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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive

Published: December 17, 2019 doi: 10.3791/59949
Automatic Translation
1, 1
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

Summary

Nous décrivons une approche pour générer fiable des cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) et testons leur différenciation et fonction in vitro et in vivo.

Abstract

L'immunothérapie adoptive est prometteuse pour le traitement du cancer et des maladies infectieuses. Nous décrivons une approche simple pour transduire les lymphocytes T humains primaires avec le récepteur chimérique d'antigène (CAR) et d'étendre leur progéniture ex vivo. Nous incluons des essais pour mesurer l'expression de la RCA ainsi que la différenciation, la capacité de prolifération et l'activité cytolytique. Nous décrivons des essais pour mesurer la production de cytokine effectrice et la sécrétion inflammatoire de cytokine dans les cellules T de CAR. Notre approche fournit une méthode fiable et complète pour la culture des cellules T CAR pour les modèles précliniques d'immunothérapie adoptive.

Introduction

Les récepteurs d'antigène chimérique (RAC) fournissent une approche prometteuse pour rediriger des cellules de T contre des antigènes distincts de tumeur. Les RAC sont des récepteurs synthétiques qui lient une cible antigène. Bien que leur composition précise soit variable, les RAC contiennent généralement 3 domaines distincts. Le domaine extracellulaire dirige la liaison vers un antigène cible et est généralement composé d'un fragment d'anticorps à chaîne unique relié à la RCA via une charnière extracellulaire. Le deuxième domaine, généralement dérivé de la chaîne CD3du du complexe du récepteur des lymphocytes T (TCR), favorise l'activation des lymphocytes T après l'engagement de la RCA. Un troisième domaine costimulatory est inclus pour améliorer la fonction de cellule T, l'engraftment, le métabolisme, et la persistance. Le succès de la thérapie cellulaire t CAR dans diverses malignités hématopoïétiques, y compris la leucémie lymphoblastique aigue à cellules B (LAL), la leucémie lymphocytique chronique (LCL) et le myélome multiple met en évidence la promesse thérapeutique de cette approche1,2,3,4,5,6. Les approbations récentes de la Food and Drug Administration (FDA) pour deux thérapies à cellules T CAR spécifiques à la Car19, le tisagenlecleucel pour les patients atteints de l'ENSEMBLE pédiatrique et des jeunes adultes et du ciloleucel d'axicabtagene pour le lymphome diffus à grandes cellules B, renforce le mérite translationnel de la thérapie cellulaire T de la RCA.

Les approches basées sur le CAR T impliquent l'isolement des lymphocytes T du sang périphérique, l'activation, la modification génétique et l'expansion ex vivo. La différenciation est un paramètre important régulant l'efficacité des lymphocytes T CAR. En conséquence, la restriction de la différenciation des lymphocytes T pendant la culture ex vivo améliore la capacité du produit infusé à s'engrafter, à se développer et à persister, fournissant une immunosurveillance à long terme après le transfert adoptif2,7,8,9. Les lymphocytes T se composent de plusieurs sous-ensembles distincts, y compris : les lymphocytes T naïfs (Tn), la mémoire centrale (Tcm), la mémoire effectrice (Tem), l'effecteur différencié (Tte) et la mémoire des cellules souches (Tscm). Les lymphocytes T différenciés de l'Effecteur ont une capacité cytolytique puissante; cependant, ils sont de courte durée et engraft mal10,11,12. En revanche, les lymphocytes T avec un phénotype moins différencié comprenant les lymphocytes T naïfs et les Tcm présentent des capacités supérieures d'engraftment et de prolifération suivant le transfert adoptif de cellule13,14,15,16,17,18. La composition des lymphocytes T collectés dans le produit préfabriqué peut varier d'un patient à l'autre et est en corrélation avec le potentiel thérapeutique des lymphocytes T CAR. La proportion de lymphocytes T avec un immunophénotype naïf-comme dans le produit d'apheresis de départ est fortement corrélée avec l'engraftment et la réponse clinique19.

La durée de la culture est un paramètre important influençant la différenciation dans les cellules T CAR préparées pour le transfert adoptif. Nous avons récemment développé une approche pour générer des cellules T CAR de qualité supérieure en utilisant un paradigme de culture abrégé20. En utilisant notre approche, nous avons montré que la culture limitée donne lieu à des cellules T CAR avec la fonction effectrice supérieure et la persistance suivant le transfert adoptif dans les modèles de xénogreffe de la leucémie. Ici, nous présentons les approches pour générer de façon fiable des cellules CART19 (cellules T autologues conçues pour exprimer l'anti-CD19 scFv attaché à CD3 et les domaines de signalisation 4-1BB) et incluons une description détaillée des essais qui fournissent un aperçu de la bioactivité et de l'efficacité de CAR T avant le transfert adoptif.

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Protocol

Toutes les études sur les animaux sont approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Pennsylvanie.

1. Activation, transduction et expansion des lymphocytes T

  1. Activer les lymphocytes T humains primaires frais ou cryoconservés en mélangeant avec des perles magnétiques anti CD3/CD28 (p. ex., dynabeadss) à un rapport de 3 perles par cellule T dans des plats de culture cellulaire de 6 puits. Les cellules T de culture dans le milieu x-VIVO 15 complété avec le sérum humain normal de AB de 5%, 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, et IL2 (100 unités/mL). Maintenir les lymphocytes T à une concentration de 106 lymphocytes T/mL pendant l'expansion. Cellules T de culture à 37 oC, 20 % O2, et 95 % d'humidité avec 5 % de CO2.
  2. Après la stimulation de la nuit, ajouter le supernatant lentiviral aux lymphocytes T activés. Calculer le volume de supernatant nécessaire pour atteindre une multiplicité d'infection (MOI) de 3 à 5.
    REMARQUE: Le plasmide de lentivirus CD19-BBMD CAR se compose d'une charnière CD8, d'un domaine costimulatoire 4-1BB et d'un domaine de signalisation CD321. Le supernatant lentiviral CD19-BBMD a été produit comme décrit précédemment21.
  3. Le jour 3, recueillir un aliquot représentatif de cellules pour la cryoconservation. Avant la cryoconservation, retirez les perles magnétiques par pipetage doux et séparation magnétique. Préparer le milieu de congélation contenant de la saline tamponnée de phosphate (PBS) avec 0,5 % de sulfoxide de diméthyle (DMSO) et conserver à 4 oC jusqu'à l'utilisation.
    1. Centrifugeuses lymphocytes T à 300 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant et ajouter 5 ml de PBS. Centrifugeuses cellules à 300 x g pendant 5 min et jetez le PBS.
    2. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de milieu de cryoconservation froid. Congeler les lymphocytes T dans un contenant de congélation réfrigéré et les conserver à -80 oC pendant 48 h. Transférer les cellules congelées à l'azote liquide.
  4. Laver le reste des lymphocytes T une fois sur 5 ml de PBS pour éliminer le vecteur résiduel. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. Décant le PBS et resuspendre le granule cellulaire dans le milieu de culture des lymphocytes T à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL.
  5. Divisez les lymphocytes T en deux cultures, désignées pour le jour 5 et le jour 9. Compter les lymphocytes T par cytométrie d'écoulement à l'aide de perles de comptage (Tableau des matériaux) et d'anticorps monoclonaux pour les CD4 et CD8 humains, ainsi qu'un colorant de viabilité (Tableau des matériaux).
    1. Pour mesurer la concentration des lymphocytes T, préparez un mélange maître contenant 500 L de PBS, 5 L de perles de comptage, 10 l de solution de viabilité des cellules D 7-Amino-actinomycine D, 4 oL de CD4-FITC et 4 OL de CD8-APC. Ajoutez 40 L de lymphocytes T au mélange principal et mesurez la concentration cellulaire par cytométrie d'écoulement en fonction du nombre de lymphocytes T vivants/dénombrements de perles. Reflux pour maintenir les cultures à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL tous les deux jours.
  6. Le jour 5, comptez et cryoconservez les cultures du jour 5 telles que décrites dans les étapes 1.3 et 1.5.
  7. Le jour 7, lavez 0,5 x 106 lymphocytes T dans le PBS et suspendez-les dans un tampon de tri cellulaire activé à la fluorescence (FACS) de 100 ll. Détecter l'expression des protéines de surface de cararie par immunostaining avec un idiotype anti-CAR19 fluorescent par cytométrie de flux.
  8. Le jour 9, comptez les cultures du jour 9 et cryopreserve comme décrit dans l'étape 1.3.

2. Évaluation phénotypique de la différenciation des lymphocytes T

  1. Préparer un mélange maître contenant des anticorps pré-titrés pour les anticorps anti-CD3-BV605 (clone OKT3), anti-CD14-Pacific Blue (PB) (clone HCD14), anti-CD19-PB (clone HIB19), anti-CD4-BV510 (clone OKT4), anti-CD8-H7APC (clone SK1), anti-CCR7-FITC (clone 150503), anti-CD45RO-PE (clone UCHL1), anti-CD27-PE-Cy7 (clone 1A4CD27), anti-CD95-PerCP-Cy5.5 (Clone DX2), et anti-CAR19-APC.
  2. Préparer les contrôles individuels de fluorescence moins un (FMO) pour les cellules anti-CD45RO-PE, anti-CCR7-FITC, anti-CD27-PE-Cy7 et anti-CD95-PerCP-Cy5.5 pour distinguer les cellules tachées positivement de l'arrière-plan.
  3. Préparer la solution de coloration de cellules mortes en diluant le réactif vivant/mort de stock (tableau des matériaux) 1:10.000 dans PBS.
  4. Décongeler le jour 3, le jour 5 et le jour 9 lymphocytes T qui étaient auparavant cryoconservés. Centrifugeuse 1 x 106 lymphocytes T de chaque groupe à 300 x g pendant 3 min. Jeter le supernatant. Laver les cellules une fois avec PBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 3 min et jetez le PBS.
  5. Mélanger les lymphocytes T avec la solution de coloration morte pendant 15 min à température ambiante (RT), à l'abri de la lumière.
  6. Ajouter 1 mL de tampon FACS pour étancher le colorant de coloration de cellules mortes. Centrifugeuse à 300 x g pendant 3 min, jetez le supernatant et suspendez à nouveau la pastille cellulaire dans 100 ll de tampon FACS contenant le cocktail d'anticorps décrit à l'étape 2.1 et 2.2. Incuber pendant 1 h à 4 oC.
  7. Ajouter 1 mL de tampon FACS et centrifugeuse à 300 x g pendant 3 min pour laver les anticorps non liés. Répétez trois fois avec le tampon FACS.
  8. Resuspendre les cellules dans 1 % de paraformaldéhyde (PFA) et les conserver à 4 oC.
  9. Pendant que l'expression de CD45RO diminue après fixation, analysez les échantillons par cytométrie de flux après immunostaining. Pour évaluer la différenciation, portez dans l'ordre suivant : singlets (FSC-H vs FSC-A), cellules CD3et T vivantes (Dump [violet vivant-mort, CD14-PB et CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). En CD4et CD8, porte sur CD45RO-PE vs CCR7-FITC pour définir les cellules T naïfs (CD45RO-CCR7,Tcm (CD45RO-CCR7-), Tem (CD45RO-CCR7-), et Tte (CD45RO-CCR7-). Pour identifier Tscm, porte sur les cellules CD27et T dans la population de lymphocytes T naïfs. Dans ce compartiment, Tscm sont CD95et Tn sont CD95-.

3. Analyse fonctionnelle in vitro

  1. Prolifération des lymphocytes T CAR et sécrétion de cytokine
    1. Vérifier l'expression de la RCA ainsi que la viabilité cellulaire décrite dans les étapes 1.5 et 1.7, par cytométrie de flux.
    2. Laver 5 x 106 lymphocytes T de chaque groupe (jour 3, jour 5 et jour 9) avec PBS et resuspendre dans une solution de 1 M m de carboxyfluorescein diacétate succinimidyl ester (CFSE) en PBS pendant 3,5 min à RT.
    3. Ajouter immédiatement 10 ml de PBS contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SGF) pour éteindre la réaction.
    4. Centrifuger la solution à 300 x g pendant 3 min. Jetez le supernatant et répétez cette étape de lavage trois fois. Compter les cellules à la fin de la coloration CFSE à l'aide d'un compteur Coulter (Tableau des matériaux).
    5. Récoltedes de cellules tachées de CFSE (non stimulées), resuspendre es à 1 % de PFA et conserver à 4 oC pour analyse par cytométrie de débit.
    6. Incuber le nombre souhaité de cellules T CAR tachées de CFSE avec k562-CD19 irradiés (cible) ainsi que des cellules de type K562-sauvage (contrôle) à un rapport de 1:1 pour 120 h dans le milieu de culture libre de cytokine et les conditions de culture comme décrit à l'étape 1.1.
    7. Après 24 h, centrifuger le récipient de culture à 300 x g pendant 5 min. Recueillir 120 ll de supernatant cellulaire. Évaluer la production dépendante de l'activation de l'IL2, de l'IFNMD, du TNFMD, du GM-CSF et d'autres cytokines inflammatoires (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 et IL10) par luminex, conformément aux recommandations du fabricant.
    8. Remplacer le volume de supernatant qui a été recueilli à l'étape 3.1.7 avec un volume équivalent (120 l) de milieu frais.
    9. Le jour 3 (c.-à-d. après 96 h), compter et réalimenter à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL à l'aide de cytométrie à base de perles comme précédemment à l'étape 1.5.
    10. Le jour 5, comptez les cellules CD3vivantes et calculez le changement de pli des lymphocytes T vivants par rapport au nombre de lymphocytes T vivants au jour 0.
    11. Effectuez une analyse complète de la dilution de CFSE en divisant les cellules T de CAR à l'aide du logiciel FlowJo pour mettre en évidence les cycles successifs de division cellulaire.
      REMARQUE : Les tests de prolifération sont bien décrits dans le manuel FlowJo.
  2. Cytotoxicité
    REMARQUE: La capacité des cellules CART19 à tuer les cellules cibles exprimant le CD19 est évaluée à l'aide d'un réto-tosay de 51Cr.
    1. Étiquetez les cellules cibles en mélangeant 5 x 105 K562-CD19, les cellules témoins de type K562-sauvage ou les cellules leucémiques NALM6 avec 50 OL de Na251CrO4 et 0,5 mL de RPMI complétées par 10 % de FBS pendant 90 min dans l'incubateur à 37 oC.
    2. Cellules centrifugeuses à 300 x g pendant 2,5 min. Jeter le supernatant radioactif dans des bacs d'élimination appropriés et laver les cellules cibles dans 5 ml de PBS. Répétez les étapes de lavage deux fois.
    3. Resuspendre les cellules cibles dans le milieu sans phénol rouge contenant 5% de FBS. Utilisez ce support pour le reste de la procédure pour réduire le fond.
    4. Après avoir évalué l'expression de la RCA et la viabilité cellulaire par cytométrie de flux (tel que décrit dans la section 5.1), mélanger les lymphocytes T CAR avec des cellules cibles étiquetées aux ratios effector:target (E:T) de 10:1, 3:1 et 1:1, en triple. Transférer dans une plaque inférieure U de 96 puits.
    5. En parallèle, inclure les cellules cibles seules, et les cellules cibles avec 1% de sulfate de dodecyl de sodium (SDS), pour déterminer spontanée (S) et maximale (M) 51Cr libération, respectivement.
    6. Centrifugeuses cellules à 300 x g pendant 5 min et incuber pendant 4 h ou 20 h dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2.
    7. Après l'heure indiquée, centrifugez le récipient de culture à 300 x g pendant 5 min. Recueillir 35 l de supernatant cellulaire et transférer dans une plaque à lecteurs. Évitez les bulles. Laisser sécher l'assiette toute la nuit.
    8. Scellez la plaque avec un joint de plaque standard et comptez avec un compteur de scintillation liquide. L'abondance de chrome dans le supernatant fournit un proxy de la mise à mort de cellules cibles. Calculez le pourcentage de lyse spécifique comme suit : 100 x (comptes par minute [cpm] version expérimentale - cpm S release)/ (cpm M release - cpm S release).

4. Analyse fonctionnelle In Vivo

  1. Obtenez des souris NOD-SCID de 6 à 10 semaines, qui n'ont pas de système immunitaire adaptatif et les assignent au groupe de traitement/contrôle au hasard.
  2. Injectez des animaux par voie intraveineuse par la veine de la queue avec 1 x 106 cellules NALM6 dans un PBS stérile de 0,1 ml.
  3. Après 5 à 7 jours, confirmer l'engraftment de tumeur par la formation image de bioluminescence (BLI). Injecter 150 mg/kg de D-luciferine à des souris qui ont été anesthésiés avec de l'isoflurane (le volume dépend de la masse corporelle).
  4. Mesurer les valeurs de bioluminescence à l'aide d'un système d'imagerie. Quantifier le flux total à l'aide du logiciel correspondant en dessinant des rectangles de zone identique autour des souris, atteignant de la tête à 50% de la longueur de la queue. Soustrayez l'arrière-plan de chaque image individuellement.
  5. Après avoir établi la leucémie, injectez 3 x 106 cellules de CART19 de jour, 0,5 x 106 jours 3 cellules T de CAR, ou les cellules T humaines non transducées correspondantes (NTD) par l'intermédiaire de la veine de queue dans un volume de 100 oL de PBS/Ca stérile2.
    REMARQUE: Comme la bioactivité des cellules récoltées à divers intervalles au cours du processus de culture est différente, la concentration choisie des cellules du jour 3 est inférieure à celle du jour 9.
  6. Pour déterminer la progression de la maladie, mesurez les valeurs de bioluminescence deux fois par semaine comme décrit ci-dessus à l'étape 4.3.
  7. Pour déterminer l'engraftment des cellules T de carRE, collectez 75 sang de L par l'intermédiaire du saignement rétro-orbital dans un tube EDTA-enduit. Transférer 50 lde de sang dans des tubes de comptage absolus.
  8. Tachez le sang avec des anticorps contre CD45, CD4, CD8 et CAR pendant 30 min à RT. Ajouter 400 l de 1x FACS lysing solution aux tubes et vortex à fond. Après coloration, analyser l'expression des marqueurs de surface par cytométrie de flux.
    REMARQUE: D'autres marqueurs de surface peuvent être utilisés pour évaluer la différenciation et l'état d'épuisement des lymphocytes T dans le sang.
  9. Pour mesurer les taux de cytokines dans le sang, centrifuger le sang à 1 200 x g pendant 30 min à 4 oC pour séparer le sérum de la couche supérieure du sang.
  10. Recueillir le sérum et mesurer les cytokines avec une plaque de lecteur désignée selon les instructions du fabricant.

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Representative Results

En utilisant les méthodes décrites ci-dessus, nous avons stimulé et élargi les lymphocytes T pendant 3 ou 9 jours(figure 1A,B). Nous avons également analysé leur profil de différenciation, tel qu'indiqué par la stratégie de gating décrite à la figure 1C, en mesurant l'abondance de glycoprotéines distinctes exprimées à la surface des cellules. Nous montrons un changement progressif vers la différenciation effector au fil du temps au cours de la culture ex vivo (Figure 1D). Nous avons évalué la fonction effectrice et la capacité proliférante de la cellule T de CAR en réponse à l'antigène. Nous montrons que les cellules qui ont été développées moins (récoltées plus tôt) étaient fonctionnellement supérieures par rapport aux cellules largement cultivées sur une plus longue durée. Jour 3 Les cellules CART19 ont amélioré la capacité proliférante et cytolytique lors de la re-stimulation avec leur ligand cognate par rapport au jour 9 (Figure 2A,B).

Dans un modèle humain de moue de xénogreffe de TOUS, nous avons comparé la puissance des cellules T de CAR récoltées à 3 jours contre 9 jours(figure 3A). Nous avons montré une réponse anti-leucémique dépendante de dose pour les cellules de CART19 produites pendant 9 jours avec une réponse complète pour la dose élevée de 3 x 106 et une perte d'efficacité pour la basse dose de 0.5 x 106. Le jour 3 cellules CART19 a montré un contrôle tumoral persistant à fortes et faibles doses de cellules CART19 (Figure 3B). Cette réponse a été associée au compte absolu de CART19 dans le sang périphérique des souris (figure 3C) qui a été analysé basé sur le protocole décrit ci-dessus. Ces résultats obtenus à partir de notre évaluation complète de la fonction CAR T fournissent la preuve que les lymphocytes T CAR récoltés plus tôt (jour 3) surpassent les cellules T carracinées le jour 9.

Figure 1
Figure 1 : Profil représentatif de prolifération et de différenciation des lymphocytes T CAR. (A) CART19 l'expansion de cellules suivant la stimulation avec les perles magnétiques anti-CD3/CD28. (B) La taille des cellules a été évaluée par l'analyse de Coulter tout au long de la culture. (C) Stratégie de gating représentative pour l'analyse phénotypique des lymphocytes T. (D) Analyse temporelle de la différenciation des lymphocytes T. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Les cellules CART19 de jour 3 affichent la fonction et la prolifération améliorées d'effecteur par rapport aux cellules de jour 9. (A) LES cellules CART19 ont été récoltées les jours 3 et 9 et co-cultivées au rapport E:T indiqué avec les cellules K562 exprimant CD19 (K562-19) ou le type sauvage K562 (type K562-sauvage). La cytotoxicité spécifique a été mesurée par 51Cr libération après 4 h. (B) CSFE-étiqueté cart19 cellules ont été co-cultivés avec K562-19, K562-type sauvage, ou moyen seulement pour 120 h à un rapport E:T 1:1. Les cellules ont été récoltées à des moments indiqués. Les dénombrements absolus ont été évalués par cytométrie de débit. Les changements relatifs de pli du nombre de lymphocytes T vivants normalisés au compte de cellules T au jour 0 sont montrés. Les données sont tracées comme moyen d'écart type (SD). P lt; 0,001 comparant le jour 3 par rapport au jour 9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Les cellules CART19 de jour 3 sont plus puissantes in vivo que les cellules de jour 9. (A) Schématique du modèle de xénogreffe et du traitement cellulaire CART19. Les cellules de jour 3 et 9 CART19 ou lymphocytes T de contrôle (UTD) ont été IV-injectées chez les souris 5-7 jours après injection de NALM6. (B) Quantification de la charge tumorale par imagerie par bioluminescence le jour 38 chez les souris traitées avec des cellules CART19 récoltées le jour 3 et le jour 9. Les symboles représentent une souris chacun. Ligne noire horizontale : moyenne de chaque groupe. (C) Les numérations de cellulesT du sang périphérique absolu Ont été mesurées toutes les deux semaines après l'injection de cellules CART19 et à la fin de l'expérience par une méthode de comptage appropriée (comme truCount) Unpaired Mann-Whitney test, deux queues a été utilisé. P 'lt; 0.01, 'P 'lt; 0.001, 'P 'lt; 0.0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Ici nous décrivons des approches pour mesurer la fonction et l'efficacité des cellules T de CAR récoltées à des intervalles variables tout au long de la culture ex vivo. Nos méthodes fournissent un aperçu complet des essais conçus pour évaluer la capacité de prolifération ainsi que la fonction effector in vitro. Nous décrivons comment mesurer l'activité des lymphocytes T carracinés par stimulation par le CAR et détaillons les modèles de xénogreffe de la leucémie à l'aide de cellules T CAR récoltées au jour 3 contre le 9e jour de leur phase d'expansion logarithmique.

Il y a des défis inhérents à comparer l'efficacité des lymphocytes T carracinés à différents moments pendant l'expansion ex vivo. Comme la quantité de lymphocytes T générées sur une durée de culture de 3 jours est faible, il peut y avoir un nombre insuffisant pour effectuer une évaluation complète de la fonction. Ceci est exacerbé dans le contexte des lymphocytes T patients dont la capacité proliférante est souvent diminuée en raison de facteurs extrinsèques et intrinsèques20.

Combien de cellules T CAR devraient être infusées étant donné que les cellules de jour 3 présentent une capacité métabolique et prolimique améliorée par rapport à leurs homologues de jour 9 qui sortent de leur phase de prolifération logarithmique? Nous avons estimé que le nombre de lymphocytes T CAR de 3 jours atteindrait 3 x 106 s'ils étaient élargis pendant 6 jours supplémentaires en culture. Nous avons utilisé cette estimation pour informer combien de cellules T CAR 3 jours devraient être infusées (0,5 x 106) pour comparer équivalentement au jour 9. En conséquence, nous appliquons l'approche de « test de stress » pour comparer la bioactivité, l'efficacité et la persistance des cellules T infusées de CAR. La réduction du nombre de cellules T CAR infusées de 3 x 106 à 0,5 x 106 révèle des différences qui seraient autrement masquées par la saturation des nombres. Mécaniquement, le contrôle de tumeur repose sur l'accumulation des cellules effectrices suffisantes pour lyser leurs cellules cibles correspondantes. À un nombre élevé d'infusion, les lymphocytes T CAR du jour 3 et du jour 9 présentent une compétence fonctionnelle.

Un autre défi dans le travail avec les cellules T carracinées de 3 jours est leur attachement ferme à la surface de stimulation. Les déplacer des perles magnétiques nécessite des tuyaux répétitifs pour les dissocier mécaniquement et améliorer leur récupération de la culture. En revanche, les cellules du jour 9 ont 1) déjà détachées des perles, et 2) dilué les perles à un point tel qu'ils peuvent être récoltés avec une relative facilité.

Une autre variable importante dans le processus de fabrication des lymphocytes T CAR est le choix du milieu de culture cellulaire. Le milieu rpMI qui a été complété avec FBS est couramment employé à des fins expérimentales. En revanche, soit X-VIVO 15 ou OpTmizer, complété avec du sérum humain sont préférés dans les applications cliniques. Bien qu'ils soient moins caractérisés, ils peuvent contenir des composants qui facilitent l'expansion des lymphocytes T dans un laps de temps plus court. Leur impact sur la différenciation est inconnu. En outre, l'addition des cytokines influence la croissance, la survie, et le phénotype. Alors que l'IL-2 entraîne une prolifération et une différenciation rapides dans les cellules effectrices, il-7 et IL-15, qui proviennent du ganglion lymphatique et ont des rôles connus dans la persistance homéostatique, améliore l'expansion des lymphocytes T et favorisent une tige de mémoire / phénotype de mémoire centrale22,23,24,25.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par le financement fourni par Novartis Pharmaceuticals par le biais d'une alliance de recherche avec l'Université de Pennsylvanie (Michael C. Milone) ainsi que st. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CD3/CD28 dynabeads Thermo Fisher 40203D
APC Mouse Anti-Human CD8 BD Biosciences 555369 RRID:AB_398595
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody BD Biosciences 560179 RRID:AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate BD Biosciences 349202
BD Trucount Absolute Counting Tubes BD Biosciences 340334
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody BioLegend 317444 RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody BioLegend 317322 RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Life Technolohgies C34554
CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen C36950
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody BD Pharmingen 561271 RRID:AB_10561679
FITC Mouse Anti-Human CD4 BD Biosciences 555346 RRID:AB_395751
HEPES Gibco 15630-080
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Human IL-2 IS, premium grade Miltenyi 130-097-744
L-glutamine Gibco 28030-081
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux Perkin Elmer
LIVE/DEAD Fixable Violet Molecular Probes L34964
Multisizer Coulter Counter Beckman Coulter
Na251CrO4 Perkin Elmer NEZ030S001MC
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody BioLegend 325616 RRID:AB_830689
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody BioLegend 302223
PE anti-human CD45RO Antibody BD Biosciences 555493 RRID:AB_395884
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody BioLegend 305610 RRID:AB_493652
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody Beckman Coulter A54823
Phenol red-free medium Gibco 10373-017
UltraPure SDS Solution, 10% Invitrogen 15553027
Via-Probe BD Biosciences 555815
X-VIVO 15 Gibco 04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Perkin Elmer 122799

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References

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Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive
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Ghassemi, S., Milone, M. C. Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy. J. Vis. Exp. (154), e59949, doi:10.3791/59949 (2019).

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