Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

בידוד של שלשלות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום הנושאות גרנולוציט-מקרופאג' גורם מעורר מושבה מתאי גזע עובריים

Published: November 11, 2021 doi: 10.3791/60170
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 2, 1,2,3, 1,2,3, 4,5,6
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 2Experimental Therapeutics Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 3Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Surgery, University of Louisville, 5Immuno-Oncology Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 6Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

Summary

מחקר זה מתאר שיטה לבודד שלשולים חוץ-תאיים מועשרים אקסוזום הנושאים גורמים מעוררי גרנולוציטים מקרופטים למושבה מגרה את המעי הגס מתאי גזע עובריים.

Abstract

תאי גזע עובריים (ESCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים המסוגלים להתחדשות עצמית ובידול לכל סוגי התאים העובריים. כמו סוגי תאים רבים אחרים, ESCs משחררים שלטי ממברנה קטנים, כגון אקסוזומים, לסביבה חוץ-תאית. אקסוזומים משמשים כמתווכים חיוניים של תקשורת בין-תאית וממלאים תפקיד בסיסי בתהליכים פיזיולוגיים רבים (פתולוגיים). גורם גרנולוצייט-מקרופאג' מגרה מושבה (GM-CSF) מתפקד כציטוקין כדי לווסת את התגובה החיסונית. לנוכחות של GM-CSF באקסוזומים יש פוטנציאל להגביר את תפקוד מערכת החיסון-רגולציה שלהם. כאן, GM-CSF היה ביציבות יתר על המידה בקו תא ESC מורין ES-D3. פותח פרוטוקול לבידוד שלשלשות חוץ-תאיות (EV) מועשרות אקסוזום באיכות גבוהה מתאי ES-D3 המבישים יתר על המידה GM-CSF. רכבים אלקטרוניים מבודדים מועשרים אקסוזום התאפיינו במגוון גישות ניסיוניות. חשוב לציין, כמויות משמעותיות של GM-CSF נמצאו נוכחים ב- EVs מועשר אקסוזום. באופן כללי, EVs מועשר אקסוזום נושא GM-CSF מ- ESCs עשוי לתפקד כשלישיות ללא תאים כדי להפעיל את פעילותם החיסון-רגולטורית.

Introduction

ESCs נגזרים מהשלב הפיצוץ של עובר ההשתלה מראש1. כתאי גזע פלוריפוטנטים, ל- ESCs יש את היכולת לחדש את עצמם ולהבדיל לכל סוג של תא עוברי. בשל הפוטנציאל ההתפתחותי המדהים שלהם ויכולת שגשוג לטווח ארוך, ESCs הם בעלי ערך רב למחקר ביו-רפואי1. מאמצי המחקר הנוכחי התמקדו במידה רבה בפוטנציאל הטיפולי של ESCs למגוון הפרעות פתולוגיות עיקריות, כולל סוכרת, מחלות לב ומחלות ניווניות2,3,4.

תאי יונקים, כולל ESCs, ידועים לשחרר שלל עם גדלים משתנים לסביבה חוץ תאית, ורכבים אלקטרוניים אלה יש פונקציות פיזיולוגיות ופתולוגיות רבות בשל תפקידם בתקשורת בין תאית5. בין תת-סוגים שונים של רכבים חללית, אקסוזומים הם שלל ממברנה קטן המשתחרר מסוגי תאים שונים לחלל החוץ-תאי עם היתוך של תאים אנדוציטיים ביניים, גופים רב-לשוניים (MVB), עם קרום הפלזמה6. Exosomes דווחו לתווך תקשורת בין תאית והם מעורבים באופן קריטי בתהליכים פיזיולוגיים רבים (פאתוס)7,8. אקסוזומים יורשים כמה פונקציות ביולוגיות מתאי ההורים שלהם, כי אקסוזומים מכילים חומרים ביולוגיים שנרכשו מהציטוסול, כולל חלבונים וחומצות גרעין. לכן, האנטיגנים הקשורים או גורמים הממריצים את התגובה החיסונית הספציפית למחלה נתונה הם עטופים exosomes מסוגים מסוימים של תאים9. זה סלל את הדרך לניסויים קליניים לחקור אקסוזומים שמקורם בגידולים כחיסון נגד סרטן10.

GM-CSF הוא ציטוקינים המופרשים על ידי סוגים שונים של תאי מערכת החיסון11. ראיות המתעוררות ממחישות כי GM-CSF מפעיל ומווסת את המערכת החיסונית וממלא תפקיד חיוני בתהליך האנטיגן-הצגה12. לדוגמה, דו"ח קליני מציע כי GM-CSF מגרה את התגובה החיסונית לגידולים כאדג'ובנטחיסון 13. מספר אסטרטגיות אימונותרפיה לסרטן מבוסס GM-CSF כדי לנצל את הפעילות החיסונית החזקה של GM-CSF נחקרו בניסויים קליניים14. בין אלה, חיסון לסרטן המורכב מתאי גידול מפרישים GM-CSF מוקרן הראה הבטחה מסוימת בחולי מלנומה מתקדמים על ידי גרימת תגובות אנטיטומור תאיות והומוריסטיות ונמק לאחר מכן בגידולים גרורתיים15.

מכיוון שהאקסוזומים הנגזרים מ- ESCs הם בעלי פעילויות ביולוגיות דומות לזו של ESCs המקוריים, אולי אקסוזומים נושאי GM-CSF מ- ESCs יכולים לתפקד כשלשלות ללא תאים כדי לווסת את התגובה החיסונית. במאמר זה, מתוארת שיטה מפורטת לייצור EVs מועשר אקסוזום באיכות גבוהה מ- ESCs המבטאים GM-CSF. ל-EVs המועשרים באקסוזום יש פוטנציאל לשמש כשלפוחיות רגולטוריות של מערכת החיסון כדי לווסת את התגובה החיסונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פולחן תאי ES-D3

  1. כדי ליצור סרום בקר עוברי נטול אקסוזומים (FBS), טען FBS לתוך אולטרה צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 16 שעות ב 4 °C (7 ).C. לאחר צנטריפוגה, לאסוף סרום supernatant כמו FBS ללא exosome ללא exosome עבור culturing קו תא ESC מורין ES-D3 ורכישת EVs מועשר exosome.
  2. לפני ציפוי תאי ES-D3, יש לצפות 15 ס"מ בתרבית הרקמות באמצעות ג'לטין (0.1%) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  3. בעקבות פרוטוקול16שתואר בעבר , תרבית תאי ES-D3 ללא תאי שכבת מאכילים במנות תרבית רקמות מצופות ג'לטין 15 ס"מ. המדיום תרבית התא ES-D3 מורכב DMEM, FBS ללא אקסוזום (15%), חומצות אמינו לא חיוניות (0.1 מ"מ), L-גלוטמין (2 מ"מ), β-mercaptoethanol (0.1 mM), פניצילין (50 יחידות/ מ"ל), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם /מ"ל) ומקדם מעכב לוקמיה (LIF; 100 יחידות /מ"ל). תאי ES-D3 תרבית ב 37 °C בחממה לחה5% CO 2.
  4. ברגע שתאי ES-D3 מגיעים למפגש של כ-90% במנות תרבית רקמות של 15 ס"מ, הסירו את המדיום בשאיפה. לשטוף את התאים באמצעות טריפסין (5 מ"ל; 0.05%). מוסיפים טריפסין (5 מ"ל) לכלים ודגרה ב 37 °C (5 דקות). לאסוף את התאים מן הכלים.
  5. הוסף בינוני תרבית טרי (5 מ"ל) לתאים שנאספו כדי לנטרל את הטריפסין. צנטריפוגות התאים ב 390 x g במשך 5 דקות. resuspend התאים במדיום טרי ולקבוע את מספר התא באמצעות hemocytometer.
  6. עבור תאים עוברים, צלחת את תאי ES-D3 (5 x 106) בציפוי ג'לטין (0.1%) 15 ס"מ צלחת תרבית רקמות עם בינוני טרי (15 מ"ל) ותרבית במשך 3 ימים לפני תת התרבות של התאים.
  7. כדי לאסוף את תרבית התאים supernatant לבידוד של EVs מועשר exosome, צלחת את תאי ES-D3 (1 x 107) בציפוי ג'לטין (0.1%) 15 ס"מ צלחת תרבית רקמות עם בינוני טרי (15 מ"ל) במשך 3 ימים לפני איסוף גזע תאי.

2. יצירת ביטוי GM-CSF פלסמיד

הערה: צור את הפלסמיד pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP כדי להדגיש יתר על המידה GM-CSF בתאי ES-D3. ב plasmid זה, ביטוי של ממורמור GM-CSF cDNA יחד עם חלבון הסמן אנושי רנילאם GFP (hrGFP) מונע על ידי גורם התארכות שרשרת הפוליפפטיד האנושי 1α (EF1α) מקדם17,18.

  1. צור את עמוד השדרה הווקטורי.
    1. לעכל את plasmid pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 מיקרוגרם של DNA) באמצעות אנזים ההגבלה EcoRI (100 יחידות) ב 37 °C עבור 2 שעות כדי ליצור שני שברי DNA: עמוד השדרה הווקטורי (6.0 kb) ו FD3ER להוסיף (2.5 kb).
    2. העבר 50% של DNA plasmid מעוכל (10 מיקרוגרם) לתוך צינור microcentrifuge אחד 1.5 מ"ל ולטפל עם פוספטאז אלקליין (20 יחידות) ב 37 °C (1 שעה). פתור הן DNA לא מטופל והן dephosphorylated באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז (2%).
    3. לטהר את שברי DNA עמוד השדרה וקטור (6.0 kb) באמצעות ערכת חילוץ ג'ל DNA . בעוד עמוד השדרה הווקטורי שלא טופל ישמש כווקטור הריק (pEF1α-IRES-hrGFP), עמוד השדרה הווקטורי של dephosphorylated ישמש ליצירת פלסמיד ביטוי GM-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
  2. צור את הוספת CDNA של GM-CSF.
    1. לעכל את pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 מיקרוגרם) באמצעות אנזים ההגבלה EcoRI (100 יחידות) ב 37 °C עבור 2 °C כדי לייצר שני שברי DNA: עמוד השדרה הווקטורי (6.5 kb) ואת ההוספה GM-CSF cDNA ממורמור (474 bp).
    2. פתור את הדנ"א המעוכל באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (2%). טהרו את שבר ה-CDNA של ה-GM-CSF (474 bp) באמצעות ערכת מיצוי ג'ל דנ"א.
  3. צור את הביטוי plasmids.
    1. הגדר 2 תגובות קשירה (נפח כולל של 10 μL) באמצעות ערכת קשירת DNA.
      1. כדי ליצור את הווקטור הריק pEF1α-IRES-hrGFP, ליהט את עמוד השדרה הווקטורי הלא מטופל בשלב 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng).
      2. כדי ליצור pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ליתג את שברי הדנ"א הבאים: (1) עמוד השדרה הווקטורי dephosphorylated ממשלב 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) ו - (2) שבר mGM-CSF cDNA שנוצר בשלב 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
    2. ליגייט ב 25 °C (5 דקות). להפוך DNA קשירה לתאי E. coli מוכשרים DH5α. צלחת תאי E. coli המרה על לוחות LB-אגר המכיל קרבניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל).
    3. לטהר plasmids ממושבות אי קולי יחיד באמצעות ערכת בידוד DNA. לאמת את הזהויות של plasmids על ידי ריצוף DNA.

3. יצירת תאי ES-D3 המבטאים יתר על המידה GM-CSF

הערה: להעביר את תאי ES-D3 עם pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP כדי להדגיש יתר על המידה GM-CS. Cotransfect את pBabe-Neo plasmid לתוך תאי ES-D3 כדי להקל על הבחירה של תאים שהודבקו ביציבות18,20.

  1. מעבירים את הפלסמידים לתאי ES-D3.
    1. צלחת תאי ES-D3 (1.4 x 106) בציפוי ג'לטין (0.1%) 10 ס"מ תרבות רקמות צלחת עם בינוני תרבית (10 מ"ל) עבור transfection. תאי ES-D3 מצופים תרבות ב 37 °C (7 °F) עבור 24 שעות.
    2. הכן שתי תערובות plasmid ב 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 מיקרוגרם, בקרה וקטורית) עם pBabe-Neo (4 מיקרוגרם) ו -(2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 מיקרוגרם, מבטא GM-CSF) עם pBabe-Neo (4 מיקרוגרם). בצע טרנספקטציה באמצעות ערכת טרנספקטו בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    3. הוסף בינוני transfection (1 מ"ל) ריאגנט transfection (64 μL) לכל צינור המכיל את תערובות plasmid ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    4. מוסיפים את תערובות טרנספקטיון למנות 10 ס"מ בהתאמה של תאי ES-D3. דגירה ב 37 °C (5 °F) במשך 5 שעות.
    5. החליפו את המדיום במנות 10 ס"מ עם בינוני תרבות טרי (10 מ"ל). דגירה ב 37 °C (55 °F) עבור 24 שעות.
  2. ליצור אוכלוסיות בתפזורת של תאי ES-D3 שהודבקו ביציבות.
    1. הסר את המדיום מתאי ES-D3 שהודבקו. לשטוף את התאים עם טריפסין (2 מ"ל; 0.05%). מוסיפים טריפסין (2 מ"ל) ודגרה ב 37 °C (5 דקות). להעביר את התאים לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום תרבות טרי לנטרל טריפסין. צנטריפוגה ב 390 x g במשך 5 דקות.
    2. resuspend התאים transfected במדיום תרבית טרי (10 מ"ל). להעריך את עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP בתאי ES-D3 שהודבקו באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS), בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    3. מעבירים את התאים המודבקים לשתי מנות 10 ס"מ המכילות מדיום תרבות טרי (10 מ"ל). הוסף neomycin (0.5 מ"ג / מ"ל) כדי לחסל תאים לא נגועים.
    4. המשך פולחן התאים transfected במדיום תרבית המכיל neomycin (0.5 מ"ג / מ"ל). כאשר ES-D3 transfected להגיע 90% השפעה, להעביר תאים 15 ס"מ תרבית רקמות מנות שוב. חזור על ההליך במשך שבועיים.
  3. צור שיבוטים של תאי ES-D3 שהודבקו ביציבות.
    1. לאחר נוצרים אוכלוסיות בתפזורת של תאי ES-D3 שהודבקו ביציבות, אסוף את התאים כבעבר. לקבוע את מספרי התאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגות התאים ב 390 x g במשך 5 דקות. resuspend התאים (1 x 107 תאים / מ"ל) במדיום תרבית טרי.
    2. לסנן את התאים באמצעות מסננת תאים סטרילית 40 מיקרומטר. טהר תאי ES-D3 חיוביים GFP באמצעות FACS, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    3. צלחת תא ES-D3 ממוין יחיד לתוך באר אחת של מצופה ג'לטין (0.1%) 96-well צלחת תרבית רקמות המכיל תאי ES-D3 הורים (1 x 103) במדיום ללא neomycin (200 μL). שיתוף פולחן תאי ES-D3 transfected עם עמיתיהם ההורים untransfected מבטיח כי תאי ES-D3 בודדים ייצוב לשרוד ולהתרבות כשיבוט יחיד.
    4. תרבית התאים עבור 48 שעות, ולאחר מכן להוסיף neomycin (0.5 מ"ג / מ"ל) כדי 96-טוב לוחות כדי לחסל תאי ES-D3 הורים לא נגועים.
    5. המשך פולחן תאי ES-D3 חיובי GFP בלוחות תרבית רקמות 96-well עם ניומיצין המכיל בינוני (0.5 מ"ג / מ"ל) במשך שבוע אחד. העבר קווי תאי ES-D3 ציפורן לציפוי ג'לטין (0.1%) 6 ס"מ תרבית רקמות מנות עם בינוני תרבות (5 מ"ל) המכיל neomycin (0.5 מ"ג / מ"ל) במשך שבוע אחד.
    6. קבע את עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP בכל אחד משיבוטי תאי ES-D3 שהודבקו באמצעות FACS, בהתאם לפרוטוקול היצרן. בחר את שיבוטי ES-D3 המבטאים GM-CSF או את הווקטור הריק עם רמות גבוהות של פלואורסצנטיות ירוקה.
    7. קבע את כמויות GM-CSF המופרשות על-ידי תאי ES-D3 באמצעות ערכת GM-CSF ELISA מורינה, בהתאם לפרוטוקול היצרן.

4. בידוד של שלשלות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום

  1. תרבית תאי ES-D3 (1 x 107) ב 15 ס"מ תרבית רקמות מנות עבור 72 שעות ב 37 °C (50 °F). לאסוף את תרבות התא supernatant. חנות נאספה supernatant ב 4 °C (5 °F) עד שבוע אחד כדי לשמור על שלמות exosomal.
  2. צנטריפוגה את תרבית התא supernatant ב 5,000 x g במשך 60 דקות ב 4 °C (70 °F) באמצעות צנטריפוגה כדי משקעים שברי תאים גדולים.
  3. לאסוף את supernatant וצנטריפוגה ב 100,000 x g במשך 90 דקות ב 4 °C (60 °F) באמצעות אולטרה צנטריפוגה.
  4. הסר את סופר-טבעי. יש לשטוף בעדינות כל גלולה פעמיים עם תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS; 1 מ"ל) כדי להסיר את שאריות התרבות העל-טבעית.
  5. יש לתתכוד מחדש כל גלולה ב-PBS. לכמת EVs מועשר אקסוזום על ידי תכולת החלבון שלהם5.
    1. מדדו את ריכוז החלבון של EVs מועשר אקסוזום עם חומצה בינצ'ונינית (BCA). התשואה הצפויה של EVs מועשר אקסוזום מתאי ES-D3 הוא כ 4 מיקרוגרם חלבון / מ"ל של גזע תאי. יש להזרים מחדש את ה-EVs המועשרים ב-PBS (ריכוז חלבונים: ~6 מיקרוגרם/מיקרו-אל). יש לאחסן את ה-EVs המועשרים ב-80 מעלות צלזיוס.

5. אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

הערה: לחקור את ההרכב ואת המבנה של EVs מועשר exosome מבודדים ESCs באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM)5.

  1. תקן את EVs מועשר exosome (3-5 מיקרוגרם / μL) עם ריכוז סופי של 2% פרפורמלדהיד כיתה EM בטמפרטורת החדר עבור 2 שעות.
  2. טען דגימות קבועות (10 μL) על רשתות נחושת עם סרט תמיכה בפחמן. לדגור את הדגימות עם רשתות נחושת במשך 1 דקות, ולאחר מכן לנקז את הרשתות עם נייר מסנן.
  3. הכתימו את הרשתות בפתרון מכתים בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  4. העבר את הרשתות לפיסת נייר סינון באמצעות פינצטה. אפשר לרשתות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  5. לרכוש תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (הגדלה של פי 50,000), בהתאם לפרוטוקול היצרן.

6. הערכה של שלפוחיות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום על ידי ניתוח כתם מערבי

  1. הכן תמציות תאים שלמים.
    1. הסר את המדיום מתאי ES-D3 בתרבית מנות 15 ס"מ. לשטוף את התאים עם טריפסין (5 מ"ל; 0.05%). הוסף טריפסין (5 מ"ל) לתאים. דגירה ב 37 °C (5 דקות). לאסוף את התאים ולהוסיף מדיום תרבית טרי (5 מ"ל) כדי לנטרל טריפסין. צנטריפוגות התאים ב 390 x g במשך 5 דקות. תקיף מחדש את התאים ב-PBS.
    2. לקבוע מספרי תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגות התאים שוב ב 390 x גרם במשך 5 דקות. תגדיל מחדש את התאים במאגר הטעינה SDS-PAGE המכיל 0.5% SDS (5,000 תאים/μL).
    3. Sonicate הדגימות עבור 10 s באמצעות sonicator עם 10% משרעת (וואט: 500 W; תדר קולי: 20 kHz). מחממים את הדגימות ב 100 °C (5 דקות).
  2. הכן את הריסטים של EVs מועשר אקסוזום.
    1. תמזגו מחדש את ה-EVs המועשרים ב-SDS-PAGE המכילים 0.5% SDS בריכוז של 1.2 מיקרוגרם/מיקרו-לן.
    2. Sonicate הדגימות עבור 10 s באמצעות sonicator עם 10% משרעת (וואט: 500 W; תדר קולי: 20 kHz). מחממים את הדגימות ב 100 °C (5 דקות).
  3. לזהות חלבונים על ידי כתם מערבי.
    1. טען תמציות תאים שלמים (10 μL; 5,000 תאים / μL) ו LYSates EV מועשר אקסוזום (10 μL; 1.2 מיקרוגרם / μL) לתוך כל באר של ג'ל ביס-טריס PAGE (4-20%). העבר חלבונים על ממברנות פלואוריד פוליווינילידן (PVDF).
    2. ממברנות דגירה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים מתאימים. לדלל נוגדנים (בריכוזים המצוינים להלן) במאגר סופג המכיל PBS, Tween-20 (0.2%), וחלב יבש דל שומן (10% w/v).
      1. השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: אנטי-נספח V (200 ננוגרם/מ"ל), אנטי-CD81 (50 ננוגרם/מ"ל), אנטי-פלוטילין-1 (200 ננוגרם/מ"ל), אנטי-ציטוכרום c (100 ננוגרם/מ"ל), איזומראז אנטי-חלבון (200 ננוגרם/מ"ל), אנטי-GAPDH (33 ננוגרם/מ"ל) ונגד אוקספוס COX IV-subunit IV (600 ננוגרם/מ"ל).
      2. השתמש בנוגדנים המשניים הבאים: עיזים נגד ארנבות (20 ננוגרם/מ"ל) ו-Peroxidase-מצומדים נגד עכבר IgG (20 ננוגרם/מ"ל).
    3. זהה חלבונים באמצעות ערכת זיהוי כימותרפיה משופרת.

7. קביעת ריכוזי GM-CSF בשלל חוץ-תאי מועשר אקסוזום על ידי ELISA

הערה: להעריך את כמויות GM-CSF ברכבים חשמליים מועשרים exosome על ידי ELISA באמצעות ערכה עבור GM-CSF murine, בעקבות פרוטוקול היצרן עם כמה שינויים.

  1. מצפים את צלחת ELISA בנוגדן לכידה. טפלו בריו-מים אלקטרוניים מועשרים אקסוזום (0.6 מיקרוגרם) ב-PBS בלבד או PBS + 0.05% טווין-20 (100 μL) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. מוסיפים דגימות מטופלות לצלחת ELISA מצופה ודגר בטמפרטורת החדר למשך שעה. לשטוף את הצלחת עם PBS לבד או PBS + 0.05% Tween-20.
  2. הוסף נוגדן זיהוי לדגימות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לשטוף את הצלחת עם PBS לבד או PBS + 0.05% Tween-20. הוסף אבידין-HRP לדגימות. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לשטוף את הצלחת עם PBS לבד או PBS + 0.05% Tween-20.
  3. קבע את הריכוזים של GM-CSF ברכבים הפעלה אלקטרוניים מועשרים אקסוזום על ידי מדידת הספיגה ב 450 ננומטר על קורא מיקרו-לוחית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GM-CSF הוא יתר על המידה ב ESCs מורין.
כדי להמחיש יתר על המידה GM-CSF בתאי ES-D3, ממורין GM-CSF cDNA שוכפל לווקטור טרנספקטציה כדי ליצור את וקטור הביטוי pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (איור 1A). GM-CSF התבטא יתר על המידה בתאי ES-D3 על ידי טרנספקטציה, וכ -20% מתאי ES-D3 שהודבקו באופן חולף היו חיוביים ל- GFP. שיבוטי תאים המדחיקים יתר על המידה GM-CSF או הפקד הווקטורי הריק נרכשו על ידי FACS. כפי שמוצג באיור 1B, עוצמת הפלואורסצנטיות של GM-CSF המבטאת ES-D3 או קו תא ES-D3 המבטאים את הווקטור הריק הייתה גבוהה בהרבה מזו של עמיתיהם ההורים. בוצעה הערכת מצב של ELISA כדי להעריך את ריכוזי ה-GM-CSF בתרבית התאים של קווי תאים שונים(איור 2). תאי ES-D3 המבטאים GM-CSF יצרו רמות גבוהות משמעותית של GM-CSF בתרבית התאים סופר-לאומית מאשר השליטה הווקטורית הריקה שלהם. יתר על כן, כמות GM-CSF שנוצר על ידי GM-CSF מבטא ES-D3 תאים היה דומה לזה של פיברובלסטים STO מבטאים GM-CSF, כפי שדווח בעבר19.

אקסוזומים מועשרים בשלל חוץ-תאי שמקורו ב-ESCs מורינים.
שליטה וקטורית ותרביות תאי ES-D3 המבטאות GM-CSF הורחבו, ונאספו סופרנטאנט של תרבית התאים. EVs היו מבודדים לאחר מספר צעדים של צנטריפוגה. EVs יחיד הוערך לראשונה על ידי TEM (איור 3). כפי שמוצג בתמונות TEM, EVs מבודד הכיל שלל בגדלים שונים, אשר נצפתה בדרך כלל בהכנות exosomal5. חשוב לציין, הקטרים של שלל בודדים היו 30-100 ננומטר, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים המתארים exosomes21. יתר על כן, נוכחותם של אקסוזומים ברכבים נטויים נבחנה על ידי סופגות מערביות(איור 4). הביטוי של סמנים exosomal, כולל CD81, annexin V, ו Flotillin-1, היה משופר באופן משמעותי ב- EVs מבודד מתאי ES-D3 לעומת תמציות תאים שלמים תואמים (WCE). חשוב לציין, נוכחותם של סמני תאים תת-תאיים אחרים ב- ES-D3 נגזר EVs לא זוהתה, כולל (1) סמן רטיקולום אנדופלסמי (ER) חלבון דיסולפיד איזומראז (PDI), (2) סמנים מיטוכונדריאליים cytochrome c ו- COX IV-subunit IV, ו - (3) הסמן הציטוטוסולי GAPDH. בסך הכל, נתונים אלה מראים כי exosomes היו מועשרים מאוד ב- EVs נגזר מתאי ES-D3.

GM-CSF הוא מקומי בתוך שלל חוץ-תאי מועשר אקסוזום מבודד ESCs.
כדי לקבוע אם EVs מועשר exosome מכילים מולקולות GM-CSF, ELISA assay נערך כדי להעריך את רמות GM-CSF ב EVs מועשר exosome שנרכשו מתאי ES-D3 עם או בלי ביטוי GM-CSF (איור 5). כדי לחקור עוד יותר את לוקליזציה של חלבון GM-CSF בתוך כלי עבודה אלקטרוניים מועשרים אקסוזום, רמות GM-CSF היו כמותית ברכבים 000 מועשרים exosome בתנאי כביסה שונים על ידי ELISA. לשם כך, חומר הניקוי Tween-20 (0.05%) הועסק לראשונה כדי לחלחל לממברנות exosomal, ו ASSAYS ELISA בוצעו במאגרים עם או בלי 0.05% Tween-20. מכיוון שידוע ש-Tween-20 מפחיתה את האינטראקציות בין חלבון לחלבון, רמות ה-GM-CSF ברקע שזוהו ברכבים האלקטרוניים של הבקרה צומצמו באופן משמעותי על ידי Tween-20 במאגר הכביסה. לעומת זאת, רמות GM-CSF ברכבים האלקטרוניים של תאים המבטאים GM-CSF גדלו באופן משמעותי על ידי Tween-20. תוצאות אלה מראות כי פרמוזציות קרום exosomal המושרה Tween-20-induced הופך מולקולות GM-CSF בתוך שלל נגיש לזיהוי נוגדנים, מתן ראיות כי רוב מולקולות GM-CSF exosomal הם מקומיים בתוך לומן של שלל מבודד.

Figure 1
איור 1: GM-CSF אקסוגני מתבטא ביציבות יתר בתאי ES-D3.
(A)הדיאגרמה הסכמטית של הפלסמיד עבור ביטוי יתר של GM-CSF בתאי ES-D3, שבה מקדם EF1α מניע ביטוי GM-CSF ו- hrGFP משמש כסמן ביטוי.
(B)עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP בתאי ES-D3 המבטאים GM-CSF או עמיתיהם לבקרה וקטורית ריקה נקבעה על ידי FACS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תאי ES-D3 המדחיקים יתר על המידה GM-CSF מייצרים רמות גבוהות של GM-CSF.
ריכוזי GM-CSF במדיום של התאים שצוינו נמדדו על ידי ELISA. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיות תקן (ממוצע ± SD) של שלוש מדידות ELISA עצמאיות: **p < 0.001, NS = לא משמעותי, ANOVA עם מבחן ההשוואה המרובה של Tukey. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שלשלות חוץ-תאיות שמקורן ב-ES-D3 נבדקות על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור.
שלל חוץ-תאי הוכנו מתאי ES-D3 שהודבקו עם הפלסמיד המבטא את GM-CSF או את מקבילו הווקטורי הריק. החצים מציינים שלל בודד. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: סמנים אקסוסומאליים מרוכזים מאוד של שלשלשות חוץ-תאיות המבודדות מתאי ES-D3.
כמויות הסמנים עבור exosomes, רטיקולום אנדופלסמי (ER), מיטוכונדריה, וציטוסול בתמציות התא כולו המצוין (WCE) ו- EVs הוערכו על ידי סופג מערבי. PDI = איזומראז דיסולפיד חלבון. סמני משקולות מולקולריות (kD) נמצאים בצד שמאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הערכת רמות GM-CSF בשלל חוץ-תאי מועשר אקסוזום.
רמות GM-CSF ב- EVs המועשר אקסוזום שצוין נקבעו בתנאי ELISA שונים. EVs מועשר Exosome טופלו מראש עם או בלי 0.05% Tween-20. ELISA בוצע באמצעות מאגר כביסה המכיל PBS בלבד או PBS + 0.05% Tween-20. הנתונים מוצגים כ-SD ± הממוצע של שלושה בדיקות ELISA עצמאיות. *p < 0.05, **p < 0.005, ANOVA עם מבחן ההשוואה המרובה של טוקי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר זה מראה שיטה יעילה ביותר לייצור EVs מועשר אקסוזום הנושא את חלבון גירוי מערכת החיסון GM-CSF, אשר ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את ההשפעות המווסתות של מערכות הפעלה חשמליות מועשרות אקסוזום. מספר מחקרים מראים כי exosomes להפגין פונקציות חיסונית-רגולטורית ואנטי הגידול22. לפיכך, אקסוזומים מ- ESCs המבטאים GM-CSF עשויים גם הם להיות בעלי פעילויות ביולוגיות המווסתות את התגובה החיסונית. בפרוטוקול זה, מורק exogenous GM-CSF היה ביציבות overexexed בתאי ES-D3 מורין על ידי transfection (איור 1). חשוב לציין, כמויות משמעותיות של GM-CSF זוהו ב- EVs מועשר אקסוזום מבודד מתאי ES-D3 המדחיקים יתר על המידה GM-CSF (איור 5).

נתונים אלה מצביעים על כך שכמעט כל GM-CSF שוכן בתוך EVs מועשר exosome. כציטוקינים, רוב חלבון GM-CSF מופרש באופן חוץ תאי11. כמו חומר מטען אקסוסומלי אחר (למשל, mRNAs, miRNAs וחלבונים), מולקולות GM-CSF בציטוסול עטוף של שלשולים תוך-אלומינליים (ILVs) של גופים רב-לשוניים (MVBs)6,23. עם היתוך MVB עם קרום הפלזמה, ILVs נושא GM-CSF משתחררים לחלל החוץ תאי.

צעד חשוב בפרוטוקול זה הוא להגזים ביעילות ב-GM-CSF בתאי ES-D3 מורינים(איור 2). מאמצים קודמים להשיג מטרה זו על ידי זיהום רטרו-ויראלי נכשלו במידה רבה, ככל הנראה בגלל דיכוי ביטוי גנים רטרו-ויראלי ברמות התמלול ב- ESCs24. בין מספר מקדמים ויראליים ותאיים שנבדקו, מקדם EF1α האנושי הראה את הפעילות החזקה ביותר בתאי ES-D3. חשוב לציין, ביטוי טרנסג'ן בשליטת מקדם EF1α נשאר יציב בעקבות תרבית תאים ארוכת טווח של תאי ES-D3 שהודבקו. כדי לבטא GM-CSF אקסוגני בסוג תא אחר, דרושים מחקרים נוספים כדי להעריך את היעילות של מקדמים שונים. היישום של שיטה זו כדי לבודד GM-CSF נושאת exosome מועשר EVs ניתן להרחיב לסוגי תאי גזע אחרים, כמו גם תאים סרטניים מהונדס לבטא ציטוקינים שונים. כמו GM-CSF, רוב הציטוקינים מופרשים באופן חוץ-תאי25. לכן, מגבלה אפשרית של גישה זו היא שכמות הציטוקינים הנתונה שנצבר ב- EVs מועשר אקסוזום נמוכה מכדי להפגין את פעילותה הביולוגית. עבור ציטוקינים מסוימים, מחקרים חדשים צריכים להתבצע כדי לייעל את רמת החלבון שלה ואת הפעילות הביולוגית שלה EVs מועשר exosome.

המשוכה הקריטית ביותר במחקר זה היא יצירת שיבוטים ES-D3 overexpressing GM-CSF. כדי לשמור על המצב pluripotential ולקדם את התפשטות התא במבחנה, ESCs מורין הם בדרך כלל תרבית בנוכחות תאים מזינים26. כדי לרכוש אקסוזומים באופן בלעדי מ- ESCs, הועסק פרוטוקול ללא תאי מאכיל לתרבות ESCs27. במחקר זה, תאי ES-D3 היו בתרבית מנות מצופות ג'לטין באמצעות בינוני בתוספת LIF. יעילות הצלחת והתפשטותם של שיבוטים בודדים של תאי ES-D3 בתנאי תרבית זה היו נמוכים מאוד, מה שהופך את זה מאוד מאתגר ליצור שיבוטים ES-D3 מתאים בודדים. התוספת של המדיום המותנה המתקבל מתאי ES-D3 הורים לא הצליחה להציל את חוסר ההתפשטות של תאי ES-D3 בודדים מצופים. כדי להתגבר על מגבלה זו, תאים בודדים ES-D3 overexpressing GM-CSF היו מצופים יחד עם תאי ES-D3 הורים. גישת ציפוי זו שיפרה את הכדאיות של שיבוטי ES-D3 בודדים המביעים GM-CSF, ובכך הקלו על התפשטות והתרחבות כליות. לאחר שהודבקו, שיבוטי ES-D3 בודדים כנראה מחוברים ללוחות תרבות רקמות. הם התרבו ללא קשר לנוכחותם של תאי ES-D3 אחרים, שכן תאי ES-D3 הוריים חוסלו 48 שעות לאחר שהם מצופים, ומאפשרים רק לתאי ES-D3 בודדים שהודבקו לגדול.

בסך הכל, פרוטוקול כדי ליצור בהצלחה EVs מועשר exosome נושא GM-CSF מ ESCs עם פוטנציאל לעורר את התגובה החיסונית בתנאי מחלה שונים פותח. יתר על כן, המחקר שלנו שפורסם לאחרונה מדגים כי GM-CSF נושא exosome מועשר EVs מ ESCs יכול לשמש חיסון מניעתי ללא תאים נגד סרטן28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Kavitha Yaddanapudi, צ'י לי, וג'ון ו. איטון הגישו בקשת פטנט בארה"ב "קומפוזיציות הכוללות אקסוזומים ושיטות שימוש בתאי גזע עובריות מהונדסות ושיטות שימוש בהן".

Acknowledgments

אנו מודים למר ארקדיוש סלוסרצ'יק ורשת תשתיות המחקר הביו-רפואי של קנטאקי (KBRIN, P20GM103436) על רכישת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מ NIH AA018016-01 (J.W.E.), חבר העמים של קנטאקי מחקר אתגר אמון אמון (J.W.E.), NIH CA106599 ו CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.), וחופשי לנשום מענק מחקר (K.Y.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alkaline phosphate, Calf Intestinal New England Biolabs M0290S Dephosphorylating DNA plasmid
anti-Annexin V mAb Santa Cruz Biotechnology clone H-3, sc-74438 Western blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAb Santa Cruz Biotechnology clone B-11, sc-166029 Western blot, RRID:AB_2275892
anti-cytochrome c mAb Santa Cruz Biotechnology clone A-8, sc-13156 Western blot, RRID:AB_627385
anti-Flotillin-1 mAb Santa Cruz Biotechnology clone C-2; sc-74566 Western blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAb Rockland 600-401-A33S Western blot, RRID:AB_11182910
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated Thermo Fisher 31430 Western blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb Thermo Fisher clone 20E8C12 A21348 Western blot, RRID:AB_221509
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb Enzo ADI-SPA-890 Western blot, RRID:AB_10616242
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated Thermo Fisher 31460 Western blot, RRID:AB_228341
BCA (bicinchoninic acid) assay Thermo Fisher 23223 Determining protein concentrations
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% Genscript M42015 Western blot
Carbenicillin, Disodium Salt Thermo Fisher 10177012 Selecting E. coli colonies
Centrifuge, Avanti J-26 XPI Beckman Coulter Low speed centrifugation
Centrifuge rotor, JA-10 Beckman Coulter 09U1597 Low speed centrifugation
Centrifuge bottle, Nalgene PPCO Thermo Fisher 3120-0500PK Low speed centrifugation
Cu grids with carbon support film Electron Microscopy Sciences FF200-Cu Acquiring electron microscopy images
EcoRI New England Biolabs R0101 Digesting DNA plasmid
Enhanced chemiluminescence detection system Thermo Fisher 32106 Western blot
FACScalibur flow cytometer Becton Dickinson Examining GFP levels of ES-D3 cells
Fetal bovine serum ATCC SCRR-30-2020 Medium for ES-D3 cells
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm Thermo Fisher 22-363-547 Filtering ES-D3 cells for FACS sorting
Gelatin (0.1%) Thermo Fisher ES006B Culturing ES-D3 cells
GM-CSF ELISA kit Thermo Fisher 88733422 Determining GM-CSF concentrations
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Thermo Fisher 10-829-018 Medium for ES-D3 cells
Leukemia Inhibitory Factor Thermo Fisher ESG1106 Medium for ES-D3 cells
L-glutamine VWR VWRL0131-0100 Medium for ES-D3 cells
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher 11668019 Transfecting ES-D3 cells
Microplate reader, PowerWave XS BioTek Determining GM-CSF concentrations
MoFlo XDP high-speed cell sorter Beckman Coulter Isolating single ES-D3 cell clones
NEB 5-alpha Competent E. coli New England Biolabs C2988J Generating GM-CSF expression plasmid
Neomycin Thermo Fisher 10-131-035 Selecting ES-D3 clones
Non-essential amino acids Thermo Fisher SH3023801 Medium for ES-D3 cells
Non-fat dry milk Thermo Fisher NC9022655 Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher 31985062 Transfecting ES-D3 cells
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Acquiring electron microscopy images
Penicillin/streptomycin VWR sc45000-652 Medium for ES-D3 cells
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP Addgene 37270 Generating GM-CSF expression plasmid
PVDF membranes Millipore EMD IPVH00010 Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) QIAGEN 27106 Generating GM-CSF expression plasmid
QIAquick Gel Extraction Kit (50) QIAGEN 28704 Generating GM-CSF expression plasmid
Quick Ligation Kit New England Biolabs M2200S Generating GM-CSF expression plasmid
Transmission electron microscope Hitachi HT7700 Acquiring electron microscopy images
Trypsin VWR 45000-660 Culturing ES-D3 cells
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP Beckman Coulter High speed centrifugation
Ultracentrifuge rotor, 45Ti Beckman Coulter 09U4454 High speed centrifugation
Ultracentrifuge polycarbonate bottle Beckman Coulter 355622 High speed centrifugation
UranyLess staining solution Electron Microscopy Sciences 22409 Acquiring electron microscopy images

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
  3. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  4. Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
  5. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  6. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
  8. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
  9. Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
  10. Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
  11. Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
  12. Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
  13. Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
  14. Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
  15. Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
  16. Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  17. Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
  18. Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
  19. Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
  20. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  21. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  22. Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
  23. Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
  24. Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
  25. Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
  26. Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  27. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
  28. Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).

Tags

חקר הסרטן גיליון 177 אקסוזום צעיפים חוץ תאיים תאי גזע עובריים GM-CSF גירוי חיסוני סרטן
בידוד של שלשלות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום הנושאות גרנולוציט-מקרופאג' גורם מעורר מושבה מתאי גזע עובריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meng, S., Whitt, A. G., Tu, A.,… More

Meng, S., Whitt, A. G., Tu, A., Eaton, J. W., Li, C., Yaddanapudi, K. Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (177), e60170, doi:10.3791/60170 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter