferirlo a una placa lectora. Evite las burbujas. Deje que el plato se seque durante la noche.
- Sellar la placa con un sello de placa estándar y contar con un contador de centelleo líquido. La abundancia de cromo en el sobrenadante proporciona un proxy de la matanza de células objetivo. Calcule el porcentaje de lisis específica de la siguiente manera: 100 x (cuenta por minuto [cpm] versión experimental – liberación cpm S)/ (liberación cpm M – liberación cpm S).
4. Análisis funcional in Vivo
- Obtenga ratones DE10 semanas de edad de NOD-SCIDc–/– (NSG), que carecen de un sistema inmunitario adaptativo, y asígnelos al grupo de tratamiento/control aleatoriamente.
- Inyectar animales por vía intravenosa a través de la vena de la cola con 1 x 106 células NALM6 en PBS estéril de 0,1 ml.
- Después de 5 a 7 días, confirme el injerto tumoral por imágenes de bioluminiscencia (BLI). Inyectar 150 mg/kg de D-luciferina a ratones que han sido anestesiados con isoflurano (el volumen depende de la masa corporal).
- Mida los valores de bioluminiscencia utilizando un sistema de imágenes. Cuantifique el flujo total utilizando el software correspondiente dibujando rectángulos de área idéntica alrededor de ratones, alcanzando desde la cabeza hasta el 50% de la longitud de la cola. Restar el fondo de cada imagen individualmente.
- Después de establecer la leucemia, inyectar 3 x 106 día 9 células CART19, 0,5 x 10 6 día3 células T CAR, o las correspondientes células T humanas no transducidas (NTD) a través de la vena de cola en un volumen de 100 ml de PBS estéril/Ca2+.
NOTA: Como la bioactividad de las células cosechadas a varios intervalos durante el proceso de cultivo es diferente, la concentración elegida de células del día 3 es inferior al día 9. - Para determinar la progresión de la enfermedad, mida los valores de bioluminiscencia dos veces por semana como se describe anteriormente en el paso 4.3.
- Para determinar el injerto de células T CAR, recoja sangre de 75 ml mediante sangrado retroorbital en un tubo recubierto con EDTA. Transfiera 50 s de sangre a tubos de conteo absolutos.
- Sangre de mancha con anticuerpos contra CD45, CD4, CD8 y CAR durante 30 min a RT. Añadir 400 l de 1x solución de leite FACS a los tubos y vórtice a fondo. Después de la tinción, analice la expresión del marcador de superficie por citometría de flujo.
NOTA: Otros marcadores de superficie se pueden utilizar para evaluar la diferenciación y el estado de agotamiento de los glóbulos T en la sangre. - Para medir los niveles de citoquinas en la sangre, centrifugar la sangre a 1.200 x g durante 30 min a 4 oC para separar el suero de la capa superior de sangre.
- Recoja el suero y mida las citoquinas con una placa de lectura designada de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Representative Results
Usando los métodos descritos anteriormente, estimulamos y expandimos las células T durante 3 o 9 días(Figura 1A,B). También analizamos su perfil de diferenciación, como lo indica la estrategia de medición esbozada en la Figura 1C,midiendo la abundancia de glicoproteínas distintas expresadas en la superficie celular. Mostramos un cambio progresivo hacia la diferenciación del efector a lo largo del tiempo durante el cultivo ex vivo(Figura 1D). Evaluamos la función efectora y la capacidad proliferativa de la célula T CAR en respuesta al antígeno. Mostramos que las células que se expandieron menos (cosechadas anteriormente) eran funcionalmente superiores en comparación con las células cultivadas ampliamente durante una duración más larga. Las células CART19 del día 3 han mejorado la capacidad proliferativa y citolítica al re-estimulación con su ligando cognado en relación con el día 9(Figura 2A,B).
En un modelo de moue de xenoinjerto humano de ALL, comparamos la potencia de las células T CAR cosechadas a los 3 días frente a 9 días(Figura 3A). Mostramos una respuesta anti leucemia dependiente de la dosis para las células CART19 generadas durante 9 días con una respuesta completa para dosis altas de 3 x 106 y una pérdida de eficacia para la dosis baja de 0,5 x 106. El día 3 células CART19 mostraron control tumoral persistente en dosis altas y bajas de células CART19(Figura 3B). Esta respuesta se asoció con el recuento absoluto de CART19 en la sangre periférica de ratones(Figura 3C) que se analizó en función del protocolo descrito anteriormente. Estos resultados obtenidos de nuestra evaluación exhaustiva de la función CAR T proporcionan evidencia de que las células CAR T cosechadas antes (día 3) superan a las células T DE CAR cosechadas el día 9.
Figura 1: Perfil representativo de proliferación y diferenciación de células T CAR. (A) Expansión celular CART19 después de la estimulación con perlas magnéticas anti-CD3/CD28. (B) El tamaño de la célula fue evaluado por el análisis de Coulter en toda la cultura. (C) Estrategia representativa de la gating para el análisis fenotípico de células T. (D) Análisis temporal de la diferenciación de células T. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Día 3 Cart19 células muestran la función efector mejorada y la proliferación en relación con las células del día 9. (A) Las células CART19 se cosecharon los días 3 y 9 y se cocultivaron en la relación E:T indicada con células K562 con indicación DE CD19 (K562-19) o K562 de tipo salvaje (tipo K562-wild). La citotoxicidad específica se midió por liberación de 51Cr después de 4 h.(B) Las células CART19 etiquetadas con CSFE fueron co-cultivadas con K562-19, K562-wild-type, o medium sólo para 120 h en una relación 1:1 E:T. Las células se cosecharon en los puntos de tiempo indicados. Los recuentos absolutos se evaluaron mediante citometría de flujo. Se muestran los cambios de pliegue relativos del recuento de células T vivas normalizados al recuento de células T en el día 0. Los datos se trazan como media s/ desviación estándar (SD). P < 0.001 comparando el día 3 con el día 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Día 3 Las células CART19 son más potentes in vivo que las células del día 9. (A) Esquema del modelo de xenoinjerto y tratamiento celular CART19. Las células cart19 de día 3 y 9 de CART19 o las células T de control (UTD) se inyectaron con vía intravenosa en ratones 5 a 7 días después de la inyección de NALM6. (B) Cuantificación de la carga tumoral mediante imágenes de bioluminiscencia el día 38 en ratones tratados con células CART19 cosechadas el día 3 y el día 9. Los símbolos representan un ratón cada uno. Línea negra horizontal: media de cada grupo. (C) Los recuentos absolutos de células periféricas CD45+ T se midieron cada dos semanas después de la inyección de células CART19 y al final del experimento mediante un método de recuento adecuado (como TruCount) Prueba Unpaired Mann-Whitney, se utilizó la prueba de dos colas. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí describimos enfoques para medir la función y eficacia de las células T CAR cosechadas a intervalos variables a lo largo del cultivo ex vivo. Nuestros métodos proporcionan una visión completa de los ensayos diseñados para evaluar la capacidad proliferativa, así como la función del efector in vitro. Describimos cómo medir la actividad de los linfocitos T después de la estimulación a través de la CAR y los modelos de xenoinjerto de detalle de la leucemia utilizando células T CAR cosechadas en el día 3 frente al día 9 de su fase de expansión logarítmica.
Existen desafíos inherentes en la comparación de la eficacia de las células T CAR cosechadas en diferentes momentos durante la expansión ex vivo. Como la cantidad de células T generadas durante una duración de cultivo de 3 días es baja, puede haber números insuficientes para realizar una evaluación completa de la función. Esto se exacerba en el contexto de los células T del paciente cuya capacidad proliferativa a menudo se reduce debido a factores extrínsecos e intrínsecos20.
¿Cuántas células T CAR deben ser infundidas dado que las células del día 3 exhiben mayor capacidad metabólica y proliferativa en comparación con sus contrapartes del día 9 que están saliendo de su fase proliferativa logarítmica? Estimamos qué número de células T del día 3 CAR llegarían a 3 x 106 si se expandieran durante 6 días más en cultivo. Usamos esta estimación para informar cuántos días 3 células T CAR deben ser infundidas (0.5 x 106) para comparar equivalentemente al día 9. En consecuencia, aplicamos el enfoque de "prueba de esfuerzo" para comparar la bioactividad, eficacia y persistencia de células T CAR infundidas. La reducción del número de células T CAR infundidas de 3 x 106 a 0,5 x 106 revela diferencias que de otro modo serían enmascaradas por saturación de números. Mecanísticamente, el control tumoral se basa en la acumulación de suficientes células efector para cargar sus correspondientes células diana. A un gran número de infusión, tanto el día 3 como el día 9 Células T CAR exhiben competencia funcional.
Otro desafío en el trabajo con el día 3 CÉLULAs T CAR es su firme fijación a la superficie estimulante. Desplazarlos de las cuentas magnéticas requiere pipeteo repetitivo para disociarlos mecánicamente y mejorar su recuperación de la cultura. Por el contrario, las células del día 9 tienen 1) ya separadas de las cuentas, y 2) diluyeron las cuentas hasta tal punto que se pueden cosechar con relativa facilidad.
Otra variable importante en el proceso de fabricación de células T CAR es la elección del medio de cultivo celular. Medio basado en RPMI que se ha complementado con FBS se utiliza comúnmente con fines experimentales. Por el contrario, en aplicaciones clínicas se prefieren X-VIVO 15 u OpTmizer, complementados con suero humano. Si bien estos se caracterizan menos, pueden contener componentes que facilitan la expansión de la célula T en un período de tiempo más corto. Su impacto en la diferenciación es desconocido. Además, la adición de citoquinas influye en el crecimiento, supervivencia, y fenotipo. Mientras que IL-2 impulsa la rápida proliferación y diferenciación en células efectoras, IL-7 e IL-15, que se originan en el ganglio linfático y tienen roles conocidos en la persistencia homeostática, mejora la expansión de las células T y promueve un fenotipo de memoria madre/memoria central22,23,24,25.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte a través de fondos proporcionados por Novartis Pharmaceuticals a través de una alianza de investigación con la Universidad de Pensilvania (Michael C. Milone) así como el Premio Académico de la Fundación St. Baldrick (Saba Ghassemi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
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