Summary
تصف هذه الدراسة طريقة لعزل الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالإكسوسوم التي تحمل عوامل تحفيز مستعمرة الحبيبية المحفزة للمناعة من الخلايا الجذعية الجنينية.
Abstract
الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) هي خلايا جذعية متعددة القدرات قادرة على التجديد الذاتي والتمايز في جميع أنواع الخلايا الجنينية. مثل العديد من أنواع الخلايا الأخرى، تطلق ESCs حويصلات غشاء صغيرة، مثل الإكسوسومات، إلى البيئة خارج الخلية. Exosomes بمثابة الوسطاء الأساسية للاتصال بين الخلايا وتلعب دورا أساسيا في العديد من العمليات الفسيولوجية (باثو). يعمل عامل تحفيز مستعمرة الحبيبية-الضامة (GM-CSF) كسيتوكين لتعديل الاستجابة المناعية. وجود جنرال موتورز CSF في exosomes لديه القدرة على تعزيز وظيفتها التنظيمية المناعية. هنا، تم التعبير عن GM-CSF بشكل مفرط بشكل ثابت في خط خلية مورين ESC ES-D3. تم تطوير بروتوكول لعزل الحويصلات خارج الخلية عالية الجودة المخصبة بالإكسوسوم (EVs) من خلايا ES-D3 التي تفرط في التعبير عن GM-CSF. وتميزت المركبات الكهربائية المعزولة المخصبة بالإكسوسوم بمجموعة متنوعة من النهج التجريبية. والأهم من ذلك، تبين أن كميات كبيرة من المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسوم موجودة في مركبات الكربون الكلورية المحورة. وعموما، قد تعمل المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم الحاملة للآلية العالمية من مركبات الكربون الهيدروفلورية ك الحويصلات الخالية من الخلايا لممارسة أنشطتها التنظيمية المناعية.
Introduction
ESCs مشتقة من مرحلة الكيسة الأريمية لجنين ما قبل الزرع1. كخلايا جذعية متعددة القدرات، تمتلك ESCs القدرة على التجديد الذاتي والتمييز في أي نوع من الخلايا الجنينية. نظرا لإمكاناتها التنموية الرائعة وقدرتها على الانتشار على المدى الطويل ، فإن ESCs ذات قيمة كبيرة للأبحاث الطبية الحيوية1. ركزت جهود البحث الحالية إلى حد كبير على الإمكانات العلاجية ل ESCs لمجموعة متنوعة من الاضطرابات المرضية الرئيسية ، بما في ذلك مرض السكري وأمراض القلب والأمراض العصبية2و3و4.
ومن المعروف أن خلايا الثدييات ، بما في ذلك ESCs ، تطلق الحويصلات ذات الأحجام المتغيرة للبيئة خارج الخلية ، وتمتلك هذه المركبات الكهربائية العديد من الوظائف الفسيولوجية والمرضية بسبب دورها في الاتصال بين الخلايا5. من بين أنواع فرعية مختلفة من المركبات الكهربائية، exosomes هي الحويصلات غشاء صغيرة أطلقت من أنواع مختلفة من الخلايا في الفضاء خارج الخلية عند الانصهار من مقصورات الغدد الصماء المتوسطة، والهيئات متعددة المركبات (MVBs)، مع غشاء البلازما6. وقد أفيد Exosomes للتوسط في الاتصالات بين الخلايا وتشارك بشكل حاسم في العديد من العمليات الفسيولوجية (باثو)7،8. ترث Exosomes بعض الوظائف البيولوجية من خلاياها الأبوية الخاصة ، لأن الإكسوسومات تحتوي على مواد بيولوجية تم الحصول عليها من السيتوسول ، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية. وهكذا، يتم تغليف المستضدات المرتبطة بها أو العوامل التي تحفز الاستجابة المناعية المحددة لمرض معين في exosomes من أنواع معينة من الخلايا9. مهد هذا الطريق للتجارب السريرية استكشاف exosomes المستمدة من الورم كلقاح مضاد للسرطان10.
GM-CSF هو السيتوكين الذي تفرزه أنواع مختلفة من الخلايا المناعية11. تظهر الأدلة الناشئة أن GM-CSF ينشط وينظم الجهاز المناعي ويلعب دورا أساسيا في عملية تقديم المستضد12. على سبيل المثال، يشير تقرير سريري إلى أن GM-CSF يحفز الاستجابة المناعية للأورام كلقاح المساعد13. وقد تم التحقيق في العديد من الاستراتيجيات العلاج المناعي السرطان المستندة إلى GM-CSF لاستغلال النشاط المحفز المناعي قوية من GM-CSF في التجارب السريرية14. من بين هذه, وقد أظهرت لقاح السرطان تتألف من الخلايا السرطانية المشععة GM-CSF إفراز بعض الوعد في مرضى سرطان الجلد المتقدمة عن طريق تحفيز الاستجابات المضادة للخلايا والفكاهية ونخر لاحقة في الأورامالمنتشرة 15.
ولأن الإكسوسومات المشتقة من مركبات الكربون الهيدروفلورية تمتلك أنشطة بيولوجية مماثلة لتلك التي تمتلكها البلدان النامية الأصلية، فربما يمكن أن تعمل الإكسوسومات الحاملة للآلية العالمية-CSF من مركبات الكربون الهيدروفلورية كحواف خالية من الخلايا لتنظيم الاستجابة المناعية. في هذه الورقة، يتم وصف طريقة مفصلة لإنتاج مركبات كهربائية عالية الجودة غنية بالإكسوسوم من ESCs تعبر عن GM-CSF. هذه المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم لديها القدرة على العمل ك الحويصلات التنظيمية المناعية لتعديل الاستجابة المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة خلايا ES-D3
- لتوليد مصل بقري جنيني خال من الاكسوسوم (FBS)، قم بتحميل FBS في جهاز طرد مركزي فائق والطرد المركزي عند 100,000 × غرام لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، وجمع المصل الفائق كما FBS خالية من الاكسوسوم لزراعة خط الخلية مورين ESC ES-D3 والحصول على المركبات الكهربائية المخصب exosome.
- قبل طلاء خلايا ES-D3، اغلف أطباق زراعة الأنسجة 15 سم باستخدام الجيلاتين (0.1٪) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- بعد بروتوكول16الموصوفة سابقا ، والثقافة خلايا ES - D3 دون خلايا طبقة التغذية في الجيلاتين المغلفة 15 سم أطباق زراعة الأنسجة. يتكون الوسط ثقافة الخلية ES-D3 من DMEM، FBS الخالية من الإكسوسوم (15٪)، والأحماض الأمينية غير الأساسية (0.1 mM)، L-الجلوتامين (2 mM)، β ميركابتوثانول (0.1 mM)، البنسلين (50 وحدة / مل)، الستريبتومايسين (50 ميكروغرام / مل)، وعامل مثبط لسرطان الدم (LIF؛ 100 وحدة / مل). زراعة خلايا ES-D3 عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
- بمجرد أن تصل خلايا ES-D3 إلى حوالي 90٪ من الالتقاء في أطباق زراعة الأنسجة 15 سم ، قم بإزالة الوسط حسب الطموح. غسل الخلايا باستخدام التريبسين (5 مل؛ 0.05٪). أضف التريبسين (5 مل) إلى الأطباق واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. جمع الخلايا من الأطباق.
- إضافة متوسط ثقافة جديدة (5 مل) إلى الخلايا التي تم جمعها ل inactivate التريبسين. الطرد المركزي الخلايا في 390 × ز لمدة 5 دقائق. إعادة إنفاق الخلايا في وسط جديد وتحديد رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
- بالنسبة للخلايا الممرة، صفح خلايا ES-D3 (5 × 106)في طبق زراعة الأنسجة المغلف بالجيلاتين (0.1٪) مع وسط طازج (15 مل) والثقافة لمدة 3 أيام قبل زراعة الخلايا.
- لجمع الخلايا الثقافة supernatant لعزل المركبات الكهربائية المخصب exosome، لوحة خلايا ES-D3 (1 × 107)في الجيلاتين المغلفة (0.1٪) 15 سم طبق زراعة الأنسجة مع المتوسطة الطازجة (15 مل) لمدة 3 أيام قبل جمع خلية الثقافة supernatant.
2. جيل من التعبير جنرال موتورز - CSF plasmid
ملاحظة: إنشاء pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP لفرط التعبير GM-CSF في خلايا ES-D3. في هذا البلازميد، والتعبير عن مورين GM-CSF cDNA جنبا إلى جنب مع البروتين علامة أنسنة رينيلا reniformis GFP (hrGFP) مدفوعة من قبل الإنسان polypeptide سلسلة استطالة عامل 1α (EF1α) المروج17،18.
- توليد العمود الفقري المتجه.
- هضم pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 ميكروغرام من الحمض النووي) باستخدام إنزيم تقييد EcoRI (100 وحدة) في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتوليد اثنين من شظايا الحمض النووي: العمود الفقري ناقلات (6.0 kb) وإدراج FD3ER (2.5 kb).
- نقل 50٪ من الحمض النووي البلازميد المهضوم (10 ميكروغرام) إلى أنبوب واحد 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق وعلاجه بالفوسفاتاز القلوية (20 وحدة) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. حل كل من الحمض النووي غير المعالجة وإزالة الفوسفورات باستخدام إلكتروفورسيس هلام الآغاروز (2٪).
- تنقية شظايا الحمض النووي العمود الفقري ناقلات (6.0 kb) باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي . وفي حين أن العمود الفقري النواقل غير المعالج سيكون بمثابة المتجه الفارغ (pEF1α-IRES-hrGFP)، فإن العمود الفقري للنواقل المفككة سيستخدم لتوليد البلازميد المعبر عن جنرال موتورز-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
- إنشاء إدراج CDNA GM-CSF.
- هضم pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 ميكروغرام) باستخدام إنزيم تقييد EcoRI (100 وحدة) في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لإنتاج اثنين من شظايا الحمض النووي: العمود الفقري ناقلات (6.5 kb) وإدراج مورين جنرال موتورز-CSF cDNA (474 bp).
- حل الحمض النووي المهضوم من خلال إلكتروفورسيس هلام الآغاروز (2٪). تنقية مورين GM-CSF cDNA جزء (474 نقطة أساس) باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي.
- توليد البلازميدات التعبير.
- إعداد تفاعلات ربط 2 (10 ميكرولتر الحجم الإجمالي) باستخدام عدة ربط الحمض النووي.
- لإنشاء المتجه الفارغ pEF1α-IRES-hrGFP، قم بتسييل العمود الفقري للنواقل غير المعالجة من الخطوة 2.1.3 (6.0 كيلوبايت؛ 500 نانوغرام).
- لتوليد pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP، ligate شظايا الحمض النووي التالية: (1) العمود الفقري ناقلات dephosphorylated من الخطوة 2.1.3 (6.0 كيلوبايت؛ 500 نانوغرام) و (2) جزء mGM-CSF cDNA ولدت في الخطوة 2.2.2 (474 نقطة أساس؛ 200 نانوغرام).
- Ligate عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحويل الحمض النووي المربط إلى خلايا DH5α المختصة E. القولونية. لوحة خلايا الإشريكية القولونية المحولة على لوحات LB-agar التي تحتوي على كاربينسيلين (50 ميكروغرام / مل).
- تنقية البلازميدات من مستعمرات الإشريكية القولونية المفردة باستخدام عدة عزل الحمض النووي. التحقق من صحة هويات البلازميدات عن طريق تسلسل الحمض النووي.
- إعداد تفاعلات ربط 2 (10 ميكرولتر الحجم الإجمالي) باستخدام عدة ربط الحمض النووي.
3. توليد خلايا ES-D3 الإفراط في التعبير GM-CSF
ملاحظة: تحويل خلايا ES-D3 مع pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP إلى التعبير الزائد GM-CS. Cotransfect وpBabe- نيو بلازميد في خلايا ES-D3 لتسهيل اختيار الخلايا المصابةطعنا 18،20.
- تحويل البلازميدات إلى خلايا ES-D3.
- صفيحة خلايا ES-D3 (1.4 × 106)في طبق زراعة الأنسجة المغلف بالجيلاتين (0.1٪) مع متوسط الثقافة (10 مل) للإصابة بالعدوى. اللوحة الثقافية لخلايا ES-D3 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- إعداد اثنين من خليط البلازميد في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 ميكروغرام، مكافحة ناقلات الأمراض) مع pBabe-Neo (4 ميكروغرام) و(2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 ميكروغرام، مع التعبير عن GM-CSF) مع pBabe-Neo (4 ميكروغرام). تنفيذ العدوى باستخدام عدة العدوى بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
- إضافة متوسطة العدوى (1 مل) وكواشف العدوى (64 ميكرولتر) إلى كل أنبوب يحتوي على مخاليط البلازميد واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة خليط transfection إلى كل 10 سم أطباق من خلايا ES-D3. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعة.
- استبدل الأطباق المتوسطة في 10 سم بوسط ثقافي طازج (10 مل). حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- توليد مجموعات كبيرة من خلايا ES-D3 المصابة بشكل ثابت.
- إزالة الوسيطة من خلايا ES-D3 المصابة. غسل الخلايا مع تريبسين (2 مل؛ 0.05٪). إضافة تريبسين (2 مل) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وإضافة 2 مل من الثقافة الجديدة المتوسطة لتحييد التريبسين. جهاز طرد مركزي عند 390 x g لمدة 5 دقائق.
- إعادة إنفاق الخلايا المصابة في وسط الثقافة الطازجة (10 مل). تقييم كثافة الفلورية من GFP في الخلايا ES-D3 المصابة باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- نقل الخلايا المصابة إلى اثنين من أطباق 10 سم تحتوي على ثقافة جديدة المتوسطة (10 مل). إضافة النيوميسين (0.5 ملغ / مل) للقضاء على الخلايا غير المصابة.
- مواصلة زراعة الخلايا المصابة في وسط الثقافة التي تحتوي على النيوميسين (0.5 ملغم / مل). عندما يصل التقاء ES-D3 المصاب بالعدوى إلى 90٪، قم بنقل الخلايا إلى أطباق زراعة الأنسجة 15 سم مرة أخرى. كرر الإجراء لمدة أسبوعين.
- توليد استنساخ خلايا ES-D3 المصابة بشكل ثابت.
- بمجرد إنشاء مجموعات كبيرة من خلايا ES-D3 المصابة بشكل ثابت ، قم بجمع الخلايا كما كان من قبل. تحديد أرقام الخلايا باستخدام مقياس الدم. الطرد المركزي الخلايا في 390 × ز لمدة 5 دقائق. إعادة إنفاق الخلايا (1 × 107 خلايا / مل) في وسط الثقافة الطازجة.
- تصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر معقمة. تنقية GFP إيجابية ES-D3 الخلايا باستخدام FACS، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- لوحة واحدة فرزها ES-D3 الخلية في بئر واحد من الجيلاتين المغلفة (0.1٪) لوحة زراعة الأنسجة 96 جيدا التي تحتوي على الخلايا الأبوية ES-D3 (1 × 103)في المتوسط الخالي من النيوميسين (200 ميكرولتر). يضمن الاستزراع المشترك لخلايا ES-D3 المصابة مع نظيراتها الأبوية غير المصابة بقاء خلايا ES-D3 المفردة المصابة بشكل ثابت وتكاثرها كاستنساخ واحد.
- زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة، ومن ثم إضافة النيوميسين (0.5 ملغم/ مل) إلى لوحات 96 بئر للقضاء على الخلايا الأبوية غير المصابة ES-D3.
- استمر في زراعة خلايا ES-D3 الإيجابية من GFP في لوحات زراعة الأنسجة ذات 96 بئرا مع متوسط يحتوي على النيوميسين (0.5 ملغم / مل) لمدة أسبوع واحد. نقل خطوط الخلايا clonal ES-D3 إلى الجيلاتين المغلفة (0.1٪) 6 سم أطباق زراعة الأنسجة مع متوسطة الثقافة (5 مل) التي تحتوي على النيوميسين (0.5 ملغم / مل) لمدة أسبوع واحد.
- تحديد كثافة مضان GFP في كل من استنساخ الخلايا ES-D3 المصابة باستخدام FACS، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. حدد استنساخ ES-D3 الذي يعبر إما عن GM-CSF أو المتجه الفارغ ذو المستويات العالية من الفلورسينس الأخضر.
- تحديد كميات GM-CSF التي تفرزها خلايا ES-D3 باستخدام مجموعة مورين GM-CSF ELISA، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
4. عزل الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالإكسوسوم
- زراعة خلايا ES-D3 (1 × 107) في أطباق زراعة الأنسجة 15 سم لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية. جمع ثقافة الخلية supernatant. مخزن جمعت supernatant في 4 درجة مئوية تصل إلى 1 أسبوع للحفاظ على سلامة exosomal.
- الطرد المركزي خلية الثقافة supernatant في 5000 س ز لمدة 60 دقيقة في 4 درجة مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي لرواسب شظايا الخلايا الكبيرة.
- جمع supernatant والطرد المركزي في 100،000 س ز لمدة 90 دقيقة في 4 درجة مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي للغاية.
- أزل الناتنات الفائق. شطف بلطف كل بيليه مرتين مع المالحة العازلة الفوسفات (PBS; 1 مل) لإزالة الثقافة المتبقية supernatant.
- إعادة إنفاق كل بيليه في برنامج تلفزيوني. قياس المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم من خلال محتواها من البروتين5.
- قياس تركيز البروتين من المركبات الكهربائية المخصبة exosome مع حمض البيسينونيك (BCA) المقايسة. العائد المتوقع من المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم من خلايا ES-D3 هو ما يقرب من 4 ميكروغرام بروتين / مل من الخلايا التناسلية. Resuspend المركبات الكهربائية المخصبة exosome في برنامج تلفزيوني (تركيز البروتين: ~ 6 ميكروغرام / ميكرولتر). تخزين المركبات الكهربائية المخصب exosome في -80 درجة مئوية.
5. توصيف الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالنقال المجهري الإلكتروني
ملاحظة: التحقيق في تكوين وهيكل المركبات الكهربائية المخصبة exosome معزولة عن ESCs باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال (TEM)5.
- إصلاح المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم (3-5 ميكروغرام/ميكرولتر) بتركيز نهائي قدره 2٪ من بارافورمالديهايد درجة EM في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
- تحميل عينات ثابتة (10 ميكرولتر) على شبكات النحاس مع فيلم دعم الكربون. احتضان العينات مع شبكات النحاس لمدة 1 دقيقة، ومن ثم استنزاف الشبكات مع ورقة تصفية.
- وصمة عار الشبكات مع محلول تلطيخ بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
- نقل الشبكات إلى قطعة من ورق التصفية باستخدام ملاقط. السماح للشبكات لتجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- الحصول على صور المجهر الإلكتروني باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال (50،000x التكبير)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
6. تقييم الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالنثرى من قبل تحليل البقع الغربية
- إعداد مقتطفات الخلية بأكملها.
- إزالة المتوسطة من خلايا ES-D3 المستزرعة في أطباق 15 سم. غسل الخلايا مع تريبسين (5 مل؛ 0.05٪). إضافة تريبسين (5 مل) إلى الخلايا. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. جمع الخلايا وإضافة ثقافة جديدة المتوسطة (5 مل) لتحييد التريبسين. الطرد المركزي الخلايا في 390 × ز لمدة 5 دقائق. إعادة إنفاق الخلايا في برنامج تلفزيوني.
- تحديد أرقام الخلايا باستخدام مقياس الدم. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 390 × ز لمدة 5 دقائق. إعادة إنفاق الخلايا في المخزن المؤقت لتحميل SDS-PAGE الذي يحتوي على 0.5٪ SDS (5000 خلية/ميكرولتر).
- Sonicate عينات لمدة 10 ق باستخدام sonicator مع 10 ٪ السعة (القوة الكهربائية : 500 واط ؛ تردد بالموجات فوق الصوتية : 20 كيلوهرتز). سخني العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إعداد الليسات من المركبات الكهربائية المخصب exosome.
- إعادة إنفاق المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم في المخزن المؤقت للتحميل SDS-PAGE الذي يحتوي على 0.5٪ من SDS بتركيز 1.2 ميكروغرام/ميكرولتر.
- Sonicate عينات لمدة 10 ق باستخدام sonicator مع 10 ٪ السعة (القوة الكهربائية : 500 واط ؛ تردد بالموجات فوق الصوتية : 20 كيلوهرتز). سخني العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- الكشف عن البروتينات عن طريق وصمة عار الغربية.
- تحميل مستخلصات الخلايا الكاملة (10 ميكرولتر؛ 5000 خلية/ميكرولتر) وليسات EV المخصبة بالإكسوسوم (10 ميكرولتر؛ 1.2 ميكروغرام/ميكرولتر) في كل بئر من هلام Bis-Tris PAGE (4-20٪). نقل البروتينات إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدن (PVDF).
- احتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة. تمييع الأجسام المضادة (بتركيزات المشار إليها أدناه) في العازلة النشاف التي تحتوي على برنامج تلفزيوني، توين-20 (0.2٪)، والحليب الجاف غير الدهني (10٪ ث / الخامس).
- استخدم الأجسام المضادة الأولية التالية: مضادة للمرفقات V (200 نانوغرام/مل)، مضادة للCD81 (50 نانوغرام/مل)، مضادة فلوتيلين-1 (200 نانوغرام/مل)، مضاد للسيتوكروم ج (10 0 نانوغرام/مل)، والإيزوميراز المضاد للبروتين (200 نانوغرام/مل)، ومكافحة GAPDH (33 نانوغرام/مل)، ومكافحة أوكسفوس كوكس الرابع- الوحدة الفرعية الرابعة (600 نانوغرام/مل).
- استخدام الأجسام المضادة الثانوية التالية: الماعز المترافق مع الماعز المضادة للأرانب IgG (20 نانوغرام / مل) والماعز المترافق peroxidase المضادة للفأرة IgG (20 نانوغرام / مل).
- الكشف عن البروتينات باستخدام عدة الكشف عن chemiluminescence المحسنة.
7. تحديد تركيزات GM-CSF في الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالإكسوسوم بواسطة ELISA
ملاحظة: تقييم كميات GM-CSF في EVs المخصب exosome بواسطة ELISA باستخدام عدة ل murine GM-CSF، بعد بروتوكول الشركة المصنعة مع بعض التعديلات.
- معطف لوحة ELISA مع التقاط الأجسام المضادة. علاج المركبات الكهربائية المخصب exosome (0.6 ميكروغرام) في برنامج تلفزيوني وحده أو برنامج تلفزيوني + 0.05٪ توين-20 (100 ميكرولتر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. إضافة عينات المعالجة إلى لوحة ELISA المغلفة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. غسل لوحة مع برنامج تلفزيوني وحده أو برنامج تلفزيوني + 0.05٪ توين-20.
- إضافة الأجسام المضادة الكشف إلى العينات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. غسل لوحة مع برنامج تلفزيوني وحده أو برنامج تلفزيوني + 0.05٪ توين-20. إضافة Avidin-HRP إلى العينات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. غسل لوحة مع برنامج تلفزيوني وحده أو برنامج تلفزيوني + 0.05٪ توين-20.
- تحديد تركيزات GM-CSF في المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم عن طريق قياس الامتصاص عند 450 نانومتر على قارئ لوحة صغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم التعبير عن GM-CSF بشكل مفرط في ESCs مورين.
لتعبيرات جنرال موتورز-CSF بشكل مفرط في خلايا ES-D3، تم استنساخ مورين GM-CSF cDNA في ناقل العدوى لتوليد متجه التعبير pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(الشكل 1A). تم التعبير عن GM-CSF بشكل مفرط في خلايا ES-D3 عن طريق العدوى ، وكان حوالي 20٪ من خلايا ES-D3 المصابة بشكل عابر إيجابية GFP. وقد حصلت ال FACS على استنساخ الخلايا التي تزيد من التعبير بشكل ثابت GM-CSF أو مكافحة ناقلات فارغة. وكما هو مبين في الشكل 1باء،فإن كثافة مضان GFP لخط الخلية ES-D3 المعبر عن GM-CSF أو خط الخلية ES-D3 الذي يعبر عن المتجه الفارغ كانت أعلى بكثير من تلك الموجودة لدى نظرائهم الأبويين. تم إجراء فحص ELISA لتقييم تركيزات GM-CSF في ثقافة الخلية الفائقة لخطوط الخلايا المختلفة(الشكل 2). أنتجت خلايا ES-D3 التي تعبر عن GM-CSF مستويات أعلى بشكل ملحوظ من GM-CSF في زراعة الخلايا الفائقة من مكافحة ناقلاتها الفارغة. وعلاوة على ذلك، فإن كمية GM-CSF التي ولدتها GM-CSF-التعبير عن خلايا ES-D3 مماثلة لتلك التي من الخلايا الليفية STO التعبير عن GM-CSF، كما ذكرت سابقا19.
يتم إثراء الإكسوسومات في الحويصلات خارج الخلية المستمدة من ESCs مورين.
وجرى توسيع نطاق مكافحة النواقل وثقافات خلايا ES-D3 المعبرة عن ES-CSF، وتم جمع الخلايا المتسخة. تم عزل المركبات الكهربائية بعد عدة خطوات من الطرد المركزي. تم تقييم المركبات الكهربائية المفردة لأول مرة من قبل TEM (الشكل 3). كما هو مبين في الصور TEM، EVs معزولة تحتوي على الحويصلات من أحجام مختلفة، والتي لوحظت عادة في الاستعدادات exosomal5. الأهم من ذلك، كانت أقطار الحويصلات الفردية 30-100 نانومتر، بما يتفق مع التقارير السابقة التي تصف exosomes21. وعلاوة على ذلك، تم فحص وجود exosomes في المركبات الكهربائية من قبل النشاف الغربية (الشكل 4). تم تعزيز التعبير عن علامات اكسوسومال، بما في ذلك CD81، annexin V، وFlotillin-1، بشكل ملحوظ في المركبات الكهربائية المعزولة عن خلايا ES-D3 مقارنة مع مقتطفات الخلايا الكاملة المقابلة (WCE). الأهم من ذلك، لم يتم الكشف عن وجود علامات المقصورة دون الخلوية الأخرى في المركبات الكهربائية المشتقة من ES-D3، بما في ذلك (1) الرتيلاء الانبوبلازمية (ER) علامة البروتين ثاني كبريتيد ايسومراز (PDI)، (2) علامات الميتوكوندريا cytochrome ج وكوكس الرابع subunit IV، و (3) علامة السيتوكوليك GAPDH. بشكل عام، تظهر هذه البيانات أن الإكسوسومات كانت غنية للغاية في المركبات الكهربائية المشتقة من خلايا ES-D3.
يتم ترجمة GM-CSF داخل الحويصلات خارج الخلية المخصبة exosome معزولة عن ESCs.
لتحديد ما إذا كانت المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم تحتوي على جزيئات GM-CSF، تم إجراء فحص ELISA لتقييم مستويات GM-CSF في المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم المكتسبة من خلايا ES-D3 مع أو بدون تعبير GM-CSF(الشكل 5). لمزيد من التحقيق في توطين البروتين GM-CSF داخل المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم، تم كمية مستويات GM-CSF في المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم في ظل ظروف غسيل مختلفة من قبل ELISA. لهذا الغرض، تم استخدام المنظفات توين-20 (0.05٪) لأول مرة لتغلغل الأغشية الخارجية، وأجريت المقايسات ELISA في المخازن المؤقتة مع أو بدون 0.05٪ توين-20. نظرا لأن Tween-20 معروف بأنه يقلل من التفاعلات بين البروتين والبروتين ، فقد تم تقليل مستويات GM-CSF الخلفية التي تم اكتشافها في المركبات الكهربائية التحكم بشكل كبير بواسطة Tween-20 في مخزن الغسيل المؤقت. وعلى النقيض من ذلك، زادت مستويات المركبات الكهربائية للخلايا المعبرة عن الآلية العالمية -CSF زيادة كبيرة بمقدار توين-20. هذه النتائج تثبت أن Tween-20 الناجمة عن permeabilization الغشاء الخارجي يجعل جزيئات GM-CSF داخل الحويصلات في متناول التعرف على الأجسام المضادة، وتوفير الأدلة على أن غالبية جزيئات جنرال موتورز CSF الخارجية مترجمة داخل تجويف الحويصلات المعزولة.
الشكل 1: يتم التعبير عن EXOGENOUS GM-CSF بشكل مفرط في خلايا ES-D3.
(أ)الرسم التخطيطي للplasmid ل overexpressing مورين GM-CSF في خلايا ES-D3، الذي يدفع المروج EF1α التعبير GM-CSF وhrGFP بمثابة علامة التعبير.
(ب)تم تحديد كثافة الفلورية من GFP في GM-CSF التعبير عن خلايا ES-D3 أو نظرائهم مكافحة ناقلات فارغة من قبل FACS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تنتج خلايا ES-D3 التي تزيد من التعبير عن GM-CSF مستويات عالية من GM-CSF.
تم قياس تركيزات GM-CSF في وسط الخلايا المشار إليها بواسطة ELISA. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± الانحرافات المعيارية (متوسط ± SD) لثلاثة قياسات ELISA مستقلة: ** p < 0.001 ، NS = غير مهم ، ANOVA مع اختبار المقارنة المتعدد ل Tukey. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تفحص الحويصلات خارج الخلية المشتقة من ES-D3 عن طريق المجهر الإلكتروني الإرسال.
تم إعداد الحويصلات خارج الخلية من خلايا ES-D3 المصابة بplasmid التي تعبر عن GM-CSF أو نظيرتها ناقلات فارغة. تشير الأسهم الحويصلات الفردية. شريط المقياس = 100 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تتركز العلامات الإكسوسومية بدرجة عالية في الحويصلات خارج الخلية المعزولة عن خلايا ES-D3.
تم تقييم كميات العلامات للإكسوسومات والتشبيكوبلازمي (ER) والميتوكوندريا والسيتوسول في مقتطفات الخلايا الكاملة المشار إليها (WCE) وEVs عن طريق النشاف الغربي. PDI = ايزوميراز ثنائي كبريتيد البروتين. علامات الأوزان الجزيئية (kD) على اليسار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تقييم مستويات GM-CSF في الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالإكسوسوم.
تم تحديد مستويات GM-CSF في المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم المشار إليها في ظل ظروف ELISA مختلفة. تم المعالجة المسبقة للمركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم مع أو بدون 0.05٪ Tween-20. تم تنفيذ ELISA باستخدام العازلة الغسيل التي تحتوي على إما برنامج تلفزيوني فقط أو برنامج تلفزيوني + 0.05٪ توين-20. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± SD لثلاثة مقايسات ELISA مستقلة. *p < 0.05، **p < 0.005، ANOVA مع اختبار المقارنة المتعدد ل Tukey. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تظهر هذه الدراسة طريقة فعالة للغاية لإنتاج مركبات EVs الغنية بالإكسوسوم تحمل البروتين المحفز للمناعة GM-CSF ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الآثار التضمين المناعي للمركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم. تشير العديد من الدراسات إلى أن exosomes تظهر وظائف مناعية تنظيمية ومضادة للورم22. وهكذا، فإن الإكسوسومات من البلدان النامية التي تعبر عن الآلية العالمية- CSF قد تمتلك أيضا أنشطة بيولوجية تنظم الاستجابة المناعية. في هذا البروتوكول، تم التعبير عن مورين خارجي جنرال موتورز-CSF بشكل مفرط في خلايا مورين ES-D3 عن طريق العدوى(الشكل 1). والأهم من ذلك، تم الكشف عن كميات كبيرة من GM-CSF في المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم معزولة عن خلايا ES-D3 التي تزيد من التعبير عن GM-CSF (الشكل 5).
وتشير هذه البيانات إلى أن جميع مركبات الكربون الكلورية المحورة تقريبا موجودة داخل مركبات كهربائية غنية بالإكسوسوم. كما cytokine، يتم إفراز معظم البروتين GM-CSF خارج الخلية11. مثل غيرها من مواد الشحن الخارجية (على سبيل المثال، mRNAs، ميرناس، والبروتينات)، يتم تغليف جزيئات GM-CSF في السيتوسول في الحويصلات داخل الألومين (ILVs) من الهيئات متعددة المركبات (MVBs)6،23. عند دمج MVBs مع غشاء البلازما ، يتم إطلاق ILVs الحاملة GM-CSF في الفضاء خارج الخلية.
خطوة هامة في هذا البروتوكول هو التعبير بشكل فعال GM-CSF في خلايا مورين ES-D3(الشكل 2). فشلت الجهود السابقة لتحقيق هذا الهدف عن طريق العدوى العكسية إلى حد كبير ، على الأرجح بسبب قمع التعبير الجيني للفيروسات الرجعية على المستويات النسخية في ESCs24. من بين العديد من المروجين الفيروسيين والخلويين الذين تم فحصهم ، أظهر مروج EF1α البشري أقوى نشاط في خلايا ES-D3. والأهم من ذلك، ظل التعبير المتحول تحت سيطرة مروج EF1α مستقرا بعد زراعة الخلايا طويلة الأجل لخلايا ES-D3 المصابة. للتعبير عن الآلية العالمية الخارجية CSF في نوع آخر من الخلايا، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتقييم كفاءة مختلف المروجين. يمكن توسيع تطبيق هذه الطريقة لعزل المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم الحاملة لجنرال موتورز-CSF لتشمل أنواعا أخرى من الخلايا الجذعية بالإضافة إلى الخلايا السرطانية المهندسة للتعبير عن السيتوكينات المختلفة. مثل GM-CSF، يتم إفراز معظم السيتوكينات خارج الخلية25. ولذلك، فإن أحد القيود المحتملة لهذا النهج هو أن كمية السيتوكين المعطى المتراكمة في المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم منخفضة للغاية بحيث لا يمكن إظهار نشاطها البيولوجي. بالنسبة للسيتوكينات الخاصة، يجب إجراء دراسات جديدة لتحسين مستوى البروتين والنشاط البيولوجي في المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسوم.
العقبة الأكثر أهمية في هذه الدراسة هي توليد استنساخ ES-D3 المبالغة في التعبير GM-CSF. للحفاظ على حالة متعددة القدرات وتعزيز انتشار الخلايا في المختبر، يتم استزراع مورين ESCs بشكل عام في وجود خلايا التغذية26. وللحصول على إكسوسومات حصرا من مراكز خدمة المركبات، استخدم بروتوكول خال من الخلايا المغذية لثقافة ESCs27. في هذه الدراسة، تم استزراع خلايا ES-D3 في أطباق مغلفة بالجيلاتين باستخدام متوسطة مكملة ب LIF. وكانت كفاءة اللوحة وانتشار المستنسخات المفردة لخلايا ES-D3 في ظل هذه الحالة الثقافية منخفضة للغاية، مما يجعل من الصعب للغاية توليد استنساخ ES-D3 من خلايا واحدة. فشلت إضافة الوسيطة المشروطة التي تم الحصول عليها من خلايا ES-D3 الأبوية في إنقاذ نقص انتشار خلايا ES-D3 المفردة المطلية. للتغلب على هذا القيد، تم صفيحة خلايا ES-D3 المفردة التي تفرط في التعبير عن GM-CSF جنبا إلى جنب مع خلايا ES-D3 الأبوية. وقد حسن نهج الطلاء هذا من قدرة استنساخ ES-D3 المنفرد من جنرال موتورز - CSF على البقاء، مما سهل الانتشار والتوسيع التخفيين. مرة واحدة متحولة، استنساخ واحد ES-D3 تعلق على ما يبدو إلى لوحات زراعة الأنسجة. وتكاثرت بغض النظر عن وجود خلايا أخرى من ES-D3، حيث تم القضاء على خلايا ES-D3 الأبوية بعد 48 ساعة من صفيحها، مما سمح فقط لخلايا ES-D3 المفردة العابرة بالعدوى بالنمو.
وعموما، تم وضع بروتوكول لتوليد مركبات كهربائية غنية بالإكسوسوم تحمل مركبات جنرال موتورز -CSF من مراكز دعم التنفيذ مع إمكانية تحفيز الاستجابة المناعية في ظروف مرضية مختلفة. وعلاوة على ذلك، تظهر دراستنا التي نشرت مؤخرا أن المركبات الكهربائية المخصبة exosome-CSF الحاملة للجنس العالمي من ESCs يمكن أن تكون بمثابة لقاح وقائي خال من الخلايا ضد السرطان28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
قدمت كافيتا يادانايبودي وتشي لي وجون و. إيتون طلب براءة اختراع أمريكي "مؤلفات تتألف من إكسوسومات هندسية مشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية وطرق استخدامها".
Acknowledgments
ونحن ممتنون للسيد Arkadiusz Slusarczyk وكنتاكي شبكة البنية التحتية للبحوث الطبية الحيوية (KBRIN، P20GM103436) للحصول على انتقال صور المجهر الإلكتروني. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المنح المقدمة من NIH AA018016-01 (J.W.E.) والصندوق الاستئماني لتحدي أبحاث كومنولث كنتاكي (J.W.E.) وNIS CA106599 وCA175003 (C.L.) وNIS CA198249 (K.Y.) ومنحة أبحاث التنفس المجانية (K.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G.
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
