Descriviamo un approccio per generare in modo affidabile le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) e testare la loro differenziazione e funzione in vitro e in vivo.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per l'immunoterapia adottiva
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'immunoterapia adottiva promette per il trattamento del cancro e delle malattie infettive. Descriviamo un semplice approccio per trasdurre le cellule T umane primarie con il recettore dell'antigene chimerico (CAR) ed espandere la loro progenie ex vivo. Includiamo saggi per misurare l'espressione CAR, nonché la differenziazione, la capacità proliferare e l'attività citolitica. Descriviamo i saggi per misurare la produzione di citochine e la secrezione infiammatoria di citochina nelle cellule CAR T. Il nostro approccio fornisce un metodo affidabile e completo per la coltura delle cellule T CAR per modelli preclinici di immunoterapia adottiva.
Introduzione
I recettori degli antigeni chimerici (CAT) forniscono un approccio promettente per reindirizzare le cellule T contro antigeni tumorali distinti. I CR sono recettori sintetici che legano un bersaglio dell'antigene. Mentre la loro composizione precisa è variabile, i CAR contengono generalmente 3 domini distinti. Il dominio extracellulare dirige il legame verso un antigene bersaglio ed è in genere costituito da un frammento di anticorpo a catena singola collegato alla CAR tramite una cerniera extracellulare. Il secondo dominio, comunemente derivato dalla catena CD3 del complesso del recettore delle cellule T (TCR), promuove l'attivazione delle cellule T in seguito al coi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli studi sugli animali sono approvati dal Comitato Istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Pennsylvania.
1. Attivazione, trasduzione ed espansione delle cellule T
- Attivare le cellule T umane primarie fresche o crioconservate mescolando con perline magnetiche anti CD3/CD28 (ad esempio, dinaline) a un rapporto di 3 perline per cellula T in piatti di coltura cellulare a 6 pozzetti. Cellule T di coltura nel mezzo X-VIVO 15 integrate con 5% siero umano normale AB, 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, e IL2 (100 unità/mL). Mantenere le cellule T a una concentrazione di 106 cellule T/mL durante l....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Utilizzando i metodi descritti sopra, abbiamo stimolato e ampliato le cellule T per 3 o 9 giorni (Figura 1A,B). Abbiamo anche analizzato il loro profilo di differenziazione, come indicato dalla strategia di gating delineata nella Figura 1C, misurando l'abbondanza di glicoproteine distinte espresse sulla superficie cellulare. Mostriamo un progressivo spostamento verso la differenziazione degli effetti nel tempo durante la cultura.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui descriviamo gli approcci per misurare la funzione e l'efficacia delle cellule CAR T raccolte a intervalli variabili in tutta la coltura ex vivo. I nostri metodi forniscono una visione completa dei saggi progettati per valutare la capacità proliferaria e la funzione degli effetti in vitro. Descriviamo come misurare l'attività delle cellule CAR T dopo la stimolazione attraverso la CAR e i modelli di xenotrapianto dettagliati della leucemia utilizzando cellule CAR T raccolte al giorno 3 contro il giorno 9 della loro fas.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte attraverso il finanziamento fornito da Novartis Pharmaceuticals attraverso un'alleanza di ricerca con l'Università della Pennsylvania (Michael C. Milone) e il premio St. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anti CD3 / CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Topo Anti-Umano CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Topo anti-umano CD8 Anticorpo BD | Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Soluzione di lisi 10X Concentrato | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Provette di conteggio assoluto | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anticorpo CD4 | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anticorpo CD3 umano | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Kit di proliferazione cellulare | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-umano CD197 (CCR7) Anticorpo | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Topo anti-umano CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Siero umano | AB Valley Biomedical | HP1022 | |
| Umano IL-2 IS, grado premium Miltenyi | 130-097-744 | ||
| L-glutammina | Gibco | 28030-081 | |
| Contatore a scintillazione liquida, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Sonde | molecolari | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Anticorpo CD14 blu BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 | |
| Anticorpo CD19 anti-umano blu del Pacifico | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-umano CD45RO Anticorpo | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-umano CD95 (Fas) Anticorpo | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-umano CD27 Anticorpo | Beckman Coltro | A54823 | |
| Mezzo privo di rosso fenolo | Gibco | 10373-017 | |
| Soluzione SDS UltraPure, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
Riferimenti
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).
- Grupp, S. A., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
