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Developmental Biology

Système d'analyse d'angiogenèse tridimensionnel utilisant des sphéroïdes de co-culture formés par des cellules de formation de colonies endothéliales et des cellules souches mésenchymales

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60032
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 2, 1
1College of Pharmacy, Duksung Innovative Drug Center, Duksung Women's University, 2Korea Drug Development Platform using Radio-isotope, Korea Institute of Radiological & Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Le système d'analyse sphéroïque de co-culture tridimensionnaux est conçu pour imiter l'angiogenèse physiologique. Les sphéroïdes de co-culture sont formés par deux précurseurs de cellules vasculaires humaines, Les ECFC et les MSC, et incorporés dans le gel de collagène. Le nouveau système est efficace pour évaluer les modulateurs angiogéniques, et fournit des informations plus pertinentes à l'étude in vivo.

Abstract

Les études dans le domaine de l'angiogenèse ont été agressivement en croissance au cours des dernières décennies avec la reconnaissance que l'angiogenèse est une caractéristique de plus de 50 conditions pathologiques différentes, telles que la polyarthrite rhumatoïde, l'oculopathie, les maladies cardiovasculaires , et métasses tumorales. Pendant le développement de médicament d'angiogenèse, il est crucial d'employer des systèmes in vitro d'essai avec les types appropriés de cellules et les conditions appropriées pour refléter le processus physiologique d'angiogenèse. Pour surmonter les limites des systèmes actuels d'analyse d'angiogenèse in vitro utilisant principalement des cellules endothéliales, nous avons développé un système d'analyse de la co-culture en 3dimensions (3D) de co-culture. Les sphéroïdes de co-culture ont été produits par deux précurseurs de cellules vasculaires humaines, les cellules de formation de colonie séliale endothéliale (ECFC) et les cellules souches mésenchymales (MSCs) avec un rapport de 5 à 1. Les sphéroïdes eCFC-MSCs ont été incorporés dans la matrice de collagène de type I pour imiter l'environnement extracellulaire in vivo. Un enregistreur cellulaire en temps réel a été utilisé pour observer continuellement la progression de la germination angiogénique à partir de sphéroïdes pendant 24 h. La technique d'étiquetage fluorescent des cellules vivantes a également été appliquée pour observer la localisation de chaque type de cellule pendant la formation des germes. Le potentiel angiogénique a été quantifié en comptant le nombre de germes et en mesurant la longueur cumulative des germes générés par les sphéroïdes individuels. Cinq sphéroïdes choisis au hasard ont été analysés par groupe expérimental. Des expériences de comparaison ont démontré que les sphéroïdes ECFCs-MSCs ont montré un plus grand nombre de germes et une longueur cumulative de germes par rapport aux sphéroïdes eCFC seulement. Le bévacizumab, un inhibiteur de l'angiogenèse approuvé par la FDA, a été testé avec le système d'analyse sphéroïde de co-culture nouvellement développé pour vérifier son potentiel pour dépister les médicaments anti-angiogéniques. La valeur IC50 pour les sphéroïdes ECFCs-MSCs par rapport aux sphéroïdes ECFCs-seulement était plus proche de la concentration plasmatique efficace de bevacizumab obtenue à partir du modèle de souris de tumeur de xénogreffe. La présente étude suggère que le système d'analyse de l'angiogenèse sphéroïde 3D ECFs-MSCs est pertinent pour l'angiogenèse physiologique, et peut prédire une concentration efficace de plasma avant des expériences animales.

Introduction

Environ 500 millions de personnes dans le monde devraient bénéficier d'un traitement modulant de l'angiogenèse pour les maladies associées à la malformation vasculaire comme la polyarthrite rhumatoïde, l'oculopathie, les maladies cardiovasculaires et la métasose tumorale1. Ainsi, le développement de médicaments qui contrôlent l'angiogenèse est devenu un domaine de recherche important dans l'industrie pharmaceutique. Pendant le processus de développement de drogue, l'étude animale in vivo est nécessaire pour explorer les effets des candidats de drogue sur des fonctions physiologiques et des interactions systémiques entre les organes. Cependant, les questions d'éthique et de coût ont accru les préoccupations concernant les expériences animales2. Par conséquent, des systèmes d'analyse in vitro améliorés sont nécessaires pour obtenir des données plus précises et prévisibles menant à une meilleure prise de décision avant les expériences animales. Les essais actuels d'angiogenèse in vitro mesurent habituellement la prolifération, l'invasion, la migration ou la formation tubulaire de cellules endothéliales (EC) ensemoir dans des plaques de culture bidimensionnelles (2D)3. Ces essais d'angiogenèse 2D sont rapides, simples, quantitatifs et rentables, et ont contribué de manière significative à la découverte de médicaments modulation de l'angiogenèse. Cependant, plusieurs questions restent à améliorer.

Ces systèmes d'analyse in vitro 2D ne peuvent pas refléter des événements complexes en plusieurs étapes de l'angiogenèse qui se produit dans des conditions physiologiques in vivo, conduisant à des résultats inexacts qui causent des écarts entre les données d'essai in vitro et les résultats des essais cliniques4. Les conditions de culture 2D induisaient également le changement des phénotypes cellulaires. Par exemple, après la prolifération dans les plaques de culture 2D, les EC ont un phénotype cellulaire faible comme manifesté par l'expression réduite de CD34 et plusieurs signaux qui régissent les réponses cellulaires5,6. Pour surmonter les limites des systèmes d'analyse d'angiogenèse basés sur la culture 2D, des systèmes d'analyse sphéroïde tridimensionnaux (3D) ont été développés. Sprouting suivi par la formation de structure tubulaire à partir de sphéroïdes formés par ECs reflètent in vivo processus néo-vascularisation7,8. Ainsi, l'angiogenèse sphéroïde 3D a été considérée comme un système d'évaluation efficace pour le dépistage des médicaments potentiels pro ou anti-angiogenèse.

La plupart des analyses d'angiogenèse sphéroïde 3D n'utilisent que des EC, principalement des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) ou des cellules endothéliales microvasculaires cutanées humaines (HDMECs) pour se concentrer sur la réponse cellulaire des ECs pendant l'angiogenèse. Cependant, les capillaires sanguins sont composés de deux types de cellules : les CE et les péricytes. L'élaboration de l'interaction bidirectionnelle entre les EC et les péritéytes est essentielle pour une intégrité et une fonction vasculaires adéquates. Plusieurs maladies, telles que l'aVC héréditaire, la rétinopathie diabétique, et la malformation veineuse, sont associées à la densité altérée de périyte ou à l'attachement diminué de périyte à l'endothelium9. Les péricartes sont également connus comme un élément clé du processus angiogénique. Les péricartés sont recrutées pour stabiliser les structures nouvellement formées des navires par les EC. À cet égard, l'angiogenèse sphéroïde mono-culture n'incorpore pas de péridytes7,10. Par conséquent, les sphéroïdes de co-culture formés par des ECs et des péricartétes peuvent fournir une approche valable aux événements angiogéniques physiologiques plus étroitement imités.

La présente étude visait à mettre au point un analyse d'angiogenèse sphéroïde de co-culture 3D avec une combinaison de cellules de formation de colonies endothéliales humaines (CeFC) et de cellules souches mésenchymales (MSC) pour refléter plus étroitement l'angiogenèse in vivo. Le système sphéroïde de co-culture en tant qu'assemblage in vitro de représentation d'un vaisseau sanguin normal a été établi pour la première fois par Korff et autres en 200111. Ils ont combiné des HUVECs et des cellules lisses de muscle lissed d'artère ombilicale humaine (HUSMCs), et ont démontré que la co-culture de deux cellules vasculaires mûres a diminué le potentiel de germination. Les EC matures (HUVECs) sont connus pour perdre progressivement leur capacité à proliférer et différencier, ce qui affecte négativement leurs réponses d'angiogenèse12,13. Les cellules périvasculaires matures (HUSMCs) peuvent causer l'inactivation de cellules endothéliales par l'abrogation du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) réactivité11. La principale différence entre Korff et notre système sphéroïde co-culture est les types de cellules utilisées. Nous avons appliqué deux précurseurs vasculaires, Des ECFC et des MSC, pour établir un système approprié d'angiogenèse pour examiner et étudier les agents pro-ou-anti-angiogéniques. Les CEC sont le précurseur des CE. Les CEC ont une capacité de prolifération robuste par rapport aux CE matures14, ce qui permet de surmonter la limitation des CE. Les ECFC contribuent à la formation de nouveaux vaisseaux dans de nombreuses affections pathophysiologiques postnatales15,16,17. Les MSC sont des cellules souches pluripotentes qui ont la capacité de se différencier en péricartés, contribuant ainsi à l'angiogenèse18,19.

Dans les rapports précédents, les ECFC et les MSC ont montré des effets synergiques sur la formation in vitro de tube20,la néo-vascularisation in vivo21,22, et la reperfusion améliorée des tissus ischémiques23,24. Dans la présente étude, les ECFC et les MSC ont été utilisés pour former des sphéroïdes de co-culture et incorporés dans le gel de collagène de type I pour refléter un environnement 3D in vivo. Le collagène est considéré comme un des principaux constituants de la matrice extracellulaire (ECM) entourant les EC25. L'ECM joue un rôle essentiel dans la régulation du comportement cellulaire26. Le protocole d'analyse proposé ici peut être effectué facilement et rapidement en deux jours en utilisant des techniques de laboratoire communes. Pour un suivi efficace des cellules pendant le processus de germination, chaque type de cellule peut être étiqueté et surveillé de façon fluorescente à l'aide d'un enregistreur cellulaire en temps réel. Le nouveau système d'analyse d'angiogenèse sphéroïde de co-culture 3D est conçu pour augmenter la sensibilité pour évaluer les modulateurs angiogéniques potentiels et pour fournir des informations prévisibles avant l'étude in vivo.

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Protocol

Les CeFC humains ont été isolés du sang périphérique humain tel que décrit dans un rapport précédent27. En bref, la couche de cellules mononucléaires a été séparée du sang entier à l'aide du Ficoll-Paque Plus, et cultivée dans le milieu approprié jusqu'à ce que les colonies endothéliales soient apparues. Des colonies ont été recueillies et les CeEC ont été isolés à l'aide de perles magnétiques enduites de CD31. Les MSC ont été isolés de la fraction de cellules mononucléaires adhérentes (MNC) de la moelle osseuse adulte humaine. Le protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université des femmes Duksung (IRB no 2017-002-01).

1. Culture cellulaire

  1. Préparation des CCEE et des plaques de mSC moyennes et de manteaux
    1. Préparer le milieu de croissance des cellules endothéliales MV2 (ECGM-MV2, à l'exception de l'hydrocortisone) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (SFB) et 1 % de glutamine-pénicilline-streptomycine (GPS).
    2. Préparer la croissance des cellules souches mésenchymales moyenne-2 (MSCGM-2) contenant 10% FBS et 1% GPS.
    3. Pour la culture ECFC, enrober les plaques de culture cellulaire d'une solution de gélatine de 1 %. Pour préparer une solution de gélatine de 1 %, dissoudre 1 g de poudre de gelation dans 500 ml de PBS avec l'agitateur magnétique, et stériliser avec autoclave. Les plaques peuvent être enduites de 3 mL/60 mm, 5 mL/100 mm, ou 15 mL/150 mm de solution de gélatine de 1 %. Incuber les plaques enduites pendant 15 min dans un incubateur de culture cellulaire (37 oC et 5 % DE CO2). Après cela, retirez la solution de gélatine restante de 1 % par aspiration et lavez les plaques enduites une fois avec pbS.
  2. Croissance des CCEE et des CSM
    1. Seed 1 x 106 ECFC sur 1% de plaques de 150 mm recouvertes de gélatine, et de croître en utilisant ECGM-MV2 (10% FBS, 1% GPS) dans un incubateur de culture cellulaire (37oC et 5% CO2) à 80-90% de confluency. Utilisez les CeFC aux numéros de passage 7-10 pour obtenir des résultats cohérents.
    2. Seed 1 x 106 MSCs sur des plaques de 150 mm non enrobées, et de croître en utilisant MSCGM-2 dans un incubateur de culture cellulaire (37 oC et 5 % CO2) à 80-90% de confluency. Utilisez les SDC au numéro de passage 7-10 pour obtenir des résultats cohérents.

2. Préparation de 1,2 % w/v Solution de méthylcellulose

  1. Mesurer 6 g de cellulose méthyle dans une bouteille en verre de 500 ml et stériliser dans un autoclave.
  2. Chauffer eCGM-MV2 (sans FBS et GPS) à 60 oC pendant 20 min, et ajouter 250 ml d'ECGM-MV2 chauffé à la poudre de cellulose de méthyle stérilisée. Pour maintenir des conditions stériles, effectuer le processus à l'intérieur du capot d'écoulement.
  3. Ajouter une barre d'agitation magnétique stérilisée et mélanger la solution pendant 20 min sur l'agitateur magnétique jusqu'à ce que la cellulose méthyle soit bien mouillée et dispersée uniformément sans grumeaux. Ajouter 250 ml d'ECGM-MV2 froid (4 oC) (sans FBS et GPS) dans un état stérile et mélanger pendant 10 min supplémentaires sur l'agitateur magnétique. Ensuite, réfrigérer la solution au réfrigérateur (4 oC) pendant la nuit.
    REMARQUE: La méthylcellulose est un polymère de glucides qui se dissolve nt bien dans des températures fraîches en raison de l'enflure et de l'hydratation subséquente.
  4. Le lendemain, aliquot la solution dans un tube de 50 ml et centrifugeuse à 5 000 x g pour 3 h à 4 oC. Prenez la solution de supernatant visqueux clair et entreposez-les à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit utilisé jusqu'à 3-6 mois.
    REMARQUE: Les sédiments peuvent contenir de la fibre de cellulose résiduelle, alors prenez doucement la solution supernatante laissant derrière elle au moins 5 ml de volume. Ce volume peut être ajusté en fonction des conditions expérimentales.

3. Génération et intégration de CCEE seulement, MSC-seulement, et ECFCs-MSCs Sphéroïdes

Jour 1

  1. Préparation de la suspension cellulaire des CCEE et des MSC
    1. Laver les 80-90% de confluents ECFC et MSCs en ajoutant phosphate tamponné saline (PBS) sans calcium et magnésium, et aspirer.
    2. Pour détacher les CCEC et les MSC de la plaque de culture, incubez-les avec 0,05 % de trypsine-EDTA pendant 3 min et 5 min dans un incubateur de culture cellulaire (37 oC et 5 % CO2), respectivement, dans un incubateur de culture cellulaire.
    3. Inactiver trypsin e en ajoutant le milieu DMEM contenant 10% FBS et 1% GPS. Pipette les cellules de haut en bas pour créer une suspension de cellule unique.
    4. Sédimenter les cellules en centrifuge à 282 x g pendant 5 min à RT.
    5. Retirez le supernatant et suspendez à nouveau les cellules dans le milieu respectif.
  2. Étiquetage des CCEE et des MSC avec colorant fluorescent
    REMARQUE: Effectuer l'étiquetage des membranes cellulaires des CCEC avec PKH67 (vert) et MSC avec PKH26 (rouge) colorant fluorescent suivant les instructions du fabricant avec des modifications légèrement comme suit.
    1. Laver les cellules deux fois avec un milieu sans sérum pour enlever FBS.
      REMARQUE: Les protéines et les lipides dans FBS réduisent la concentration efficace de colorant pour l'étiquetage des cellules par liaison.
    2. Comptez les CCEC et les MSC à l'aide d'un hémocytomètre sous le microscope et transférez 3 x 106 CCEC et 2 x 106 MSC dans des microtubes de 2 ml.
      REMARQUE: Ce sont les densités cellulaires optimales pour l'étiquetage des cellules avec des colorants. L'utilisation d'un grand nombre de cellules provoque une coloration faible et hétérogène, tandis que l'utilisation de trop peu de cellules donne une mauvaise récupération des cellules.
    3. Centrifuger les tubes à 100 x g pendant 5 min à RT pour obtenir une pastille cellulaire. Aspirez soigneusement le supernatant en ne laissant pas plus de 15-25 l de volume résiduel.
    4. Suspendre à nouveau les CCEC et les MSC dans 250 L de Diluent C du kit de teinture. Doucement pipette la suspension de la cellule pour assurer une dispersion complète.
      REMARQUE: Le diluant C est un sel physiologique, et peut réduire l'efficacité de coloration du colorant en formant des micelles. Par conséquent, ne laissez pas les cellules se tenir dans le diluant C pendant longtemps, et ne pas vortex les tubes.
    5. Préparer la solution de coloration pour les CCEC en ajoutant 5 L de PKH67 à 250 OL de Diluent C (concentration finale de 20 M) et pour les CSM en ajoutant 3 L de PKH26 à 250 OL de Diluent C (concentration finale de 12 M).
      REMARQUE: Les concentrations finales de colorant sont différentes des recommandations du fabricant. Une forte concentration entraînerait l'agglutination cellulaire et la toxicité cellulaire. Une faible concentration ne serait pas suffisante pour la coloration.
    6. Ajouter 250 l de suspension cellulaire eCFC à 250 oL de solution de colorant PKH67, et 250 L de MSC à 250 oL de solution de colorant PKH26. Mélanger immédiatement les cellules avec des colorants en faisant monter et descendre et incuber pendant 5 min à température ambiante. Pour de meilleurs résultats, recouvrir le tube de papier d'aluminium et placer sur un shaker pour assurer un mélange suffisant pendant la coloration.
    7. Arrêter le processus de coloration en ajoutant 0,5 mL de FBS à la suspension des cellules tachées, puis incuber pendant 1 min pour permettre à FBS de lier l'excès de colorant non lié. Sédimenter les cellules tachées en centrifugeant à 100 x g pendant 5 min.
      REMARQUE: Les granulés d'ECFC et de MSC sont jaune clair et roses, respectivement, après coloration.
    8. Retirez soigneusement le supernatant et lavez les cellules deux fois avec un milieu complet pour enlever l'excès de colorant. Centrifuger les tubes à 100 x g pendant 5 min et re-suspendre la pastille dans 2 ml de chaque milieu complet.
  3. Génération de sphéroïdes ECFC, MSC ou ECFC-MSC
    REMARQUE: Appliquer la technique de largage suspendu pour générer des sphéroïdes comme décrit précédemment28. Les étapes pour la préparation des sphéroïdes sont données ci-dessous.
    1. Comptez les CCEC et les CSM tachés.
    2. Suspendre les CCEC, les CSS ou les CCEC-MSC souillés dans eCGM-MV2 contenant 20 % de solution de méthylcellulose et 5 % de FBS. Préparer à une densité cellulaire de 4 x 104 cellules/mL pour les ECFC ou les MSC (25 l de suspension cellulaire contient 1 000 cellules). Pour la suspension à deux cellules des CCEE et des MSC, préparez-vous à une densité cellulaire de 2 x 104 cellules/ML ECFC et 0,4 x 104 mSC de cellules/mL (25 L contient 500 ECFC et 100 MSC).
      REMARQUE: Le ratio des CCEC par rapport aux SMC ne doit pas dépasser 5:1. Un plus grand nombre de MSC pourrait conduire à une migration excessive et à une morphologie irrégulière des germes. Un plus petit nombre de MSCs pourrait causer une mauvaise interaction entre les cellules, ce qui donne une faible germination.
    3. Préparer une unité d'hydratation en ajoutant 15 ml de PBS dans le fond d'une plaque de culture de 150 mm.
    4. Transférer la suspension cellulaire dans le réservoir rectangulaire en polystyrène stérilisé pour l'utilisation de la pipette multicanal. Disperser la suspension des cellules uniformément par pipetting.
    5. Déposer 25 gouttes de suspension cellulaire sur le couvercle d'une plaque de culture de 150 mm à l'aide d'une pipette multicanal (environ 100 gouttes/couverture de la plaque de 150 mm). Inverser la couverture sur une unité d'hydratation remplie de PBS et couver dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 h.
      REMARQUE: La solution de méthylcellulose offre une viscosité appropriée à la solution de suspension. Lorsque la méthode de largage suspendu a été effectuée sans solution de méthylcellulose, les gouttes ont été facilement glissées vers le bas lorsque le couvercle a été inversé (Figure supplémentaire 1). En outre, après l'incubation de nuit, les sphéroïdes n'ont pas été parfaitement formés sans solution de méthylcellulose. Ce résultat indique que la viscosité appropriée par la solution de méthylcellulose est nécessaire pour former la forme ronde des sphéroïdes.

Jour 2

  1. Intégrer des sphéroïdes dans du gel de collagène neutralisé
    1. F.S. et ECGM-MV2 (sans FBS et GPS) dans un bain d'eau (37 oC). Placer la solution de méthylcellulose froide sur un banc de travail pour apporter à la température ambiante.
    2. Placer une plaque de 24 puits dans un incubateur de culture cellulaire (37 oC) pour le réchauffement.
    3. Couper les pointes pointues de 1 ml de pipette de 3 à 5 mm pour aspirer les sphéroïdes et les suspensions visqueuses, comme la solution de méthylcellulose et le collagène de type I, confortablement et avec précision.
    4. Préparer 3 mg/mL de gel de collagène neutralisé de type I sur la glace suivant l'instruction du fabricant de gel de collagène de type I.
      REMARQUE: La neutralisation doit être effectuée sur la glace pour éviter la gélification du collagène à température ambiante. Pour un puits d'une plaque de 24 puits, 500 L de collagène neutralisé est nécessaire. Toujours préparer 1 mL de volume supplémentaire de collagène. Le gel de collagène peut être utilisé jusqu'à 2-3 h après la neutralisation s'il est maintenu sur la glace.
    5. Récoltez les sphéroïdes en rinçant la couverture contenant des sphéroïdes avec 5 ml de PBS. Recueillir la solution sphéroïde-suspendue dans un tube conique de 50 ml. Rincez le couvercle avec 5 ml de PBS pour obtenir les sphéroïdes restants.
      REMARQUE: Pendant la récolte, observez de près pour confirmer l'existence de sphéroïdes. Pour une inspection plus visuelle, transférez environ 50-100 L de solution sphéroïde suspendue sur le verre coulissant, et vérifiez la forme ronde des sphéroïdes sous le microscope.
    6. Sédimenter les sphéroïdes en centrifugeant à 282 x g pendant 5 min. Jetez soigneusement le supernatant sans déranger les sphéroïdes en ne laissant pas plus de 100-200 l de volume résiduel.
    7. Appuyez doucement sur la paroi du tube afin que les sphéroïdes soient librement suspendus dans la solution résiduelle restante de 100 à 200 l.
    8. Ajouter ECGM-MV2 contenant 5% de FBS et 40% de solution de méthylcellulose au tube contenant des sphéroïdes. Le volume ajouté est déterminé sur la base d'environ 100 sphéroïdes/mL. Mélanger délicatement la suspension sphéroïde en pipetting avec une pointe de pipette émoussée de 1 ml.
      REMARQUE: La solution de méthylcellulose est largement utilisée comme agent de suspension qui ne permet pas aux sphéroïdes de sédiments. La concentration de FBS devrait être de 5%. Une concentration plus élevée de FBS provoque une germination anormale due à des facteurs de croissance excessifs. Une concentration plus faible de FBS ne peut pas maintenir des conditions saines pour des cellules.
    9. Mélanger la solution sphéroïde-suspension et le gel de collagène I de type neutralisé (3 mg/mL) à un rapport de 1:1 sur la glace. Utilisez une pointe de pipette émoussée de 1 ml pour éviter la rupture des sphéroïdes.
      REMARQUE : 1 ml de la solution de gel de collagène sphéroïdes-suspension est exigé pour un puits d'une plaque de 24 puits. Faire une solution de suspension supplémentaire mixte si possible.
    10. Si les propriétés angiogéniques de n'importe quel agent ou produit chimique doivent être testées, transférer 1 ml de la solution de gel de collagène sphéroïde-suspension dans un micro-tube de 1 ml et ajouter l'agent (s) ou chimique (s) suivi d'un mélange doux avec une pointe émoussée de 1mL pipette.
      REMARQUE: Le volume d'agent et de produit chimique peut s'résumer à 200 ml, ce qui dilue la concentration de gel de collagène de type I de 1,5 mg/mL à 1,25 mg/mL, mais n'affecte pas la polymérisation du gel de collagène de type I. Ajouter le même volume de véhicule aux sphéroïdes de contrôle.
    11. Ajouter la solution de gel de collagène sphéroïde-suspension dans les puits d'une plaque pré-chauffée de 24 puits (0,9 ml/puits) par pipetting, puis incuber pendant 30 min dans un incubateur de culture cellulaire pour la polymérisation.
      REMARQUE: Pendant le processus d'intégration sphéroïde, ne pas déranger le gel en agitant la plaque.
    12. Couvrez le gel de collagène sphéroïde-suspendu en ajoutant 100 l d'ECGM-MV2 contenant 2,5% DE FBS avec/sans VEGF. Pour les sphéroïdes uniquement ECFC, stimuler les cellules avec l'ajout exogène de VEGF (concentration finale de 50 ng/mL) pour former des germes appropriés. Les sphéroïdes ECFC-MSC ne nécessitent aucune stimulation exogène par des facteurs de croissance.
    13. Placez la plaque dans un enregistreur cellulaire en temps réel installé dans un incubateur de culture cellulaire (37 oC et 5 % de CO2), et concentrez-vous au hasard sur 5 à 10 sphéroïdes (10x objectif). Surveillez la formation de germination de chaque sphéroïde étiqueté e à la fluorescence tous les 1 h pendant 24 h sans aucune perturbation.

4. Quantitate Spheroid Sprouting

  1. Importer les fichiers d'images au logiciel ImageJ pour quantifier le nombre de germes et mesurer la longueur de chaque pousse. Pour les sphéroïdes de co-culture, étiquetez les ECFC avec du colorant fluorescent vert avant de faire des sphéroïdes. Ensuite, mesurez le nombre et la longueur des germes tachés de fluorescence verte (Figure supplémentaire 2). Cinq sphéroïdes choisis au hasard ont été quantifiés par groupe expérimental.
    REMARQUE: Les sprouts sont des structures allongées en collaboration formées par plusieurs ECFC s'étendant à partir de sphéroïdes. La longueur des germes est mesurée comme la longueur du point d'origine des germes de la surface des sphéroïdes à la pointe des germes.
  2. Exprimez les valeurs comme moyens - SEM d'au moins trois expériences indépendantes. Déterminer la différence statistiquement significative par ANOVA à sens unique pour les comparaisons multiples ou le test t-del'étudiant pour les comparaisons appariées.
    REMARQUE: P 0,05 est considéré comme statistiquement significatif.

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Representative Results

Des expériences comparatives ont été réalisées à l'aide de sphéroïdes monoculturels (ECFC seulement) et de sphéroïdes de co-culture (ECFC-MSC) pour examiner si les MSC jouent un rôle considérable dans l'angiogenèse médiée par les CCEC. La formation de germination de chaque sphéroïde a été surveillée pendant 24 h par un enregistreur cellulaire en temps réel qui pourrait capturer la progression de la germination angiogénique des sphéroïdes. Le potentiel angiogénique a été quantifié en comptant le nombre de germes et en mesurant la longueur cumulative des germes générés par les sphéroïdes individuels. Cinq sphéroïdes choisis au hasard par groupe expérimental ont été analysés. Pour les sphéroïdes ECFCs-MSCs, le nombre de germes et la longueur cumulative des germes étaient significativement plus élevés que ceux des sphéroïdes eCFC seulement à tous les points de temps(figure 1A-C). Le nombre et la longueur des sphéroïdes ECFCs-MSCont ont augmenté continuellement pendant 12 h, mais le nombre et la longueur des sphéroïdes ECFC seulement ont augmenté pendant 6 h et n'ont pas changé à des points de temps ultérieurs(figure 1B,C). En outre, les germes formés par les sphéroïdes ECFCs-MSCs étaient plus épais et plus durables que ceux formés par les sphéroïdes uniquement eCFC avec/sans traitement VEGF (Figure 1A, et Vidéo supplémentaire 1A,B,D). Les sphéroïdes MSC seulement n'ont pas formé de germes, mais ont montré la migration individuelle des SMS à l'extérieur des sphéroïdes(figure 1A et vidéo supplémentaire 1C). Ces résultats démontrent la contribution significative des MSCs, précurseurs de périyte, à l'angiogenèse cellulaire des CCEC. Les MSC sont connus pour sécrétiser divers facteurs de croissance29 qui peuvent stimuler les ECFC à former des germes et des structures tubulaires.

Les CCEC ont été étiquetés avec du colorant vert-fluorescent et les MSC ont été étiquetés avec du colorant rouge-fluorescent avant de se combiner pour générer des sphéroïdes ECFC-MSCs. Avec l'enregistrement en temps réel, cette technique d'étiquetage de la fluorescence cellulaire vivante peut suivre les mouvements cellulaires des ECFC et des MSC pendant la formation des germes. L'imagerie fluorescente a montré que les structures de germes médiées par les CeFC étaient couvertes de SMC(figure 2 et vidéo supplémentaire 2). Ceci suggère que les MSC combinés fonctionnent en tant que cellules périvasculaires pendant la formation de germe, qui augmentent la stabilité et la durabilité de germe par l'association serrée entre deux cellules vasculaires.

Le nouveau système d'analyse sphéroïde de co-culture a été testé avec le bévacizumab, un inhibiteur de l'angiogenèse approuvé par la FDA, pour vérifier son potentiel à dépister les médicaments anti-angiogéniques. Les sphéroïdes ECFCs-MSCs prétraités avec du bévacizumab ont montré une diminution du nombre de germes et de la longueur cumulative des germes d'une manière dépendante de la dose par rapport aux sphéroïdes de contrôle ECFCs-MSCs (figure 3A,B). Dans des expériences parallèles, les sphéroïdes uniquement des ECFC prétraités avec du bévacizumab suivis d'une stimulation par VEGF (50 ng/mL) ont également montré une diminution du nombre de germes induits par le VEGF et de la longueur cumulative des germes d'une manière dépendante de la dose(figure 3C,D) . Il convient de noter que les valeurs IC50 du bévacizumab pour inhiber la longueur cumulative des germes dans les sphéroïdes ECFCs-MSC étaient 46 fois supérieures à celle des sphéroïdes uniquement des ECFC (tableau 1). Ce résultat implique fortement qu'une concentration plus élevée est nécessaire pour inhiber la formation vasculaire physiologiquement pertinente par les ECFC et les MSC par rapport à la concentration nécessaire pour inhiber seulement la formation vasculaire EC-négociée.

Ensuite, un modèle de souris de tumeur de xénogreffe a été exécuté avec le traitement de bevacizumab pour indiquer quel système sphéroïde fournissent la corrélation prévisible de données avec la concentration efficace in vivo de plasma. La lignée cellulaire U87MG-Red-FLuc de glioblastome d'origine humaine a été injectée sous-cutanée à des souris immunodéficientes. Après avoir confirmé la formation de tumeur à 1 semaine, les souris ont été aléatoirement divisées en 3 groupes qui ont reçu différents traitements : contrôle (0 mg/kg), faible dose (1 mg/kg), et dose élevée (30 mg/kg). La croissance de tumeur a été sensiblement inhibée dans le groupe mg/kg-traité comparé au groupe témoin (figure supplémentaire 3A). Le groupe de 1 mg/kg-traité a montré une tendance pour la diminution de tumeur, mais il n'y avait aucune différence statistique comparée au groupe témoin. La concentration plasmatique de souris à 3 semaines du traitement du bévacizumab était de 568,0 à 40,62 g/mL à 30 mg/kg et de 38,1 à 0,72 g/mL à 1 mg/kg (Figure supplémentaire 3B). Notamment, la concentration plasmatique de bévacizumab montrant une inhibition efficace (568,0 à 40,62 g/mL à 30 mg/kg pour un traitement de 3 semaines) a été atteinte de près par les sphéroïdes ECFCs-MSC (1261,5 à 214,49 g/mL), mais pas les sphéroïdes eCFC seulement (27,0 à 9,97 g/mL). Ainsi, le système d'analyse sphéroïde sphéroïde des CCEC peut être considéré comme un système d'analyse approprié pour prédire une concentration plasmatique efficace avant les expériences animales.

Figure 1
Figure 1 : Formation de germes à partir de CCEE seulement, mSCs-seulement, et ECFCs-MSCs sphéroïdes. (A) Images représentatives de la formation de germes provenant des ECFC seulement, des MSC seulement et des sphéroïdes ECFC-MSC incorporés dans du gel de collagène de type I à 0, 6, 12, 18 et 24 h (barre d'échelle de 100 m). (B) Graphique quantitatif du nombre de germes formé à partir de Sphéroïdes ECfCs-MSCs (moyenne-SEM, n ' 3). (C) Graphique quantitatif de la longueur cumulative des germes formée à partir des CCEC seulement et des SPcC-MSCs (moyenne-SEM, n ' 3). indique une différence significative entre les CCEC seulement et les SPlytoïdes ECFC-MSCs en même temps (p - 0,05). indique une différence significative entre les groupes indiqués par une parenthèse (p 0,05). Ce chiffre a été modifié à partir d'une pubisation précédente30. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Localisation des CeEC et des SMC dans les structures germées. Des images représentatives montrant l'emplacement de deux types de cellules dans les structures de germe après 24 h. Les ECFC et les MSC ont été étiquetés fluorescentement avec PKH67 (vert) et PKH26 (rouge), respectivement, et ont effectué l'angiogenèse sphéroïde 3D ECFCs-MSCs. Les flèches montrent que les MSC étaient recouverts de structures de germes médiées par les CCEC (barre d'échelle de 100 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Effet inhibiteur du bévacizumab sur la formation des germes des CCEE-MSC et des sphéroïdes uniquement des ECFC. Les CCEC-MSC et les sphéroïdes eCFC seulement ont été traités avec du bévacizumab, et la formation des germes a été surveillée pendant 24 h. (B) Graphique quantitatif de la longueur cumulative des germes des sphéroïdes ECFCs-MSCs traités au bévacizumab (moyenne seM, n - 3). (C) Graphique quantitatif du nombre de germes provenant de sphéroïdes éphéroïdes certifiés VEGF seulement traités au bévacizumab (moyenne, n . (D) Graphique quantitatif de la longueur cumulative des germes provenant des sphéroïdes épchéroïdes stimulés par le VEGF traités au bévacizumab (moyenne, n ' 3). indique une différence significative par rapport au groupe témoin (barre blanche) (p 0,05). indique une différence significative par rapport au groupe traité par le VEGF (barre noire) (p 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

temps
h)		 IC50 (g/mL) d'Avastin p-valeur
Sphéroïde ECFCs-seulement Sphéroïdes ECFCs-MSCs
6 94,62 à 38,53 3058,21 à 373,31 0.003
12 58,61 à 17,80 En 2006, 484,73 euros 0.015
18 83,38 à 54,54 1509,51 à 483,88 0.042
24 27,04 à 9,97 1261,51 euros 214,49 0.0045

Tableau 1 : Valeurs IC50 du bévacizumab pour l'inhibition de la longueur cumulative des germes dans les Sphéroïdes ECFC sphéroïdes. Les sphéroïdes eCFC seulement ont été traités avec le bévacizumab suivi de la stimulation avec VEGF (50 ng/mL), qui est exigé pour la formation de germe des sphéroïdes ECFC-seulement. Les sphéroïdes ECFCs-MSCs ont été traités avec le bévacizumab sans stimulation VEGF. Les deux sphéroïdes incorporés dans le gel de collagène de type I, et la formation de germe de chaque sphéroïde a été observée pendant 24 h à l'aide d'un enregistreur cellulaire en temps réel. Les données sont représentées en moyenne au SEM (n ' 3).

Supplemental Figure 1
Figure supplémentaire 1 : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Figure 2
Figure supplémentaire 2 : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Figure 3
Figure supplémentaire 3 : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Video 1A
Vidéo supplémentaire 1A: Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Supplemental Video 1B
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Supplemental Video 1C
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Supplemental Video 1D
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Supplemental Video 2
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Discussion

La présente étude introduit un système d'analyse d'angiogenèse in vitro amélioré utilisant des sphéroïdes de co-culture formés par deux progéniteurs de cellules vasculaires humaines, les CCEC et les MSC. Le système sphéroïde de co-culture peut imiter la formation de germes vasculaires in vivo, qui est par interaction et incorporation entre les cellules endothéliales et les péritéytes. Comparé à d'autres essais in vitro d'angiogenèse qui reflètent seulement l'angiogenèse ECs-négociée, ce système d'essai de co-culture est plus représentatif de la cascade multiétape de l'angiogenèse physiologique comprenant l'interaction cellulaire, la germination, la formation de tube, et la maturation des vaisseaux. Ce système d'analyse nouvellement établi ressemble également au microenvironnement extracellulaire in vivo en ensemencer des sphéroïdes dans le gel de collagène de type I. Nous suggérons que le système d'analyse d'angiogenèse sphéroïde de co-culture 3D soit fiable, répétable, facilement quantifiable, et surtout physiologiquement pertinent.

Tout en effectuant l'exemple sphéroïde de co-culture, il est essentiel d'intégrer des sphéroïdes dans le gel avec la concentration appropriée du collagène neutralisé de type I et DE FBS. La meilleure concentration finale de collagène neutralisé de type I est de 1,5 mg/mL, et le pourcentage de FBS est de 2,5 %. Dans les expériences préliminaires, des concentrations plus élevées de collagène ont eu comme conséquence le gel raide et ont entravé la qualité et la quantité des germes provenant des sphéroïdes. De plus petites concentrations de collagène ont donné le gel doux et fragile qui ne pourrait pas maintenir l'intégrité des sphéroïdes. De même, des quantités plus élevées de FBS ont causé la germination pléthorique des sphéroïdes au niveau basal indépendamment de la stimulation de facteur angiogénique. Une concentration plus faible de FBS a mené aux conditions pauvres des cellules. Pour des résultats cohérents et reproductibles, un nombre approprié de sphéroïdes doit être incorporé (environ 50 sphéroïdes/puits). Plus de 50 sphéroïdes/puits pourraient conduire à la proximité des sphéroïdes dans le puits, ce qui peut affecter anormalement la qualité et la quantité des germes générés.

Il est essentiel de maintenir le collagène de type I dans des conditions réfrigérées pendant la neutralisation et le mélange des étapes avec la suspension sphéroïde parce que le collagène peut coaguler à température ambiante, résultant en une matrice irrégulière. Tout en mélangeant la suspension sphéroïde avec la solution de collagène, il est recommandé d'utiliser 1 ml de pointe de pipette avec 3-5 mm coupé à l'extrémité pour faire un trou large. Cela permet une manipulation facile de la solution de collagène visqueux et protège les sphéroïdes de la rupture. L'agitation de la plaque après l'intégration de la solution de collagène sphéroïde-suspendue pourrait perturber l'intégrité du gel et entraîner une rupture qui peut entraver la génération normale de germes.

Dans l'étosay sphéroïde de co-culture utilisant des CCEC et des MSC, le rapport 5:1 devrait être maintenu. L'utilisation d'un plus grand nombre de MSC provoque la propagation autour du sphéroïde en raison du phénotype migrateur des MSC, ce qui peut affecter la génération idéale de germes. Un plus petit nombre de MSC est insuffisant pour stimuler la germination des ECFC et couvrir correctement les germes. En outre, il est essentiel de vérifier les conditions cellulaires pendant la croissance. Si une mauvaise germination est observée, il est recommandé d'utiliser un autre passage sain des cellules. Pour de meilleurs résultats, il est fortement recommandé d'utiliser les CCEC et les CSM à moins de 10 passages.

Ici, nous présentons un système d'angiogenèse 3D amélioré utilisant des sphéroïdes de co-culture qui capturent étroitement l'angiogenèse in vivo. Comparé aux systèmes d'essai de cellules uniques 2D, ce système d'essai sphéroïde de co-culture reflètent des réponses plus fidèlement cellulaires entre deux types de cellules vasculaires pour former des structures tubulaires dans des conditions physiologiques. Cependant, ce système reste trop simplifié par rapport au processus complexe en plusieurs étapes de l'angiogenèse in vivo. La génération vasculaire in vivo se produit habituellement par l'interaction multiple de divers autres types de cellules, y compris les cellules épithéliales, les fibroblastes, les cellules immunitaires, et également les protéines abondantes d'ECM. Les applications futures de ce nouveau système incluent l'introduction d'autres types de cellules et l'ECM pour refléter plus précisément l'angiogenèse physiologique et/ou pathologique.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par une subvention (17172MFDS215) du Ministère de l'alimentation et de la sécurité des médicaments, la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIP) (2017R1A2B4005463), et le Programme de recherche scientifique fondamentale par l'intermédiaire du National Research Foundation of Korea (NRF) financé par le Ministère de l'éducation (2016R1A6A1A03007648).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA (1x) Gibco 25300-054
Bevacizumab Roche NA Commercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium Gibco 11885-084 DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) Gibco 21600-010 PBS (10x)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) Corning 21-031-CVR PBS (1x)
Endothelial cell Growth medium MV2 kit Promocell C-22121 ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS) Atlas FP-0500A FBS
Gelatin BD Sciences 214340
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin Gibco 10378-016 GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2 Promocell C-28009 MSCGM-2
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI26 PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI67 PKH67
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Type I collagen gel Corning 354236
Vascular endothelial growth factor A R&D 293-VE-010 VEGF

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