Summary
Denna studie beskriver en metod för att isolera exosomberikade extracellulära blåsor som bär immunstimulerande granulocyt makrofag koloni-stimulerande faktorer från embryonala stamceller.
Abstract
Embryonala stamceller (EIC) är pluripotenta stamceller som kan förnya sig själva och differentiera sig till alla typer av embryonala celler. Liksom många andra celltyper släpper EPC: er små membran vesiklar, såsom exosomer, till den extracellulära miljön. Exosomer fungerar som viktiga medlare av intercellulär kommunikation och spelar en grundläggande roll i många (patho)fysiologiska processer. Granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF) fungerar som en cytokin för att modulera immunsvaret. Förekomsten av GM-CSF i exosomer har potential att öka deras immunreglerande funktion. Här blev GM-CSF stabilt överuttryckt i murine ESC-cellinjen ES-D3. Ett protokoll utvecklades för att isolera högkvalitativa exosom-berikade extracellulära vesiklar (EVs) från ES-D3 celler överuttryck GM-CSF. Isolerade exosom-berikade EVs kännetecknades av en mängd olika experimentella metoder. Det är viktigt att betydande mängder GM-GSR konstaterades förekomma i exosomberikade elfordon. Sammantaget kan GM-CSF-bärande exosomberikade EVs från EIC fungera som cellfria blåsor för att utöva sin immunreglerande verksamhet.
Introduction
EIC härrör från blastocyststadiet i ett embryo1. Som pluripotenta stamceller har EIC förmågan att självförnya och differentiera sig till alla typer av embryonala celler. På grund av deras anmärkningsvärda utvecklingspotential och långsiktiga proliferativa kapacitet är EIC extremt värdefulla för biomedicinsk forskning1. Nuvarande forskningsinsatser har till stor del fokuserat på ESCs terapeutiska potential för en mängd stora patologiska störningar, inklusive diabetes, hjärtsjukdomar och neurodegenerativa sjukdomar2,3,4.
Däggdjursceller, inklusive EIC, är kända för att frigöra blåsor med varierande storlekar till den extracellulära miljön, och dessa EVs har många fysiologiska och patologiska funktioner på grund av deras roll i intercellulär kommunikation5. Bland olika subtyper av EVs är exosomer små membran vesiklar som frigörs från olika celltyper i det extracellulära utrymmet vid fusion av mellanliggande endocytiska fack, multivesicular organ (MVBs), medplasmamembranet 6. Exosomer har rapporterats medla intercellulär kommunikation och är kritiskt involverade i många (patho)fysiologiska processer7,8. Exosomer ärver vissa biologiska funktioner från sina egna föräldraceller, eftersom exosomer innehåller biologiska material som förvärvats från cytosolen, inklusive proteiner och nukleinsyror. Således är de associerade antigenerna eller faktorerna som stimulerar immunsvaret specifikt för en viss sjukdom inkapslade i exosomerna från vissa typer av celler9. Detta banade väg för kliniska prövningar som undersökte tumör-härledda exosomer som ett anti-cancervaccin10.
GM-CSF är ett cytokin som utsöndras av olika typer av immunceller11. Nya bevis visar att GM-CSF aktiverar och reglerar immunsystemet och spelar en viktig roll i den antigen-presenterande processen12. Till exempel föreslår en klinisk rapport att GM-CSF stimulerar immunsvaret mot tumörer som ett vaccin adjuvans13. Flera GM-CSF-baserade immunterapistrategier för cancer för att utnyttja den potenta immunstimulerande aktiviteten hos GM-CSF har undersökts i kliniska prövningar14. Bland dessa har ett cancervaccin bestående av bestrålade GM-CSF-utsöndrande tumörceller visat ett visst löfte hos avancerade melanompatienter genom att inducera cellulära och humorala antitumörsvar och efterföljande nekros i metastaserade tumörer15.
Eftersom exosomerna från ESO har liknande biologiska aktiviteter som de ursprungliga ESO: erna, kanske GM-CSF-bärande exosomer från ESO: er kan fungera som cellfria vesiklar för att reglera immunsvaret. I detta dokument beskrivs en detaljerad metod för att producera högkvalitativa exosomberikade EVs från ESO som uttrycker GM-GSR. Dessa exosomberikade EVs har potential att fungera som immunreglerande vesiklar för att modulera immunsvaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Odling av ES-D3-celler
- För att generera exosomfritt fetala bovint serum (FBS), ladda FBS i en ultracentrifug och centrifugera vid 100 000 x g i 16 timmar vid 4 °C. Efter centrifugation, samla serum supernatant som exosomfria FBS för odling av murin ESC cellinje ES-D3 och förvärva exosom-berikade EVs.
- Innan du pläterar ES-D3-cellerna, täck 15 cm vävnadskulturrätter med gelatin (0,1%) vid rumstemperatur i 30 min.
- Efter ett tidigare beskrivetprotokoll 16, kultur ES-D3 celler utan matare lager celler i gelatinbelagda 15 cm vävnad kultur rätter. Cellkulturmediet ES-D3 består av DMEM, exosomfria FBS (15%), icke nödvändiga aminosyror (0,1 mM), L-glutamin (2 mM), β-mercaptoethanol (0, 1 mM), penicillin (50 enheter/ml), streptomycin (50 μg/mL) och leukemihämmande faktor (LIF; 100 enheter/mL). Kultur ES-D3 celler vid 37 °C i en 5% CO2 fuktad inkubator.
- När ES-D3-cellerna når cirka 90% sammanflöde i 15 cm vävnadskulturrätter, ta bort mediet genom aspiration. Tvätta cellerna med trypsin (5 ml; 0,05%). Tillsätt trypsin (5 ml) till disken och inkubera vid 37 °C i 5 min. Samla cellerna från disken.
- Tillsätt färskt odlingsmedium (5 ml) till de insamlade cellerna för att inaktivera trypsin. Centrifugera cellerna vid 390 x g i 5 min. Återanvänd cellerna i färskt medium och bestäm cellnumret med hjälp av en hemocytometer.
- För att passa celler, plätera ES-D3-cellerna (5 x 106) i en gelatinbelagd (0, 1%) 15 cm vävnadskulturrätt med färskt medium (15 ml) och kultur i 3 dagar innan cellerna subkultureras.
- För att samla cellkulturens supernatant för isolering av exosomberikade EVs, plätera ES-D3-cellerna (1 x 107) i en gelatinbelagd (0,1%) 15 cm vävnadskulturrätt med färskt medium (15 ml) i 3 dagar före insamling av cellkultur supernatant.
2. Generering av GM-CSF-uttryck plasmid
OBS: Generera transfection plasmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP för att överuttrycka GM-CSF i ES-D3 celler. I denna plasmid drivs uttrycket av murin GM-CSF cDNA tillsammans med markörproteinet humaniserade Renilla reniformis GFP (hrGFP) av den mänskliga polypeptidkedjans förlängningsfaktor 1α (EF1α) promotor17,18.
- Generera vektorn ryggrad.
- Smält plasmiden pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg DNA) med hjälp av restriktionsenzymet EcoRI (100 enheter) vid 37 °C i 2 timmar för att generera två DNA-fragment: vektorns ryggrad (6,0 kb) och FD3ER-skäret (2,5 kb).
- Överför 50% av smält plasmid-DNA (10 μg) till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och behandla med alkaliskt fosfatas (20 enheter) vid 37 °C i 1 timme. Lös både obehandlat och defosforylerat DNA med agarose gel elektrofores (2%).
- Rena vektorns DNA-fragment (6,0 kb) med hjälp av ett DNA-gelextraktionskit . Medan den obehandlade vektorn ryggraden kommer att fungera som den tomma vektorn (pEF1α-IRES-hrGFP), kommer den defosforylerade vektor ryggraden att användas för att generera GM-CSF-uttrycker plasmid (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
- Generera GM-CSF cDNA-insatsen.
- Smält plasmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) med hjälp av restriktionsenzymet EcoRI (100 enheter) vid 37 °C i 2 h för att producera två DNA-fragment: vektorns ryggrad (6,5 kb) och murin GM-CSF cDNA-insatsen (474 bp).
- Lös det smälta DNA genom agarose gel elektrofores (2%). Rena murin GM-CSF cDNA fragment (474 bp) med hjälp av en DNA gel extraktionssats.
- Generera uttrycket plasmider.
- Ställ in 2 ligaturreaktioner (10 μL total volym) med hjälp av ett DNA-ligationskit.
- För att generera den tomma vektorn pEF1α-IRES-hrGFP, ligate den obehandlade vektor ryggraden från steg 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng).
- För att generera pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ligate följande DNA-fragment: (1) den defosforylerade vektorn ryggraden från steg 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng) och (2) mGM-CSF cDNA fragment genereras i steg 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
- Ligate vid 25 °C i 5 min. Omvandla ligated DNA till DH5α kompetenta E. coli celler. Plätera de omvandlade E. coli-cellerna på LB-agarplattor som innehåller karbinicillin (50 μg/ml).
- Rena plasmider från enstaka E. coli-kolonier med hjälp av ett DNA-isoleringskit. Validera plasmidernas identiteter genom DNA-sekvensering.
- Ställ in 2 ligaturreaktioner (10 μL total volym) med hjälp av ett DNA-ligationskit.
3. Generering av ES-D3-celler som överuttrycker GM-CSF
OBS: Transfekterar ES-D3-cellerna med plasmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP för att överuttrycka GM-CS. Samtransfektera plasmid pBabe-Neo i ES-D3 celler för att underlätta valet av stabilt transfected celler18,20.
- Transfekterar plasmiderna till ES-D3-cellerna.
- Plätera ES-D3-cellerna (1,4 x 106) i en gelatinbelagd (0,1%) 10 cm vävnadskulturrätt med odlingsmedium (10 ml) för transfection. Kulturpläterade ES-D3 celler vid 37 °C i 24 timmar.
- Förbered två plasmidblandningar i 1,5 ml mikrocentrifugrör: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, vektorkontroll) med pBabe-Neo (4 μg) och (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, uttrycker GM-CSF) med pBabe-Neo (4 μg). Utför transfection med hjälp av ett transfection kit enligt tillverkarens protokoll.
- Tillsätt transfection medium (1 ml) och transfection reagens (64 μL) till varje rör som innehåller plasmidblandningarna och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
- Tillsätt transfektionsblandningarna till respektive 10 cm rätter av ES-D3-celler. Inkubera vid 37 °C i 5 timmar.
- Byt ut mediet i 10 cm rätter mot färskt odlingsmedium (10 ml). Inkubera vid 37 °C i 24 timmar.
- Generera bulkpopulationer av stabilt transfecterade ES-D3-celler.
- Ta bort mediet från transfekterade ES-D3-celler. Tvätta cellerna med trypsin (2 ml; 0,05%). Tillsätt trypsin (2 ml) och inkubera vid 37 °C i 5 min. Överför cellerna till ett 15 ml centrifugeringsrör och tillsätt 2 ml färskt odlingsmedium för att neutralisera trypsin. Centrifugera vid 390 x g i 5 min.
- Återanvänd de transfecterade cellerna i färskt odlingsmedium (10 ml). Utvärdera fluorescensintensiteten hos GFP i transfecterade ES-D3-celler med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), enligt tillverkarens protokoll.
- Överför de transfekterade cellerna till två 10 cm rätter som innehåller färskt odlingsmedium (10 ml). Tillsätt neomycin (0,5 mg/ml) för att eliminera oöversmärkade celler.
- Fortsätt att odla de transfecterade cellerna i odlingsmedium som innehåller neomycin (0,5 mg/ml). När den transfecterade ES-D3 når 90% sammanflöde, överför celler till 15 cm vävnadskulturrätter igen. Upprepa proceduren i 2 veckor.
- Generera kloner av stabilt transfecterade ES-D3-celler.
- När bulkpopulationer av stabilt transfecterade ES-D3-celler genereras, samla cellerna som tidigare. Bestäm cellnumren med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera cellerna vid 390 x g i 5 min. Återanvänd cellerna (1 x 107 celler/ml) i färskt odlingsmedium.
- Filtrera cellerna genom en steril cellsil på 40 μm. Rena GFP-positiva ES-D3-celler med FACS enligt tillverkarens protokoll.
- Plätera en enda sorterad ES-D3-cell i en brunn av en gelatinbelagd (0, 1%) 96-brunns vävnadskulturplatta som innehåller föräldraceller ES-D3 (1 x 103)i neomycinfritt medium (200 μL). Samodling av transfekterade ES-D3-celler med deras otransfected föräldramotsvarigheter säkerställer att stabilt transfected singel ES-D3 celler överlever och förökar sig som en enda klon.
- Odla cellerna i 48 h och tillsätt sedan neomycin (0,5 mg/ml) till 96-brunnsplattor för att eliminera oöversmårda föräldraceller ES-D3.
- Fortsätt att odla GFP-positiva ES-D3-celler i 96-brunns vävnadsodlingsplattor med medium som innehåller neomycin (0, 5 mg/ml) i 1 vecka. Överför klonurspiga ES-D3-cellinjer till gelatinbelagda (0, 1%) 6 cm vävnadskulturrätter med odlingsmedium (5 ml) som innehåller neomycin (0, 5 mg/ml) i 1 vecka.
- Bestäm intensiteten hos GFP-fluorescens i var och en av transfecterade ES-D3-cellkloner med FACS, enligt tillverkarens protokoll. Välj ES-D3 kloner som uttrycker antingen GM-CSF eller den tomma vektorn med höga nivåer av grön fluorescens.
- Bestäm de mängder GM-CSF som utsöndras av ES-D3-celler med hjälp av ett murin GM-CSF ELISA-kit enligt tillverkarens protokoll.
4. Isolering av exosomberikade extracellulära blåsor
- Kultur ES-D3-cellerna (1 x 107) i 15 cm vävnadskulturrätter i 72 timmar vid 37 °C. Samla cellkulturens supernatant. Förvara insamlat supernatant vid 4 °C upp till 1 vecka för att upprätthålla exosomintegritet.
- Centrifugera cellkulturens supernatant vid 5 000 x g i 60 min vid 4 °C med hjälp av en centrifugering för att sedimentera stora cellfragment.
- Samla supernatanten och centrifugen vid 100 000 x g i 90 min vid 4 °C med en ultracentrifug.
- Ta bort supernaten. Skölj försiktigt varje pellet två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 1 ml) för att avlägsna restkulturens supernatant.
- Återanvänd varje pellet i PBS. Kvantifiera exosomberikade elbilar med proteininnehåll5.
- Mät proteinkoncentrationen av exosomberikade EVs med en bicinchoninic syra (BCA) analys. Den förväntade avkastningen av exosomberikade EVs från ES-D3-celler är cirka 4 μg protein/ml cellkultur supernatant. Återanvänd de exosomberikade EVs i PBS (proteinkoncentration: ~6 μg/μL). Förvara de exosomberikade elbilarna vid -80 °C.
5. Karakterisering av exosomberikade extracellulära blåsor genom transmissionselektronmikroskopi
OBS: Undersök sammansättningen och strukturen hos de exosomberikade EVs som isolerats från EIC med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM)5.
- Fixera de exosomberikade EVs (3-5 μg/μL) med en slutlig koncentration på 2% EM-klass paraformaldehyd vid rumstemperatur i 2 timmar.
- Ladda fasta prover (10 μL) på kopparnät med kolstödsfilm. Inkubera proverna med kopparnät i 1 minut och dränera sedan gallret med filterpapper.
- Färga gallret med en färglösning enligt tillverkarens protokoll.
- Överför gallren till ett filterpapper med pincett. Låt gallret torka över natten vid rumstemperatur.
- Skaffa elektronmikroskopibilder med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop (50 000x förstoring), enligt tillverkarens protokoll.
6. Utvärdering av exosomberikade extracellulära blåsor genom western blot-analys
- Förbered hela cellextrakt.
- Ta bort mediet från ES-D3-celler odlade i 15 cm rätter. Tvätta cellerna med trypsin (5 ml; 0,05%). Tillsätt trypsin (5 ml) i cellerna. Inkubera vid 37 °C i 5 min. Samla cellerna och tillsätt färskt odlingsmedium (5 ml) för att neutralisera trypsin. Centrifugera cellerna vid 390 x g i 5 min. Återanvänd cellerna i PBS.
- Bestäm cellnummer med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera cellerna igen vid 390 x g i 5 min. Återanvänd cellerna i SDS-PAGE-laddningsbuffert som innehåller 0,5 % SDS (5 000 celler/μL).
- Sonicate proverna för 10 s med hjälp av en ljuddator med 10% amplitud (wattal: 500 W; ultraljud frekvens: 20 kHz). Värm proverna vid 100 °C i 5 minuter.
- Förbered lysaterna av exosomberikade EVs.
- Återanvänd de exosomberikade EVs i SDS-PAGE lastbuffert som innehåller 0,5% SDS vid en koncentration av 1,2 μg/μL.
- Sonicate proverna för 10 s med hjälp av en ljuddator med 10% amplitud (wattal: 500 W; ultraljud frekvens: 20 kHz). Värm proverna vid 100 °C i 5 minuter.
- Detektera proteiner från Western blot.
- Ladda hela cellextrakt (10 μL; 5 000 celler/μL) och exosomberikade EV-lysates (10 μL; 1,2 μg/μL) i varje brunn i en Bis-Tris PAGE-gel (4-20%). Överför proteiner till polyvinylidenfluoridmembran (PVDF).
- Inkubera membran med lämpliga primära och sekundära antikroppar. Späd ut antikroppar (vid de koncentrationer som anges nedan) i blottingbuffert som innehåller PBS, Tween-20 (0, 2%) och fettfri torrmjölk (10% w/v).
- Använd följande primära antikroppar: anti-Annexin V (200 ng/ml), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anticytokrom c (1 ng/mL), antiproteindisulfid isomeras (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) och anti-Oxphos COX IV-underavdelning IV (600 ng/mL).
- Använd följande sekundära antikroppar: peroxidaskonjugerad getantikanin IgG (20 ng/mL) och peroxidaskonjugerad get antimus IgG (20 ng/mL).
- Detektera proteiner med hjälp av ett förbättrat chemiluminescensdetekteringskit.
7. Bestämma GM-CSF-koncentrationer i exosomberikade extracellulära blåsor av ELISA
OBS: Utvärdera mängden GM-CSF i exosomberikade EVs av ELISA med hjälp av ett kit för murin GM-CSF, enligt tillverkarens protokoll med vissa modifieringar.
- Täck ELISA-plattan med capture antikropp. Behandla exosomberikade EVs (0,6 μg) enbart i PBS eller PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) vid rumstemperatur i 30 min. Tillsätt behandlade prover på den belagda ELISA-plattan och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme. Tvätta plattan med PBS ensam eller PBS + 0,05% interpolering-20.
- Lägg till detektionsantikropp i proverna. Inkubera i rumstemperatur i 1 timme. Tvätta plattan med PBS ensam eller PBS + 0,05% interpolering-20. Lägg till Avidin-HRP i proverna. Inkubera i rumstemperatur i 30 min. Tvätta plattan med PBS ensam eller PBS + 0,05% interpolering-20.
- Bestäm koncentrationerna av GM-CSF i exosomberikade EVs genom att mäta absorbansen vid 450 nm på en mikroplåtläsare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GM-CSF är överuttryckt i murin EIC.
För att stabilt överuttrycka GM-CSF i ES-D3-celler klonades murin GM-CSF cDNA till en transfection vektor för att generera uttrycket vektor pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Figur 1A). GM-CSF var överuttryckt i ES-D3 celler genom transfection, och cirka 20% av transiently transfected ES-D3 celler var GFP-positiva. Cellkloner stably överuttryck GM-CSF eller den tomma vektor kontroll förvärvades av FACS. Som visas i figur 1Bvar GFP-fluorescensintensiteten hos en GM-CSF-uttryckande ES-D3-cellinje eller en ES-D3-cellinje som uttrycker den tomma vektorn mycket högre än deras föräldramotparter. En ELISA-analys utfördes för att utvärdera GM-CSF-koncentrationerna i cellkulturens supernatant av olika cellinjer(figur 2). ES-D3 celler som uttrycker GM-CSF produceras markant högre nivåer av GM-CSF i cellkulturen supernatant än deras tomma vektor kontroll. Dessutom liknade mängden GM-CSF som genererades av GM-CSF-uttrycksceller ES-D3 de flesta STO fibroblaster som uttryckte GM-CSF, vilket tidigare rapporterats19.
Exosomer berikas i extracellulära blåsor som härrör från murin ESO.
Vektor kontroll och GM-CSF-uttrycker ES-D3 cell kulturer utvidgades, och cell kultur supernatant samlades in. EVs isolerades efter flera steg av centrifugation. Enskilda elfordon utvärderades först av TEM(figur 3). Som visas i TEM-bilderna innehöll isolerade EVs blåsor av olika storlekar, vilket vanligtvis observeras i exosomala preparat5. Viktigt, diametern på de enskilda blåsorna var 30-100 nm, överensstämmer med tidigare rapporter som beskriver exosomer21. Dessutom undersöktes förekomsten av exosomer i elfordon av western blotting(figur 4). Uttrycket av exosomal markörer, inklusive CD81, annexin V och Flotillin-1, förbättrades markant i EVs isolerade från ES-D3 celler jämfört med motsvarande hela cell extrakt (WCE). Det är viktigt att det inte upptäcktes att det fanns andra subcellulära fackmarkörer i ES-D3-härledda EVs, inklusive (1) den endoplasmatiska retikulum (ER) markörproteindisulfid isomerase (PDI), (2) mitokondriella markörer cytokrom c och COX IV-underavdelning IV och (3) cytosolic markör GAPDH. Sammantaget visar dessa data att exosomer var mycket berikade i EVs som härrör från ES-D3 celler.
GM-CSF är lokaliserad inuti exosomberikade extracellulära blåsor isolerade från ESO.
För att avgöra om exosomberikade EVs innehåller GM-CSF-molekyler genomfördes ELISA-analys för att utvärdera nivåerna av GM-CSF i exosomberikade EVs som förvärvats från ES-D3-celler med eller utan GM-CSF-uttryck (figur 5). För att ytterligare undersöka GM-CSF protein lokalisering inom exosom-berikade EVs, GM-CSF nivåer kvantifierades i exosom-berikade EVs under olika tvättförhållanden av ELISA. För detta ändamål användes tvättmedlet Tween-20 (0, 05%) först för att permeabilisera exosommembranen, och ELISA-analyser utfördes i buffertarna med eller utan 0, 05% Tween-20. Eftersom Tween-20 är känt för att minska proteinproteininteraktioner, minskade de bakgrunds-GM-CSF-nivåer som upptäcktes i kontroll-EVs avsevärt med Tween-20 i tvättbufferten. Däremot ökade GM-CSF nivåer i EVs gm-CSF-uttrycker celler avsevärt med Tween-20. Dessa resultat visar att Tween-20-inducerad exosomal membran permeabilization gör GM-CSF molekyler inuti vesicles tillgängliga för antikropp erkännande, vilket ger bevis för att majoriteten av exosomal GM-CSF molekyler är lokaliserade inuti lumen av isolerade blåsor.
Figur 1: Exogen GM-CSF överuttrycks stabilt i ES-D3-celler.
a)Det schematiska diagrammet över plasmiden för överuttryck av murin GM-CSF i ES-D3-celler, där en EF1α-promotor driver GM-CSF-uttryck och hrGFP fungerar som uttrycksmarkör.
B)Fluorescensintensiteten hos GFP i GM-CSF-uttrycksceller för ES-D3 eller deras motsvarigheter till tom vektorkontroll fastställdes av FACS. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: ES-D3-celler som överuttrycker GM-CSF producerar höga halter av GM-CSF.
GM-CSF-koncentrationerna i de angivna cellernas medium mättes med ELISA. Uppgifterna presenteras som genomsnittliga ± standardavvikelser (medelvärde ± SD) för tre oberoende ELISA-mätningar: **p < 0,001, NS = inte signifikant, ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: ES-D3-härledda extracellulära blåsor undersöks genom transmissionselektronmikroskopi.
Extracellulära blåsor utarbetades från ES-D3 celler transfected med plasmid uttrycker GM-CSF eller dess tomma vektor motsvarighet. Pilar indikerar enskilda blåsor. Skalstång = 100 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Exosommarkörer är starkt koncentrerade till extracellulära blåsor isolerade från ES-D3-celler.
Mängden markörer för exosomer, endoplasma reticulum (ER), mitokondrier och cytosol i de angivna hela cell extrakten (WCE) och EVs utvärderades av western blotting. PDI = proteindisulfid isomerase. Molekylviktsmarkörer (kD) finns till vänster. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Utvärdering av GM-CSF-nivåer i exosomberikade extracellulära blåsor.
Nivåerna av GM-GSR i de angivna exosomberikade elfordonen fastställdes under olika ELISA-förhållanden. Exosomberikade EVs var förbehandlade med eller utan 0,05% Tween-20. ELISA utfördes med tvättbuffert som endast innehöll PBS eller PBS + 0,05% Tween-20. Uppgifterna presenteras som medelvärdet av ± AV tre oberoende ELISA-analyser. *p < 0,05, **p < 0,005, ANOVA med Tukeys flerfaldiga jämförelsetest. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie visar en mycket effektiv metod för att producera exosomberikade EVs som bär det immunstimulerande proteinet GM-CSF, som kan användas för att studera immunmodulerande effekter av exosomberikade EVs. Flera studier tyder på att exosomer uppvisar immunreglerande och anti-tumör funktioner22. Exosomer från ESO som uttrycker GM-CSF kan därför också ha biologiska aktiviteter som reglerar immunsvaret. I detta protokoll överuttrycktes exogent murin GM-CSF stabilt i murin ES-D3-celler genom transfekt (figur 1). Det är viktigt att betydande mängder GM-CSF upptäcktes i exosomberikade EVs som isolerats från ES-D3-celler och som överuttryckte GM-CSF (figur 5).
Dessa uppgifter tyder på att nästan alla GM-CSF finns i exosomberikade EVs. Som cytokin utsöndras majoriteten av GM-CSF-protein extracellulärt11. Liksom andra exosomala lastmaterial (t.ex. mRNAs, miRNAs och proteiner) är GM-CSF-molekyler i cytosolen inkapslade i intraluminala blåsor (ILVs) av multivesicular kroppar (MVBs)6,23. Vid fusion av MVB med plasmamembranet frigörs GM-CSF-bärande ILV i det extracellulära utrymmet.
Ett viktigt steg i detta protokoll är att effektivt överuttrycka GM-CSF i murin ES-D3-celler (figur 2). Tidigare ansträngningar för att uppnå detta mål genom retroviral infektion misslyckades till stor del, sannolikt på grund av undertryckandet av retrovirala genuttryck på transkriptionsnivå i EIC24. Bland flera virala och cellulära promotors undersöktes, den mänskliga EF1α promotorn visade den mest robusta aktiviteten i ES-D3 celler. Viktigt är att transgene uttryck under kontroll av EF1α promotorn förblev stabil efter långsiktiga cell kultur av transfected ES-D3 celler. För att uttrycka exogen GM-CSF i en annan celltyp behövs ytterligare studier för att utvärdera effektiviteten hos olika promotors. Tillämpningen av denna metod för att isolera GM-CSF-bärande exosomberikade EVs kan utvidgas till andra stamcellstyper samt tumörceller konstruerade för att uttrycka olika cytokiner. Liksom GM-CSF utsöndras de flesta cytokinerextracellulärt 25. Därför är en möjlig begränsning av detta tillvägagångssätt att mängden av en viss cytokin ackumulerad i exosomberikade EVs är för låg för att uppvisa sin biologiska aktivitet. För ett visst cytokin måste nya studier genomföras för att optimera dess proteinnivå och biologiska aktivitet i exosomberikade EVs.
Det mest kritiska hindret i denna studie är att generera ES-D3 kloner överuttryck GM-CSF. För att upprätthålla det pluripotentialtillståndet och främja cellproliferation in vitro odlas murin-EIC i allmänhet i närvaro av matarceller26. För att förvärva exosomer uteslutande från ESO:er användes ett feedercellsfritt protokoll till kultur-EIC27. I denna studie odlades ES-D3 celler i gelatinbelagda rätter med medel kompletterat med LIF. Platteffektiviteten och spridningen av enstaka kloner av ES-D3-celler under detta odlingsförhållanden var extremt låg, vilket gör det mycket utmanande att generera ES-D3-kloner från enstaka celler. Tillägget av villkorade medium erhålls från föräldrarna ES-D3 celler misslyckades med att rädda spridning brist på pläterade enskilda ES-D3 celler. För att övervinna denna begränsning, enskilda ES-D3 celler överuttryck GM-CSF pläterades tillsammans med föräldrarnas ES-D3 celler. Denna plätering strategi förbättrade livskraften hos GM-CSF-uttrycker enskilda ES-D3 kloner, vilket underlättar klonursp spridning och expansion. När de har transfecterats, enskilda ES-D3 kloner uppenbarligen fäst på vävnad kultur plattor. De proliferated oavsett förekomsten av andra ES-D3 celler, som föräldrarnas ES-D3 celler eliminerades 48 h efter att ha pläterats, så att endast transfected enstaka ES-D3 celler att växa.
Sammantaget utvecklades ett protokoll för att framgångsrikt generera exosomberikade EVs som bär GM-CSF från ESO med potential att stimulera immunsvaret i olika sjukdomsförhållanden. Dessutom visar vår nyligen publicerade studie att GM-CSF-bärande exosomberikade EVs från ECS kan fungera som ett cellfritt profylaktiskt vaccin mot cancer28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kavitha Yaddanapudi, Chi Li och John W. Eaton lämnade in en amerikansk patentansökan "Sammansättningar bestående av konstruerade embryonala stamcellsbaserade exosomer och användningsmetoder för dessa."
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Arkadiusz Slusarczyk och Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) för att ha förvärvat transmissionselektronmikroskopbilder. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 och CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) och Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G.
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
