Summary
三次元共培養スフェロイド血管新生アッセイシステムは、生理学的血管新生を模倣するように設計されている。共培養スフェロイドは、2つのヒト血管細胞前駆体、CFFCおよびMSCによって形成され、コラーゲンゲルに埋め込まれる。新しいシステムは血管新生調節器の評価に有効であり、生体内研究により関連性の高い情報を提供する。
Abstract
血管新生の分野での研究は、血管新生が関節リウマチ、眼科症、心血管疾患などの50以上の異なる病理学的状態の特徴であるという認識で、ここ数十年で積極的に成長してきました。、および腫瘍転移。血管新生の薬剤開発の間、生理血管新生プロセスを反映するために適切な細胞型および適切な条件を有するインビトロアッセイシステムを使用することが重要である。主に内皮細胞を用いた体外血管新生アッセイ系の現在の限界を克服するために、3次元(3D)共培養スフェロイド発芽アッセイシステムを開発した。共培養スフェロイドは、2つのヒト血管細胞前駆体、内皮コロニー形成細胞(CFFC)および間葉系幹細胞(MSC)の2つの比率によって5対1の比率で産生された。EFc+MSCスフェロイドは、生体内細胞外環境を模倣するためにI型コラーゲンマトリックスに埋め込まれた。リアルタイムの細胞レコーダーを用い、24時間のスフェロイドからの血管新芽の進行を連続的に観察した。血管新生電位は、芽の数を数え、個々のスフェロイドから発生する芽の累積長さを測定することによって定量された。実験群ごとに5つのランダムに選択されたスフェロイドを分析した。比較実験は、EFC+MSCスフェロイドが、EFCのみのスフェロイドと比較して、より大きな芽数と累積芽長を示したことを実証した。FDA承認血管新生阻害剤であるベバシズマブは、新たに開発された共培養スフェロイドアッセイシステムを用いて、抗血管新生薬のスクリーニングの可能性を検証した。ECFCのみのスフェロイドと比較したECFC+MSCスフェロイドのIC50値は、異種移植片腫瘍マウスモデルから得られたベバシズマブの有効血漿濃度に近かった。本研究は、3D ECFC+MSCスフェロイド血管新生アッセイシステムが生理学的血管新生に関連し、動物実験の前に有効な血漿濃度を予測できることを示唆している。
Introduction
世界中で約5億人が、関節リウマチ、眼症、心血管疾患、腫瘍転移1などの血管奇形関連疾患に対する血管新生調節療法の恩恵を受ける見込みです。このように、血管新生を制御する薬剤の開発は、製薬業界において重要な研究領域となっています。創薬プロセスの間に、生体内動物研究は、生理機能および臓器間の全身相互作用に対する薬剤候補の影響を探求する必要がある。しかし、倫理的およびコストの問題は、動物実験2に関する懸念を高めています。したがって、動物実験の前により良い意思決定につながるより正確で予測可能なデータを得るためには、インビトロアッセイシステムの改良が必要です。現在の体外血管新生アッセイは、通常、2次元(2D)培養プレート3に播種された内皮細胞(IC)の増殖、侵入、移行、または管状構造形成を測定する。これらの2D血管新生アッセイは、迅速、シンプル、定量的、費用対効果が高く、血管新生調節薬の発見に大きく貢献しています。ただし、いくつかの問題は改善される必要があります。
このような2Dインビトロアッセイシステムは、生体内生理学的条件下で起こる血管新生の複雑な多段階事象を反映することができず、インビトロアッセイデータと臨床試験結果との間に不一致を引き起こす不正確な結果をもたらす4。2D培養条件はまた、細胞型の変化を誘発する。例えば、2D培養プレートで増殖した後、ICはCD34の発現の減少と細胞応答5、6を支配するいくつかのシグナルによって現れる弱い細胞表現型を持つ。2D培養系血管新生アッセイシステムの限界を克服するために、3次元(3D)スフェロイド血管新生アッセイシステムが開発されました。発芽に続いて、ICによって形成されたスフェロイドからの管状構造形成は、生体内ネオ血管化プロセス7,8に反映される。従って、3Dスフェロイド血管新生アッセイは、潜在的なプロまたは抗血管新生薬をスクリーニングするための有効なアッセイシステムと考えられている。
ほとんどの3Dスフェロイド血管新生アッセイは、主にヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)またはヒト真皮微小血管内皮細胞(HDMEC)のみを使用して、血管新生時のICの細胞応答に焦点を当てています。しかし、血液毛細血管は、2つの細胞タイプで構成されています: ICとペリサイト.適切な血管の完全性と機能のためには、ICとペリサイト間の双方向相互作用を詳述することが重要です。遺伝性脳卒中、糖尿病網膜症、静脈奇形などのいくつかの疾患は、内皮9に対する周辺細胞密度の変化または減少した周辺細胞の付着と関連している。血管細胞はまた、血管新生プロセスの重要な要素として知られています。ペリサイトは、新たに形成された容器構造をICで安定させるために募集されています。この点に関して、単培養スフェロイド血管新生アッセイは、ペリサイト7、10を組み込まない。したがって、ICおよびペリサイトによって形成される共培養スフェロイドは、生理学的血管新生事象をより密接に模倣する貴重なアプローチを提供しうる。
本研究は、ヒト内皮コロニー形成細胞(EFC)と間葉系幹細胞(MSC)を組み合わせて生体内血管新生をより密接に反映する3D共培養スフェロイド血管新生アッセイの開発を目指した。正常血管のインインビトロ表現アセンブリとしての共培養スフェロイド系は、2001年11月にKorffらによって最初に設立された。それらはHUVECとヒト臍動脈平滑筋細胞(HUSMC)を組み合わせ、2つの成熟した血管細胞の共培養が発芽電性を減少させたことを実証した。成熟したIC(HUVEC)は、増殖および分化する能力を徐々に失うことが知られており、これは血管新生応答12,13に悪影響を及ぼす。成熟した血管皮細胞(HUSMC)は、血管内皮増殖因子(VEGF)応答性11の剥奪を通じて内皮細胞の不活性化を引き起こす可能性がある。コルフと私たちの共培養スフェロイド系の主な違いは、使用される細胞タイプです。我々は、2つの血管前駆体であるCFFCとMSCを用いて、適切な血管新生アッセイシステムを確立し、プロまたは抗血管新生剤をスクリーニングおよび調査した。EFC は、PC の前駆体です。ECFCは成熟したIC14と比較して堅牢な増殖能力を備えており、PCの限界を克服できます。CFFCは、多くの出生後病態生理学的条件15、16、17における新しい血管形成に寄与する。MSCは、多能性幹細胞であり、多細胞に分化する能力を有し、それによって血管新生18、19に寄与する。
以前の報告では、CFFCおよびMSCは、インビトロチューブ形成20、生体内ネオ血管化21、22、および虚血組織23、24の改善された再灌流に相乗効果を示した。本研究では、CFFCとMSCを用いて共培養スフェロイドを形成し、生体内3D環境を反映するためにI型コラーゲンゲルに埋め込まれた。コラーゲンは、EC25を取り巻く細胞外マトリックス(ECM)の主要成分と考えられている。ECMは、細胞行動26を調節する上で重要な役割を果たしている。ここで提案されるアッセイプロトコルは、一般的な実験室技術を用いて2日以内に容易かつ迅速に行うことができる。発芽プロセス中に効果的な細胞追跡のために、各細胞タイプは、リアルタイムの細胞レコーダーを使用して蛍光標識および監視することができる。新たに確立された3D共培養スフェロイド血管新生アッセイシステムは、潜在的な血管新生変調器を評価するための感度を高め、生体内研究の前に予測可能な情報を提供するように設計されています。
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Protocol
ヒトECFCは、以前の報告27で述べたように、ヒト末梢血から単離された。簡単に言えば、単核細胞層をフィコル・パック・プラスを用いて全血から分離し、内皮様コロニーが現れるまで適切な培地で培養した。コロニーを収集し、CD31コーティングされた磁気ビーズを用いてCFFCを単離した。MSCは、ヒト成人骨髄の付着単核細胞(MNC)画分から単離した。研究プロトコルは、Duksung女子大学の機関審査委員会によって承認されました (IRB No. 2017-002-01).
1. 細胞培養
-
CFC および MSC の媒体プレートとコート プレートの準備
- 内皮細胞増殖培地MV2(ECGM-MV2、ヒドロコルチゾンを除く)を10%の胎児ウシ血清(FBS)および1%グルタミンペニシリン連鎖筋マイシン(GPS)を補充した。
- 10%FBSおよび1%GPSを含む間葉系幹細胞増殖培地-2(MSCGM-2)を調製する。
- ECFC培養の場合は、細胞培養プレートを1%ゼラチン溶液で塗ります。ゼラチン溶液1%を調剤し、磁気攪拌機でPBSの500mLに1gのゲル化粉末を溶解し、オートクレーブで殺菌する。プレートは3 mL/60 mm、5 mL/100 mm、または1%ゼラチン溶液の15 mL/150 mmでコーティングすることができます。細胞培養インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)で15分間コーティングされたプレートをインキュベートする。その後、吸引によって残りの1%ゼラチン溶液を取り出し、PBSでコーティングされたプレートを1回洗浄します。
-
成長する CFFC と MSC
- 種子1 x 106 ECFCを1%ゼラチンコーティング150mmプレート上に、細胞培養インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)でECGM-MV2(10%FBS、1%GPS)を用いて80〜90%のコンフルエンスに成長させる。通路番号 7~10 で ECFC を使用して、一貫した結果を得ます。
- シード1 x 106 MSCを非コーティングされた150mmプレート上で、細胞培養インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)でMSCGM-2を用いて80〜90%の合流に成長させる。一貫した結果を得るために、通路番号 7~10 の MSC を使用します。
2. メチルセルロース溶液1.2%の調製
- 500 mLのガラスボトルで6gのメチルセルロースを測定し、オートクレーブで殺菌します。
- ECGM-MV2(FBSおよびGPSなし)を60°Cで20分間加熱し、殺菌されたメチルセルロース粉末に250 mLの加熱ECGM-MV2を加えます。滅菌条件を維持するために、フローフード内のプロセスを実行します。
- 殺菌された磁気攪拌バーを追加し、メチルセルロースが完全に濡れ、塊なしで均等に分散されるまで、磁気攪拌機に20分間溶液を混ぜます。無菌状態で250 mLの冷たい(4°C)ECGM-MV2(FBSおよびGPSなし)を加え、磁気攪拌機でさらに10分間混ぜます。その後、冷蔵庫(4°C)で一晩冷やします。
注:メチルセルロースは、腫れやその後の水分補給のために涼しい温度でよく溶解する炭水化物ポリマーです。 - 翌日、溶液を50mLチューブでアリコートし、遠心分離機を5,000 x gで4°Cで3時間使用します。透明な粘性上清溶液を取り、最大3〜6ヶ月の使用まで4°Cで保存します。
注:堆積物には残留セルロース繊維が含まれている可能性があるため、少なくとも5mLの体積を残した上清溶液を穏やかに取る。この容積は実験条件に従って調節することができる。
3. EFC のみ、MSC のみ、および ECFC-MSC スフェロイドの生成と埋め込み
1日目
- CFC および MSC セルサスペンションの準備
- カルシウムやマグネシウムを使わずにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて80~90%のコンフルエントなEFCとMSCを洗浄し、吸引します。
- 培養プレートからCFCとMSCを切り離すには、細胞培養インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)でそれぞれ0.05%トリプシン-EDTAを0.05%トリプシン-EDTAでインキュベートします。
- 10%FBSおよび1%のGPSを含むDMEM媒体を加えることによってトリプシンを不活性化する。セルを上下にピペットにして、単一のセルサスペンションを作成します。
- RTで5分間282 x gで遠心分離して細胞を堆積させる。
- 上清を取り出し、それぞれの培地で細胞を再停止させる。
- 蛍光色素によるCFFCおよびMSCのラベリング
注:PKH67(緑色)とMSCの細胞膜標識をPKH26(赤色)蛍光色素で、メーカーの指示に従って、以下のようにわずかに変更します。- 細胞を無血清培地で2回洗い、FBSを除去する。
注:FBSのタンパク質および脂質は結合によって細胞を標識するための有効な色素濃度を低下させる。 - 顕微鏡下のヘモサイトメーターを使用してCFFCとMSCをカウントし、3 x 106 ECFCと2 x 106 MSCを2 mLマイクロチューブに転送します。
注:これらは、染料で細胞を標識するための最適な細胞密度です。多数の細胞を使用すると、不十分で不均一な染色を引き起こしますが、あまりにも少ない細胞の使用は、細胞の回復が悪くなります。 - RTで100 x gでチューブを遠心分離し、細胞ペレットを得る。残量の15-25 μL以下を残して上清を慎重に吸引します。
- 色素キットから希釈Cの250 μLでCFFCとMSCを再中断します。細胞懸濁液をゆっくりとピペットにして、完全な分散を確保します。
注:希釈剤Cは生理塩であり、ミセルを形成することにより色素の染色効率を低下させてもよい。したがって、細胞が希釈Cに長時間放置し、チューブを渦にしないでください。 - PKH67の5μLを希釈Cの250μL(最終濃度20μM)に加え、PKH26の3μLを250μLの希釈Cの250μL(最終濃度12μM)で加えて、CFCの染色液を調付けます。
注:最終的な色素濃度は、メーカーの推奨とは異なります。高濃度は、細胞の束と細胞毒性につながるだろう.低濃度は染色には十分ではないであろう。 - PKH67色素溶液の250 μLに250 μLのCFC細胞懸濁液を、250 μLのMSCをPKH26色素溶液の250 μLに加えます。すぐに上下にピペッティングして染料と細胞を混合し、室温で5分間インキュベートします。より良い結果を出すために、アルミホイルでチューブを覆い、染色中に十分な混合を確保するためにシェーカーに置きます。
- 染色された細胞懸濁液に0.5 mLのFBSを加えて染色プロセスを停止し、その後、FBSが過剰な非結合色素を結合できるように1分間インキュベートします。100 x gで5分間遠心分離することにより染色した細胞を堆積させる。
注:ECFCおよびMSCペレットは、染色後、それぞれ薄黄色とピンクです。 - 上清を慎重に取り除き、余分な色素を除去するために完全な培地で細胞を2回洗浄します。チューブを100 x gで5分間遠心分離し、各完全培地の2mLでペレットを再中断します。
- 細胞を無血清培地で2回洗い、FBSを除去する。
- ECFC、MSC、または ECFC+MSC スフェロイドの生成
注:前述の28のように、吊り下げテクニックを適用してスフェロイドを生成します。スフェロイドの調製手順を以下に示す。- 染色された CFFC と MSC をカウントします。
- 20%メチルセルロース溶液および5%FBSを含むECGM-MV2で染色されたECFC、MSCまたはECC+MSCを中断します。CFCまたはMSCの4 x 104セル/mLの細胞密度で調記します(25 μLの細胞懸濁液には1,000個の細胞が含まれています)。CFFCとMSCの2つの細胞懸濁液の場合は、2 x 104セル/mLエクセルおよび0.4 x 104セル/mL MSC(25 μLには500のCFFCと100のMSCが含まれています)の細胞密度で調記します。
注:MSC に対する CFC の比率は 5:1 を超えてはなりません。MSC の数が多いほど、過度の移行や不規則な芽の形態が発生する可能性があります。MSC の数が少ないと、セル間の相互作用が悪くなり、発芽が不十分になります。 - 150mm培養板の底部に15mLのPBSを加えて水和ユニットを準備します。
- マルチチャンネルピペットの使用のための殺菌ポリスチレン長方形リザーバに細胞懸濁液を移します。ピペッティングにより細胞懸濁液を均等に分散させる。
- マルチチャンネルピペット(150mmプレートの約100滴/カバー)を使用して、150mm培養プレートのカバーに25μL滴のセルサスペンションを堆積させます。PBS充填水和ユニットの上にカバーを反転し、細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートします。
注:メチルセルロース溶液は、懸濁液に適切な粘度を提供する。メチルセルロース溶液を使用せずに吊り下げ方法を行った場合、カバーを反転させた際に滴が滑り落ちやすい(補足図1)。さらに、一晩インキュベーション後、スフェロイドはメチルセルロース溶液なしで完全に形成されなかった。この結果は、メチルセルロース溶液による適切な粘度がスフェロイドの円形を形成する必要があることを示している。
2日目
- 中和コラーゲンゲルにスフェロイドを埋め込む
- 水浴(37°C)で温かいFBSおよびECGM-MV2(FBSおよびGPSなし)。冷たいメチルセルロース溶液を作業ベンチに置き、室温にします。
- 24ウェルプレートを細胞培養インキュベーター(37°C)に入れ、温めます。
- メチルセルロース溶液やI型コラーゲンなどのスフェロイドや粘性懸濁液を吸引するために、尖った1 mLピペットチップを3〜5mmカットし、快適かつ正確に。
- I型コラーゲンゲルメーカーの指示に従い、氷上に3mg/mL中和型Iコラーゲンゲルを調剤する。
注:室温でコラーゲンのゲル化を避けるために氷上で中和を行う必要があります。24ウェルプレートの1つのウェルには、中和コラーゲンの500 μLが必要です。常にコラーゲンの1 mL余分なボリュームを準備します。コラーゲンゲルは、氷の上に保持した場合、中和後2〜3時間まで使用することができます。 - PBSの5 mLでスフェロイドを含むカバーをすすいでスフェロイドを収穫します。50 mL円錐形チューブでスフェロイド懸濁液を採取します。残りのスフェロイドを得るためにPBSの5 mLでカバーを再リンスします。
注:収穫の間、スフェロイドの存在を確認するために密接に観察する。より多くの目視検査のために、スライドガラス上に約50-100 μLのスフェロイド懸濁液を移し、顕微鏡下でスフェロイドの丸い形状を確認してください。 - 282 x gで5分間遠心分離してスフェロイドを堆積させ、残留量の100-200 μL以下の残りのスフェロイドを邪魔することなく、上清を慎重に廃棄します。
- 残りの100-200 μL残液でスフェロイドが自由に吊り下げられたように、チューブの壁を軽くタップします。
- 5%FBSおよび40%メチルセルロース溶液を含むECGM-MV2をスフェロイド含有管に添加する。添加された体積は、約100のスフェロイド/mLに基づいて決定される。鈍い1 mLピペットの先端とピペットによってそっとスフェロイド懸濁液を混ぜる。
注:メチルセルロース溶液は、スフェロイドが堆積物にすることを許さない中断剤として広く使用されている。FBS濃度は5%でなければなりません。高いFBS濃度は、過剰な成長因子による異常な芽を引き起こす。低FBS濃度は、細胞の健康条件を維持することはできません. - スフェロイド懸濁液と中和型Iコラーゲンゲル(3mg/mL)を氷上で1:1の比率で混合します。スフェロイドの破損を避けるために、鈍い1 mLピペットの先端を使用してください。
注:24ウェルプレートの1つのウェルには、スフェロイドサスペンドコラーゲンゲル溶液の1 mLが必要です。可能であれば、余分な混合サスペンションソリューションを作成します。 - 任意の薬剤または化学薬品の血管新生特性をテストする必要がある場合は、1 mLマイクロチューブにスフェロイドサスペンジングコラーゲンゲル溶液の1 mLを転送し、その後、鈍い1mLピペット先端と穏やかな混合を加えます。
注:薬剤および化学物質の体積は200 mLに合計することができ、これは1.5mg/mLから1.25 mg/mLにタイプIコラーゲンゲル濃度を希釈するが、タイプIコラーゲンゲル重合には影響しない。コントロール スフェロイドに同じボリュームの車両を追加します。 - ピペッティングにより予め温められた24ウェルプレート(0.9mL/ウェル)の井戸にスフェロイドサスペンジングコラーゲンゲル溶液を加え、重合のために細胞培養インキュベーターで30分間インキュベートします。
注:スフェロイド埋め込みプロセス中に、プレートを攪拌することによってゲルを乱さしないでください。 - VEGFの有無にかかわらず2.5%FBSを含むECGM-MV2を100μL添加して、スフェロイド懸濁コラーゲンゲルをカバーします。ECFCのみのスフェロイドの場合、VEGF(50ng/mLの最終濃度)を外因性添加して細胞を刺激し、適切な芽を形成する。ECFC+MSCスフェロイドは、任意の成長因子による外因性刺激を必要としません。
- 細胞培養インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に取り付けられたリアルタイムセルレコーダーにプレートを置き、5~10枚のスフェロイド(10倍対物レンズ)にランダムに焦点を合わせます。各蛍光標識スフェロイドの発芽形成を1時間ごとに24時間毎に監視し、妨害を行いません。
4. 量子スポロイド発芽
- イメージ ファイルを ImageJ ソフトウェアに読み込んで、新芽の数を定量化し、各芽の長さを測定します。共培養スフェロイドの場合は、スフェロイドを作る前に緑色蛍光色素でEFCにラベルを付けます。次に、緑色蛍光で染色した芽の数と長さを測定する(補足図2)。5つのランダムに選択されたスフェロイドを実験群ごとに定量した。
注:芽は、スフェロイドから伸びるいくつかのCFCによって形成される協調的に細長い構造である。芽の長さは、スフェロイドの表面から芽の先端までの芽の点から起源の長さとして測定されます。 - 少なくとも3つの独立した実験の平均±SEMとして値を表す。複数の比較の一方通行分散分析またはペア比較の学生の t-testによって統計的に有意な差を決定します。
注: P ≤ 0.05 は統計的に有意と見なされます。
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Representative Results
比較実験は、単培養スフェロイド(ECFCのみ)と共培養スフェロイド(EFc+MSC)を用いて、MSFcがEFC媒介血管新生において大きな役割を果たしているかどうかを調べた。各スフェロイドからの発芽形成は、スフェロイドからの血管新芽の進行を捕捉できるリアルタイム細胞レコーダーによって24時間モニタリングされた。血管新生電位は、芽の数を数え、個々のスフェロイドから発生する芽の累積長さを測定することによって定量された。実験群ごとに5つのランダムに選択されたスフェロイドを分析した。ECFC+MSCのスフェロイドの場合、全ての時間点で、BCFcのみのスフェロイドに比べて、芽の数と累積芽長さが有意に高かった(図1A-C)。FCFC+MSCスフェロイドの発芽数と長さは12時間連続的に増加したが、CFC専用スフェロイドの数と長さは6時間増加し、後の時点では変化しなかった(図1B,C)。さらに、EFc+MSCスフェロイドによって形成された芽は、VEGF処理を伴う/なしのEFCのみのスフェロイドによって形成されたものよりも厚く、耐久性があった(図1A、および補足ビデオ1A、B、D)。MSCのみのスフェロイドは芽を形成しなかったが、スフェロイドの外でMSCの個々の移行を示した(図1Aおよび補足ビデオ1C)。これらの結果は、MSC、ペリサイト前駆体、EFCの細胞血管新生に対する有意な寄与を示す。MSCは、芽や管状構造を形成するためにCFFCを刺激し、様々な成長因子29を分泌することが知られている。
EFcは緑色蛍光色素で標識され、MSCは赤色蛍光色素で標識され、組み合わせてEFC+MSCスフェロイドを生成した。リアルタイム記録と共に、このライブ細胞蛍光標識技術は、芽形成中のCFFCおよびMSCの細胞運動を追跡することができる。蛍光イメージングは、CFFC媒介芽構造がMSCで覆われていたことを示した(図2および補足ビデオ2)。これは、組み合わせたMSCが芽形成時に血管細胞として機能し、2つの血管細胞間の緊密な関連によって芽の安定性および耐久性を高めることを示唆している。
新たに開発された共培養スフェロイドアッセイシステムは、FDA承認血管新生阻害剤であるベバシズマブを用いて試験し、抗血管新生薬のスクリーニングの可能性を検証した。ベバシズマブで前処理されたECFC+MSCスフェロイドは、対照EFc+MSCスフェロイドと比較して用量依存的な方法で芽数および累積芽長の減少を示した(図3A,B)。並行実験では、ベバシズマブで前処理されたFCFCのみのスフェロイドに続いてVEGF(50 ng/mL)による刺激も、用量依存的な方法でVEGF誘発芽数および累積芽長の減少を示した(図3C,D)。.なお、EFc+MSCスフェロイドにおける累積芽長を阻害するベバシズマブのIC50値は、EFCのみのスフェロイドの46倍であった(表1)。この結果は、EC媒介血管形成のみを阻害するために必要な濃度と比較して、ECFCおよびMSCによる生理的に関連する血管形成を阻害するために、より高い濃度が必要であることを強く示唆する。
次に、異種移植片腫瘍マウスモデルをベバシズマブ治療で行い、生体内有効血漿濃度と相関する予測可能なデータを提供するスフェロイド系を明らかにした。ヒト由来神経膠芽腫U87MG-Red-FLuc細胞株を皮下注射し、免疫欠損マウスに注射した。1週間で腫瘍形成を確認した後、マウスを無作為に3群に分け、対照(0mg/kg)、低用量(1mg/kg)、高用量(30mg/kg)を投与した。対照群と比較して30mg/kg処理群において腫瘍増殖が有意に阻害された(補足図3A)。1mg/kg処理群は腫瘍減少傾向を示したが、対照群と比較して統計的差はなかった。ベバシズマブ治療の3週間におけるマウス血漿濃度は、30mg/kgで568.0±40.62 μg/mL、1mg/kgで38.1±0.72 μg/mLであった(補足図3B)。特に、有効な阻害を示すベバシズマブの血漿濃度(3週間の治療では30mg/kgで568.0±40.62 μg/mL)は、EFC+MSCスフェロイド(1261.5±214.49 μg/mL)によって密接に達成されたが、ECFCのみのスパロイド(27μg/mL)は達成されなかった。従って、ECFC+MSCスフェロイド血管新生アッセイシステムは、動物実験の前に有効な血漿濃度を予測するための適切なアッセイシステムと考えることができる。
図 1: CFC のみ、MSC のみ、および EFc+MSC スフェロイドからのスプラウト形成。(A)0、6、12、18、および 24 h (スケールバー = 100 μm) で I 型コラーゲンゲルに埋め込まれた FCC のみ、MSFC のみおよび EFC+MSC スフェロイドからの芽形成の代表的な画像。(B)EFcのみおよびECFC+MSCスフェロイドから形成された芽数の定量グラフ(平均±SEM、n =3)。(C)CFFCのみおよびECFC+MSCスフェロイドから形成された累積芽長の定量グラフ(平均±SEM、n =3)。* は、同時に CFFC のみと EFc+MSC スフェロイドの間の有意な差を示します (p ≤ 0.05)。# は、角かっこで示されるグループ間の有意な差を示します (p ≤ 0.05)。この数値は、以前の pubication30から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 芽構造におけるCFFCおよびMSCのローカリゼーション24時間後のEFCおよびMSCの後の芽構造における2つの細胞タイプの位置を示す代表的な画像を、それぞれPKH67(緑)およびPKH26(赤色)で蛍光標識し、3D EFC+MSC+MSCスフェロイド血管新生アッセイを行った。矢印は、MSCがEFC媒介の芽構造で覆われていたことを示しています(スケールバー = 100 μm)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:EFc+MSCおよびEFcのみのスフェロイドからの芽形成に対するベバシズマブの阻害効果EFc+MSCおよびCFCのみのスフェロイドをベバシズマブで処理し、芽形成を24時間(B)ベバシズマブで処理したEFC+MSCスフェロイドからの累積芽長の定量グラフ(平均±SEM、n=3)でモニタリングした。(C)ベバシズマブで処理したVEGF刺激性のCFFCのみのスフェロイドからの芽数の定量グラフ(平均±SEM,n=3)。(D)ベバシズマブで処理したVEGF刺激性FCFCのみのスフェロイドからの累積芽長の定量グラフ(平均±SEM,n=3)。*は対照群(白い棒)との有意な差を示す(p ≤0.05)。#はVEGF処理群(黒色バー)との有意差を示す(p ≤ 0.05)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 時間 (h) |
アバスチンの IC50 (μg/mL) | p 値 | |
| CFC専用スフェロイド | ECFC+MSC スフェロイド | ||
| 6 | 94.62 ± 38.53 | 3058.21 ± 373.31 | 0.003 |
| 12 | 58.61 ± 17.80 | 2006 ± 484.73 | 0.015 |
| 18 | 83.38 ± 54.54 | 1509.51 ± 483.88 | 0.042 |
| 24 | 27.04 ± 9.97 | 1261.51 ± 214.49 | 0.0045 |
表1:EFCのみまたはEFc+MSCスフェロイドにおける累積芽長の阻害のためのベバシズマブのIC50値。EFCのみのスフェロイドをベバシズマブで処理し、続いてVEGF(50ng/mL)で刺激を行い、EFCのみのスフェロイドからの芽形成に必要となる。EFc+MSCスフェロイドは、VEGF刺激なしでベバシズマブで治療した。いずれもI型コラーゲンゲルに埋め込まれたスフェロイドと、リアルタイム細胞レコーダーを用いて各スフェロイドからの芽形成を24時間観察した。データは平均±SEM(n=3)として表される。
補足図 1:この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 2:この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、2つのヒト血管細胞前駆体、EFCおよびMSCによって形成された共培養スフェロイドを利用したインビトロ血管新生アッセイ系の改良を導入する。内皮細胞と膜細胞間の相互作用と組み込みによって達成される。この共培養アッセイシステムは、IC媒介血管新生のみを反映する他のインビトロ血管新生アッセイと比較して、細胞相互作用、発芽、チューブ形成を含む生理学的血管新生の多段階カスケードをより代表する。そして容器の成熟。この新しく確立されたアッセイシステムは、スフェロイドをI型コラーゲンゲルに播種することにより、生体内細胞外微小環境にも似ています。我々は、3D共培養スフェロイド血管新生アッセイシステムが信頼性が高く、反復可能で、容易に定量可能であり、最も重要な生理学的に関連していることを示唆する。
共培養スフェロイドアッセイを行う一方で、中和型Iコラーゲン及びFBSの適切な濃度でゲルにスフェロイドを埋め込むことが不可欠である。中和されたI型コラーゲンの最良の最終濃度は1.5mg/mLであり、FBSの割合は2.5%である。予備実験では、コラーゲンの濃度が高いと硬いゲルが生じ、スフェロイド由来の芽の質と量が妨げられました。コラーゲンの濃度が低いほど、スフェロイドの完全性を維持できなかった柔らかく壊れやすいゲルが得られた。同様に、FBSの量が多いと、血管新因子刺激に関係なく基底レベルでスフェロイドから多量の発芽が起因する。FBS濃度の低下は、細胞の劣悪な状態につながった。一貫性のある再現性のある結果を生み出すには、適切な数のスフェロイドを埋め込む必要があります(約50のスフェロイド/ウェル)。50以上のスフェロイド/ウェルは、発生する芽の質と量に異常に影響を与える可能性があり、井戸内のスフェロイドの近接につながる可能性があります。
コラーゲンは室温で凝固し、不規則なマトリックスを生じるため、中和およびスフェロイド懸濁液との混合工程中に、I型コラーゲンをチルド状態で維持することが重要です。スフェロイド懸濁液とコラーゲン溶液を混合しながら、広い穴を作るために最後に3-5ミリメートルカットで1 mLピペットチップを使用することをお勧めします。これは粘性コラーゲン溶液の容易な処理を可能にし、破裂からスフェロイドを保護する。スフェロイド懸濁コラーゲン溶液を埋め込んだ後のプレートの攪拌は、ゲルの完全性を妨げ、通常の芽発生を妨げる可能性のある破損をもたらす可能性があります。
ECFCおよびMSCを用いた共培養スフェロイドアッセイでは、5:1の比率を維持する必要があります。より多くのMSCを使用すると、MSCの渡り目の表現型が原因でスフェロイドの周りに広がり、理想的な芽の生成に影響を与える可能性があります。少数のMSCは、CFFCの発芽を刺激し、芽を適切にカバーするには不十分です。また、増殖中の細胞の状態をチェックすることが不可欠です。不良発芽が観察される場合は、細胞の別の健康な通路を使用することをお勧めします。より良い結果を出すには、10 未満の通路での CFFC と MSC の使用を強くお勧めします。
ここでは、生体内血管新生に密接に捕捉する共培養スフェロイドを用いた改良された3D血管新生アッセイシステムを紹介する。2D単一細胞アッセイシステムと比較して、この共培養スフェロイドアッセイシステムは、2つの血管細胞タイプ間のより忠実な細胞応答を反映し、生理学的条件下で管状構造を形成する。しかし、このシステムは、生体内血管新生の複雑な多段階プロセスと比較して過度に単純化されたままである。生体内での血管生成は、通常、上皮細胞、線維芽細胞、免疫細胞、および豊富なECMタンパク質を含む様々な他の細胞タイプの複数の相互作用を介して起こる。この新しいシステムの将来の応用には、生理学的および/または病理学的血管新生をより正確に反映する他の細胞型およびECMの導入が含まれる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
本研究は、食品医薬品安全省の助成金(17172MFDS215)、韓国政府(MSIP)の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)助成金(2017R1A2A2B4005463)、基礎科学研究プログラムの支援を受けました。韓国国立研究財団(NRF)は、教育省が出資(2016R1A6A1A03007648)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA (1x) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) | Gibco | 21600-010 | PBS (10x) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1x) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
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