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Cancer Research

भ्रूणीय स्टेम सेल से ग्रेनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक ले जाने वाले एक्सोसोम-समृद्ध एक्सेलरुलर वेसिकल्स का अलगाव

Published: November 11, 2021 doi: 10.3791/60170
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 2, 1,2,3, 1,2,3, 4,5,6
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 2Experimental Therapeutics Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 3Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Surgery, University of Louisville, 5Immuno-Oncology Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 6Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

Summary

यह अध्ययन भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से प्रतिरक्षा उत्तेजक ग्रैनुलोसाइट मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारकों को ले जाने वाले एक्सोसोम-समृद्ध एक्सेलैलरुलर वेसिकल्स को अलग करने की विधि का वर्णन करता है।

Abstract

भ्रूणस्टेम कोशिकाएं (ईएसएसी) सभी प्रकार की भ्रूणीय कोशिकाओं में आत्म-नवीकरण और भेदभाव करने में सक्षम प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल हैं। कई अन्य सेल प्रकारों की तरह, ईएससी अतिरिक्त पर्यावरण के लिए छोटे झिल्ली वेसिकल्स, जैसे एक्सोसोम्स जारी करते हैं। एक्सोसोम इंटरसेलुलर संचार के आवश्यक मध्यस्थ के रूप में काम करते हैं और कई (पाथो) शारीरिक प्रक्रियाओं में एक बुनियादी भूमिका निभाते हैं। ग्रेनुलोसिटे-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मिलाने के लिए एक साइटोकिन के रूप में कार्य करता है। एक्सोसोम्स में जीएम-सीएसएफ की उपस्थिति में उनके प्रतिरक्षा-नियामक कार्य को बढ़ावा देने की क्षमता है। यहां, जीएम-सीएसएफ को मुरीन ईएससी सेल लाइन ईएस-डी 3 में स्थिर रूप से अधिक व्यक्त किया गया था। जीएम-सीएसएफ को ओवरएक्सप्रेस करने वाली ईएस-डी3 कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता वाले एक्सोसोम-समृद्ध एक्सोसेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। अलग एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस को विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों की विशेषता थी। महत्वपूर्ण बात यह है कि जीएम-सीएसएफ की महत्वपूर्ण मात्रा एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में मौजूद पाई गई । कुल मिलाकर, ईएसएसी से जीएम-सीएसएफ-असर एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस अपनी प्रतिरक्षा-नियामक गतिविधियों को लागू करने के लिए सेल-मुक्त वेसिकल्स के रूप में कार्य कर सकते हैं।

Introduction

ईएससी एक प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण के ब्लास्टोसिस्ट चरण से प्राप्त होते हैं1. प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल के रूप में, ईएसएससी के पास किसी भी प्रकार की भ्रूणीय कोशिका में आत्म-नवीनीकरण और अंतर करने की क्षमता है। उनकी उल्लेखनीय विकासात्मक क्षमता और दीर्घकालिक प्रसार क्षमता के कारण, ईएसएसी जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए अत्यंत मूल्यवान हैं1। वर्तमान अनुसंधान प्रयासों ने मधुमेह, हृदय रोग और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों सहित विभिन्न प्रमुख रोग विकारों के लिए ईएसएसी की चिकित्सीय क्षमता पर काफी हद तक ध्यान केंद्रित किया है2,3,4।

ईएससी सहित स्तनधारी कोशिकाओं को बाह्य पर्यावरण के लिए चर आकारों के साथ वेसिकल्स जारी करने के लिए जाना जाता है, और इन ईवीएस में अंतरकोशिकीय संचार5में उनकी भूमिका के कारण कई शारीरिक और रोग कार्य होते हैं। ईवीएस के विभिन्न उपप्रकारों में, एक्सोसोम्स प्लाज्मा झिल्ली6के साथ मध्यवर्ती एंडोसाइटिक डिब्बों, मल्टीवेस्कुलर निकायों (एमवीबी) के संलयन पर विभिन्न सेल प्रकारों से बाह्य अंतरिक्ष में जारी छोटे झिल्ली वेसिकल्स हैं। एक्सोसोम्स को अंतरकोशिकीय संचार में मध्यस्थता करने के लिए सूचित किया गया है और कई (पाथो) शारीरिक प्रक्रियाओं में गंभीर रूप से शामिल हैं7,8। एक्सोसोम्स अपने स्वयं के माता-पिता की कोशिकाओं से कुछ जैविक कार्यों के वारिस हैं, क्योंकि एक्सोसोम्स में प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सहित साइटोसोल से प्राप्त जैविक सामग्री होती है। इस प्रकार, किसी दिए गए रोग के लिए विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को उत्तेजित करने वाले संबंधित एंटीजन या कारकों को विशेष प्रकार की कोशिकाओं से एक्सोसोम्स में समझाया जाता है9। यह एक कैंसर विरोधी वैक्सीन10के रूप में ट्यूमर व्युत्पन्न एक्सोसोम्स की खोज नैदानिक परीक्षणों के लिए मार्ग प्रशस्त किया ।

जीएम-सीएसएफ एक साइटोकिन है जो विभिन्न प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा स्रावित किया जाता है11। उभरते सबूत दर्शाता है कि जीएम-CSF सक्रिय और प्रतिरक्षा प्रणाली को नियंत्रित करता है और एंटीजन पेश करने की प्रक्रिया12में एक आवश्यक भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, एक नैदानिक रिपोर्ट से पता चलता है कि जीएम-सीएसएफ ट्यूमर के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को एक टीका एडजुवेंट13के रूप में उत्तेजित करता है । जीएम-सीएसएफ की शक्तिशाली प्रतिरक्षा-उत्तेजक गतिविधि का फायदा उठाने के लिए कई जीएम-सीएसएफ आधारित कैंसर इम्यूनोथेरेपी रणनीतियों की नैदानिक परीक्षणों में जांच की गई है14। इनमें से, विकिरणित जीएम-सीएसएफ-स्राव ट्यूमर कोशिकाओं से बना एक कैंसर टीका ने उन्नत मेलानोमा रोगियों में सेलुलर और विनोदी एंटीट्यूमर प्रतिक्रियाओं और मेटास्टेसाइज्ड ट्यूमर15में बाद में परिगलन को प्रेरित करके कुछ वादा दिखाया है ।

क्योंकि ईएससी से प्राप्त एक्सोसोम्स में मूल ईएससी के रूप में समान जैविक गतिविधियां होती हैं, शायद जीएम-सीएसएफ-ईएसएक्स से एक्सोसोम ले जाने से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने के लिए सेल-मुक्त वेसिकल्स के रूप में कार्य हो सकता है। इस पत्र में, जीएम-सीएसएफ को व्यक्त करने वाले ईएससी से उच्च गुणवत्ता वाले एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस का उत्पादन करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन किया गया है। इन एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मिलाने के लिए प्रतिरक्षा-नियामक वेसिकल्स के रूप में सेवा करने की क्षमता है।

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Protocol

1. ES-D3 कोशिकाओं को Culturing

  1. एक्सोसोम-फ्री भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) उत्पन्न करने के लिए, एफबीएस को 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए 100,000 x ग्राम पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूज और सेंट्रलाइज में लोड करें। अपकेंद्रित्र के बाद, मुरीन ईएससी सेल लाइन ES-D3 को एकत्र करने और एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस प्राप्त करने के लिए सीरम सुपरनैंट को एक्सोसोम-मुक्त एफबीएस के रूप में एकत्र करें।
  2. ES-D3 कोशिकाओं चढ़ाना से पहले, कोट 15 सेमी ऊतक संस्कृति व्यंजन 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जिलेटिन (०.१%) का उपयोग कर ।
  3. पहले वर्णित प्रोटोकॉल16के बाद, जिलेटिन-लेपित 15 सेमी ऊतक संस्कृति व्यंजनों में फीडर लेयर कोशिकाओं के बिना ES-D3 कोशिकाओं को संस्कृति। ES-D3 सेल संस्कृति माध्यम डीएमईएम से बना है, एक्सोसोम-फ्री एफबीएस (15%), गैरजरूरी अमीनो एसिड (०.१ एमएम), एल-ग्लूटामाइन (2 एमएम), β-मर्केप्टोथेन (०.१ एमएम), पेनिसिलिन (५० यूनिट/एमएल), स्ट्रेप्टोमीसिन (५० माइक्रोजी/एमएलए), और ल्यूकेमिया अवरोधक कारक (एलआईएफ; 100 यूनिट/एमएल) । संस्कृति ES-D3 कोशिकाओं में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ2 humidified इनक्यूबेटर में।
  4. एक बार ES-D3 कोशिकाओं को 15 सेमी ऊतक संस्कृति व्यंजनों में लगभग ९०% संकुचन तक पहुंचने, आकांक्षा द्वारा माध्यम को हटा दें । ट्रिप्सिन (5 एमएल; 0.05%) का उपयोग करके कोशिकाओं को धोएं। व्यंजनों में ट्राइपसिन (5 एमएल) जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। व्यंजनों से कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  5. ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए एकत्र कोशिकाओं में ताजा संस्कृति माध्यम (5 एमएल) जोड़ें। 5 मिनट के लिए 390 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। कोशिकाओं को ताजा माध्यम में पुनर्साइपेंड करें और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबर निर्धारित करें।
  6. पासिंग कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को उपकुलचर करने से पहले 3 दिनों के लिए ताजा माध्यम (15 एमएल) और संस्कृति के साथ एक जिलेटिन-लेपित (0.1%) 15 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान में ES-D3 कोशिकाओं (5 x 106)को प्लेट करें।
  7. एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस के अलगाव के लिए सेल कल्चर सुपरनैटेंट को इकट्ठा करने के लिए, सेल कल्चर सुपरनेटेंट इकट्ठा करने से पहले 3 दिनों के लिए ताजा माध्यम (15 एमएल) के साथ 15 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान में ईएस-डी 3 कोशिकाओं (1 x 107)को प्लेट करें।

2. जीएम-सीएसएफ अभिव्यक्ति प्लाज्मिड की पीढ़ी

नोट: ईएस-डी 3 कोशिकाओं में जीएम-सीएसएफ को अधिकएक्सप्रेस करने के लिए ट्रांसफैक्शन प्लाज्मिड पीईएफ1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP उत्पन्न करें। इस प्लाज्मिड में, मार्कर प्रोटीन ह्यूमनाइज्ड रेनिला रेनिफॉर्मिस जीएफपी (एचआरजीएफपी) के साथ मुरीन जीएम-सीएसएफ सीडीएनए की अभिव्यक्ति मानव पॉलीपेप्टाइड चेन विस्तार कारक17,18से प्रेरित है।

  1. वेक्टर रीढ़ उत्पन्न करें।
    1. दो डीएनए टुकड़े उत्पन्न करने के लिए 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिबंध एंजाइम इकोरी (100 इकाइयों) का उपयोग करके प्लाज्मिड पीईएफ 1α-FD3ER-IRES-hrGFP (डीएनए के 20 माइक्रोग्राम) को पचा लें: वेक्टर बैकबोन (6.0 किलो) और एफडी 3ईआर डालें (2.5 किलो)।
    2. पचा हुआ प्लाज्मिड डीएनए (10 माइक्रोग्राम) का 50% एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर क्षारीय फॉस्फेट (20 इकाइयों) के साथ इलाज करें। एगर्लाज्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (2%) का उपयोग करके अनुपचारित और डीफोस्फोरिलेटेड डीएनए दोनों को हल करें।
    3. डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके वेक्टर बैकबोन डीएनए टुकड़ों (6.0 केबी) को शुद्ध करें। जबकि अनुपचारित वेक्टर रीढ़ खाली वेक्टर (pEF1α-IRES-hrGFP) के रूप में काम करेगा, dephosphorylated वेक्टर रीढ़ जीएम-CSF-व्यक्त प्लाज्मिड (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  2. जीएम-सीएसएफ सीडीएनए डालें उत्पन्न करें।
    1. प्लाज्मिड पीएफएससीवी-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) प्रतिबंध एंजाइम EcoRI (100 इकाइयों) का उपयोग कर 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर दो डीएनए टुकड़े का उत्पादन करने के लिए पचा: वेक्टर रीढ़ (6.5 kb) और murine जीएम-CSF सीडीएनए डालें (474 bp)।
    2. एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (2%) के माध्यम से पचा डीएनए को हल करें। डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके मुरीन जीएम-सीएसएफ सीडीएनए टुकड़ा (474 बीपी) को शुद्ध करें।
  3. अभिव्यक्ति प्लाज्मिड उत्पन्न करें।
    1. डीएनए लिगेशन किट का उपयोग करके 2 लिगेशन प्रतिक्रियाएं (10 μL कुल मात्रा) सेट करें।
      1. खाली वेक्टर pEF1α-IRES-hrGFP उत्पन्न करने के लिए, चरण 2.1.3 (6.0 केबी; 500 एनजी) से अनुपचारित वेक्टर बैकबोन को लिगेट करें।
      2. pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP उत्पन्न करने के लिए, निम्नलिखित डीएनए टुकड़ों को लिगेट करें: (1) चरण 2.1.3 (6.0 केबी; 500 एनजी) और (2) से डेपोफोफोरीलेटेड वेक्टर बैकबोन चरण 2.2.2 (474 बीपी; 200 एनजी) में उत्पन्न हुआ है।
    2. 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर लिगेट। लिटेड डीएनए को DH5α सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं में बदलें। प्लेट एलबी-एगर प्लेटों पर बदल ई कोलाई कोशिकाओं कार्बेनेसिलिन (५० μg/mL) युक्त ।
    3. डीएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके एकल ई. कोलाई कॉलोनियों से प्लाज्मिड को शुद्ध करें। डीएनए अनुक्रमण द्वारा प्लाज्मिड की पहचान को मान्य करें।

3. जीएम-सीएसएफ को ओवरएक्सप्रेस करने वाली ईएस-डी 3 कोशिकाओं का उत्पादन

नोट: जीएम-सीएस को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए प्लाज्मिड पीईएफ1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP के साथ ES-D3 कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें। 18, 20 को18,20,छुरा संक्रमित कोशिकाओं के चयन की सुविधा के लिए प्लाज्मिड पीबे-नियो को ईएस-डी 3 कोशिकाओं में कोट्रांसफेक्ट करें।

  1. प्लाज्मिड को ईएस-डी 3 कोशिकाओं में स्थानांतरित करें।
    1. ट्रांसफेक्शन के लिए कल्चर मीडियम (10 एमएल) के साथ जिलेटिन-लेपित (0.1%) 10 सेमी टिश्यू कल्चर डिश में ईएस-डी 3 कोशिकाओं (1.4 x 106)को प्लेट करें। कल्चर प्लेटेड ईएस-डी3 सेल 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में दो प्लाज्मिड मिश्रण तैयार करें: (1) पीईएफ 1α-IRES-hrGFP (28 माइक्रोग्राम, वेक्टर नियंत्रण) pBabe-Neo (4 μg) और (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, जीएम-CSF व्यक्त) के साथ pBabe-Neo (4 μg) के साथ । निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए ट्रांसफैक्शन किट का उपयोग करके ट्रांसफैक्शन करें।
    3. प्लाज्मिड मिश्रण युक्त प्रत्येक ट्यूब में ट्रांसफेक्शन माध्यम (1 एमएल) और ट्रांसफैक्शन रीएजेंट (64 माइक्रोन) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. ES-D3 कोशिकाओं के संबंधित 10 सेमी व्यंजनों में ट्रांसफेक्शन मिश्रण जोड़ें। 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    5. 10 सेमी व्यंजनों में माध्यम को ताजा संस्कृति माध्यम (10 एमएल) के साथ बदलें। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  2. छुरा संक्रमित ES-D3 कोशिकाओं की थोक आबादी उत्पन्न करें।
    1. ट्रांस संक्रमित ES-D3 कोशिकाओं से माध्यम निकालें। कोशिकाओं को ट्राइप्सिन (2 मिलील; 0.05%) से धोएं। ट्राइप्सिन (2 एमएलए) जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्रिप्सिन को बेअसर करने के लिए ताजा संस्कृति माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 390 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    2. ताजा संस्कृति माध्यम (10 एमएल) में संक्रमित कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग करके संक्रमित ES-D3 कोशिकाओं में जीएफपी की फ्लोरेसेंस तीव्रता का मूल्यांकन करें।
    3. संक्रमित कोशिकाओं को ताजा संस्कृति माध्यम (10 एमएल) युक्त दो 10 सेमी व्यंजनों में स्थानांतरित करें। असंक्रमित कोशिकाओं को खत्म करने के लिए नियोमाइसिन (0.5 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें।
    4. नियोमाइसिन (0.5 मिलीग्राम/एमएल) युक्त संस्कृति माध्यम में संक्रमित कोशिकाओं को रखना जारी रखें। जब संक्रमित ES-D3 90% तक पहुंचता है, तो कोशिकाओं को 15 सेमी ऊतक संस्कृति व्यंजनों में फिर से स्थानांतरित करें। 2 सप्ताह के लिए प्रक्रिया दोहराएं।
  3. स्टेबल संक्रमित ES-D3 कोशिकाओं के क्लोन उत्पन्न करें।
    1. एक बार जब छुरा संक्रमित ES-D3 कोशिकाओं की थोक आबादी उत्पन्न होती है, तो कोशिकाओं को पहले की तरह इकट्ठा करें। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबर निर्धारित करें। 5 मिनट के लिए 390 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। ताजा संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं (1 x 107 7 कोशिकाओं/एमएल) को फिर से रीसुस्ल करें।
    2. एक बाँझ 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, एफएएफएस का उपयोग करके जीएफपी-पॉजिटिव ES-D3 कोशिकाओं को शुद्ध करें।
    3. प्लेट एक जिलेटिन-लेपित (0.1%) 96-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के एक कुएं में एक एकल क्रमबद्ध ES-D3 सेल जिसमें माता-पिता की ES-D3 कोशिकाएं (1 x 103)नियोमाइसिन-मुक्त माध्यम (200 माइक्रोल) में होती हैं। सह-खेती उनके असंक्रमित माता-पिता के समकक्षों के साथ संक्रमित ES-D3 कोशिकाओं को यह सुनिश्चित करता है कि एक ही ES-D3 कोशिकाओं को एक क्लोन के रूप में जीवित और पैदा होता है ।
    4. संस्कृति ४८ घंटे के लिए कोशिकाओं, और फिर नियोमाइसिन (०.५ मिलीग्राम/एमएल) ९६-अच्छी तरह से प्लेटों को जोड़ने के लिए असंक्रमित माता पिता ES-D3 कोशिकाओं को खत्म ।
    5. 1 सप्ताह के लिए नियोमाइसिन (0.5 मिलीग्राम/एमएल) युक्त मध्यम के साथ 96-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में GFP-सकारात्मक ES-D3 कोशिकाओं को तैयार करना जारी रखें। 1 सप्ताह के लिए नियोमाइसिन (0.5 मिलीग्राम/एमएल) युक्त संस्कृति माध्यम (5 एमएल) के साथ 6 सेमी ऊतक संस्कृति व्यंजन जिलेटिन-लेपित (0.1%) के लिए क्लोनल ES-D3 सेल लाइनों को स्थानांतरित करें।
    6. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, FACS का उपयोग करके प्रत्येक संक्रमित ES-D3 सेल क्लोन में जीएफपी फ्लोरेसेंस की तीव्रता निर्धारित करें। ईएस-डी 3 क्लोन का चयन करें जो या तो जीएम-सीएसएफ या खाली वेक्टर को हरी फ्लोरेसेंस के उच्च स्तर के साथ व्यक्त करते हैं।
    7. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद, मुरीन जीएम-सीएसएफ एलिसा किट का उपयोग करके ईएस-डी 3 कोशिकाओं द्वारा स्रावित जीएम-सीएसएफ की मात्रा निर्धारित करें।

4. एक्सोसोम-समृद्ध एक्सेलरुलर वेसिकल्स का अलगाव

  1. संस्कृति ईएस-डी 3 कोशिकाओं (1 x 107)15 सेमी ऊतक संस्कृति व्यंजन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए। सेल कल्चर सुपरनेट लीजिए। एक्सोसोमल अखंडता बनाए रखने के लिए स्टोर ने 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सुपरनैंट एकत्र किया।
  2. सेंट्रलाइज बड़े सेल के टुकड़ों के लिए एक अपकेंद्रित्र का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर सेल कल्चर सुपरनेट।
  3. एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 100,000 x ग्राम पर सुपरनेट और सेंट्रलाइज ले लीजिए।
  4. सुपरनिट निकालें। अवशिष्ट संस्कृति सुपरनेट को हटाने के लिए फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस; 1 एमएल) के साथ प्रत्येक गोली को धीरे से दो बार कुल्ला करें।
  5. प्रत्येक गोली को पीबीएस में फिर से रीस्ब करें। अपने प्रोटीन सामग्री5द्वारा एक्सोसोम समृद्ध ईवीएस की मात्रा ।
    1. एक बाइसिनकोनिक एसिड (बीसीए) परख के साथ एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस की प्रोटीन एकाग्रता को मापें। ES-D3 कोशिकाओं से एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस की अपेक्षित उपज लगभग 4 माइक्रोग्राम प्रोटीन/एमएल सेल कल्चर सुपरनेटेंट है । पीबीएस (प्रोटीन एकाग्रता: ~ 6 μg/μL) में एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस को फिर से खर्च करें। एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा एक्सोसोम-समृद्ध एक्सेरैलुलर वेसिकल्स का लक्षण वर्णन

नोट: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM)5का उपयोग करके ईएससी से अलग एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस की संरचना और संरचना की जांच करें।

  1. एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस (3-5 माइक्रोग्राम/माइक्रोनएल) को 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 2% ईएम ग्रेड पैराफॉर्मल्डिहाइड की अंतिम एकाग्रता के साथ ठीक करें।
  2. कार्बन समर्थन फिल्म के साथ कॉपर ग्रिड पर फिक्स्ड नमूने (10 μL) लोड करें। 1 मिनट के लिए तांबे के ग्रिड के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें, और फिर फिल्टर पेपर के साथ ग्रिड को छान लें।
  3. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद एक धुंधला समाधान के साथ ग्रिड दाग।
  4. चिमटी का उपयोग कर फिल्टर पेपर के एक टुकड़े को ग्रिड स्थानांतरित करें। ग्रिड को कमरे के तापमान पर रात भर सूखने दें।
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (50,000x आवर्धन) का उपयोग करके इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों का अधिग्रहण करें।

6. पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा एक्सोसोम-समृद्ध एक्सेरसेलुलर वेसिकल्स का मूल्यांकन

  1. पूरी सेल अर्क तैयार करें।
    1. 15 सेमी व्यंजनों में सुसंस्कृत ES-D3 कोशिकाओं से माध्यम निकालें। कोशिकाओं को ट्राइप्सिन (5 एमएल; 0.05%) से धोएं। कोशिकाओं में ट्राइपसिन (5 एमएल) जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। कोशिकाओं को इकट्ठा करें और ट्रिप्सिन को बेअसर करने के लिए ताजा संस्कृति माध्यम (5 एमएल) जोड़ें। 5 मिनट के लिए 390 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
    2. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबर निर्धारित करें। 5 मिनट के लिए 390 x ग्राम पर फिर से कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। एसडीएस-पेज लोडिंग बफर में कोशिकाओं को फिर से ० से अधिक ०.५% एसडीएस (५,००० कोशिकाओं/μL) में पुनर्निर्भर करें ।
    3. 10% आयाम (वाट: 500 डब्ल्यू; अल्ट्रासोनिक आवृत्ति: 20 किलोहर्ट्ज) के साथ एक सोनिकेटर का उपयोग करके 10 एस के लिए नमूनों को सोनिकेट करें। नमूनों को 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  2. एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस की लाइसेट्स तैयार करें।
    1. एसडीएस-पेज लोडिंग बफर में एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस को 1.2 माइक्रोग्राम/माइक्रोन की एकाग्रता पर 0.5% एसडीएस युक्त पुनर्सुष्ण करें।
    2. 10% आयाम (वाट: 500 डब्ल्यू; अल्ट्रासोनिक आवृत्ति: 20 किलोहर्ट्ज) के साथ एक सोनिकेटर का उपयोग करके 10 एस के लिए नमूनों को सोनिकेट करें। नमूनों को 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  3. पश्चिमी दाग द्वारा प्रोटीन का पता लगाएं।
    1. पूरे सेल अर्क (10 माइक्रोन; 5,000 कोशिकाओं/μL) और एक्सोसोम-समृद्ध EV lysates (10 μL; 1.2 μg/μL) को एक बीआईएस-ट्रिस पेज जेल (4-20%) के प्रत्येक कुएं में लोड करें। पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली पर प्रोटीन स्थानांतरित करें।
    2. उपयुक्त प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट झिल्ली। पीबीएस, ट्वीन-20 (0.2%), और नॉनफैट ड्राई मिल्क (10% डब्ल्यू/वी) वाले ब्लॉटिंग बफर में पतला एंटीबॉडी (नीचे इंगित सांद्रता पर) ।
      1. निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें: एंटी-एनेक्सटिन वी (200 एनजी/एमएल), एंटी-सीडी 81 (50 एनजी/एमएल), एंटी-फ्लोटिलिन-1 (200 एनजी/एमएल), एंटी-साइटोक्रोम सी (1 00 एनजी/एमएल), एंटी प्रोटीन डिसल्फाइड आइसोमेरेस (२०० एनजी/एमएल), एंटी-गपध (३३ एनजी/एमएल), और एंटी ऑक्सफॉस कॉक्स IV-सबयूनिट IV (६०० एनजी/एमएल) ।
      2. निम्नलिखित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें: पेरोक्सिडास-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (20 एनजी/एमएल) और पेरोक्सिडास-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी (20 एनजी/एमएल) ।
    3. एक उन्नत रसायनिनी का पता लगाने किट का उपयोग कर प्रोटीन का पता लगाएं।

7. एलिसा द्वारा एक्सोसोम-समृद्ध एक्सेसेलुलर वेसिकल्स में जीएम-सीएसएफ सांद्रता का निर्धारण करना

नोट: कुछ संशोधनों के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, मुरीन जीएम-सीएसएफ के लिए एक किट का उपयोग करके एलिसा द्वारा एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में जीएम-सीएसएफ की मात्रा का मूल्यांकन करें।

  1. कब्जा एंटीबॉडी के साथ एलिसा प्लेट कोट। अकेले पीबीएस में एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस (0.6 माइक्रोग्राम) या पीबीएस + 0.05% ट्वीन-20 (100 माइक्रोन) को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इलाज करें। लेपित एलिसा प्लेट में उपचारित नमूने जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। अकेले पीबीएस या पीबीएस + 0.05% ट्वीन-20 के साथ प्लेट धोएं।
  2. नमूनों में डिटेक्शन एंटीबॉडी जोड़ें। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। अकेले पीबीएस या पीबीएस + 0.05% ट्वीन-20 के साथ प्लेट धोएं। नमूनों में एविडिन-एचआरपी जोड़ें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। अकेले पीबीएस या पीबीएस + 0.05% ट्वीन-20 के साथ प्लेट धोएं।
  3. एक माइक्रोप्लेट रीडर पर 450 एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में जीएम-सीएसएफ की सांद्रता निर्धारित करें।

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Representative Results

जीएम-सीएसएफ मुरीन ईएसएससीएस में अतिव्यक्त है।
ES-D3 कोशिकाओं में जीएम-सीएसएफ को स्थिर रूप से अधिक करने के लिए, मुरीन जीएम-सीएसएफ सीडीएनए को अभिव्यक्ति वेक्टर pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(चित्रा 1ए)उत्पन्न करने के लिए एक ट्रांसफेक्शन वेक्टर में क्लोन किया गया था। जीएम-सीएसएफ को ट्रांसफैक्शन द्वारा ईएस-डी 3 कोशिकाओं में अधिकएक्सप्रेस किया गया था, और लगभग 20% क्षणिक रूप से संक्रमित ईएस-डी 3 कोशिकाएं जीएफपी-सकारात्मक थीं। सेल क्लोन लगातार जीएम-सीएसएफ या खाली वेक्टर नियंत्रण को एफएसीएस द्वारा अधिग्रहित किया गया था। जैसा कि चित्रा 1बीमें दिखाया गया है, जीएम-सीएसएफ-व्यक्त ES-D3 सेल लाइन या एक ES-D3 सेल लाइन की जीएफपी फ्लोरेसेंस तीव्रता खाली वेक्टर व्यक्त करने के लिए उनके पैतृक समकक्षों की तुलना में बहुत अधिक था । विभिन्न सेल लाइनों(चित्रा 2)के सेल संस्कृति सुपरनैंट में जीएम-सीएसएफ सांद्रता का मूल्यांकन करने के लिए एक एलिसा परख की गई थी। जीएम-सीएसएफ को व्यक्त करने वाली ES-D3 कोशिकाओं ने अपने खाली वेक्टर नियंत्रण की तुलना में सेल संस्कृति सुपरनेट में जीएम-सीएसएफ के स्पष्ट रूप से उच्च स्तर का उत्पादन किया। इसके अलावा, जीएम-CSF द्वारा उत्पन्न जीएम-CSF की राशि-ES-D3 कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए जीएम-CSF व्यक्त STO फाइब्रोब्लास्ट के समान था, जैसा कि पहले19रिपोर्ट ।

एक्सोसोम्स को मुरीन ईएसएससी से प्राप्त एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स में समृद्ध किया जाता है।
वेक्टर नियंत्रण और जीएम-सीएसएफ-व्यक्त ES-D3 सेल संस्कृतियों का विस्तार किया गया, और सेल संस्कृति सुपरनेटेंट एकत्र किया गया था। अपकेंद्रित्र के कई कदमों के बाद EVs अलग-थलग पड़ गए थे । एकल ईवी का मूल्यांकन पहले ईएम(चित्रा 3)द्वारा किया गया था। जैसा कि टेम छवियों में दिखाया गया है, अलग-अलग ईवीएस में विभिन्न आकारों के वेसिकल्स होते थे, जो आमतौर पर एक्सोसोमल तैयारी 5 में मनायाजाताहै। महत्वपूर्ण बात यह है कि व्यक्तिगत वेसिकल्स का व्यास 30-100 एनएम था, जो पहले की रिपोर्टों के अनुरूप था, जो एक्सोसोम्स21का वर्णन करता था। इसके अलावा, ईवीएस में एक्सोसोम्स की उपस्थिति की जांच वेस्टर्न ब्लॉटिंग(चित्रा 4)द्वारा की गई थी। सीडी 81, एनेक्सटिन वी और फ्लोटिलिन-1 सहित एक्सोसोमल मार्कर की अभिव्यक्ति को इसी पूरे सेल अर्क (डब्ल्यूसीई) की तुलना में ईएस-डी 3 कोशिकाओं से अलग ईवीएस में स्पष्ट रूप से बढ़ाया गया था। महत्वपूर्ण बात यह है कि ईएस-डी 3-व्युत्पन्न ईवीएस में अन्य उपकोशिक डिब्बे मार्कर की उपस्थिति का पता नहीं चला, जिसमें (1) एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) मार्कर प्रोटीन डिफोल्फाइड आइसोमेरेस (पीडीआई), (2) माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर साइटोक्रोम सी और कॉक्स चतुर्थ-सबयूनिट चतुर्थ, और (3) साइटोसोलिक मार्कर गैप शामिल हैं। कुल मिलाकर, ये डेटा प्रदर्शित करता है कि एक्सोसोम्स ES-D3 कोशिकाओं से प्राप्त ईवीएस में अत्यधिक समृद्ध थे।

जीएम-सीएसएफ को ईएससी से अलग एक्सोसोम-समृद्ध एक्सेसेलुलर वेसिकल्स के अंदर स्थानीयकृत किया जाता है।
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में जीएम-सीएसएफ अणु होते हैं, एलिसा परख जीएम-सीएसएफ के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए आयोजित की गई थी, जो जीएम-सीएसएफ अभिव्यक्ति(चित्रा 5)के साथ या बिना ES-D3 कोशिकाओं से प्राप्त एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में जीएम-सीएसएफ के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस के भीतर जीएम-सीएसएफ प्रोटीन स्थानीयकरण की जांच करने के लिए, एलिसा द्वारा विभिन्न धोने की स्थिति के तहत जीएम-सीएसएफ स्तर को एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में मात्रा निर्धारित किया गया था। इस उद्देश्य के लिए, डिटर्जेंट ट्वीन-20 (0.05%) को पहले एक्सोसोमल झिल्ली को पार करने के लिए नियोजित किया गया था, और एलिसा परख के साथ या 0.05% ट्वीन-20 के बिना बफ़र्स में किया गया था। क्योंकि ट्वीन-20 प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को कम करने के लिए जाना जाता है, पृष्ठभूमि जीएम-CSF नियंत्रण EVs में पाया स्तर काफी वाशिंग बफर में ट्वीन-20 द्वारा कम थे । इसके विपरीत, जीएम-CSF-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं के EVs में जीएम-CSF के स्तर में ट्वीन-20 द्वारा काफी वृद्धि हुई थी । इन परिणामों से पता चलता है कि ट्वीन-20-प्रेरित एक्सोसोमल झिल्ली परमीबिलाइजेशन एंटीबॉडी मान्यता के लिए सुलभ वेसिकल्स के अंदर जीएम-सीएसएफ अणुओं को बनाता है, जो इस बात का सबूत देता है कि अधिकांश एक्सोसोमल जीएम-सीएसएफ अणुओं को अलग-थलग वेसिकल्स के ल्यूमेन के अंदर स्थानीयकृत किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: एक्सोजेनस जीएम-सीएसएफ ES-D3 कोशिकाओं में स्थिर रूप से अतिव्यक्त है।
(क)ईएस-डी3 कोशिकाओं में मुरीन जीएम-सीएसएफ को अधिकएक्सप्रेस करने के लिए प्लाज्मिड का योजनाबद्ध आरेख, जिसमें एक EF1α प्रमोटर जीएम-सीएसएफ अभिव्यक्ति और एचआरजीएफपी को अभिव्यक्ति मार्कर के रूप में कार्य करता है ।
(ख)जीएम-सीएसएफ-एक्सप्रेसिंग ईएस-डी 3 कोशिकाओं या उनके खाली वेक्टर नियंत्रण समकक्षों में जीएफपी की फ्लोरेसेंस तीव्रता का निर्धारण एफएएफएस द्वारा किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जीएम-सीएसएफ को अधिकएक्सप्रेस करने वाली ES-D3 कोशिकाएं जीएम-सीएसएफ के उच्च स्तर का उत्पादन करती हैं।
इंगित कोशिकाओं के माध्यम में जीएम-सीएसएफ सांद्रता एलिसा द्वारा मापा गया था। डेटा तीन स्वतंत्र एलिसा माप के मानक विचलन (मतलब ± एसडी) के ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं: * * पी < ०.००१, एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है, Tukey कई तुलना परीक्षण के साथ ANOVA । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: ईएस-डी 3-व्युत्पन्न एक्सपेरिमेंटल वेसिकल्स की जांच ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा की जाती है।
जीएम-सीएसएफ या इसके खाली वेक्टर समकक्ष को व्यक्त करते हुए प्लाज्मिड से संक्रमित ES-D3 कोशिकाओं से अतिरिक्त सेलसेलुलर वेसिकल्स तैयार किए गए थे। तीर व्यक्तिगत वेसिकल्स का संकेत देते हैं। स्केल बार = 100 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: एक्सोसोमल मार्कर ईएस-डी 3 कोशिकाओं से अलग एक्सेसेलुलर वेसिकल्स में अत्यधिक केंद्रित होते हैं।
संकेत पूरे सेल अर्क (WCE) और ईवीएस में एक्सोसोम्स, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), माइटोकॉन्ड्रिया और साइटोसोल के लिए मार्कर की मात्रा का मूल्यांकन पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा किया गया था। पीडीआई = प्रोटीन डिफाइड आइसोमेरास। आणविक वजन मार्कर (केडी) बाईं ओर हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एक्सोसोम-समृद्ध एक्सेलरुलर वेसिकल्स में जीएम-सीएसएफ स्तर का मूल्यांकन।
संकेतित एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में जीएम-सीएसएफ के स्तर विभिन्न एलिसा स्थितियों के तहत निर्धारित किए गए थे। एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस के साथ या बिना 0.05% ट्वीन-20 का पूर्वउपचार किया गया था। एलिसा को केवल पीबीएस या पीबीएस + 0.05% ट्वीन-20 युक्त वाशिंग बफर का उपयोग करके किया गया था। डेटा तीन स्वतंत्र एलिसा परख के मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । * पी < 0.05, * * पी < 0.005, टुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ ANOVA। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह अध्ययन प्रतिरक्षा-उत्तेजक प्रोटीन जीएम-सीएसएफ को ले जाने वाले एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस के उत्पादन की एक अत्यधिक कुशल विधि दिखाता है, जिसे एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस के प्रतिरक्षा-मॉड्यूलरी प्रभावों का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। कई अध्ययनों से पता चलता है कि एक्सोसोम प्रतिरक्षा-नियामक और एंटी-ट्यूमर कार्यों का प्रदर्शन करते हैं22। इस प्रकार, जीएम-सीएसएफ व्यक्त करने वाले ESCs के एक्सोसोम्स में जैविक गतिविधियां भी हो सकती हैं जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करती हैं। इस प्रोटोकॉल में, एक्सोजेनस मुरीन जीएम-सीएसएफ को ट्रांसफैक्शन(चित्रा 1)द्वारा मुरीन ईएस-डी 3 कोशिकाओं में स्थिर रूप से अधिक विस्तारित किया गया था। महत्वपूर्ण बात यह है कि जीएम-सीएसएफ(चित्रा 5)को ओवरएक्सप्रेस करने वाले ईएस-डी3 कोशिकाओं से अलग एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में जीएम-सीएसएफ की महत्वपूर्ण मात्रा का पता लगाया गया था।

इन आंकड़ों से पता चलता है कि लगभग सभी जीएम-सीएसएफ एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस के भीतर रहता है। एक साइटोकिन के रूप में, जीएम-सीएसएफ प्रोटीन के बहुमत को बाह्य रूप से11स्रावित किया जाता है। अन्य एक्सोसोमल कार्गो सामग्री (जैसे, mRNAs, miRNAs, और प्रोटीन) की तरह, साइटोसोल में जीएम-सीएसएफ अणुओं को मल्टीवेस्कुलर निकायों (एमवीबी)6,23के इंट्राल्यूमिनल वेसिकल्स (आईएलवी) में समझायाजाताहै। प्लाज्मा झिल्ली के साथ एमवीबी के संलयन पर, जीएम-सीएसएफ-ले जाने वाले आईएलवी को बाह्य अंतरिक्ष में जारी किया जाता है।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम मुरीन ईएस-डी 3 कोशिकाओं(चित्रा 2)में जीएम-सीएसएफ को प्रभावी ढंग से अधिक करना है। रेट्रोवायरल संक्रमण द्वारा इस लक्ष्य को प्राप्त करने के पहले के प्रयास काफी हद तक विफल रहे, क्योंकि ईएसएसी24में प्रतिलेखन स्तरों पर रेट्रोवायरल जीन अभिव्यक्ति के दमन की संभावना है । कई वायरल और सेलुलर प्रमोटरों की जांच के बीच, मानव EF1α प्रमोटर ES-D3 कोशिकाओं में सबसे मजबूत गतिविधि दिखाया । महत्वपूर्ण बात, EF1α प्रमोटर के नियंत्रण में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति संक्रमित ES-D3 कोशिकाओं की दीर्घकालिक सेल संस्कृति के बाद स्थिर रही। एक अन्य सेल प्रकार में एक्सोजेनस जीएम-सीएसएफ को व्यक्त करने के लिए, विभिन्न प्रमोटरों की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है। जीएम-सीएसएफ-असर एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस को अलग करने के लिए इस विधि के आवेदन को अन्य स्टेम सेल प्रकारों के साथ-साथ विभिन्न साइटोकिन्स व्यक्त करने के लिए इंजीनियर ट्यूमर कोशिकाओं में विस्तारित किया जा सकता है। जीएम-सीएसएफ की तरह, अधिकांश साइटोकिन्स को25अतिरिक्त रूप से स्रावित किया जाता है। इसलिए, इस दृष्टिकोण की एक संभावित सीमा यह है कि एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में संचित दिए गए साइटोकिन की मात्रा अपनी जैविक गतिविधि को प्रदर्शित करने के लिए बहुत कम है। एक विशेष साइटोकिन के लिए, एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में अपने प्रोटीन स्तर और जैविक गतिविधि को अनुकूलित करने के लिए नए अध्ययन किए जाने की आवश्यकता है।

इस अध्ययन में सबसे महत्वपूर्ण बाधा जीएम-सीएसएफ को अधिकएक्सएक्सप्रेस करने वाले ईएस-डी3 क्लोन पैदा करना है। प्लूइपेंशियल राज्य को बनाए रखने और विट्रो में सेल प्रसार को बढ़ावा देने के लिए, मुरीन ईएसएस को आम तौर पर फीडर कोशिकाओं की उपस्थिति में सुसंस्कृत किया जाता है26। विशेष रूप से ईएससी से एक्सोसोम प्राप्त करने के लिए, संस्कृति ईएससी27 के लिए एक फीडर-सेल-मुक्त प्रोटोकॉल नियोजित किया गया था। इस अध्ययन में, ES-D3 कोशिकाओं को एलआईएफ के साथ पूरक मध्यम का उपयोग करके जिलेटिन-लेपित व्यंजनों में सुसंस्कृत किया गया था। इस संस्कृति की स्थिति के तहत ES-D3 कोशिकाओं के एकल क्लोन की प्लेट दक्षता और प्रसार बेहद कम थे, जिससे एकल कोशिकाओं से ES-D3 क्लोन उत्पन्न करना बहुत चुनौतीपूर्ण था। माता-पिता ES-D3 कोशिकाओं से प्राप्त सशर्त माध्यम के अलावा चढ़ाया एकल ES-D3 कोशिकाओं के प्रसार की कमी को बचाने में विफल रहा । इस सीमा को दूर करने के लिए, जीएम-सीएसएफ को ओवरएक्सप्रेस करने वाली सिंगल ईएस-डी3 कोशिकाओं को माता-पिता ES-D3 कोशिकाओं के साथ चढ़ाया गया था। इस चढ़ाना दृष्टिकोण जीएम-CSF की व्यवहार्यता में सुधार-एकल ES-D3 क्लोन व्यक्त, क्लोन प्रसार और विस्तार की सुविधा । एक बार संक्रमित होने के बाद, एकल ईएस-डी 3 क्लोन जाहिरा तौर पर ऊतक संस्कृति प्लेटों से जुड़े होते हैं। वे अन्य ES-D3 कोशिकाओं की उपस्थिति की परवाह किए बिना पैदा हुए, के रूप में माता पिता के ES-D3 कोशिकाओं को चढ़ाया जा रहा है के बाद ४८ घंटे समाप्त हो गए थे, केवल संक्रमित एकल ES-D3 कोशिकाओं को विकसित करने की अनुमति ।

कुल मिलाकर, विभिन्न रोग स्थितियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रोत्साहित करने की क्षमता के साथ ईएससी से जीएम-सीएसएफ ले जाने वाले एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस को सफलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। इसके अलावा, हमारे हाल ही में प्रकाशित अध्ययन दर्शाता है कि जीएम-CSF असर एक्सोसोम-ईएसएसी से समृद्ध EVs कैंसर28के खिलाफ एक सेल मुक्त रोगनिरोधी वैक्सीन के रूप में काम कर सकते हैं ।

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Disclosures

कविथा याददानपुडी, ची ली और जॉन डब्ल्यू ईटन ने एक अमेरिकी पेटेंट आवेदन प्रस्तुत किया "इंजीनियर भ्रूणस्टेम सेल-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स और उसके उपयोग के तरीकों को शामिल करने वाली रचनाएं।

Acknowledgments

हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों को प्राप्त करने के लिए श्री आर्कादिउज़ स्लुसारसीज़िक और केंटकी बायोमेडिकल रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर नेटवर्क (KBRIN, P20GM103436) के आभारी हैं। इस काम के हिस्से में NIH AA018016-01 (J.W.E.), केंटकी रिसर्च चैलेंज ट्रस्ट फंड (J.W.E.), NIH CA106599 और CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.), और मुक्त सांस अनुसंधान अनुदान (K.Y.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alkaline phosphate, Calf Intestinal New England Biolabs M0290S Dephosphorylating DNA plasmid
anti-Annexin V mAb Santa Cruz Biotechnology clone H-3, sc-74438 Western blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAb Santa Cruz Biotechnology clone B-11, sc-166029 Western blot, RRID:AB_2275892
anti-cytochrome c mAb Santa Cruz Biotechnology clone A-8, sc-13156 Western blot, RRID:AB_627385
anti-Flotillin-1 mAb Santa Cruz Biotechnology clone C-2; sc-74566 Western blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAb Rockland 600-401-A33S Western blot, RRID:AB_11182910
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated Thermo Fisher 31430 Western blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb Thermo Fisher clone 20E8C12 A21348 Western blot, RRID:AB_221509
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb Enzo ADI-SPA-890 Western blot, RRID:AB_10616242
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated Thermo Fisher 31460 Western blot, RRID:AB_228341
BCA (bicinchoninic acid) assay Thermo Fisher 23223 Determining protein concentrations
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% Genscript M42015 Western blot
Carbenicillin, Disodium Salt Thermo Fisher 10177012 Selecting E. coli colonies
Centrifuge, Avanti J-26 XPI Beckman Coulter Low speed centrifugation
Centrifuge rotor, JA-10 Beckman Coulter 09U1597 Low speed centrifugation
Centrifuge bottle, Nalgene PPCO Thermo Fisher 3120-0500PK Low speed centrifugation
Cu grids with carbon support film Electron Microscopy Sciences FF200-Cu Acquiring electron microscopy images
EcoRI New England Biolabs R0101 Digesting DNA plasmid
Enhanced chemiluminescence detection system Thermo Fisher 32106 Western blot
FACScalibur flow cytometer Becton Dickinson Examining GFP levels of ES-D3 cells
Fetal bovine serum ATCC SCRR-30-2020 Medium for ES-D3 cells
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm Thermo Fisher 22-363-547 Filtering ES-D3 cells for FACS sorting
Gelatin (0.1%) Thermo Fisher ES006B Culturing ES-D3 cells
GM-CSF ELISA kit Thermo Fisher 88733422 Determining GM-CSF concentrations
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Thermo Fisher 10-829-018 Medium for ES-D3 cells
Leukemia Inhibitory Factor Thermo Fisher ESG1106 Medium for ES-D3 cells
L-glutamine VWR VWRL0131-0100 Medium for ES-D3 cells
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher 11668019 Transfecting ES-D3 cells
Microplate reader, PowerWave XS BioTek Determining GM-CSF concentrations
MoFlo XDP high-speed cell sorter Beckman Coulter Isolating single ES-D3 cell clones
NEB 5-alpha Competent E. coli New England Biolabs C2988J Generating GM-CSF expression plasmid
Neomycin Thermo Fisher 10-131-035 Selecting ES-D3 clones
Non-essential amino acids Thermo Fisher SH3023801 Medium for ES-D3 cells
Non-fat dry milk Thermo Fisher NC9022655 Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher 31985062 Transfecting ES-D3 cells
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Acquiring electron microscopy images
Penicillin/streptomycin VWR sc45000-652 Medium for ES-D3 cells
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP Addgene 37270 Generating GM-CSF expression plasmid
PVDF membranes Millipore EMD IPVH00010 Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) QIAGEN 27106 Generating GM-CSF expression plasmid
QIAquick Gel Extraction Kit (50) QIAGEN 28704 Generating GM-CSF expression plasmid
Quick Ligation Kit New England Biolabs M2200S Generating GM-CSF expression plasmid
Transmission electron microscope Hitachi HT7700 Acquiring electron microscopy images
Trypsin VWR 45000-660 Culturing ES-D3 cells
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP Beckman Coulter High speed centrifugation
Ultracentrifuge rotor, 45Ti Beckman Coulter 09U4454 High speed centrifugation
Ultracentrifuge polycarbonate bottle Beckman Coulter 355622 High speed centrifugation
UranyLess staining solution Electron Microscopy Sciences 22409 Acquiring electron microscopy images

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 177 एक्सोसोम एक्सेसेलुलर वेसिकल भ्रूणस्टेम सेल जीएम-सीएसएफ प्रतिरक्षा-उत्तेजक कैंसर
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Meng, S., Whitt, A. G., Tu, A.,… More

Meng, S., Whitt, A. G., Tu, A., Eaton, J. W., Li, C., Yaddanapudi, K. Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (177), e60170, doi:10.3791/60170 (2021).

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