Summary
אנו מתארים גישה מהימנה ליצור הקולטן אנטיגן הצ (רכב) T תאים ולבדוק בידול שלהם ותפקוד מבחנה בvivo.
Abstract
חיסוני המאמצת מחזיקה הבטחה לטיפול בסרטן ומחלות זיהומיות. אנו מתארים גישה פשוטה לשנות את התאים הראשוניים של האדם הראשי עם קולטן אנטיגן צ'יאריק (רכב) ולהרחיב את הצאצאים שלהם לשעבר vivo. אנו כוללים בחני למדוד ביטוי רכב, כמו גם בידול, קיבולת ההתרבות ופעילות cytolytic. אנו מתארים בחני למדוד את הייצור cy, ציטוקין והפרשת ציטוקין דלקתיים בתאי T רכב. הגישה שלנו מספקת שיטה אמינה ומקיפה לתאי T מכונית התרבות עבור מודלים פרה-קליניים של טיפול חיסוני המאמצת.
Introduction
הקולטנים אנטיגן הצ (מכוניות) לספק גישה מבטיחה לנתב מחדש את תאי T נגד אנטיגנים הגידול ברורים. מכוניות הם קולטנים סינתטיים כי לאגד מטרה אנטיגן. בעוד הרכב המדויק שלהם הוא משתנה, מכוניות מכילות בדרך כלל 3 תחומים שונים. תחום החילוץ מורה כריכת אנטיגן היעד הוא מורכב בדרך כלל קטע נוגדן שרשרת אחת המקושרת למכונית באמצעות ציר מסחטות. התחום השני, הנגזר בדרך כלל משרשרת CD3ζ של קולטן תא T (TCR) מורכב, מקדמת הפעלת תא T לאחר האירוסין רכב. תחום מגירוי שלישי כלול כדי לשפר את תפקוד התא T, העפילה, חילוף החומרים והתמדה. ההצלחה של המכונית טיפול בתאי T ב ממאירות המטפאות שונים כולל B לוקמיה לימפובלסטית חריפה (כל), לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) ומיאלומה נפוצה מדגיש את ההבטחה הטיפולית של גישה זו1,2,3,4,5,6. המזון והתרופות האחרונות (FDA) אישורים עבור שתי CD19-ספציפיים מכונית T טיפולים, tisagenlecleucel עבור ילדים ובוגרים צעירים ALL ו-axicabtagene עבור לימפומה מפוזר תא B גדול, מחזקת את הכשרון הטרנסלאליות של טיפול בתאי T מכונית.
שיטות T מבוססות מכונית כרוכות בבידוד של תאי T מ דם היקפי, הפעלה, שינוי גנטי, והרחבת ex vivo. בידול הוא פרמטר חשוב הוויסות מכונית T יעילות תאים. בהתאם לכך, הגבלת בידול תא T במהלך התרבות vivo ex מגביר את היכולת של המוצר המוחדרת כדי חרט, להרחיב, ולהמשיך, מתן מעקב לטווח ארוך החיסונית בעקבות העברה המאמצת2,7,8,9. תאי t מורכבים ממספר קבוצות מערכות ברורות כולל: תאי T תמימים (Tn), זיכרון מרכזי (Tcm), זיכרון אפקטור (Tem), אפקטור הבדיל (Tte) וזיכרון תא גזע (Tscm). אפקטור הבדיל תאים T יש יכולת cytolytic חזקה; עם זאת, הם קצרים חיו והוא חרט גרוע10,11,12. לעומת זאת, תאים t עם הפנוטיפ פחות הבדיל כולל תאי T תמים ו Tcm התערוכה מעולה בתיאום ויכולות ההתרבות בעקבות העברת התא המאמצת13,14,15,16,17,18. הרכב של תאי T שנאספו במוצר שיוצרו מראש יכול להשתנות ברחבי החולים והתואם את הפוטנציאל התרפויטי של מכונית T. היחס של תאי T עם הimmunophenotype נאיבי כמו המוצר המתחיל apheresis הוא מתאם מאוד עם השני והתגובה הקלינית של התשובה19.
משך התרבות הוא פרמטר חשוב המשפיע על בידול בתאי T רכב מוכן העברה המאמצת. פיתחנו לאחרונה גישה כדי ליצור באיכות מעולה בתאי T מכונית באמצעות פרדיגמה תרבות מקוצרת20. באמצעות הגישה שלנו, הראנו כי תרבות מוגבלת מעניקה העלייה לתאי T רכב עם פונקציה מעולה אפקטור והתמדה בעקבות העברה המאמצת במודלים מבע של לוקמיה. כאן, אנו מציגים את הגישות לייצר באופן אמין CART19 תאים (בתאי T אוטוולוגיים הנדסה כדי לבטא anti-CD19 scfv מצורף CD3ζ ו 4-1bb התחומים איתות) וכוללים תיאור מפורט של בחני כי לספק תובנה לתוך מכונית ביולוגי T ויעילות לפני העברה המאמצת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל לימודי בעלי החיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת פנסילבניה.
1. הפעלת תא T, התמרה והרחבה
- הפעל טרי או cryopreserved מורות האדם הראשי T תאים על ידי ערבוב עם מחרוזות anti CD3/CD28 מגנטי (g., dynabeads) ביחס של 3 חרוזים לכל תא T ב 6-היטב מנות תרבות התא. תרבות T תאים ב-X-VIVO 15 בינוני בתוספת עם 5% סרום AB אנושי רגיל, 2 מ"מ L-גלוטמין, 20 מ"מ HEPES, ו IL2 (100 יחידות/mL). לשמור על תאי T בריכוז של 106 תאים T/mL במהלך ההרחבה. התרבות T תאים ב 37 ° c, 20% O2, ו 95% לחות עם 5% CO2.
- לאחר גירוי הלילה, להוסיף לתאי T מופעלים. לחשב את הנפח של סופרנטנט הדרוש כדי להשיג ריבוי של זיהום (מוי) של 3-5.
הערה: מכונית CD19-BBζ מורכבת מציר CD8 וירוס, 4-1BB תחום מגירוי, ו CD3ζ איתות בתחום21. CD19-BBζ מאוד הופק על ידי סופר ויראלי כפי שתוארה בעבר21. - ביום 3, לאסוף מייצג מייצגים של תאים עבור הקפאה קריוגנית. לפני הקפאת ההזמנה, להסיר את החרוזים המגנטי על ידי ליטוף עדין והפרדה מגנטית. הכינו אמצעי הקפאה המכילים תמיסת מלח (PBS) עם 0.5% diמתיל סולפוקסיד (DMSO) והחנות ב -4 ° c עד השימוש.
- התאים צנטריפוגה T ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט ולהוסיף 5 מ ל של PBS. בתאי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ולהיפטר PBS.
- השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של בינונית הקפאה קרה. הקפאת תאי T במיכל קפוא מקורר ולאחסן ב-80 ° c עבור 48 h. העבירו את התאים הקפואים. לחנקן נוזלי
- שטוף את שאר התאים T פעם ב 5 מ ל של PBS לחסל וקטור שיורית. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות. decant ה-PBS ולהשעות מחדש את הגלולה התא במדיום תרבות התא T בריכוז של 0.5 x 106 תאים/mL.
- לפצל את התאים T לשתי תרבויות, מיועד ליום 5 ויום 9. ספירת T תאים על ידי זרימה cy, לנסות באמצעות חרוזי ספירה (טבלה של חומרים) ו נוגדנים חד שבטיים כדי CD4 ו CD8 האדם, כמו גם לצבוע את הכדאיות (טבלת חומרים).
- כדי למדוד ריכוז תא T, להכין תמהיל הורים המכיל 500 μL של PBS, 5 μL של חרוזים ספירה, 10 μL של 7-אמינו-אקטינומיצין D הכדאיות הפתרון, 4 μL של CD4-FITC ו-4 μL של CD8-APC. הוסף 40 μL של תאים T לתמהיל הראשי ולמדוד את הריכוז התא על ידי הזרמת cy, מבוסס על מספר תאים T לחיות/ספירות חרוז. להאכיל מחדש כדי לשמור על התרבויות בריכוז של 0.5 x 106 תאים/mL בכל יום אחר.
- ביום 5, לספור והקפאה היום 5 תרבויות כמתואר בשלבים 1.3 ו 1.5.
- ביום 7, לשטוף 0.5 x 106 תאים T ב PBS ו-resuspend ב 100 μl של מיון תא המופעל על ידי הזריחה (facs) מאגר. לזהות ביטוי חלבון פני השטח של המכונית על ידי כתמים חיסוני עם מבCAR19-מצומנת אנטי-בעלת מעלה-מעלה-מעלה-מעלה ידי זרימה cy, לנסות.
- ביום 9, לספור יום 9 תרבויות ו cryopreserve כמתואר בשלב 1.3.
2. הערכה פנוטימית של בידול תא T
- להכין תערובת הורים המכילים נוגדנים pre-titrated עבור anti-CD3 – BV605 (שיבוט OKT3), anti-CD14 – פסיפיק כחול (PB) (שיבוט HCD14), anti-CD19 – PB (שיבוט HIB19), אנטי CD4 – BV510 (שיבוט OKT4), anti-CD8 – H7APC (שיבוט SK1), anti-CCR7 – FITC 150503 ( anti-CD45RO – PE (שיבוט UCHL1), anti-CD27 – PE-Cy7 (שיבוט 1A4CD27), anti-CD95 – PerCP-Cy 5.5 (שיבוט DX2), ו-anti-CAR19-APC.
- להכין זריחה בודדת מינוס אחד (FMO) פקדים עבור anti-CD45RO – PE, אנטי CCR7 – FITC, anti-CD27 – PE-Cy7 ו anti-CD95 – PerCP-Cy 5.5 כדי להבחין תאים מוכתמים באופן חיובי מרקע.
- הכנת פתרון מכתים תא מת על ידי דילול מלאי חי/מת במלאי (טבלת חומרים) 1:10000 ב PBS.
- ההפשרה יום 3, יום 5, ויום 9 תאים T שהיו בעבר cryopreserved מורות. צנטריפוגה 1 x 106 תאים T מכל קבוצה ב 300 x g עבור 3 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. רחץ את התאים פעם אחת עם ה-PBS. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות ולהיפטר PBS.
- לערבב תאים T עם פתרון מכתים מתים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT), מוגן מפני האור.
- הוסף 1 מ ל של מאגר FACS כדי להרוות את הצבע התא המת מכתים. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות, למחוק את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא ב 100 μl של מאגר facs המכיל את קוקטייל הנוגדן המתואר בשלב 2.1 ו 2.2. מיכל הדגירה 1 h ב 4 ° c.
- הוסף 1 מ ל של מאגר FACS ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות כדי לשטוף את הנוגדן לא מאוגד. חזור על שלוש פעמים עם מאגר FACS.
- השהה את התאים ב-1% פאראפורמלדהיד (בכיוון הבית) ואחסן ב-4 ° c.
- כפי CD45RO ביטוי יורדת לאחר קיבעון, לנתח את הדגימות על ידי הזרמת cy, לאחר התניית החיסוני. להערכת בידול, שער לפי הסדר הבא: סינגמייטים (FSC-H vs FSC-A), live CD3+ T תאים (Dump [חי-מת סגול, CD14-PB ו CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). ב CD4+ ו CD8+ קבוצות מערכות, שער על CD45RO-PE VS CCR7-fitc להגדיר תאים לא תמימים כמו (CD45RO-CCR7+), Tcm (CD45RO+ CCR7+), TEM (CD45RO+CCR7-), ו-Tte (CD45RO-CCR7-). כדי לזהות את Tscm, שער בתאים CD27+ T באוכלוסיית תאי T בדומה לתמים. בתוך תא זה, Tscm הם CD95+ ו-TN הם CD95-.
3. ניתוח תפקודי חוץ-גופית
- מכונית הפצת תאי T והפרשת ציטוקין
- לאמת ביטוי רכב, כמו גם הכדאיות של התא כפי שמתואר בשלבים 1.5 ו 1.7, על ידי הזרמת cy, לנסות.
- לשטוף 5 x 106 בתאי T מכל קבוצה (יום 3, יום 5 ויום 9) עם PBS ולהשעות את הפתרון 1 μm של carboxyfluorמחדש את שיטת הסינכרון (cfse) ב-pbs עבור 3.5 דקות ב-RT.
- מייד להוסיף 10 מ ל של PBS המכיל 10% סרום של שור עוברי (FBS) כדי להרוות את התגובה.
- צנטריפוגה את הפתרון ב 300 x g עבור 3 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולחזור על שלב זה שלוש פעמים. לספור את התאים בסיום הצביעת CFSE באמצעות מונה קולטר (טבלת חומרים).
- בציר CFSE מוכתם תאים (לא מגורה), להשעות מחדש 1% בכיוון הראשון ולאחסן ב 4 ° c עבור ניתוח על ידי הזרימה cy, try.
- מקרין את המספר הרצוי של מכונית מוכתמת cfse-T עם הקרינה הK562-CD19 (היעד) כמו גם K562-wild סוג (שליטה) תאים ביחס של 1:1 עבור 120 h ב ציטוקינים תרבות חינם בינונית ותרבות תנאים כמתואר בשלב 1.1.
- לאחר 24 שעות, צנטריפוגה את כלי התרבות ב 300 x g עבור 5 דקות. לאסוף 120 μl של הסלולר supernatant. להעריך את הייצור תלויי ההפעלה של IL2, IFNγ, TNFα, GM-שדרתי, ו ציטוקינים דלקתיים אחרים (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8, ו IL10) על ידי מנתח לומיקס בהתאם להמלצות של היצרן.
- החלף את עוצמת הקול של סופרנטאנט שנאסף בשלב 3.1.7 עם אמצעי אחסון שווה ערך (120 μL) של מדיום טרי.
- ביום 3 (כלומר, לאחר 96 h), לספור ולהאכיל מחדש בריכוז של 0.5 x 106 תאים/mL באמצעות מבוססי חרוז הזרימה cy, לנסות כמו בעבר בשלב 1.5.
- ביום 5, לספור את התאים live CD3+ ולחשב את שינוי הקיפול של תאי t לחיות ביחס לספירת התאים החיים t ביום 0.
- בצע ניתוח מקיף של דילול CFSE בחלוקת תאי T רכב באמצעות תוכנת FlowJo כדי להדגיש סיבובים רצופים של החטיבה התא.
הערה: מספר ההפצה מתואר היטב במדריך FlowJo.
- שיטת רעילות התא
הערה: היכולת של תאים CART19 להרוג את תאי היעד ביטוי CD19 מוערך באמצעות 51Cr שחרור שחרורו.- סמן את תאי היעד על ידי ערבוב 5 x 105 K562-CD19, K562-פראי בקרת סוג תאים, או NALM6 תאים לוקמיה עם 50 μl של Na251קרו4 ו 0.5 ML של RPMI שיושלם עם 10% fbs עבור 90 מינימום בחממה ב 37 ° c.
- בתאי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 2.5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט רדיואקטיבי בפחי סילוק המתאים ולשטוף את תאי היעד ב 5 מ ל של PBS. חזור על השלבים פעמיים.
- השהה מחדש את תאי היעד ב-פנול בינונית ללא אדום המכילה 5% FBS. השתמש במדיום זה להמשך ההליך כדי להקטין את הרקע.
- לאחר הערכת ביטוי רכב והכדאיות של התאים על-ידי שילוב cy, כמתואר בסעיף 5.1), מערבבים תאים T רכב עם תוויות היעד בתאי ב-אפקטור: היעד (E:T) היחס של 10:1, 3:1 ו 1:1, בטרילקאט. . העבר ללוחית התחתונה של 96
- במקביל, לכלול תאי יעד בלבד, ואת היעד תאים עם 1% נתרן dodecyl סולפט (SDS), כדי לקבוע ספונטנית (S) ומקסימום (M) 51Cr שחרור, בהתאמה.
- בתאי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ו-דגירה עבור 4 h או 20 שעות בחממה 37 ° c עם 5% CO2.
- לאחר הזמן המיועד, צנטריפוגה את כלי התרבות ב 300 x g עבור 5 דקות. לאסוף 35 μl של supernatant הסלולר ולהעביר לוחית הקורא. להימנע בועות. . תנו לצלחת להתייבש בן לילה
- לאטום את הצלחת עם חותם לוחית סטנדרטי ולספור עם מונה של נוזל נוזלי. שפע כרום ב-supernatant מספק פרוקסי של רצח תא היעד. חשב את אחוז הליזה הספציפית כדלקמן: 100 x (ספירות לדקה [cpm] שחרור ניסיוני – cpm S שחרור)/(cpm שחרור – cpm S שחרור).
4. באנליזה פונקציונלית Vivo
- להשיג 6 על 10-שבוע בן נוד-scid γc–/– (nsg) עכברים, אשר חסר מערכת חיסונית אדפטיבית, ולהקצות אותם לטיפול/בקרת הקבוצה באופן אקראי.
- הכנס בעלי חיים באמצעות וריד הזנב עם 1 x 106 NALM6 תאים ב 0.1 mL מעוקר PBS.
- לאחר 5-7 ימים, אשר בתאום הגידול על ידי הדמיה ביולומינסנציה (בלי). הכנס 150 מ"ג/ק"ג של D-לluciferin לעכברים אשר כבר מורדם עם isof, הכרך תלוי במסת הגוף).
- מדידת ערכים ביולומינציה באמצעות מערכת הדמיה. לכמת שטף הכולל באמצעות התוכנה המתאימה על ידי ציור מלבנים של אזור זהה סביב עכברים, להגיע מראש אל 50% של אורך הזנב. הפחת את הרקע עבור כל תמונה בנפרד.
- לאחר יצירת לוקמיה, להזריק 3 x 106 יום 9 CART19 תאים, 0.5 x 106 יום 3 מכונית T תאים, או המקביל לא התמרה (ntd) האדם תאים t באמצעות וריד הזנב בנפח של 100 μl של PBS וסטרילי/Ca2 +.
הערה: כפעילות ביולוגית של תאים שנקטפו במרווחי זמן שונים במהלך תהליך התרבות הוא שונה, הריכוז הנבחר של יום 3 תאים נמוך יותר מיום 9. - כדי לקבוע התקדמות מחלות, למדוד את ערכי biלומינסנציה פעמיים בשבוע כמתואר לעיל בשלב 4.3.
- כדי לקבוע מכונית תא T בתאום, לאסוף 75 μL דם דרך דימום מסלולית רטרו בתוך צינור EDTA-מצופה. העברת 50 μL של דם לצינורות ספירת מוחלטים.
- הכתם דם עם נוגדנים נגד CD45, CD4, CD8 ומכונית עבור 30 דקות ב RT. הוסף 400 μL של הפתרון הכולל של 1x FACS לצינורות ומערבולת ביסודיות. לאחר צביעת, לנתח ביטוי סמן פני השטח על ידי הזרמת cy, לנסות.
הערה: סמנים פני השטח האחרים יכולים לשמש כדי להעריך את מצב הבידול והתשישות של תאי T בדם. - כדי למדוד רמות ציטוקינים בדם, דם צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 30 דקות ב 4 ° צלזיוס כדי להפריד סרום מהשכבה העליונה של דם.
- לאסוף סרום למדוד את ציטוקינים עם לוחית הקורא המיועד על פי הוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות השיטות המתוארות לעיל, אנו ממריצים והרחיבו תאי T עבור 3 או 9 ימים (איור 1א, ב). כמו כן ניתחנו את פרופיל הבידול שלהם, כפי שמצוין על-ידי אסטרטגיית האיתור המתוארים באיור 1C, על ידי מדידת השפע של גליקורופונים ברורים המתבטאת במשטח התא. אנו מראים שינוי פרוגרסיבי לקראת הבידול בידול לאורך זמן במהלך תרבות vivo לשעבר (איור 1ד). העריכו את הפונקציה האפקטור וקיבולת ההתרבות של תא T רכב בתגובה אנטיגן. אנו מראים כי תאים שהורחבו פחות (שנקטפו קודם לכן) היו מעולים פונקציונלית בהשוואה לתאים שבהרחבה לאורך זמן ארוך יותר. יום 3 התאים CART19 יש משופר ההתרבות ואת היכולת cytolytic עם גירוי מחדש עם קנצוני שלהם ליגייט ביחס ליום 9 (איור 2א, ב).
ב מודל מוראד השתל האנושי של כל, השוונו את העוצמה של מכונית T תאים שנקטפו 3 ימים לעומת 9 ימים (איור 3א). הראנו תגובה מינון אנטי לוקמיה נגד התאים CART19 שנוצר עבור 9 ימים עם תגובה מלאה עבור מינון גבוה של 3 x 106 ואובדן של יעילות עבור המינון הנמוך של 0.5 x 106. היום 3 CART19 תאים הראו בקרת גידול מתמשך במינונים גבוהים ונמוכים של CART19 תאים (איור 3ב). תגובה זו הייתה קשורה לספירה המוחלטת של CART19 בדמו ההיקפי של עכברים (איור 3ג) שנותח בהתבסס על הפרוטוקול המתואר לעיל. תוצאות אלה התקבלו מן ההערכה המקיפה שלנו של מכונית t הפונקציה לספק ראיות כי מכונית t התאים שנקטפו מוקדם יותר (יום 3) הכות מכונית t בתאי שנקטפו ביום 9.
איור 1: התפשטות הנציג ובידול פרופיל של תאי T רכב. (א) CART19 הרחבתתאים לאחר גירוי נגד CD3/CD28 מגנטיים חרוזים. (ב) גודל התא הוערך על ידי ניתוח קולטר ברחבי התרבות. (ג) נציג האסטרטגיה לניתוח פנוטימית של תאי T. (ד) אנליזה טמפורלית של בידול תא T. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: יום 3 תאים CART19 להציג פונקציה משופרת של אפקטור והתפשטות יחסית ליום 9 תאים. (א) CART19 תאים נקצרו ביום 3 ו -9 ושיתוף תרבותי ביחס E:T המצוין עם תאים K562 הביע CD19 (K562-19) או פראי סוג K562 (K562-פראי סוג). הרעלת ציטוזה ספציפי נמדד על ידי 51Cr שחרור לאחר 4 h. (ב) csfe שכותרתו תאים CART19 היו שיתוף תרבותי עם K562-19, K562-wild-סוג, או בינוני רק עבור 120 h ביחס ה1:1 e:t. התאים נקצרו בנקודות זמן שצוינו. ספירות מוחלטות העריכו על ידי הזרימה cy, לנסות. שינויי קיפול יחסיים של ספירת תאים לחיים T מנורמלות לספירת תאים T ביום 0 מוצגים. הנתונים מותווים כמשמעות של ± סטיית תקן (SD). P < 0.001 השוואת יום 3 לעומת יום 9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יום 3 CART19 תאים חזקים יותר בvivo מיום 9 תאים. (A) סכמטי של דגם מבע וטיפול CART19 cell. יום 3 ו 9 CART19 תאים או לשלוט בתאי T (UTD) היו IV-הוזרק עכברים 5-7 ימים לאחר הזרקת NALM6. (ב) כימות של נטל הגידול על ידי הדמיה biלומינסנציה ביום 38 בעכברים שטופלו עם CART19 תאים שנקטפו ביום 3 ויום 9. סמלים מייצגים עכבר אחד לכל אחד. קו אופקי שחור: ממוצע של כל קבוצה. (ג) מוחלט דם היקפי CD45+ T ספירות תאים נמדדו כל שבועיים לאחר CART19 הזרקת התא בסוף הניסוי על ידי שיטת ספירה מתאימה (כגון trucount) מבחן Unpaired מאן-ויטני, נעשה שימוש דו-זנבי. * * P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים גישות למדוד את הפונקציה ואת היעילות של תאי T רכב שנקטפו במרווחי זמן שונים ברחבי התרבות vivo ex. השיטות שלנו מספקות תובנה מקיפה לתוך בחני שנועדה להעריך את הקיבולת ההתרבות, כמו גם את התפקוד של אפקטור בתוך מבחנה. אנו מתארים כיצד למדוד פעילות תא T המכונית בעקבות גירוי דרך המכונית ופרטים מבע מודלים של לוקמיה באמצעות מכונית T תאים שנקטפו ביום 3 לעומת יום 9 של שלב ההתרחבות לוגריתמי שלהם.
ישנם אתגרים הטבועות בהשוואת היעילות של מכונית T התאים שנקטפו בזמן נקודות שונות במהלך הרחבת vivo ex. כמות תאי T שנוצרת לאורך משך התרבות של 3 ימים נמוכה, ייתכן שאין די מספרים לביצוע הערכה מקיפה של הפונקציה. זה מחמיר בהקשר של תאי T החולה שיכולת ההתרבות שלה לעתים קרובות פוחתת בשל גורמים חיצוניים ופנימיים20.
כמה תאים T המכונית צריך להיות מוחדרת ובאותו יום 3 תאים התערוכה מוגברת מטבולית היכולת ההתרבות לעומת היום שלהם 9 עמיתיהם כי הם היציאה השלב שלהם לוגריתמי ההתרבות? הערכנו מה מספר היום 3 מכונית T תאים יגיע 3 x 106 אם הם הורחבו למשך 6 ימים נוספים בתרבות. השתמשנו הערכה זו כדי להודיע כמה יום 3 תאים מכונית T צריך להיות מוחדרת (0.5 x 106) כדי להשוות אופן ליום 9. בהתאם לכך, אנו מיישמים את הגישה "מבחן הלחץ" כדי להשוות בין הפעילות הביוביולוגית, היעילות וההתמדה של תאי T מכונית. הפחתת מספר תאי T מכונית מוחדרת מ 3 x 106 כדי 0.5 x 106 חושף הבדלים שאחרת יהיה רעולי פנים על ידי הרוויה של מספרים. מכונאי, בקרת הגידול מסתמך על הצטברות של תאים מספיקים כדי למחוק את התאים שלהם היעד המקביל. במספר גבוה של אינפוזיה, ביום 3 וביום 9 מכונית T תאים מוצג מיומנות תפקודית.
אתגר נוסף בעבודה עם היום 3 מכונית T תאים הוא ההחזקה המשרד שלהם למשטח גירוי. העקירה מהחרוזים המגנטיים דורשת ליטוף חוזר ונשנה כדי לנתק אותם מכנית ולשפר את ההחלמה שלהם מהתרבות. לעומת זאת, יום 9 התאים יש 1) כבר מנותקת מן החרוזים, ו 2) מדולל את החרוזים במידה כזאת, כי הם יכולים להיות שנקטפו בקלות יחסית.
משתנה חשוב נוסף בתהליך הייצור של מכונית T הוא הבחירה של מדיום תרבות התא. מדיום מבוסס RPMI אשר כבר בתוספת עם FBS משמש בדרך כלל למטרות ניסיוני. לעומת זאת, או X-VIVO 15 או OpTmizer, שיושלם עם סרום אנושי עדיפים יישומים קליניים. בעוד שאלה מאופיינים פחות, הם עשויים להכיל רכיבים המאפשרים הרחבת תא T בפרק זמן קצר יותר. השפעתם על בידול אינה ידועה. בנוסף, התוספת של ציטוקינים משפיע על צמיחה, הישרדות, ו פנוטיפים. בעוד IL-2 כוננים התפשטות מהירה והבידול לתוך התאים אפקטור, il-7 ו-il-15, אשר מקורם בצומת לימפה יש הכיר תפקידים הומרופטיק התמדה, משפר את התפשטות התאים T ולקדם זיכרון גזע/זיכרון מרכזי זכרון22,23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת בחלקו באמצעות מימון שסופקו על ידי התרופות נוברטיס באמצעות ברית מחקר עם אוניברסיטת פנסילבניה (מייקל C. Milone), כמו גם את פרס מלומד בקרן סנט בלדריק (סאבא Ghassemi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
- Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
- Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
- Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
- Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
- Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
- Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).
