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Developmental Biology

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60032
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 2, 1
1College of Pharmacy, Duksung Innovative Drug Center, Duksung Women's University, 2Korea Drug Development Platform using Radio-isotope, Korea Institute of Radiological & Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

El sistema de ensayo de angiogénesis esferoide cocultura tridimensional está diseñado para imitar la angiogénesis fisiológica. Los esferoides de cocultivo están formados por dos precursores de células vasculares humanas, EFCC y MSC, e incrustados en gel de colágeno. El nuevo sistema es eficaz para evaluar moduladores angiogénicos y proporciona información más relevante al estudio in vivo.

Abstract

Estudios en el campo de la angiogénesis han ido creciendo agresivamente en las últimas décadas con el reconocimiento de que la angiogénesis es un sello distintivo de más de 50 condiciones patológicas diferentes, como artritis reumatoide, oculopatía, enfermedades cardiovasculares , y metástasis tumoral. Durante el desarrollo de fármacos de angiogénesis, es crucial utilizar sistemas de ensayo in vitro con tipos celulares adecuados y condiciones adecuadas para reflejar el proceso fisiológico de angiogénesis. Para superar las limitaciones de los sistemas actuales de ensayo de angiogénesis in vitro utilizando principalmente células endoteliales, desarrollamos un sistema de ensayo de brote de esferoides de cocultivo tridimensional (3D). Los esferoides de cocultivo fueron producidos por dos precursores de células vasculares humanas, células formadoras de colonias endoteliales (EFC) y células madre mesenquimales (MSC) con una proporción de 5 a 1. Los esferoides ECFCs+MSCs se incrustaron en la matriz de colágeno de tipo I para imitar el entorno extracelular in vivo. Se utilizó un grabador celular en tiempo real para observar continuamente la progresión de la brotación angiogénica de esferoides durante 24 h. La técnica de etiquetado fluorescente de células vivas también se aplicó para tratar la localización de cada tipo de célula durante la formación de brotes. El potencial angiogénico se cuantificó contando el número de brotes y midiendo la longitud acumulada de los brotes generados a partir de los esferoides individuales. Se analizaron cinco esferoides seleccionados al azar por grupo experimental. Los experimentos de comparación demostraron que los esferoides de eCFCs+MSC mostraron un mayor número de brotes y una longitud de brote acumulativa en comparación con los esferoides solo de eFCCs. Bevacizumab, un inhibidor de la angiogénesis aprobado por la FDA, fue probado con el sistema de ensayo esferoide de cocultivo recientemente desarrollado para verificar su potencial para detectar fármacos antiangiogénicos. El valoric 50 para los esferoides de ECFCs+MSC en comparación con los esferoides solo de eFCC sin lugar a la concentración plasmática efectiva de bevacizumab obtenida del modelo de ratón tumor xenoinjerto. El presente estudio sugiere que el sistema de ensayo de angiogénesis esferoidea 3D ECFCs+MSCs es relevante para la angiogénesis fisiológica, y puede predecir una concentración plasmática efectiva antes de experimentos con animales.

Introduction

Se espera que aproximadamente 500 millones de personas en todo el mundo se beneficien de la terapia moduladora de la angiogénesis para enfermedades asociadas a la malformación vascular, como la artritis reumatoide, la oculopatía, las enfermedades cardiovasculares y la metástasis tumoral1. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos que controlan la angiogénesis se ha convertido en un importante área de investigación en la industria farmacéutica. Durante el proceso de desarrollo de fármacos, es necesario estudiar en animales in vivo para explorar los efectos de los candidatos a fármacos en las funciones fisiológicas y las interacciones sistémicas entre los órganos. Sin embargo, las cuestiones éticas y de costos han aumentado las preocupaciones con respecto a los experimentos con animales2. Por lo tanto, se necesitan sistemas de ensayo in vitro mejorados para obtener datos más precisos y predecibles que conduzcan a una mejor toma de decisiones antes de los experimentos con animales. Los ensayos actuales de angiogénesis in vitro suelen medir la proliferación, invasión, migración o formación de estructura tubular de células endoteliales (EC) sembradas en placas de cultivo bidimensionales (2D)3. Estos ensayos de angiogénesis 2D son rápidos, simples, cuantitativos y rentables, y han contribuido significativamente al descubrimiento de fármacos moduladores de angiogénesis. Sin embargo, quedan varias cuestiones por mejorar.

Estos sistemas de ensayo in vitro 2D no pueden reflejar eventos complejos de angiogénesis en varios pasos que se producen en condiciones fisiológicas in vivo, lo que conduce a resultados inexactos que causan discrepancias entre los datos de ensayo in vitro y los resultados de los ensayos clínicos4. Las condiciones de cultivo 2D también inducen el cambio de fenotipos celulares. Por ejemplo, después de la proliferación en placas de cultivo 2D, los ECs tienen un fenotipo celular débil como se manifiesta por la expresión reducida de CD34 y varias señales que rigen las respuestas celulares5,6. Para superar las limitaciones de los sistemas de ensayo de angiogénesis basados en cultivos 2D, se han desarrollado sistemas de ensayo de angiogénesis esferoide tridimensionales (3D). La formación de la estructura tubular a partir de esferoides formados por eCs refleja los procesos de neovascularización in vivo7,8. Por lo tanto, el ensayo de angiogénesis esferoide 3D se ha considerado un sistema de ensayo eficaz para la detección de posibles fármacos pro o anti-angiogénesis.

La mayoría de los ensayos de angiogénesis esferoide 3D utilizan únicamente eCs, principalmente células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) o células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMC) para centrarse en la respuesta celular de las EC durante la angiogénesis. Sin embargo, los capilares sanguíneos se componen de dos tipos de células: eCs y pericitas. La elaboración de la interacción bidireccional entre los eCs y los pericitas es fundamental para la correcta integridad y función vascular. Varias enfermedades, como el accidente cerebrovascular hereditario, la retinopatía diabética y la malformación venosa, se asocian con una densidad de pericita alterada o una disminución de la unión pericita al endotelio9. Pericytes también se conocen como un elemento clave del proceso angiogénico. Los pericíticos son reclutados para estabilizar las estructuras de buques recién formados por las CE. En este sentido, el ensayo de angiogénesis esferoide monocultivo no incorpora pericitos7,10. Por lo tanto, los esferoides cocultivoformados por eCs y pericitas pueden proporcionar un enfoque valioso para imitar más estrechamente los eventos angiogénicos fisiológicos.

El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar un ensayo de angiogénesis esferoide cocultivo 3D con una combinación de células formadoras de colonias endoteliales humanas (ECFC) y células madre mesenquimales (MSC) para reflejar más de cerca la angiogénesis in vivo. El sistema esferoide de cocultura como un conjunto de representación in vitro de un vaso sanguíneo normal fue establecido por primera vez por Korff et al. en 200111. Combinaron HUVECs y células musculares lisas de la arteria umbilical humana (HMM), y demostraron que el cocultivo de dos células vasculares maduras disminuyó el potencial de brotación. Se sabe que las EC maduras (HUVEC) pierden progresivamente su capacidad de proliferar y diferenciar, lo que afecta negativamente a sus respuestas de angiogénesis12,13. Las células perivasculares maduras (HusMC) pueden causar inactivación de células endoteliales a través de la abrogación de la capacidad de respuesta del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)11. La principal diferencia entre Korff y nuestro sistema de esferoides de cocultura son los tipos de células utilizados. Aplicamos dos precursores vasculares, los FCFC y los MSC, para establecer un sistema de ensayo de angiogénesis adecuado para examinar e investigar agentes pro-o-anti-angiogénicos. Los FCFC son el precursor de las CE. Los FCFC tienen una capacidad de proliferación sólida en comparación con los CEmaduros 14,lo que permite superar la limitación de los CE. Los FCFC contribuyen a la formación de nuevos buques en muchas condiciones fisiopatologías post-natales15,16,17. Los MSC son células madre pluripotentes que tienen la capacidad de diferenciarse en pericitos, contribuyendo así a la angiogénesis18,19.

En informes anteriores, los FCFC y los MSC mostraron efectos sinérgicos en la formación de tubos in vitro20, in vivo neo-vascularización21,22, y mejor reperfusión de tejidos isquémicos23,24. En el presente estudio, los EFCC y los MSC se utilizaron para formar esferoides de cocultura e incrustados en gel de colágeno tipo I para reflejar un entorno 3D in vivo. El colágeno se considera como un componente importante de la matriz extracelular (ECM) que rodea a los CE25. El ECM desempeña un papel crítico en la regulación del comportamiento celular26. El protocolo de ensayo propuesto aquí se puede llevar a cabo fácil y rápidamente en un plazo de dos días utilizando técnicas de laboratorio comunes. Para un seguimiento eficaz de las celdas durante el proceso de brotación, cada tipo de celda se puede etiquetar fluorescentemente y supervisarse mediante una grabadora de celdas en tiempo real. El sistema de ensayo de angiogénesis esferoidea de cocultivo 3D recientemente establecido está diseñado para aumentar la sensibilidad para evaluar posibles moduladores angiogénicos y proporcionar información predecible antes del estudio in vivo.

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Protocol

Los EFCC humanos se aislaron de la sangre periférica humana, como se describe en un informe anterior27. Brevemente, la capa de células mononucleares fue separada de toda la sangre usando el Ficoll-Paque Plus, y cultivada en el medio adecuado hasta que aparecieron las colonias endoteliales. Se recogieron colonias y se aislaron los EFC utilizando perlas magnéticas recubiertas de CD31. Los MSC se aislaron de la fracción de células mononucleares adherentes (MNC) de la médula ósea adulta humana. El protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad de Mujeres de Duksung (IRB No. 2017-002-01).

1. Cultivo celular

  1. Preparación de eFC y PLACAs de capa medianas y de MSC
    1. Preparar el medio de crecimiento de células endoteliales MV2 (ECGM-MV2, excepto hidrocortisona) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de glutamina-penicilina-estreptomicina (GPS).
    2. Preparar el crecimiento de células madre mesenquimales medio-2 (MSCGM-2) que contiene 10% FBS y 1% GPS.
    3. Para el cultivo ECFC, cubra las placas de cultivo celular con una solución de gelatina al 1%. Para preparar 1% solución de gelatina, disolver 1 g de gelificación en polvo en 500 ml de PBS con el agitador magnético, y esterilizar con autoclave. Las placas se pueden recubrir con 3 ml/60 mm, 5 ml/100 mm o 15 ml/150 mm de solución de gelatina al 1%. Incubar placas recubiertas durante 15 minutos en una incubadora de cultivo celular (37 oC y 5% CO2). Después de eso, retire el 1% restante de la solución de gelatina por aspiración y lave las placas recubiertas una vez con PBS.
  2. Crecientes EFCCs y MSCs
    1. Semilla 1 x 106 EFC en placas 1% recubiertas de gelatina de 150 mm, y crecen usando ECGM-MV2 (10% FBS, 1% GPS) en una incubadora de cultivo celular (37oC y 5% CO2)a 80-90% de confluencia. Utilice los FCFC en los números de paso 7-10 para obtener resultados consistentes.
    2. Semilla 1 x 106 MSC en placas no recubiertas de 150 mm, y crecen usando MSCGM-2 en una incubadora de cultivo celular (37oC y 5% CO2)a 80-90% de confluencia. Utilice los MSC en los números de paso 7-10 para obtener resultados consistentes.

2. Preparación de 1,2% p/v Solución de metilcelulosa

  1. Mida 6 g de celulosa metilenenenenta en una botella de vidrio de 500 ml y esterilizar en un autoclave.
  2. Calentar ECGM-MV2 (sin FBS y GPS) a 60 oC durante 20 min, y añadir 250 ml de ECGM-MV2 calentado a polvo de metilcelulosa esterilizado. Para mantener condiciones estériles, lleve a cabo el proceso dentro de la campana de flujo.
  3. Agregue una barra de agitación magnética esterilizada y mezcle la solución durante 20 minutos en el agitador magnético hasta que la celulosa metilse se humedezca completamente y se disperse uniformemente sin grumos. Añadir 250 mL de ECGM-MV2 frío (4 oC) (sin FBS y GPS) bajo la condición estéril y mezclar durante 10 minutos adicionales en el agitador magnético. A continuación, enfríe la solución en un frigorífico (4oC) durante la noche.
    NOTA: La metilcelulosa es un polímero de carbohidratos que se disuelve bien en temperaturas frías debido a la hinchazón y posterior hidratación.
  4. Al día siguiente, alícuota la solución en un tubo de 50 ml y centrífuga a 5.000 x g durante 3 h a 4 oC. Tomar la solución de sobrenadante viscoso transparente y almacenar a 4 oC hasta su uso durante un máximo de 3-6 meses.
    NOTA: El sedimento puede contener fibra residual de celulosa, por lo que tomar suavemente la solución sobrenadante dejando atrás al menos 5 ml de volumen. Este volumen se puede ajustar según las condiciones experimentales.

3. Generación e incrustación de esferoides de ECFCs, solo para MSC y ECFCs-MSCs

Día 1

  1. Preparación de la suspensión celular de los EFCC y los MSC
    1. Lave los eFC y MSC confluentes del 80-90% añadiendo solución salina tamponada de fosfato (PBS) sin calcio y magnesio, y aspirar.
    2. Para separar los EFC y los MSC de la placa de cultivo, incubarlos con 0,05% de trippsina-EDTA durante 3 min y 5 min en una incubadora de cultivo celular (37oC y 5% CO2),respectivamente, en una incubadora de cultivo celular.
    3. Inactivar la trippsina añadiendo un medio DMEM que contenga 10% FBS y 1% GPS. Pipetear las celdas hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión de una sola celda.
    4. Sedimentar las células por centrifugación a 282 x g durante 5 min a RT.
    5. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el medio respectivo.
  2. Etiquetado de EFC y MSC con tinte fluorescente
    NOTA: Realizar el etiquetado de membrana celular de eFC con PKH67 (verde) y MSCs con PKH26 (rojo) colorante fluorescente siguiendo las instrucciones del fabricante con ligeras modificaciones de la siguiente manera.
    1. Lave las células dos veces con un medio libre de suero para eliminar el FBS.
      NOTA: Las proteínas y los lípidos de FBS reducen la concentración efectiva de tinte para el etiquetado de las células mediante la unión.
    2. Cuente los EFC y los MSC utilizando un hemocitómetro bajo el microscopio, y transfiera 3 x 106 EFCC y 2 x 106 MSC a microtubos de 2 ml.
      NOTA: Estas son las densidades celulares óptimas para el etiquetado de células con tendedes. El uso de un gran número de células causa una tinción deficiente y heterogénea, mientras que el uso de muy pocas células produce una recuperación deficiente de las células.
    3. Centrifugar los tubos a 100 x g durante 5 min a RT para obtener un pellet celular. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante dejando no más de 15-25 l de volumen residual.
    4. Vuelva a suspender los EFC y los MSC en 250 ml de diluyente C del kit de tinte. Pipetee suavemente la suspensión celular para asegurar una dispersión completa.
      NOTA: El diluyente C es una sal fisiológica, y puede reducir la eficiencia de tinción del tinte mediante la formación de micelas. Por lo tanto, no deje que las células se pongan de pie en el diluyente C durante mucho tiempo, y no vórtice los tubos.
    5. Preparar la solución de tinción para los FCE añadiendo 5 l de PKH67 a 250 l de diluyente C (concentración final de 20 m) y para los MCS añadiendo 3 ml de PKH26 a 250 l de diluyente C (concentración final de 12 m).
      NOTA: Las concentraciones finales de tinte son diferentes de las recomendaciones del fabricante. Una alta concentración conduciría a aglutinamiento celular y toxicidad celular. La baja concentración no sería suficiente para la tinción.
    6. Añadir 250 l de suspensión celular de EFC a 250 ml de solución de tinte PKH67, y 250 ml de MSC a 250 ml de solución de tinte PKH26. Mezcle inmediatamente las células con colorantes pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para obtener mejores resultados, cubra el tubo con papel de aluminio y colóquelo en una coctelera para asegurar una mezcla suficiente durante la tinción.
    7. Detenga el proceso de tinción agregando 0,5 ml de FBS a la suspensión de células manchadas y, a continuación, incuba durante 1 min para permitir que FBS se adhiera al exceso de tinte no unido. Sedimentar las células manchadas por centrifugación a 100 x g durante 5 min.
      NOTA: Los peletes EFC y MSCson son de color amarillo claro y rosa, respectivamente, después de la tinción.
    8. Retire cuidadosamente el sobrenadante y lave las células dos veces con un medio completo para eliminar el exceso de tinte. Centrifugar los tubos a 100 x g durante 5 min y volver a suspender el pellet en 2 ml de cada medio completo.
  3. Generación de esferoides ECFC, MSC o ECFC+MSC
    NOTA: Aplique la técnica de caída colgante para generar esferoides como se describió anteriormente28. Los pasos para la preparación de esferoides se indican a continuación.
    1. Cuente los EFC manchados y los MSC.
    2. Suspenda los FCFC manchados, los MSC o los FCM+MSC en ECGM-MV2 que contengan una solución de metilcelulosa al 20% y un 5% de FBS. Prepárese a una densidad celular de 4 x 104 células/ml para EFC o MSC (25 ml de suspensión celular contiene 1.000 células). Para la suspensión de dos células de los EFC y los MSC, prepárese a una densidad celular de 2 x 104 células/mL de EFCC y 0,4 x 104 MSC de célula/ml (25 ml contiene 500 EFCC y 100 MSC).
      NOTA: La relación entre los FCFC y los MSC no debe exceder de 5:1. Un mayor número de MSC podría conducir a una migración excesiva y a una morfología irregular de los brotes. Un número menor de MSC podría causar una mala interacción entre las células, produciendo una mala brotación.
    3. Prepare una unidad de hidratación añadiendo 15 ml de PBS en la parte inferior de una placa de cultivo de 150 mm.
    4. Transfiera la suspensión celular al depósito rectangular de poliestireno esterilizado para el uso de pipetas multicanal. Disperse la suspensión de las células uniformemente pipeteando.
    5. Deposite 25 s/L gotas de suspensión celular en la cubierta de una placa de cultivo de 150 mm utilizando una pipeta multicanal (aproximadamente 100 gotas/cubierta de la placa de 150 mm). Invierta la cubierta sobre una unidad de hidratación llena de PBS e incubar en una incubadora de cultivo celular durante 24 horas.
      NOTA: La solución de metilcelulosa proporciona una viscosidad adecuada a la solución de suspensión. Cuando el método de caída colgante se realizó sin solución de metilcelulosa, las gotas se deslizaron fácilmente cuando la cubierta se invirtió(Figura suplementaria 1). Además, después de la incubación durante la noche, los esferoides no se formaron perfectamente sin solución de metilcelulosa. Este resultado indica que la viscosidad adecuada por solución de metilcelulosa es necesaria para formar forma redonda de los esferoides.

Día 2

  1. Incrustar esferoides en gel de colágeno neutralizado
    1. FbS caliente y ECGM-MV2 (sin FBS y GPS) en un baño de agua (37 oC). Coloque la solución de metilcelulosa fría en un banco de trabajo para llevar a temperatura ambiente.
    2. Coloque una placa de 24 pocillos en una incubadora de cultivo celular (37 oC) para calentarla.
    3. Corte las puntas puntiagudas de 1 ml de pipeta de 3-5 mm para aspirar esferoides y suspensiones viscosas, como la solución de metilcelulosa y el colágeno tipo I, de forma cómoda y precisa.
    4. Preparar 3 mg/ml de gel de colágeno tipo I neutralizado en hielo siguiendo las instrucciones del fabricante del gel de colágeno tipo I.
      NOTA: La neutralización debe realizarse sobre hielo para evitar la gelación de colágeno a temperatura ambiente. Para un pozo de una placa de 24 pocillos, se necesitan 500 ml de colágeno neutralizado. Preparar siempre 1 ml de volumen extra de colágeno. Gel de colágeno se puede utilizar hasta 2-3 h después de la neutralización si se mantiene en hielo.
    5. Cosecha los esferoides encerrando la cubierta que contiene esferoides con 5 ml de PBS. Recoger la solución suspendida por esferoides en un tubo cónico de 50 ml. Vuelva a enjuagar la cubierta con 5 ml de PBS para obtener los esferoides restantes.
      NOTA: Durante la cosecha, observar de cerca para confirmar la existencia de esferoides. Para una inspección más visual, transfiera alrededor de 50-100 l de solución suspendida por esferoides en el vidrio deslizante y compruebe la forma redonda de los esferoides bajo el microscopio.
    6. Sedimentar los esferoides centrifugando a 282 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante cuidadosamente sin molestar a los esferoides dejando atrás no más de 100-200 l de volumen residual.
    7. Toque suavemente en la pared del tubo para que los esferoides se suspendan libremente en la solución residual restante de 100-200 l.
    8. Agregue ECGM-MV2 que contenga 5% de FBS y 40% de solución de metilcelulosa al tubo que contiene esferoides. El volumen añadido se determina sobre la base de aproximadamente 100 esferoides/ml. Mezcle suavemente la suspensión esferoide pipeteando con una punta de pipeta contundente de 1 ml.
      NOTA: La solución de metilcelulosa se utiliza ampliamente como un agente de suspensión que no permite que los esferoides sedimenten. La concentración de FBS debe ser del 5%. Mayor concentración de FBS causa brotes anormales debido a factores de crecimiento excesivos. La concentración más baja de FBS no puede mantener condiciones saludables para las células.
    9. Mezclar la solución de suspensión de esferoides y el gel de colágeno de tipo neutralizado I (3 mg/ml) en una proporción de 1:1 en hielo. Utilice una punta de pipeta contundente de 1 ml para evitar la rotura de esferoides.
      NOTA: Se requiere 1 ml de la solución de gel de colágeno que suspende los esferoides para un pozo de una placa de 24 pocillos. Haga una solución de suspensión mixta adicional si es posible.
    10. Si es necesario probar las propiedades angiogénicas de cualquier agente o producto químico, transfiera 1 ml de la solución de gel de colágeno que suspende los esferoides en un microtubo de 1 ml y añada los agentes o productos químicos seguidos de una mezcla suave con una punta de pipeta de 1 ml.
      NOTA: El volumen de agente y producto químico puede sumar 200 ml, lo que diluye la concentración de gel de colágeno tipo I de 1,5 mg/ml a 1,25 mg/ml, pero no afecta a la polimerización de gel de colágeno tipo I. Añade el mismo volumen de vehículo a los esferoides de control.
    11. Agregue la solución de gel de colágeno que suspende el esferoide en los pozos de una placa precalentada de 24 pocillos (0,9 ml/pozo) mediante pipeteo, y luego incubar durante 30 minutos en una incubadora de cultivo celular para la polimerización.
      NOTA: Durante el proceso de incrustación de esferoides, no moleste el gel agitando la placa.
    12. Cubrir el gel de colágeno que suspende el esferoide añadiendo 100 ml de ECGM-MV2 que contiene 2,5% DE FBS con/sin VEGF. Para los esferoides solo ECFC, estimule las células con la adición exógena de VEGF (concentración final de 50 ng/ml) para formar brotes adecuados. Los esferoides ECFC+MSC no requieren estimulación exógena por ningún factor de crecimiento.
    13. Coloque la placa en una grabadora celular en tiempo real instalada en una incubadora de cultivo celular (37 oC y 5% CO2),y concéntrese aleatoriamente en 5-10 esferoides (10x lente objetivo). Supervise la formación de brotes de cada esferoides etiquetados con fluorescencia cada 1 h durante 24 horas sin ninguna perturbación.

4. Cantidad de brotes de esferoides

  1. Importe los archivos de imagen al software ImageJ para cuantificar el número de brotes y medir la longitud de cada brote. Para los esferoides de cocultura, etiquete los EFC con un tinte fluorescente verde antes de hacer esferoides. A continuación, mida el número y la longitud de los brotes teñidos con fluorescencia verde(Figura suplementaria 2). Se cuantificaron cinco esferoides seleccionados al azar por grupo experimental.
    NOTA: Los brotes son estructuras alargadas colaborativamente formadas por varios EFC que se extienden a partir de esferoides. La longitud del brote se mide como la longitud desde el punto de origen de los brotes desde la superficie de los esferoides hasta la punta de los brotes.
  2. Exprese los valores como medios de SEM de al menos tres experimentos independientes. Determine la diferencia estadísticamente significativa por ANOVA unidireccional para comparaciones múltiples o la prueba tdel estudiante para las comparaciones emparejadas.
    NOTA: P a 0,05 se considera estadísticamente significativa.

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Representative Results

Los experimentos de comparación se realizaron utilizando esferoides monocultivos (solo EFCC) y esferoides de cocultura (ECFCs+MSCs) para examinar si los MSC desempeñan un papel considerable en la angiogénesis mediada por los FCFC. La formación de brotes de cada esferoide fue monitoreada durante 24 horas por un grabador celular en tiempo real que podía capturar la progresión de la brotación angiogénica de esferoides. El potencial angiogénico se cuantificó contando el número de brotes y midiendo la longitud acumulada de los brotes generados a partir de esferoides individuales. Se analizaron cinco esferoides seleccionados al azar por grupo experimental. En el lugar de los esferoides eFC+MSC, el número de brotes y la longitud acumulativa de los brotes fueron significativamente mayores en comparación con los esferoides solo de los EFCC en todos los puntos de tiempo(Figura 1A-C). El número de brotes y la longitud de los esferoides de eCFCs+MSC aumentaron continuamente durante 12 h, pero el número y la longitud de los esferoides solo de ECFC s aumentaron durante 6 h y no cambiaron en los puntos de tiempo posteriores(Figura 1B,C). Además, los brotes formados por esferoides eCFCs+MSCs eran más gruesos y duraderos que los formados por esferoides solo de EFCC con/sin tratamiento VEGF(Figura 1A,y Video Suplementario 1A,B,D). Los esferoides solo de los MSC no formaron brotes, pero mostraron la migración individual de los MSC fuera de los esferoides(Figura 1A y Video Suplementario 1C). Estos resultados demuestran la contribución significativa de los MSC, precursores de pericytos, a la angiogénesis celular de los EFCC. Los MSC son conocidos por secretar varios factores de crecimiento29 que pueden estimular los EFC a formar brotes y estructuras tubulares.

Los FCFC fueron etiquetados con tinte verde-fluorescente y los MSC fueron etiquetados con tinte rojo-fluorescente antes de combinarlos para generar esferoides eCFCs+MSCs. Junto con la grabación en tiempo real, esta técnica de etiquetado de fluorescencia celular en vivo puede rastrear los movimientos celulares de los EFCC y MSC durante la formación de brotes. Las imágenes fluorescentes mostraron que las estructuras de brotes mediadas por eCFCs estaban cubiertas con MSC(Figura 2 y Video Suplementario 2). Esto sugiere que los MSC combinados funcionan como células perivasculares durante la formación del brote, que mejoran la estabilidad y durabilidad del brote por la estrecha asociación entre dos células vasculares.

El sistema de ensayo esferoide de cocultivo recientemente desarrollado fue probado con bevacizumab, un inhibidor de la angiogénesis aprobado por la FDA, para verificar su potencial para detectar fármacos antiangiogénicos. Los esferoides eCFCs+MSC pretratados con bevacizumab mostraron una disminución del número de brotes y de la longitud acumulada del brote de manera dependiente de la dosis en comparación con los esferoides EFC+MSC de control(Figura 3A,B). En experimentos paralelos, los esferoides solo para eFC pretratados con bevacizumab seguidos de estimulación con VEGF (50 ng/mL) también mostraron una disminución del número de brotes inducidos por VEGF y la longitud acumulada del brote de manera dependiente de la dosis(Figura 3C,D) . Cabe destacar que los valores de IC50 de bevacizumab para inhibir la longitud acumulativa del brote en los esferoides eBRS/MSC fueron 46 veces mayores que los de los esferoides solo para eFC(Tabla 1). Este resultado implica fuertemente que se necesita una mayor concentración para inhibir la formación vascular fisiológicamente relevante por los FCFC y los MSC en comparación con la concentración necesaria para inhibir únicamente la formación vascular mediada por la CE.

A continuación, se realizó un modelo de ratón tumor de xenoinjerto con tratamiento con bevacizumab para revelar qué sistema esferoide proporciona datos predecibles que se correlacionan con la concentración plasmática efectiva in vivo. La línea celular de glioblastoma U87MG-Red-FLuc de origen humano se inyectó subcutáneamente en ratones con deficiencia inmune. Después de confirmar la formación de tumores a la 1 semana, los ratones se dividieron aleatoriamente en 3 grupos que recibieron diferentes tratamientos: control (0 mg/kg), dosis baja (1 mg/kg) y dosis alta (30 mg/kg). El crecimiento tumoral se inhibió significativamente en el grupo tratado con 30 mg/kg en comparación con el grupo de control(Figura suplementaria 3A). El grupo tratado con 1 mg/kg mostró una tendencia a la disminución tumoral, pero no hubo diferencia estadística en comparación con el grupo de control. La concentración plasmática del ratón a las 3 semanas de tratamiento con bevacizumab fue de 568,0 a 40,62 g/ml a 30 mg/kg y 38,1 a 0,72 g/ml a 1 mg/kg(Figura suplementaria 3B). En particular, La concentración plasmática de bevacizumab que muestra una inhibición efectiva (568,0 x 40,62 g/ml a 30 mg/kg durante un tratamiento de 3 semanas) se logró estrechamente mediante esferoides de EFC/MSC (1261,5 a 214,49 g/ml), pero no por esferoides solo para eCFCs (27,0 x 9,97 g/ml). Por lo tanto, el sistema de ensayo de angiogénesis esferoidea ECFCs+MSC puede considerarse como un sistema de ensayo adecuado para predecir la concentración plasmática efectiva antes de los experimentos con animales.

Figure 1
Figura 1: Formación de brotes de esferoides solo de EFCCs, MSCs y ECFCs+MSCs. (A) Imágenes representativas de la formación de brotes de sólo ECFCs, sólo MSC y ECFCs +MSC esferoides incrustados en gel de colágeno tipo I a 0, 6, 12, 18 y 24 h (Barra de escala a 100 m). (B) Gráfico cuantitativo del número de brotes formado a partir de esferoides de EFC-only y ECFCs+MSCs (media-SEM, n.o 3). (C) Gráfico cuantitativo de la longitud acumulativa del brote formado únicamente por los FCFC y los esferoides de los EFC+MSC (media-SEM, n.o 3). * indica una diferencia significativa entre los esferoides eFC-only y ECFCs+MSCs en los mismos puntos de tiempo (p a 0,05). • indica una diferencia significativa entre los grupos indicados por un corchete (p a 0,05). Esta cifra se ha modificado a partir de una publicación anterior30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Localización de EFC y MSC en estructuras de brotes. Las imágenes representativas que muestran ubicaciones de dos tipos de células en estructuras de brotes después de 24 h. Los EFC y los MSC fueron etiquetados fluorescentemente con PKH67 (verde) y PKH26 (rojo), respectivamente, y realizaron ensayos de angiogénesis esferoide shéferoides 3D ECFCs+MSC. Las flechas muestran que los MSC estaban cubiertos con estructuras de brotes mediadas por EFC (barra de escala de 100 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Efecto inhibitorio de bevacizumab en la formación de brotes de EFCCs+MSC y esferoides solo de EFC. Se trataron los EFC+MSC y los esferoides solo de eFC con bevacizumab, y se monitorizaron la formación de brotes durante 24 h. (B) Se monitorizaron gráficacuantitativas de la longitud acumulativa del brote de los esferoides de los EFC+MSC tratados con bevacizumab (media-SEM, n.o 3). (C) Gráfico cuantitativo del número de brotes de esferoides sólo de EFC estimulados por EL VEGF tratados con bevacizumab (media-SEM, n.o 3). (D) Gráfico cuantitativo de la longitud acumulativa del brote a partir de esferoides sólo de EFC estimulados por EL VEGF tratados con bevacizumab (media-SEM, n.o 3). * indica una diferencia significativa con respecto al grupo de control (barra blanca) (p a 0,05). • indica una diferencia significativa con respecto al grupo tratado con VEGF (barra negra) (p a 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

hora
(h)		 IC50 (g/ml) de Avastin valor p
Esferoides solo para ECFCs ECFCs+MSCs esferoides
6 94,62 a 38,53 3058,21 a 373,31 0.003
12 58,61 a 17,80 2006 484,73 0.015
18 83,38 a 54,54 1509,51 a 483,88 0.042
24 27,04 a 9,97 1261,51 a 214,49 0.0045

Tabla 1: Valores IC50 de bevacizumab para la inhibición de la longitud acumulativa del brote en esferoides solo en EFCCs o ECFCs+MSCs. Los esferoides solo para eFC se trataron con bevacizumab seguido de estimulación con VEGF (50 ng/ml), que es necesario para la formación de brotes de esferoides solo de EFCCs. Los esferoides de EFC+MSC se trataron con bevacizumab sin estimulación veGF. Ambos esferoides incrustados en gel de colágeno tipo I, y la formación de brotes de cada esferoide se observó durante 24 horas utilizando una grabadora celular en tiempo real. Los datos se representan como medias - SEM (n.o 3).

Supplemental Figure 1
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Supplemental Figure 2
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Supplemental Figure 3
Figura suplementaria 3: Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El presente estudio introduce un sistema de ensayo de angiogénesis in vitro mejorado utilizando esferoides de cocultivo formados por dos progenitores de células vasculares humanas, EFCC y MSC. interacción e incorporación entre células endoteliales y pericítas. En comparación con otros ensayos de angiogénesis in vitro que reflejan sólo la angiogénesis mediada por los CE, este sistema de ensayo de cocultura es más representativo de la cascada multipaso de angiogénesis fisiológica, incluida la interacción celular, la brotación, la formación de tubos, y la maduración del recipiente. Este sistema de ensayo recién establecido también se asemeja al microambiente extracelular in vivo mediante la sembración de esferoides en gel de colágeno tipo I. Sugerimos que el sistema de ensayo de angiogénesis esferoidea de cocultivo 3D sea fiable, repetible, fácilmente cuantificable y, lo que es más importante, fisiológicamente relevante.

Durante la realización del ensayo esferoide co-cultivo, es esencial incrustar esferoides en gel con la concentración adecuada de colágeno neutralizado tipo I y FBS. La mejor concentración final de colágeno neutralizado tipo I es 1,5 mg/ml, y el porcentaje de FBS es del 2,5%. En los experimentos preliminares, mayores concentraciones de colágeno dieron lugar a gel rígido y obstaculizaron la calidad y cantidad de brotes procedentes de esferoides. Las concentraciones menores de colágeno produjeron geles blandos y frágiles que no podían mantener la integridad de los esferoides. Del mismo modo, las cantidades más altas de FBS causaron la brotación pletórica de esferoides a nivel basal independientemente de la estimulación del factor angiogénico. La menor concentración de FBS condujo a malas condiciones de las células. Para obtener resultados consistentes y reproducibles, se debe incrustar un número adecuado de esferoides (alrededor de 50 esferoides/bien). Más de 50 esferoides/pozopodrían conducir a la proximidad de los esferoides dentro del pozo, lo que puede afectar anormalmente la calidad y cantidad de brotes generados.

Es fundamental mantener el colágeno tipo I en condiciones frías durante los pasos de neutralización y mezcla con la suspensión esferoide porque el colágeno puede coagularse a temperatura ambiente, lo que resulta en una matriz irregular. Durante la mezcla de la suspensión esferoide con solución de colágeno, se recomienda utilizar la punta de pipeta de 1 ml con corte de 3-5 mm en el extremo para hacer un agujero ancho. Esto permite un manejo fácil de la solución de colágeno viscoso y protege los esferoides de la ruptura. La agitación de la placa después de incrustar la solución de colágeno suspendida por esferoides podría perturbar la integridad del gel y provocar una rotura que puede dificultar la generación normal de brotes.

En el ensayo de esferoides de cocultura utilizando EFCCys y MSC, se debe mantener la relación 5:1. El uso de un mayor número de MSC según la propagación del esferoide debido al fenotipo migratorio de los MSC, que puede afectar a la generación ideal de brotes. Un número menor de MSC es insuficiente para estimular los EFC que brotan y cubrir los brotes correctamente. Además, es esencial comprobar las condiciones celulares durante el crecimiento. Si se observa una mala brotación, se recomienda utilizar otros pasajes sanos de las células. Para obtener un mejor resultado, se recomienda encarecidamente el uso de los FCE y los MSC en el pasaje inferior a 10.

Aquí, presentamos un sistema mejorado de ensayo de angiogénesis 3D utilizando esferoides de cocultivo que capturan de cerca la angiogénesis in vivo. En comparación con los sistemas de ensayo de células únicas 2D, este sistema de ensayo esferoide de cocultivo refleja respuestas celulares más fieles entre dos tipos de células vasculares para formar estructuras tubulares en condiciones fisiológicas. Sin embargo, este sistema sigue siendo demasiado simplificado en comparación con el complejo proceso de varios pasos de la angiogénesis in vivo. La generación vascular in vivo generalmente ocurre a través de la interacción múltiple de varios otros tipos de células, incluyendo células epiteliales, fibroblastos, células inmunitarias, y también abundantes proteínas ECM. Las aplicaciones futuras de este nuevo sistema incluyen la introducción de otros tipos de células y el ECM para reflejar con mayor precisión la angiogénesis fisiológica y/o patológica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por una subvención (17172MFDS215) del Ministerio de Seguridad Alimentaria y de Drogas, la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Gobierno de Corea (MSIP) (2017R1A2B4005463), y el Programa de Investigación de Ciencia Básica a través del Programa de Investigación de Cienciabásica básica a través del Programa de Investigación de Ciencias Básicas a través del Gobierno de Corea (MSIP) (2017R1A2B4005463), y el Programa de Investigación de CienciaS Básicas a través del Programa de Investigación de Cienciabásica básica a través del National Research Foundation of Korea(NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2016R1A6A1A03007648).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA (1x) Gibco 25300-054
Bevacizumab Roche NA Commercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium Gibco 11885-084 DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) Gibco 21600-010 PBS (10x)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) Corning 21-031-CVR PBS (1x)
Endothelial cell Growth medium MV2 kit Promocell C-22121 ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS) Atlas FP-0500A FBS
Gelatin BD Sciences 214340
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin Gibco 10378-016 GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2 Promocell C-28009 MSCGM-2
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI26 PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI67 PKH67
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Type I collagen gel Corning 354236
Vascular endothelial growth factor A R&D 293-VE-010 VEGF

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References

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Biología del desarrollo Número 151 angiogénesis esferoide co-cultivo células formadoras de colonias endoteliales células madre mesenquimales gel de colágeno tipo I brotación bevacizumab
Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales
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