Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد باستخدام Spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية والخلايا الجذعية Mesenchymal

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60032
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 2, 1
1College of Pharmacy, Duksung Innovative Drug Center, Duksung Women's University, 2Korea Drug Development Platform using Radio-isotope, Korea Institute of Radiological & Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

تم تصميم نظام فحص تكوين الأوعية الدموية ثلاثي الأبعاد للزراعة الوعائية لمحاكاة تكوين الأوعية الفسيولوجية. يتم تشكيل spheroids الثقافة المشتركة من قبل اثنين من السلائف خلايا الأوعية الدموية البشرية، ECFCs وMSCs، وجزءا لا يتجزأ من هلام الكولاجين. النظام الجديد فعال لتقييم المغيرات الوعائية، ويوفر معلومات أكثر صلة للدراسة في الجسم الحي.

Abstract

وقد نمت الدراسات في مجال تكوين الأوعية الدموية بقوة في العقود القليلة الماضية مع الاعتراف بأن تكوين الأوعية الدموية هو السمة المميزة لأكثر من 50 حالة مرضية مختلفة، مثل التهاب المفاصل الروماتويدي، اعتلال العين، وأمراض القلب والأوعية الدموية ، وورم خبيث. أثناء تطوير عقار تكوين الأوعية، من الضروري استخدام أنظمة الاختبار في المختبر مع أنواع الخلايا المناسبة والظروف المناسبة لتعكس عملية تكوين الأوعية الفسيولوجية. للتغلب على القيود المفروضة على أنظمة فحص تكوين الأوعية الدموية الحالية في المختبر باستخدام الخلايا البطانية بشكل رئيسي، قمنا بتطوير نظام فحص ثنائي الشعر ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للزراعة المشتركة. تم إنتاج البشيرويدات ذات الثقافة المشتركة من قبل اثنين من سلائف الخلايا الوعائية البشرية، والخلايا المكونة للمستعمرة البطانية (ECFCs) والخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) بنسبة 5 إلى 1. تم تضمين ECFCs + MSCs spheroids في مصفوفة الكولاجين من النوع الأول لتقليد البيئة خارج الخلية في الجسم الحي. وقد استخدم مسجل خلية في الوقت الحقيقي لمراقبة تطور الأوعية الدموية تنبت باستمرار من النثيرات لمدة 24 ساعة. تم قياس الإمكانات الوعائية من خلال حساب عدد البراعم وقياس الطول التراكمي للبراعم المتولدة من النفيض الفردية. تم تحليل خمسة spheroids مختارة عشوائيا لكل مجموعة تجريبية. وأظهرت تجارب المقارنة أن مركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية أظهرت عدداً أكبر من البراعم وطولاً تراكمياً للبراعم مقارنة بمركبات الكربون الكلورية فلورية فقط. تم اختبار Bevacizumab، وهو مثبط للتكوين الأوعية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير، مع نظام الفحص بزراعة مشتركة تم تطويره حديثًا للتحقق من قدرته على فحص الأدوية المضادة للأوعية. وكانت القيمةIC 50 لمركبات الكربون الكلورية فلورية + MSCs spheroids بالمقارنة مع spheroids ECFCs فقط أقرب إلى تركيز البلازما الفعال من bevacizumab التي تم الحصول عليها من نموذج الماوس الورم xenograft. وتشير هذه الدراسة إلى أن نظام فحص تكوين الأوعية الجيوعية ثلاثي المفعول ECFCs+MSCs له صلة بتكوين الأوعية الفيزيولوجي، ويمكنه التنبؤ بتركيز فعال للبلازما قبل إجراء التجارب الحيوانية.

Introduction

ومن المتوقع أن يستفيد ما يقرب من 500 مليون شخص في جميع أنحاء العالم من العلاج بتحوير الأوعية الدموية للأمراض المرتبطة بتشوه الأوعية الدموية مثل التهاب المفاصل الروماتويدي، واعتلال الأوعية الدموية، وأمراض القلب والأوعية الدموية، وورم خبيث1. وهكذا، أصبح تطوير الأدوية التي تتحكم في تكوين الأوعية مجالا هاما للبحوث في صناعة الأدوية. خلال عملية تطوير المخدرات، في دراسة الحيوان في الجسم الحي ضروري لاستكشاف آثار المرشحين المخدرات على وظائف الفيزيولوجية والتفاعلات النظامية بين الأجهزة. ومع ذلك، فإن القضايا الأخلاقية والتكاليف قد زادت من المخاوف المتعلقة بالتجارب الحيوانية2. ولذلك، هناك حاجة إلى تحسين نظم الاختبار في المختبر للحصول على بيانات أكثر دقة ويمكن التنبؤ بها مما يؤدي إلى اتخاذ قرارات أفضل قبل التجارب الحيوانية. عادة ما تقيس اختبارات تكوين الأوعية الدموية في المختبر عادة الانتشار أو الغزو أو الهجرة أو تشكيل البنية الأنبوبية للخلايا البطانية (ECs) المصنفة في لوحات ثقافة ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد)3. هذه الاختبارات الأنجية 2D سريعة وبسيطة وكمية وفعالة من حيث التكلفة، وقد ساهمت بشكل كبير في اكتشاف الأدوية الأنبية تحوير. ومع ذلك، لا يزال يتعين تحسين عدة مسائل.

مثل هذه الأنظمة اختبار في المختبر لا يمكن أن تعكس الأحداث المعقدة متعددة الخطوات من تكوين الأوعية الدموية التي تحدث في الظروف الفسيولوجية الحية، مما يؤدي إلى نتائج غير دقيقة التي تسبب الاختلافات بين بيانات الاختبار في المختبر ونتائج التجارب السريرية4. ظروف الثقافة 2D أيضا الحث على تغيير الأنماط الظاهرية الخلوية. على سبيل المثال، بعد الانتشار في لوحات الثقافة 2D، ECs لديها النمط الظاهري الخلوي ضعيفة كما يتجلى في انخفاض التعبير من CD34 والعديد من الإشارات التي تحكم الاستجابات الخلوية5،6. للتغلب على القيود المفروضة على أنظمة فحص تكوين الأوعية الدموية المستندة إلى الثقافة 2D، تم تطوير أنظمة اختبار تكوين الأوعية الوعائية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). تنبت تليها تشكيل بنية أنبوبي من spheroids التي شكلتها ECs تعكس في عمليات الأوعية الدموية الجديدة في الجسم الحي7،8. وهكذا، فإن الفحص الأوعية الوعائية ثلاثية المفعول يعتبر نظاماً فعالاً لفحص الأدوية المحتملة المؤيدة أو المضادة للأوعية الدموية.

معظم الاختبارات الأنجية السفيرة 3D تستخدم فقط ECs، أساسا الخلايا البطانية الوريد السري البشري (HUVECs) أو الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة الجلدية البشرية (HDMECs) للتركيز على الاستجابة الخلوية من ECs أثناء تكوين الأوعية الدموية. ومع ذلك، تتكون الشعيرات الدموية الشعرية من نوعين من الخلايا: ECs وpericytes. إن وضع تفاعل ثنائي الاتجاه بين ECs وpericytes أمر بالغ الأهمية لسلامة الأوعية الدموية السليمة ووظيفتها. ترتبط العديد من الأمراض، مثل السكتة الدماغية الوراثية، اعتلال الشبكية السكري، والتشوه الوريدي، مع كثافة pericyte المتغيرة أو انخفاض التعلق pericyte إلى البطانة9. ومن المعروف أيضا Pericytes كعنصر رئيسي في عملية الأوعية. يتم تعيين Pericytes لتحقيق الاستقرار هياكل السفن التي شكلت حديثا من قبل اللجان البيئية. في هذا الصدد، أحادية الثقافة spheroid الأوعية الدموية لا يتضمن البيريسيس7،10. ولذلك، فإن الـ spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها ECs وpericytes قد توفر نهجا قيما لتقليد الأحداث الوعائية الفيزيولوجية بشكل أوثق.

تهدف هذه الدراسة إلى تطوير فحص الأوعية الجيوعية ية الشفيرة المشتركة ثلاثية الدناق مع مزيج من الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية البشرية (ECFCs) والخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) لتعكس بشكل أوثق في تكوين الأوعية الحية. تم تأسيس نظام spheroid الثقافة المشتركة كتجميع التمثيل في المختبر من الأوعية الدموية العادية لأول مرة من قبل Korff وآخرون في عام 200111. أنها الجمع بين HUVECs وخلايا العضلات الملساء الشريان السري البشري (HUSMCs)، وأظهرت أن الثقافة المشتركة لخليتين الأوعية الدموية الناضجة خفضت من إمكانات تنبت. ومن المعروف أن ECs ناضجة (HUVECs) تفقد تدريجيا قدرتها على التكاثر والتفريق، مما يؤثر سلبا على استجابات ها الأوعية الدموية12،13. الخلايا الناضجة المحيطة بالأوعية الدموية (HUSMCs) يمكن أن تسبب تعطيل الخلايا البطانية من خلال إلغاء عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) استجابة11. الفرق الرئيسي بين Korff ونظام نا spheroid الثقافة المشتركة هو أنواع الخلايا المستخدمة. وقد طبقنا سلائف الأوعية الدموية، وهما مركبات الكربون الكلورية فلورية ومركبات الكربون الكلورية فلورية وأجهزة التصلب العصبي المتعدد، لإنشاء نظام سليم لفحص تكوين الأوعية الدموية لفحص العوامل المؤيدة أو المضادة للأوعية الدموية والتحقيق فيها. ومركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية هي مقدمة مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. وتتمتع مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية بقدرة قوية على الانتشار مقارنة بالبلدان الـ14الناضجة، التي تمكن من التغلب على الحد من الـ ECs. تساهم مركبات الكربون الكلورية فلورية في تكوين سفن جديدة في العديد من الظروف الفيزيولوجية المرضية بعد الولادة15و16و17. MSCs هي الخلايا الجذعية متعددة القوى التي لديها القدرة على التمييز إلى pericytes، وبالتالي المساهمة في تكوين الأوعية الدموية18،19.

في التقارير السابقة، أظهرت مركبات الكربون الكلورية فلورية وMSCs آثار التآزر على تشكيل أنبوب في المختبر20، في الجسم الحي الأوعية الدموية الجديدة21،22، وتحسين إعادة ضخ الأنسجة الإقفارية23،24. وفي هذه الدراسة، استُخدمت مركبات الكربون الكلورية فلورية والمركبات الصغيرة والمتوسطة لتشكيل الـ spheroids للثقافة المشتركة وجزءاً لا يتجزأ من جل الكولاجين من النوع الأول ليعكس بيئة ثلاثية المدة في الجسم الحي. ويعتبر الكولاجين كمكونات رئيسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM) المحيطة ECs25. يلعب ECM دورًا حاسمًا في تنظيم سلوك الخلايا26. ويمكن تنفيذ بروتوكول الفحص المقترح هنا بسهولة وسرعة في غضون يومين باستخدام تقنيات مختبرية مشتركة. لتتبع الخلايا الفعالة خلال عملية تنبت، يمكن تسمية كل نوع خلية بشكل فلورسنت ورصدها باستخدام مسجل الخلية في الوقت الحقيقي. تم تصميم نظام فحص تكوين الأوعية الوعائية المزدوج ة 3D المنشأ حديثًا لزيادة الحساسية لتقييم المغيرات الوعائية المحتملة وتوفير معلومات يمكن التنبؤ بها قبل الدراسة في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم عزل مركبات الكربون الهيدروكلورية الإلكترونية عن الدم المحيطي البشري كما هو موضح في تقرير سابق27. وباختصار، تم فصل طبقة الخلية أحادية النووية عن الدم كله باستخدام Ficoll-Paque Plus، ومثقفة في الوسط المناسب حتى ظهرت المستعمرات الشبيهة بالبطانة. تم جمع المستعمرات وتم عزل مركبات الكربون الكلورية فلورية باستخدام الخرز المغناطيسي المغلفة CD31. تم عزل MSCs من الخلية أحادية النووية الملتصقة (MNC) جزء من نخاع العظام البشرية البالغة. وقد وافق على بروتوكول الدراسة مجلس المراجعة المؤسسية لجامعة دوكسونغ النسائية (رقم IRB 2017-002-01).

1. خلية الثقافة

  1. إعداد مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية ولوحات متوسطة وألواح المعاطف
    1. إعداد نمو الخلايا البطانية المتوسطة MV2 (ECGM-MV2، باستثناء هيدروكورتيزون) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ الجلوتامين البنسلين-ستربيماتومين (GPS).
    2. إعداد نمو الخلايا الجذعية mesenchymal المتوسطة-2 (MSCGM-2) التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ GPS.
    3. لثقافة ECFC، معطف لوحات ثقافة الخلية مع 1٪ محلول الجيلاتين. لإعداد 1٪ محلول الجيلاتين، حل 1 غرام من مسحوق الجلج في 500 مل من PBS مع النمام المغناطيسي، وتعقيم مع الأوتوكلاف. لوحات يمكن أن تكون مغلفة مع 3 مل / 60 ملم، 5 مل / 100 ملم، أو 15 مل / 150 ملم من محلول الجيلاتين 1٪. احتضان لوحات المغلفة لمدة 15 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO2). بعد ذلك، قم بإزالة محلول الجيلاتين المتبقي بنسبة 1% عن طريق الطموح واغسل الأطباق المغلفة مرة واحدة مع PBS.
  2. نمو مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية والبلدان المتوسطة الدخل
    1. البذور 1 × 106 ECFCs على 1٪ الجيلاتين المغلفة 150 لوحات مم، وتنمو باستخدام ECGM-MV2 (10٪ FBS، 1٪ GPS) في حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO2)إلى 80-90٪ الملاءمة. استخدم مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية عند أرقام المرور 7-10 للحصول على نتائج متسقة.
    2. البذور 1 × 106 MSCs على لوحات غير المغلفة 150 ملم، وتنمو باستخدام MSCGM-2 في حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO2)إلى 80-90٪ الملاءمة. استخدام MSCs في أرقام المرور 7-10 للحصول على نتائج متسقة.

2. إعداد 1.2٪ ث / الخامس ميثيل سيلولوز الحل

  1. قياس 6 غرام من السليلوز الميثيل في زجاجة 500 مل وتعقيم في الأوتوكلاف.
  2. الحرارة ECGM-MV2 (دون FBS ونظام تحديد المواقع) في 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، وإضافة 250 مل من ECGM-MV2 ساخنة لتعقيم مسحوق السليلوز الميثيل. للحفاظ على الظروف المعقمة، وتنفيذ العملية داخل غطاء محرك السيارة تدفق.
  3. يُضاف شريط تحريك مغناطيسي معقم ويُخلط الحل لمدة 20 دقيقة على النمام المغناطيسي حتى يتم ترطيب السليلوز الميثيل يُبلل تمامًا ويُنثر بالتساوي بدون كتل. إضافة 250 مل من البرد (4 درجة مئوية) ECGM-MV2 (دون FBS ونظام تحديد المواقع) تحت حالة معقمة ومزيج لمدة 10 دقيقة إضافية على النمام المغناطيسي. ثم، قم بتبريد الحل في الثلاجة (4 درجة مئوية) بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: ميثيل سيلولوز هو بوليمر الكربوهيدرات التي تذوب بشكل جيد في درجات الحرارة الباردة بسبب التورم والترطيب اللاحقة.
  4. في اليوم التالي، aliquot الحل في أنبوب 50 مل والطرد المركزي في 5000 × ز لمدة 3 ساعة في 4 درجة مئوية. خذ الحل اللزج الفائق الواضح واخزنه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامه لمدة تصل إلى 3-6 أشهر.
    ملاحظة: قد تحتوي الرواسب على ألياف السليلوز المتبقية، لذلك تأخذ بلطف الحل الفائق ة تاركاً وراءها ما لا يقل عن 5 مل من الحجم. ويمكن تعديل هذا الحجم وفقا للظروف التجريبية.

3 - توليد وتضمين مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية فقط، والمركبات الصغيرة والمتوسطة فقط، ومركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية - مركبات الكربون الكلورية فلورية

اليوم الأول

  1. إعداد تعليق خلايا مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية وMSCs
    1. غسل 80-90٪ من مركبات الكربون الكلورية فلورية وMSCs confluent عن طريق إضافة الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم، واستنشاق.
    2. لفصل مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية وMSCs من لوحة الثقافة، واحتضانها مع 0.05٪ تريبسين-EDTA لمدة 3 دقائق و 5 دقائق في حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO2)،على التوالي، في حاضنة ثقافة الخلية.
    3. تعطيل التربسين عن طريق إضافة DMEM المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ GPS. ماصة الخلايا صعودا وهبوطا لخلق تعليق خلية واحدة.
    4. الرواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 282 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    5. إزالة supernatant، وإعادة تعليق الخلايا في المتوسطة المعنية.
  2. وضع العلامات على مركبات الكربون الكلورية فلورية وMSCs مع صبغة الفلورسنت
    ملاحظة: إجراء وضع العلامات على غشاء الخلية من مركبات الكربون الكلورية فلورية مع PKH67 (الأخضر) وMSCs مع PKH26 (الأحمر) صبغ الفلورسنت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة على النحو التالي.
    1. غسل الخلايا مرتين مع المصل وسيلة حرة لإزالة FBS.
      ملاحظة: البروتينات والدهون في FBS يقلل من تركيز صبغ فعالة لخلايا الوسم عن طريق الربط.
    2. (ج) عد مركبات الكربون الكلورية فلورية ومركبات الكربون الكلورية فلورية باستخدام مقياس الهيموكيتومات تحت المجهر، ونقل 3 x 106 مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية و2 x 106 MSCs إلى 2 مل أنابيب صغيرة.
      ملاحظة: هذه هي الكثافات الخلية الأمثل لوضع العلامات على الخلايا مع الأصباغ. استخدام عدد كبير من الخلايا يسبب تلطيخ الفقراء وغير متجانسة، في حين أن استخدام عدد قليل جدا من الخلايا يؤدي الانتعاش الخلايا الفقيرة.
    3. طرد مركزي الأنابيب في 100 × ز لمدة 5 دقائق في RT للحصول على بيليه الخلية. يستنشق بعناية supernatant ترك ما لا يزيد عن 15-25 درجة مئوية من حجم المتبقية.
    4. إعادة تعليق مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية ومركبات الكربون الكلورية فلورية في 250 ميكرولتر من مخفف C من مجموعة الصبغة. ماصة بلطف تعليق الخلية لضمان تشتت كامل.
      ملاحظة: C مخفف هو الملح الفسيولوجي، ويمكن أن تقلل من كفاءة تلطيخ الصبغة عن طريق تشكيل micelles. لذلك، لا تدع الخلايا تقف في C مخفف لفترة طويلة، ولا دوامة الأنابيب.
    5. إعداد محلول تلطيخ مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية عن طريق إضافة 5 ميكروات من PKH67 إلى 250 ميكرولتر من ثنائية التتكون C (التركيز النهائي 20 ميكرومتر) وللمركبات الصغيرة والمتوسطة بإضافة 3 ميكروت من PKH26 إلى 250 ميكرولتر من ثنائية المدة C (التركيز النهائي 12 ميكرومتر).
      ملاحظة: تركيزات صبغ النهائي تختلف عن توصيات الشركة المصنعة. ومن شأن التركيز العالي أن يؤدي إلى تكتل الخلايا وسمية الخلايا. انخفاض التركيز لن يكون كافيا للتلطيخ.
    6. إضافة 250 درجة مئوية من تعليق الخلايا ECFCs إلى 250 درجة مئوية من محلول صبغ PKH67، و 250 ميكرولتر من MSCs إلى 250 ميكرولتر من محلول صبغ PKH26. على الفور خلط الخلايا مع الأصباغ عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا وحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. للحصول على نتائج أفضل، قم بتغطية الأنبوب برقائق الألومنيوم ووضعها على هزاز لضمان الخلط الكافي أثناء التلطيخ.
    7. وقف عملية تلطيخ عن طريق إضافة 0.5 مل من FBS إلى تعليق الخلية الملونة، ومن ثم احتضان لمدة 1 دقيقة للسماح FBS لربط الصبغة الزائدة غير منضم. الرواسب الخلايا الملونة عن طريق الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: والكريات ذات الـ ECFCs وMSCs صفراء فاتحة ووردية، على التوالي، بعد تلطيخها.
    8. إزالة بعناية supernatant وغسل الخلايا مرتين مع المتوسطة كاملة لإزالة الصبغة الزائدة. طرد مركزي الأنابيب في 100 × ز لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق بيليه في 2 مل من كل وسيلة كاملة.
  3. توليد مركبات الكربون الكلورية فلورية أو MSC أو ECFC+MSC spheroids
    ملاحظة: تطبيق تقنية إسقاط شنقا لتوليد spheroids كما هو موضح سابقا28. وترد أدناه الخطوات اللازمة لإعداد النفيوات.
    1. عد مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية الملطخة والبلدان المتوسطة الدخل.
    2. تعليق مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية الملطخة، أو مركبات الكربون الكلورية فلورية، أو مركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية في ECGM-MV2 التي تحتوي على محلول ميثيل سيلولوز بنسبة 20% و5% من FBS. الاستعداد بكثافة خلايا تبلغ 4 x 104 خلايا/مل لمركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية أو مركبات الكربون الكلورية فلورية (25 ميكرولتر من تعليق الخلايا يحتوي على 1000 خلية). وبالنسبة لتعليق خلايا اثنين من مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية ومركبات الكربون الكلورية فلورية، قم بالاستعداد بكثافة خلايا تبلغ 2 x 104 خلايا/مل من مركبات الكربون الكلورية فلورية و0.4 x 104 خلايا/مل (25 ميكرولتر تحتوي على 500 من مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية و100 من مركبات الكربون الكلورية فلورية).
      ملاحظة: وينبغي ألا تتجاوز نسبة مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية إلى البلدان المتوسطة الدخل 5:1. ويمكن أن يؤدي عدد أكبر من هذه البلدان إلى الهجرة المفرطة ومورفولوجيا البراعم غير النظامية. ويمكن أن يتسبب عدد أقل من هذه الشركات في ضعف التفاعل بين الخلايا، مما يؤدي إلى ظهور ضعيف.
    3. إعداد وحدة ترطيب عن طريق إضافة 15 مل من PBS في الجزء السفلي من لوحة ثقافة 150 ملم.
    4. نقل تعليق الخلية في خزان البوليسترين المستطيلة المعقمة لاستخدام ماصة متعددة القنوات. تفريق تعليق الخلايا بالتساوي عن طريق الأنابيب.
    5. إيداع 25 ميكروغرام قطرات من تعليق الخلية على غلاف لوحة ثقافة 150 مم باستخدام ماصة متعددة القنوات (حوالي 100 قطرة / غطاء من لوحة 150 ملم). عكس الغطاء على وحدة ترطيب مليئة PBS وحضانة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: يوفر حل ميثيل سيلولوز اللزوجة المناسبة لحل التعليق. عندما تم تنفيذ طريقة إسقاط شنقا دون حل ميثيل سيلولوز، وتراجع قطرات بسهولة إلى أسفل عندما تم عكس الغطاء(الشكل التكميلي 1). وعلاوة على ذلك، بعد الحضانة بين عشية وضحاها، لم يتم تشكيل spheroids تماما دون حل ميثيل سيلولوز. وتشير هذه النتيجة إلى أن اللزوجة المناسبة عن طريق حل ميثيل سيلولوز ضروري لتشكيل شكل دائري من spheroids.

اليوم الثاني

  1. تضمين البشيرويدات في جل الكولاجين تحييد
    1. دافئ FBS وECGM-MV2 (بدون FBS ونظام تحديد المواقع) في حمام مائي (37 درجة مئوية). وضع حل ميثيل سيلولوز الباردة على مقاعد البدلاء العمل لجلب إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. ضع طبقًا من 24 بئرًا في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية) للاحترار.
    3. قطع وأشار 1 مل نصائح ماصة 3-5 ملم لاستنشاق spheroids وتعليق لزجة، مثل حل ميثيل سيلولوز والكولاجين من النوع الأول، بشكل مريح ودقيق.
    4. إعداد 3 ملغ / مل تحييد نوع الأول هلام الكولاجين على الجليد بعد نوع أنا تعليمات الشركة المصنعة هلام الكولاجين.
      ملاحظة: وينبغي إجراء تحييد على الجليد لتجنب هلام الكولاجين في درجة حرارة الغرفة. لبئر واحد من لوحة 24 جيدا، هناك حاجة 500 ميكرولتر من الكولاجين تحييد. إعداد دائما 1 مل حجم إضافي من الكولاجين. يمكن استخدام هلام الكولاجين حتى 2-3 ساعة بعد تحييد إذا أبقى على الجليد.
    5. حصاد spheroids عن طريق الرينس الغطاء الذي يحتوي على spheroids مع 5 مل من PBS. جمع حل spheroid معلقة في أنبوب مخروطي 50 مل. إعادة شطف الغطاء مع 5 مل من PBS للحصول على spheroids المتبقية.
      ملاحظة: خلال الحصاد، ومراقبة عن كثب لتأكيد وجود spheroids. لمزيد من الفحص البصري، نقل حوالي 50-100 درجة مئوية من حل spheroid معلقة على الزجاج الشريحة، والتحقق من الشكل الدائري من spheroids تحت المجهر.
    6. الرواسب النفيدات عن طريق الطرد المركزي في 282 × ز لمدة 5 دقائق.
    7. اضغط بلطف على جدار الأنبوب بحيث يتم تعليق spheroids بحرية في الحل المتبقي المتبقي 100-200 درجة مئوية المتبقية.
    8. إضافة ECGM-MV2 التي تحتوي على 5٪ FBS و 40٪ ميثيل سيلولوز الحل إلى الأنبوب الذي يحتوي على spheroid. يتم تحديد وحدة التخزين المضافة على أساس ما يقرب من 100 spheroids / مل. اخلطي بلطف نظام التعليق البذير عن طريق الأنابيب مع طرف ماصة 1 مل.
      ملاحظة: يستخدم محلول ميثيل سيلولوز على نطاق واسع كعامل تعليق لا يسمح للسبليريدات للرواسب. يجب أن يكون تركيز FBS 5٪. ارتفاع تركيز FBS يسبب تنبت غير طبيعي بسبب عوامل النمو المفرطة. لا يمكن لتركيز FBS السفلي الحفاظ على ظروف صحية للخلايا.
    9. مزيج spheroid-تعليق الحل وتحييد من نوع I هلام الكولاجين (3 ملغ / مل) بنسبة 1:1 على الجليد. استخدام طرف ماصة 1 مل حادة لتجنب كسر spheroids.
      ملاحظة: مطلوب 1 مل من محلول هلام الكولاجين سفيرويدس تعليق لبئر واحد من لوحة 24 جيدا. جعل حل تعليق مختلطة إضافية إذا كان ذلك ممكنا.
    10. إذا كانت الخصائص الوعائية لأي عامل (عوامل) أو مادة كيميائية (مواد كيميائية) تحتاج إلى اختبار، قم بنقل 1 مل من محلول جل الكولاجين اليعلق من السفيرويد في أنبوب صغير بمقدار 1 مل وإضافة وكيل (عوامل) أو مادة كيميائية (مواد كيميائية) متبوعة بخلط لطيف مع طرف ماصة 1 مل حادة.
      ملاحظة: حجم العوامل والمواد الكيميائية يمكن أن تُجمع إلى 200 مل، مما يخفف من تركيز جل الكولاجين من النوع الأول من 1.5 ملغم/مل إلى 1.25 ملغم/مل، ولكنه لا يؤثر على النوع الأول من البلمرة هلام الكولاجين. إضافة نفس الحجم من السيارة إلى spheroids التحكم.
    11. أضف محلول جل الكولاجين القافق إلى آبار طبق 24 بئرًا مُدفأ مسبقًا (0.9 مل/بئر) عن طريق الأنابيب، ثم قم بالحضانة لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا للبلمرة.
      ملاحظة: خلال عملية تضمين spheroid، لا تزعج الجل عن طريق تحريك لوحة.
    12. قم بتغطية جل الكولاجين المنعل بـ spheroid عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من ECGM-MV2 الذي يحتوي على 2.5% FBS مع/بدون VEGF. بالنسبة للspheroids ECFC فقط، تحفز الخلايا مع إضافة خارجية من VEGF (التركيز النهائي من 50 نانوغرام / مل) لتشكيل براعم السليم. ECFC + MSC spheroids لا تتطلب التحفيز الخارجي من قبل أي عوامل النمو.
    13. ضع اللوحة في مسجل خلية في الوقت الحقيقي مثبتة في حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO2)،والتركيز عشوائيا على 5-10 spheroids (عدسة موضوعية 10X). رصد تشكيل تنبت من كل spheroids الفلورية المسمى كل 1 ساعة لمدة 24 ساعة دون أي اضطراب.

4. الكم سفيرويد سبات

  1. استيراد ملفات الصور إلى برنامج ImageJ لتكميم عدد من براعم وقياس طول كل برعم. لspheroids الثقافة المشتركة، تسمية ECFCs مع صبغ الفلورسنت الأخضر قبل صنع spheroids. ثم، وقياس عدد وطول براعم ملطخة الفلورية الخضراء(الشكل التكميلي 2). وقد تم تحديد خمسة من السفيرويدات المختارة عشوائياً كمياً لكل مجموعة تجريبية.
    ملاحظة: البراعم هي هياكل ممدودة بشكل تعاوني شكلتها العديد من مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية التي تمتد من النضدة. يتم قياس طول براعم كما طول من نقطة أصل براعم من سطح spheroids إلى غيض من براعم.
  2. التعبير عن القيم كوسيلة ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. تحديد الفرق المهم إحصائياً حسب ANOVA في اتجاه واحد للمقارنات المتعددة أو اختبار t-testللطلاب للمقارنات المقترنة.
    ملاحظة:P ≤ 0.05 يعتبر هاما إحصائيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد أجريت تجارب مقارنة باستخدام الـ spheroids أحادية الثقافة (ECFCs-فقط) وspheroids co culture (ECFCs+MSCs) لدراسة ما إذا كانت هذه الشركات تؤدي دوراً كبيراً في تكوين الأوعية بوساطة مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. تم رصد تشكيل تنبت من كل spheroid لمدة 24 ساعة من قبل مسجل الخلية في الوقت الحقيقي التي يمكن التقاط تطور تنبت الوعائية من spheroids. تم قياس الإمكانات الوعائية من خلال حساب عدد البراعم وقياس الطول التراكمي للبراعم المتولدة من النفيض الفردية. تم تحليل خمسة spheroids مختارة عشوائيا لكل مجموعة تجريبية. وفيما يتعلق بمركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية، كان عدد البراعم وطول البراعم التراكميأعلى بكثير مقارنة بعدد الزوائد التي تحتوي على مركبات الكربون الكلورية فلورية فقط في جميع نقاط الوقت(الشكل 1ألف - جيم). ازداد عدد وطول مركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية بشكل مستمر لمدة 12 ساعة، ولكن عدد وطول السفيرويدات التي تقتصر على مركبات الكربون الكلورية فلورية فقط زادت لمدة 6 ساعات ولم تتغير عند النقاط الزمنية اللاحقة(الشكل 1باء، جيم). وبالإضافة إلى ذلك، كانت براعم شكلتها مركبات الكربون الكلورية فلورية + MSCs spheroids أكثر سمكا وأكثر دواما من تلك التي شكلتها eCFCs فقط spheroids مع / بدون العلاج VEGF(الشكل 1A،والفيديو التكميلي 1A، B، D). لم تشكل spheroids MSCs فقط براعم ولكن أظهرت الهجرة الفردية من MSCs خارج spheroids(الشكل 1A والفيديو التكميلي 1C). وتبين هذه النتائج المساهمة الكبيرة التي تقدمها هذه الشركات، وهي سلائف البيريكيت، في تكوين الأوعية الخلوية لمركبات الكربون الكلورية فلورية. ومن المعروف أن هذه الشركات تفرز عوامل نمو مختلفة29 التي قد تحفز مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية على تشكيل براعم وهياكل أنبوبية.

وقد وُصفت مركبات الكربون الكلورية فلورية بصبغة فلورية خضراء، ووُصفت هذه المركبات بصبغة فلورية حمراء قبل أن تتضافر لتوليد مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية. جنبا إلى جنب مع تسجيل في الوقت الحقيقي، وهذا تقنية وضع العلامات الفلورة الخلية الحية يمكن تتبع الحركات الخلوية من مركبات الكربون الكلورية فلورية وMSCs خلال تشكيل براعم. وأظهر التصوير الفلورسنت أن هياكل البراعم التي تتوسط فيها مركبات الكربون الكلورية فلورية كانت مغطاة بمركبات الكربون الكلورية فلورية(الشكل 2 والفيديو التكميلي 2). وهذا يشير إلى أن الجمع بين MSCs تعمل كخلايا ما حول الأوعية الدموية أثناء تشكيل براعم، والتي تعزز الاستقرار والمتانة تنبت من خلال الارتباط الضيق بين خليتين الأوعية الدموية.

تم اختبار نظام الفحص بـ bevacizumab، وهو مثبط للأوعية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير، للتحقق من قدرته على فحص الأدوية المضادة للأوعية الدموية. أظهرت مركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية التي عولجت مسبقاً مع bevacizumab انخفاض عدد البراعم وطول البراعم التراكمي بطريقة تعتمد على الجرعة مقارنة بالتحكم في مركبات الكربون الكلورية فلورية + CS spheroids(الشكل 3ألف، باء). وفي التجارب الموازية، أظهرت السفيرويدات التي تعتمد على مركبات الكربون الكلورية فلورية فقط المعالجة مسبقاً بـ bevacizumab تليها التحفيز مع VEGF (50 نانوغرام/مل) انخفاض عدد البراعم الناجمة عن VEGF وطول البراعم التراكمي بطريقة تعتمد على الجرعة(الشكل 3C,D) . وتجدر الإشارة إلى أن قيم IC50 من bevacizumab لتثبيط طول البراعم التراكمية في مركبات الكربون الكلورية فلورية + CS spheroids كانت 46 مرة أكبر من تلك الموجودة في spheroids ECFCs فقط(الجدول 1). وتعني هذه النتيجة بقوة أن هناك حاجة إلى تركيز أعلى لمنع تكوين الأوعية الدموية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من قبل مركبات الكربون الكلورية فلورية ومركبات الكربون الكلورية فلورية مقارنة بالتركيز اللازم لمنع تكوين الأوعية الدموية بوساطة المفوضية الأوروبية فقط.

بعد ذلك، تم تنفيذ نموذج الماوس الورم xenograft مع العلاج bevacizumab للكشف عن أي نظام spheroid توفير بيانات يمكن التنبؤ بها المرتبطة في تركيز البلازما فعالة في الجسم الحي. تم حقن خط الخلايا المغليفة المستمدة من الإنسان U87MG-Red-FLuc بشكل تحت الجلد إلى الفئران التي تعاني من نقص المناعة. بعد تأكيد تكوين الورم في 1 أسبوع، تم تقسيم الفئران عشوائيا إلى 3 مجموعات التي تلقت علاجات مختلفة: السيطرة (0 ملغ / كغ)، جرعة منخفضة (1 ملغ / كغ)، وجرعة عالية (30 ملغ / كغ). وقد تم تثبيط نمو الورم بشكل كبير في المجموعة المعالجة بـ 30 ملغم/كغم مقارنة بمجموعة التحكم(الشكل التكميلي 3ألف). وأظهرت المجموعة التي تعالج 1 مغ/كغ اتجاها ً لانخفاض الورم، ولكن لم يكن هناك فرق إحصائي مقارنة بمجموعة التحكم. وكان تركيز بلازما الفأر في 3 أسابيع من العلاج بيفاسيزوماب 568.0 ± 40.62 ميكروغرام / مل في 30 ملغ / كغ و 38.1 ± 0.72 ميكروغرام / مل في 1 ملغ / كغ(الشكل التكميلي 3B). وتجدر الإشارة إلى أن تركيز البلازما من بيفاسيزوماب الذي يظهر تثبيطاً فعالاً (568.0± 40.62 ميكروغرام/مل عند 30 ملغم/كغم للعلاج لمدة 3 أسابيع) قد تحقق عن كثب من خلال مركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات متعددة السنوات (1261.5± 214.49 ميكروغرام/مل) ولكن ليس الـ ECFCs-فقط spheroids (27.0± 9.97 μg/mL). وهكذا، يمكن اعتبار نظام الفحص الأوعية الدموية ECFCs+MSCs بمثابة نظام فحص مناسب للتنبؤ بتركيز البلازما الفعال قبل التجارب الحيوانية.

Figure 1
الشكل 1: تكوين البراعم من مركبات الكربون الكلورية فلورية فقط، ومركبات الكربون الكلورية فلورية فقط، ومركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية. (أ)صور تمثيلية لتكوين البراعم من مركبات الكربون الكلورية فلورية فقط، ومركبات الكربون الكلورية فلورية فقط، ومركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية، والمركبات العضوية المُسَنَة (MSC) المدمجة في جل الكولاجين من النوع الأول في 0 و6 و12 و18 و24 ساعة (شريط المقياس = 100 م). (ب)الرسم البياني الكمي لعدد البراعم المتكونة من مركبات الكربون الكلورية فلورية فقط ومركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية (متوسط ± SEM، ن = 3). (ج)الرسم البياني الكمي لطول البراعم التراكمية المتكونة من مركبات الكربون الكلورية فلورية فقط ومركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية (متوسط ± SEM، ن = 3). * يشير إلى وجود فرق كبير بين مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية فقط ومركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية في نفس النقاط الزمنية (p ≤ 0.05). # يشير إلى الفرق الكبير بين المجموعات المشار إليها بواسطة قوس (ع ≤ 0.05). تم تعديل هذا الرقم من pubication السابقة30. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توطين مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية والبلدان المتوسطة الدخل في هياكل البراعم. الصور التمثيلية التي تُظهر مواقع نوعين من الخلايا في هياكل البراعم بعد 24 ساعة. وتبين الأسهم أن هذه الشركات كانت مغطاة بهياكل البراعم التي تتوسط فيها مركبات الكربون الكلورية فلورية (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التأثير المثبط لـ bevacizumab على تكوين البراعم من مركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية والمركبات العضوية المُسْتوابة فقط. وقد عولجت مركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية والمركبات العضوية الثابتة فقط بـ bevacizumab، وتم رصد تكوين البراعم لمدة 24 ساعة (باء) الرسم البياني الكمي لطول البراعم التراكمية من مركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية التي تعالج بـ bevacizumab (متوسط ± SEM، n = 3). (C)الرسم البياني الكمي لعدد البراعم من الـ VEGF-حفز ECFCs فقط spheroids تعامل مع bevacizumab (متوسط ± SEM، ن = 3). (D)الرسم البياني الكمي لطول البراعم التراكمية من الـ VEGF-حفز ECFCs فقط spheroids تعامل مع bevacizumab (متوسط ± SEM، ن = 3). * يشير إلى اختلاف كبير من مجموعة التحكم (شريط أبيض) (ع ≤ 0.05). # يشير إلى فرق كبير من VEGF -المعالجة المجموعة (شريط أسود) (ع ≤ 0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوقت
(ح)		 IC50 (ميكروغرام / مل) من أفاستين p-القيمة
الـ ECFCs فقط مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية
6 94.62 ± 38.53 3058.21 ± 373.31 0.003
12 58.61 ± 17.80 2006 ± 484.73 0.015
18 83.38 ± 54.54 1509.51 ± 483.88 0.042
24 27.04 ± 9.97 1261.51 ± 214.49 0.0045

الجدول 1: قيم IC50 من bevacizumab لتثبيط طول البراعم التراكمية إما في مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية فقط أو مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية + CS spheroids. وقد عولجت السفيرويدات التي تحتوي على مركبات الكربون الكلورية فلورية فقط بـ bevacizumab يليها التحفيز مع VEGF (50 نانوغرام/مل)، وهو أمر مطلوب لتكوين البراعم من الـ ECFCs فقط. وقد عولجت مركبات الكربون الكلورية فلورية + MSCs مع bevacizumab دون تحفيز VEGF. وقد لوحظ كل من spheroids جزءا لا يتجزأ من هلام الكولاجين من النوع الأول، وتشكيل براعم من كل spheroid لمدة 24 ساعة باستخدام مسجل الخلية في الوقت الحقيقي. يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM (n = 3).

Supplemental Figure 1
الشكل التكميلي 1: الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Figure 2
الشكل التكميلي 2: الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Figure 3
الشكل التكميلي 3: الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Video 1A
فيديو تكميلي 1A: الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Supplemental Video 1B
فيديو إضافي 1B: الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Supplemental Video 1C
فيديو تكميلي 1C: الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Supplemental Video 1D
فيديو إضافي 1D: الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Supplemental Video 2
فيديو إضافي 2: الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقدم هذه الدراسة نظام فحص تكوين الأوعية الدموية المحسن في المختبر باستخدام spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها اثنين من الذرية الخلايا الوعائية البشرية، ومركبات الكربون الكلورية فلورية وMSCs. التي يتم إنجازها من خلال التفاعل والدمج بين الخلايا البطانية وpericytes. بالمقارنة مع غيرها من الاختبارات في المختبر الأوعية الدموية التي تعكس فقط ECs بوساطة الأوعية الدموية، وهذا النظام اختبار الثقافة المشتركة هو أكثر تمثيلا للسلسلة متعددة الخطوات من تكوين الأوعية الفسيولوجية بما في ذلك التفاعل الخلوي، تنبت، تشكيل أنبوب، ونضج السفينة. هذا النظام اختبار أنشئت حديثا يشبه أيضا في بيئة صغيرة خارج الخلية في الجسم الحي عن طريق البذر spheroids في هلام الكولاجين من النوع الأول. نقترح أن نظام فحص تكوين الأوعية الوعائية ثلاثي الخصائص هو نظام فحص قابل للتكرار ويمكن قياسه بسهولة، والأهم من ذلك أنه ذو صلة من الناحية الفسيولوجية.

أثناء إجراء اختبار spheroid الثقافة المشتركة، فمن الضروري تضمين spheroids في هلام مع تركيز مناسب من نوع تحييد أنا الكولاجين وFBS. أفضل تركيز نهائي من الكولاجين من النوع الأول تحييد هو 1.5 ملغ / مل، والنسبة المئوية للFBS هو 2.5٪. في التجارب الأولية، أدت تركيزات أعلى من الكولاجين في هلام قاسية وأعاقت نوعية وكمية من براعم الناشئة من spheroids. أقل تركيزات من الكولاجين أسفرت عن هلام لينة وهشة التي لا يمكن الحفاظ على سلامة spheroids. وبالمثل، تسبب كميات أعلى من FBS تنبت عدد كبير من spheroids على المستوى القاعدي بغض النظر عن تحفيز عامل الأوعية الدموية. أدى انخفاض تركيز FBS إلى سوء ظروف الخلايا. للحصول على نتائج متسقة واستنساخها، يجب أن يكون جزءا لا يتجزأ من عدد مناسب من spheroid (حوالي 50 spheroids / جيدا). أكثر من 50 spheroids / جيدا يمكن أن يؤدي إلى قرب وثيق من spheroids داخل البئر، والتي قد تؤثر بشكل غير طبيعي على نوعية وكمية من براعم ولدت.

من المهم الحفاظ على الكولاجين من النوع الأول في الظروف المبردة أثناء التحييد وخلط الخطوات مع تعليق spheroid لأن الكولاجين يمكن أن تجلط في درجة حرارة الغرفة، مما أدى إلى مصفوفة غير منتظمة. في حين خلط تعليق spheroid مع حل الكولاجين، فمن المستحسن استخدام 1 مل تلميح ماصة مع قطع 3-5 ملم في نهاية لجعل حفرة واسعة. وهذا يتيح سهولة التعامل مع محلول الكولاجين لزج ة ويحمي spheroids من التمزق. يمكن أن يؤدي الهياج في اللوحة بعد تضمين محلول الكولاجين المعلق من السفيرويد إلى اضطراب سلامة الجل ويؤدي إلى الكسر الذي قد يعوق توليد البراعم الطبيعية.

وفي التضوى على المستقبلات المشتركة باستخدام مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية ومركبات الكربون الكلورية فلورية، ينبغي الحفاظ على نسبة 5:1. استخدام عدد أكبر من MSCs يسبب الانتشار حول spheroid بسبب النمط الظاهري المهاجرة من MSCs، والتي يمكن أن تؤثر على توليد براعم مثالية. ولا يكفي عدد أقل من هذه الشركات لتحفيز مركبات الكربون الكلورية فلورية التي تنبت وتغطية البراعم على نحو سليم. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري للتحقق من ظروف الخلية أثناء النمو. إذا لوحظ تنبت الفقراء ، فمن المستحسن استخدام مقاطع صحية أخرى من الخلايا. وللحصول على نتائج أفضل، يوصى بشدة باستخدام مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية والبلدان المتوسطة الدخل عند مرور أقل من 10.

هنا، نقدم نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثيالد محسن باستخدام الـ spheroids الثقافة المشتركة التي تلتقط عن كثب في تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي. بالمقارنة مع أنظمة فحص خلية واحدة 2D، يعكس هذا النظام فحص spheroid ثقافة مشتركة الاستجابات الخلوية أكثر إخلاصا بين نوعين من الخلايا الوعائية لتشكيل هياكل أنبوبي في الظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، لا يزال هذا النظام أكثر تبسيطا بالمقارنة مع عملية معقدة متعددة الخطوات من في تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي. عادة ما يحدث توليد الأوعية الدموية في الجسم الحي من خلال التفاعل المتعدد من أنواع الخلايا الأخرى المختلفة، بما في ذلك الخلايا الظهارية، الخلايا الليفية، الخلايا المناعية، وأيضا البروتينات ECM وفيرة. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذا النظام الجديد إدخال أنواع الخلايا الأخرى وECM لتعكس على نحو أدق تكوين الأوعية الفسيولوجية و / أو المرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا البحث بمنحة (17172MFDS215) من وزارة سلامة الأغذية والأدوية، ومنحة مؤسسة البحوث الوطنية الكورية (NRF) الممولة من حكومة كوريا (MSIP) (2017R1A2B4005463)، وبرنامج بحوث العلوم الأساسية من خلال مؤسسة البحوث الوطنية في كوريا (NRF) بتمويل من وزارة التعليم (2016R1A6A1A03007648).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA (1x) Gibco 25300-054
Bevacizumab Roche NA Commercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium Gibco 11885-084 DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) Gibco 21600-010 PBS (10x)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) Corning 21-031-CVR PBS (1x)
Endothelial cell Growth medium MV2 kit Promocell C-22121 ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS) Atlas FP-0500A FBS
Gelatin BD Sciences 214340
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin Gibco 10378-016 GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2 Promocell C-28009 MSCGM-2
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI26 PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI67 PKH67
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Type I collagen gel Corning 354236
Vascular endothelial growth factor A R&D 293-VE-010 VEGF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
  3. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  4. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  5. Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
  6. Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
  7. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
  8. Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
  9. Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
  10. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
  11. Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
  12. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  13. Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
  14. Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
  15. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  16. Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
  17. Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
  18. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
  19. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  20. Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
  21. Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
  22. Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
  23. Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
  24. Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
  25. Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
  26. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
  27. Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
  28. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  29. Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
  30. Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).

Tags

علم الأحياء التنموية، العدد 151، تكوين الأوعية الدموية، spheroid الثقافة المشتركة، الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية، الخلايا الجذعية mesenchymal، النوع الأول هلام الكولاجين، تنبت، bevacizumab
نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد باستخدام Spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية والخلايا الجذعية Mesenchymal
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shah, S., Lee, H., Park, Y. H.,… More

Shah, S., Lee, H., Park, Y. H., Jeon, E., Chung, H. K., Lee, E. S., Shim, J. H., Kang, K. T. Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (151), e60032, doi:10.3791/60032 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter