Summary
이 연구는 배아 줄기 세포에서 면역 자극 과립 대세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외약 농축 세포 소포를 분리하는 방법을 설명합니다.
Abstract
배아 줄기 세포 (ESC)는 모든 유형의 배아 세포로 자가 재생 및 분화를 할 수있는 만능 줄기 세포입니다. 다른 많은 세포 유형과 마찬가지로, ESC는 외식과 같은 작은 막 소포를 세포 외 환경에 방출합니다. 엑소좀은 세포간 통신의 필수 중재자 역할을 하며 많은 (patho) 생리적 과정에 기본적인 역할을 합니다. 과립구-대식세포 식민지 자극 인자(GM-CSF)는 면역 반응을 조절하기 위해 사이토카인으로서 기능한다. 엑소좀에 GM-CSF의 존재는 면역 조절 기능을 높일 가능성이 있다. 여기서, GM-CSF는 뮤린 ESC 세포주 ES-D3에서 안정적으로 과발현되었다. 프로토콜은 GM-CSF를 과발현하는 ES-D3 세포로부터 고품질 엑소좀 농축 세포 소포(EV)를 분리하기 위해 개발되었다. 고립 된 엑소좀 농축 된 전기는 다양한 실험적 접근법을 특징으로하였다. 중요한 것은, 상당한 양의 GM-CSF는 엑소좀 농축 된 전기 에 존재하는 것으로 나타났습니다. 전반적으로, ESC에서 GM-CSF 베어링 엑소좀 농축 된 전기 는 그들의 면역 규제 활동을 발휘 하기 위해 세포 없는 소포로 작동할 수 있습니다.
Introduction
ESC는 이식 전 배아1의배반성 단계에서 유래된다. 만능 줄기 세포로서, ESC는 배아 세포의 어떤 모형든지로 자기 갱신하고 분화할 수 있는 기능을 가지고 있습니다. 그들의 놀라운 발달 잠재력 및 장기 증식 능력으로 인해, ESC는 생물 의학 연구1에매우 귀중하다. 현재의 연구 노력은 주로 당뇨병, 심장 질환 및 신경 퇴행성 질환2,3,4를포함한 다양한 주요 병리학 적 질환에 대한 EsC의 치료잠재력에초점을 맞추고 있다.
ESC를 포함한 포유류 세포는 세포간 환경에 가변 크기로 소포를 방출하는 것으로 알려져 있으며, 이들 EV는 세포간 통신5에서의역할로 인해 많은 생리적 및 병리학적 기능을 갖는다. 이외 용이성 중에서도, 외형은 플라즈마 멤브레인6을가진 중간 내구, 다중 혈관 체납체(MVBs)의 융합시 세포외 공간으로 다양한 세포 유형에서 방출되는 작은 막 소포이다. 엑소좀은 세포간 통신을 중재하기 위해 보고되었으며 많은 (patho)의 생리적 과정에 비판적으로 관여하고있다7,8. 엑소좀은 단백질과 핵산을 포함한 사이토솔에서 획득한 생물학적 물질을 함유하고 있기 때문에 자신의 부모 세포로부터 일부 생물학적 기능을 상속합니다. 따라서, 주어진 질병에 특이적인 면역 반응을 자극하는 관련 항원 또는 인자는 특정 유형의 세포로부터 엑소좀에서 캡슐화된다9. 이는 항암 백신10으로종양 유래 엑소좀을 탐구하는 임상 시험을 위한 길을 열어주었다.
GM-CSF는 면역세포(11)의상이한 모형에 의해 분비되는 사이토카인이다. 새로운 증거는 GM-CSF가 면역 계통을 활성화하고 통제하고 항원 제시 프로세스12에서필수적인 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 임상 보고서는 GM-CSF가 백신보조제 13로서종양에 대한 면역 반응을 자극한다는 것을 시사한다. GM-CSF의 강력한 면역 자극 활성을 악용하기 위한 여러 GM-CSF 기반 암 면역 요법 전략은 임상 시험14에서조사되었다. 이들 중, 조사된 GM-CSF-분비 종양 세포로 구성된 암 백신은 전이 종양에서 세포 및 유머 항종양 반응 및 후속 괴사를 유도하여 고급 흑색종 환자에서 몇 가지 약속을 나타내고있다.
ESC에서 파생된 엑소솜은 원래 ESC와 유사한 생물학적 활동을 가지고 있기 때문에, 아마도 ESC에서 GM-CSF 운반 엑소좀은 면역 반응을 조절하기 위하여 세포 없는 소포로 작동할 수 있었습니다. 본 백서에서는 GM-CSF를 발현하는 ESC로부터 고품질 엑소좀 농축 전기자동차를 생산하는 상세한 방법이 설명되어 있다. 이 엑소좀 농축 된 전기 는 면역 반응을 조절하기 위해 면역 조절 소포역할을 할 가능성이 있습니다.
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Protocol
1. ES-D3 세포 배양
- 외성 없는 태아 소 혈청(FBS)을 생성하려면 FBS를 4°C에서 16시간 동안 100,000 x g의 초원심분리기 및 원심분리기로 로드합니다. 원심분리에 따라, 뮤린 ESC 세포주 ES-D3를 배양하고 엑소좀 농축 된 전기를 획득하기 위한 외성 없는 FBS로서 혈청 상피물을 수집합니다.
- ES-D3 세포를 도금하기 전에 실온에서 젤라틴(0.1%)을 사용하여 15cm 조직 배양 접시를 30분 동안 코팅합니다.
- 이전에 설명된프로토콜(16)에이어, 젤라틴 코팅 15cm 조직 배양식에서 피더 층 세포없이 ES-D3 세포를 배양한다. ES-D3 세포 배양 배지는 DMEM으로 구성되며, 엑소좀 없는 FBS(15%), 비필수 아미노산(0.1mM), L-글루타민(2mM), β-메르카토에탄올(0.1mMM), 페니실린(50단위/mL), 연쇄상구(50μg/mL), 백혈병 억제제 인자(LIF; 10000mL) 배양 ES-D3 세포는 37°C에서 5%CO2 가습인 인큐베이터에서.
- ES-D3 세포가 15cm 조직 배양 접시에 약 90%의 합류에 도달하면 포부로 배지를 제거합니다. 트립신 (5 mL; 0.05 %)을 사용하여 세포를 세척합니다. 접시에 트립신 (5 mL)을 추가하고 5 분 동안 37 °C에서 배양하십시오. 요리에서 세포를 수집합니다.
- 수집된 세포에 신선한 배양 배지(5mL)를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 세포를 390 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 신선한 배지에서 세포를 다시 중단하고 혈종계를 사용하여 세포 수를 결정합니다.
- 월세 세포의 경우, ES-D3 세포(5 x106)를젤라틴 코팅(0.1%) 15cm 조직 배양 접시에 신선한 배지(15mL) 및 배양으로 플레이트하여 세포를 세분화하기 전에 3일간 한다.
- 외음이 농축된 전기자동차의 분리를 위한 세포 배양 상체를 수집하기 위해, ES-D3 세포(1 x 107)를젤라틴 코팅(0.1%) 15cm 조직 배양 접시에 신선한 배지(15mL)로 플레이트하여 세포 배양 상류체를 수집하기 전에 3일간 한다.
2. GM-CSF 발현 플라스미드 세대
참고: ES-D3 세포에서 GM-CSF를 과발하게 하기 위해 트랜스포마이트 플라스미드 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP를 생성한다. 본 플라스미드에서, 마커 단백질과 함께 뮤린 GM-CSF cDNA의 발현은 인간 폴리펩티드 사슬 연신인1α(EF1α) 프로모터17,18에의해 구동된다.
- 벡터 백본을 생성합니다.
- 2시간 동안 37°C에서 37°C에서 제한 효소 EcoRI(100단위)를 이용하여 플라스미드 pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP(DNA의 20μg)를 소화하여 벡터 백본(6.0kb) 및 FD3ER 인서트(2.5kb)를 생성한다.
- 소화된 플라스미드 DNA(10μg)를 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기고 알칼리성 인산염(20대)으로 1시간 동안 37°C로 치료한다. 아가로즈 젤 전기포진(2%)을 사용하여 치료되지 않은 DNA와 탈포증 DNA를 모두 해결합니다.
- DNA 겔 추출 키트를 사용하여 벡터 백본 DNA 단편(6.0 kb)을 정화한다. 처리되지 않은 벡터 백본은 빈 벡터(pEF1α-IRES-hrGFP)로 작용하지만, 탈포량 벡터 백본은 GM-CSF-발현 플라스미드(pEF1α-mGM-CSRES-HrGFP)를 생성하는 데 사용될 것이다.
- GM-CSF cDNA 인서트를 생성합니다.
- 플라스미드 pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19(20 μg)를 사용하여 37°C에서 37°C에서 2시간 동안 2개의 DNA 단편을 생성한다: 벡터 백본(6.5 kb) 및 뮤린 GM-CSF cDNA 삽입물(474bp).
- 아가로즈 젤 전기포진(2%)을 통해 소화된 DNA를 해결한다. DNA 젤 추출 키트를 사용하여 뮤린 GM-CSF cDNA 단편(474bp)을 정화합니다.
- 발현 플라스미드를 생성합니다.
- DNA 결찰 키트를 사용하여 2개의 결찰 반응(10 μL 총 부피)를 설정합니다.
- 빈 벡터 pEF1α-IRES-hrGFP를 생성하려면, 처리되지 않은 벡터 백본을 단계 2.1.3(6.0 kb; 500 ng)에서 리게이트한다.
- pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP를 생성하기 위해, 다음 DNA 단편을 리게이트: (1) 단계 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) 및 (2) mGM-CSF cDNA 단편은 단계 2.2.2(474bp; 200 ng)에서 생성된 mGM-CSF cDNA 단편으로부터 의 경우
- 5 분 동안 25 °C에서 리게이트. 결찰된 DNA를 DH5α 유능한 대장균 세포로 변환합니다. 카베니실린(50 μg/mL)을 함유한 LB-agar 플레이트에 변형된 대장균 세포를 플레이트.
- DNA 격리 키트를 사용하여 단일 대장균 콜로니에서 플라스미드를 정화합니다. DNA 시퀀싱에 의해 플라스미드의 정체성을 검증합니다.
- DNA 결찰 키트를 사용하여 2개의 결찰 반응(10 μL 총 부피)를 설정합니다.
3. GM-CSF를 과발현하는 ES-D3 세포의 생성
참고: PLAsmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP를 통해 ES-D3 세포를 트랜스펙트하여 GM-CS를 과발성한다. 코트랜스펙트는 안정적으로 전염된세포(18,20)의선택을 용이하게 하기 위해 ES-D3 세포로 플라스미드 pBabe-Neo를 한다.
- 플라스미드를 ES-D3 세포로 전환합니다.
- ES-D3 세포(1.4 x106)를젤라틴 코팅(0.1%) 10cm 조직 배양 접시에 배양 배지(10mL)로 플레이트한다. 배양은 24h에 대한 37°C에서 ES-D3 세포를 도금하였다.
- 1.5mL 마이크로센트심분리기 튜브에 2개의 플라스미드 혼합물을 준비: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, 벡터 제어) pBabe-Neo (4 μg) 및 (2) pEF1α-mGM-IRES-hrGFP (28 μg, 익스프레스 GM-CSF).. 제조업체의 프로토콜에 따라 트랜스페트 키트를 사용하여 트랜스페트를 수행합니다.
- 플라스미드 혼합물을 함유한 각 튜브에 경질 배지(1mL) 및 형질 계약 시약(64 μL)을 넣고 실온에서 5분 동안 배양한다.
- ES-D3 세포의 각각 10cm 접시에 경피 혼합물을 추가합니다. 5 시간 동안 37 °C에서 인큐베이션하십시오.
- 10cm 의 접시에 중간을 신선한 배양 매체 (10 mL)로 교체하십시오. 24 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 안정적으로 전감염된 ES-D3 세포의 대량 집단을 생성합니다.
- 감염된 ES-D3 세포에서 배지를 제거합니다. 트립신 (2 mL; 0.05 %)으로 세포를 씻으십시오. 트립신 (2 mL)을 추가하고 5 분 동안 37 °C에서 배양하십시오. 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 트립신을 중화하기 위해 신선한 배양 배지 2mL를 추가한다. 390 x g의 원심분리기는 5분 동안.
- 신선한 배양 배지(10mL)에서 감염된 세포를 다시 중단한다. 제조업체의 프로토콜에 따라 형광 활성화 세포 정렬(FACS)을 사용하여 감염된 ES-D3 세포에서 GFP의 형광 강도를 평가합니다.
- 감염된 세포를 신선한 배양 배지(10mL)를 함유한 2개의 10cm 요리로 옮는다. 비감염 된 세포를 제거 하는 네오 마이신 (0.5 mg/mL)를 추가 합니다.
- 네오마이신을 함유하는 배양 배지에서 감염된 세포를 계속 배양한다(0.5 mg/mL). 감염된 ES-D3가 90%의 합류에 도달하면 세포를 15cm 조직 배양 접시로 다시 옮기. 2 주 동안 절차를 반복하십시오.
- 안정적으로 전감염된 ES-D3 세포의 클론을 생성합니다.
- 안정적으로 감염된 ES-D3 세포의 대량 인구가 생성되면 이전과 같이 세포를 수집하십시오. 혈종계를 사용하여 세포 수를 결정합니다. 세포를 390 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 신선한 배양 배지에서 세포(1 x 107 세포/mL)를 다시 중단합니다.
- 멸균 40 μm 세포 여과기를 통해 세포를 필터링합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 FACS를 사용하여 GFP 양성 ES-D3 세포를 정화합니다.
- 단일 정렬 ES-D3 세포를 신미신 프리 배지(200 μL)에서 부모 ES-D3 세포(1 x103)를포함하는 젤라틴 코팅(0.1%) 96웰 조직 배양 판의 1웰에 플레이트. 감염된 ES-D3 세포를 감염되지 않은 부모 대응과 공동 배양하면 확실하게 감염된 단일 ES-D3 세포가 단일 클론으로 생존하고 증식되도록 합니다.
- 세포를 48h에 배양한 다음, 네오마이신(0.5 mg/mL)을 96웰 플레이트에 추가하여 감염되지 않은 부모 ES-D3 세포를 제거한다.
- 1주일 동안 네오마이신(0.5 mg/mL)을 함유한 배지를 가진 96웰 조직 배양 판에서 GFP 양성 ES-D3 세포를 계속 배양한다. 1주일 동안 네오마이신(0.5 mg/mL)을 함유한 배양 배지(5mL)를 함유한 6cm 조직 배양식에 클로날 ES-D3 세포주를 전달한다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 FACS를 사용하여 각 전자 감염된 ES-D3 세포 클론에서 GFP 형광의 강도를 결정합니다. GM-CSF 또는 높은 수준의 녹색 형광을 가진 빈 벡터를 표현하는 ES-D3 클론을 선택합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 뮤린 GM-CSF ELISA 키트를 사용하여 ES-D3 세포에 의해 분비된 GM-CSF의 양을 결정합니다.
4. 외성 농축 세포 외 소포의 격리
- ES-D3 세포(1 x 107)를15cm 조직 배양 배양식에서 37°C에서 72h로 배양한다. 세포 배양 상체를 수집합니다. 외경 무결성을 유지하기 위해 최대 1 주일까지 4 °C에서 상체 수집 된 상점.
- 원심분리기는 4°C에서 60분 동안 5,000 x g에서 세포 배양 상피물을 퇴적시키기 위해 원심분리기를 사용하여 큰 세포 단편을 퇴적시한다.
- 초원심분리기를 사용하여 4°C에서 90분 동안 100,000 x g에서 상피 및 원심분리기를 수집합니다.
- 상부체를 제거합니다. 잔류 배양 상류체를 제거하기 위해 인산염 완충식식염수(PBS; 1 mL)로 각 펠릿을 두 번 부드럽게 헹구십시오.
- PBS에서 각 펠릿을 다시 중단합니다. 그들의 단백질 함량에 의해 엑소좀 농축 된 전기를 정량화5.
- 비신천산(BCA) 분석으로 외식이 풍부한 전기자동차의 단백질 농도를 측정합니다. ES-D3 세포로부터의 외성 농축 전기자동차의 예상 수율은 세포 배양 상류제의 약 4μg 단백질/mL이다. PBS에서 외성 농축 된 전기를 다시 중단합니다 (단백질 농도 : ~ 6 μg / μL). 엑소좀 농축 된 전기 를 -80 °C에 저장합니다.
5. 전염 전자 현미경 검사법에 의한 외형 농축 세포 소포의 특성화
참고: 투과 전자 현미경(TEM)5를이용하여 ESC로부터 분리된 외종 농축 전기자동차의 조성 및 구조를 조사한다.
- 2 시간 동안 실온에서 2 % EM 등급 파라 포름알데히드의 최종 농도로 엑소솜 농축 전기 자동차 (3-5 μg /μL)를 수정합니다.
- 탄소 지원 필름을 사용하여 고정 시료(10μL)를 구리 그리드에 적재합니다. 샘플을 구리 그리드로 1분 동안 배양한 다음 필터 용지로 그리드를 배출합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 염색 솔루션으로 그리드를 얼룩지게 합니다.
- 핀셋을 사용하여 그리드를 필터 용지로 전송합니다. 전력망이 실온에서 하룻밤 사이에 건조되도록 합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 전송 전자 현미경(50,000배감)을 사용하여 전자 현미경 이미지를 획득합니다.
6. 서쪽 얼룩 분석에 의한 외성 농축 세포 외 소포의 평가
- 전체 셀 추출물을 준비합니다.
- 15cm 접시에서 배양된 ES-D3 세포에서 배지를 제거합니다. 트립신 (5 mL; 0.05 %)으로 세포를 씻으십시오. 세포에 트립신(5mL)을 추가합니다. 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 수집하고 트립신을 중화하기 위해 신선한 배양 배지 (5 mL)를 추가합니다. 세포를 390 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. PBS에서 세포를 다시 중단합니다.
- 혈전계를 사용하여 세포 수를 결정합니다. 세포를 390 x g에서 5 분 동안 다시 원심 분리합니다. 0.5% SDS(5,000셀/μL)를 포함하는 SDS-PAGE 로딩 버퍼에서 셀을 다시 일시 중지합니다.
- 10% 진폭이 있는 초음파 처리기(wattage: 500W; 초음파 주파수: 20kHz)를 사용하여 10초 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 샘플을 100°C에서 5분 동안 가열합니다.
- 엑소좀 농축 된 EV의 용하를 준비합니다.
- 1.2 μg/μL 의 농도에서 0.5% SDS를 포함하는 SDS-PAGE 적재 버퍼에서 엑소솜 농축 된 전기를 다시 중단합니다.
- 10% 진폭이 있는 초음파 처리기(wattage: 500W; 초음파 주파수: 20kHz)를 사용하여 10초 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 샘플을 100°C에서 5분 동안 가열합니다.
- 서양 얼룩에 의해 단백질을 감지합니다.
- 전세포 추출물(10μL; 5,000세포/μL) 및 외성 농축 EV 용액(10μL; 1.2 μg/μL)을 비스 트리스 PAGE 젤(4-20%)의 각 웰에 적재한다. 폴리 비닐리덴 불소 (PVDF) 막에 단백질을 전달합니다.
- 적절한 1 차 및 이차 항체를 가진 막을 배양합니다. PBS, Tween-20 (0.2%), 비지방 건조 우유 (10 % w /v)를 포함하는 블로팅 버퍼에서 항체 (아래 표시된 농도)를 희석하십시오.
- 다음 1차 항체사용: 항-부속서 V(200 ng/mL), 안티 CD81(50 ng/mL), 항 플로틸린-1(200 ng/mL), 항시토크롬 c(100) ng/mL), 항 단백질 이황화이소머라이저(200 ng/mL), 안티 GAPDH(33 ng/mL), 및 항옥스포스 COX IV-서브유닛 IV(600 ng/mL).
- 다음과 같은 이차 항체를 사용하십시오: peroxidase-접주 염소 안티래빗 IgG (20 ng/mL) 및 peroxidase-접합 염소 안티 마우스 IgG (20 ng/mL).
- 향상된 화학 발광 검출 키트를 사용하여 단백질을 감지합니다.
7. ELISA에 의해 엑소좀 농축 세포 소포에서 GM-CSF 농도 결정
참고: ELISA가 엑소좀 농축 전기자동차에서 GM-CSF의 양을 평가하는데, 이는 일부 수정으로 제조업체의 프로토콜에 따라 뮤린 GM-CSF용 키트를 사용하여 사용한다.
- ELISA 플레이트를 포획 항체로 코팅합니다. PBS단독으로 또는 PBS +0.05% Tween-20(100 μL)에서 30분 동안 외성 농축 전기자동차(0.6 μg)를 치료한다. 코팅 된 ELISA 플레이트에 처리 된 샘플을 추가하고 1 시간 동안 실온에서 배양하십시오. PBS 단독으로 또는 PBS + 0.05 % Tween-20으로 접시를 씻으십시오.
- 샘플에 검출 항체를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS 단독으로 또는 PBS + 0.05 % Tween-20으로 접시를 씻으십시오. 샘플에 아비딘 HRP를 추가합니다. 실온에서 30분 동안 배양하십시오. PBS 단독으로 또는 PBS + 0.05 % Tween-20으로 접시를 씻으십시오.
- 마이크로 플레이트 판독기에서 450nm에서 흡광도를 측정하여 외식 농축 전기 자동차에서 GM-CSF의 농도를 결정합니다.
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Representative Results
GM-CSF는 뮤린 ESC에서 과발현된다.
ES-D3 세포에서 GM-CSF를 안정적으로 과발적으로 표현하기 위해, 뮤린 GM-CSF cDNA는 발현 벡터 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(도1A)를생성하는 형질 벡터로 복제되었다. GM-CSF는 ES-D3 세포에서 과발현되었고, 과도적으로 과도하게 감염된 ES-D3 세포의 약 20%가 GFP 양성이었다. 세포 클론은 GM-CSF 또는 빈 벡터 제어를 안정적으로 과발현하는 FACS에 의해 획득되었다. 도 1B에도시된 바와 같이, GM-CSF-발현 ES-D3 세포주 또는 빈 벡터를 발현하는 ES-D3 세포주의 GFP 형광 강도는 부모의 세포보다 훨씬 높았다. ELISA 분석은 상이한 세포주의 세포배양상수에서 GM-CSF 농도를 평가하기 위해 수행되었다(도2). GM-CSF를 발현하는 ES-D3 세포는 빈 벡터 제어보다 세포 배양 상류체에서 현저하게 높은 수준의 GM-CSF를 생산하였다. 더욱이, GM-CSF-발현 ES-D3 세포에 의해 생성된 GM-CSF의 양은 GM-CSF를 발현하는 STO 섬유아세포의 양과 유사했다, 이전에 보고된 바와 같이19.
엑소좀은 뮤린 ESC에서 파생된 세포외 소포로 풍부합니다.
벡터 제어 및 GM-CSF 발현 ES-D3 세포 배양을 확대하고 세포 배양 상복부를 수집하였다. 전기는 원심 분리의 여러 단계 후에 격리되었습니다. 단일 전기는 먼저 TEM(그림 3)에의해 평가되었다. TEM 이미지에 도시된 바와 같이, 격리된 전기는 외경 제제5에서흔하게 관찰되는 다양한 크기의 소포를 함유하고 있다. 중요한 것은, 개별 소포의 직경은 30-100 nm이었다, 엑소좀을 설명하는 이전 보고서와일치(21). 더욱이, 전기자동차에서 엑소좀의 존재는 서양 블로팅(도4)에의해 조사되었다. CD81, 부속서 V 및 플로틸린-1을 포함한 외경 마커의 발현은 해당 전세포 추출물(WCE)에 비해 ES-D3 세포로부터 분리된 전기에서 현저하게 향상되었다. 중요한 것은, ES-D3 유래 전기자동차에서 다른 세포전 구획 마커의 존재는 검출되지 않았으며, (1) 내피 성 망상(ER) 마커 단백질 이황화증 이소머라제(PDI), (2) 미토콘드리아 마커 시토크롬 c 및 COX IV-서브유닛 IV, (3) 사이토콘소 카포체 마커. 전반적으로, 이 데이터는 엑소좀이 ES-D3 세포에서 파생된 전기에서 높게 농축되었다는 것을 보여줍니다.
GM-CSF는 ESC로부터 분리된 외민농축 세포외 소포 내부에 국한된다.
엑소좀 농축 된 전기가 GM-CSF 분자를 포함하는지 여부를 결정하기 위해 ELISA 분석은 GM-CSF 발현유 유무에 관계없이 ES-D3 세포로부터 획득한 엑소좀 농축 전기에서 GM-CSF의 수준을 평가하기 위해 수행되었다(그림5). 엑소좀 농축 전기자동차 내에서 GM-CSF 단백질 국산화를 더욱 조사하기 위해, GM-CSF 수준은 ELISA에 의한 다른 세척 조건 하에서 외형 농축 전기자동차에서 양으로 양화되었다. 이를 위해, 세제 Tween-20(0.05%)은 먼저 외경 막을 과소화하기 위해 사용되었고, ELISA 애사는 0.05% Tween-20의 유무에 관계없이 완충제에서 수행되었다. Tween-20은 단백질-단백질 상호 작용을 감소시키는 것으로 알려져 있기 때문에, 대조군 전기자동차에서 검출된 배경GM-CSF 수준은 세척 완충제에서 Tween-20에 의해 현저히 감소되었다. 대조적으로, GM-CSF 발현 세포의 전기에 있는 GM-CSF 수준은 Tween-20에 의해 현저하게 증가했습니다. 이러한 결과는 Tween-20 유도된 외경 막 과구화가 GM-CSF 분자를 항체 인식을 위해 접근할 수 있게 하여, 대부분의 외민성 GM-CSF 분자가 고립된 소포의 루멘 내부에 국한된다는 증거를 제공한다는 것을 보여준다.
도 1: 외인성 GM-CSF는 ES-D3 세포에서 안정적으로 과발현된다.
(A)EF1α 프로모터가 GM-CSF 발현 및 hrGFP를 구동하는 ES-D3 세포에서 murine GM-CSF를 과발표현하기 위한 플라스미드의 회로도도는 발현 마커역할을 한다.
(B)GM-CSF-발현 ES-D3 세포 또는 그들의 빈 벡터 대조군에서 GFP의 형광 강도는 FACS에 의해 결정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: GM-CSF를 과발현하는 ES-D3 세포는 높은 수준의 GM-CSF를 생성합니다.
표시된 세포의 배지에서 GM-CSF 농도는 ELISA에 의해 측정되었다. 데이터는 세 가지 독립적 인 ELISA 측정의 표준 편차 (평균 ± SD)± 의미로 제공됩니다 : **p < 0.001, NS = 중요하지 않음, Tukey의 다중 비교 테스트와 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: ES-D3 유래 세포 외 소포는 전염 전자 현미경 검사법에 의해 검사됩니다.
세포외 소포는 GM-CSF 또는 빈 벡터 대응으로 플라스미드를 발현하는 ES-D3 세포로부터 제조되었다. 화살표는 개별 소포를 나타냅니다. 스케일 바 = 100 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 외경 마커는 ES-D3 세포로부터 분리된 세포외 소포에 고도로 농축된다.
엑소좀, 내피성 망상(ER), 미토콘드리아 및 사이토솔을 위한 마커의 양은 표시된 전세포 추출물(WCE) 및 EV에서 서양 블로팅에 의해 평가되었다. PDI = 단백질 이황화이이솜라이. 분자량 마커(kD)가 왼쪽에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 외민이 풍부한 세포 외 소포에서 GM-CSF 수준의 평가.
표시된 엑소좀 농축 전기 자동차에서 GM-CSF의 수준은 다른 ELISA 조건하에서 결정되었다. 엑소좀 농축 전기자동차는 0.05% Tween-20의 유무에 관계없이 전처리되었다. ELISA는 PBS 전용 또는 PBS + 0.05% Tween-20을 포함하는 세척 버퍼를 사용하여 수행하였다. 데이터는 세 가지 독립적 인 ELISA 분석의 평균 ± SD로 제공됩니다. *p < 0.05, **p < 0.005, Tukey의 여러 비교 테스트와 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구는 면역 자극성 단백질 GM-CSF를 운반하는 외성 농축 된 전기를 생산하는 매우 효율적인 방법을 보여줍니다, 이는 외식 농축 된 EV의 면역 변조 효과를 연구하기 위해 사용할 수 있습니다. 몇몇 연구 결과는 엑소좀이 면역 조절 및 항종양 기능을 전시한다는 것을 건의합니다22. 따라서, GM-CSF를 표현하는 ESCs에서 엑소솜은 또한 면역 반응을 통제하는 생물학 활동을 소유할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 외인성 뮤린 GM-CSF는 형질전환에 의한 뮤린 ES-D3 세포에서 안정적으로 과발현되었다(도1). 중요하게도, GM-CSF의 상당량은 GM-CSF(도5)를과발현하는 ES-D3 세포로부터 분리된 엑소좀 농축 전기자동차에서 검출되었다.
이러한 데이터는 거의 모든 GM-CSF가 외민 농축 된 전기 자동차 내에 있음을 시사합니다. 사이토카인으로서, GM-CSF 단백질의 대다수는 세포외11을분비한다. 다른 외경화물 물질(예를 들어, mRNA, miRNAs 및 단백질)과 마찬가지로, 시토솔내의 GM-CSF 분자는 다중 혈관 체체(MVBs)의 내탈루피 소포(IlV)에 캡슐화된다6,23. MV를 플라즈마 멤브레인과 융합하면 GM-CSF 운반 일루프가 세포 외 공간으로 방출됩니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 뮤린 ES-D3 세포에서 GM-CSF를 효과적으로 과발현하는것이다(도 2). 레트로바이러스 감염에 의한 이 목표를 달성하기 위한 초기 노력은 ESC24의전사 수준에서 레트로바이러스 유전자 발현의 억제 로인해 크게 실패했습니다. 검사된 몇몇 바이러스 성 및 세포 프로모터 중, 인간 EF1α 프로모터는 ES-D3 세포에서 가장 강력한 활성을 보였다. 중요한 것은, EF1α 프로모터의 통제 하에 있는 트랜스진 발현은 전도된 ES-D3 세포의 장기 세포 배양에 따라 안정적으로 유지되었다. 다른 세포 유형에서 외인성 GM-CSF를 표현하기 위해 다양한 프로모터의 효율성을 평가하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 이러한 방법의 적용은 GM-CSF 베어링 엑소좀 농축 전기자동차를 다양한 사이토카인을 발현하도록 설계된 종양 세포뿐만 아니라 다른 줄기세포 유형으로 확대될 수 있다. GM-CSF처럼 대부분의 사이토카인은 세포외25로분비됩니다. 따라서, 이러한 접근법의 가능한 한계는 엑소좀 농축 된 전기 에 축적된 주어진 사이토카인의 양이 생물학적 활성을 나타내기에는 너무 낮다는 것이다. 특정 사이토카인의 경우, 외형이 풍부한 전기 자동차에서 단백질 수준과 생물학적 활동을 최적화하기 위해 새로운 연구가 수행되어야 합니다.
이 연구에서 가장 중요한 장애물은 GM-CSF를 과발현하는 ES-D3 클론을 생성하는 것입니다. 흉부 상태를 유지하고 체외에서 세포 증식을 촉진하기 위해, 뮤린 ESC는 일반적으로 피더세포(26)의존재에서 배양된다. ESC에서만 엑소좀을 획득하기 위해, 배양ESC(27)에 대한 피더 셀 프리 프로토콜이 채택되었다. 이 연구에서, ES-D3 세포는 LIF로 보충 된 매체를 사용 하 여 젤라틴 코팅 요리에서 배양 되었다. 이러한 배양 조건 하에서 ES-D3 세포의 단일 클론의 플레이트 효율 과 증식은 극히 낮았으며 단일 세포에서 ES-D3 클론을 생성하는 것이 매우 어려웠습니다. 부모 ES-D3 세포로부터 얻은 조건부 배지의 첨가는 도금 된 단일 ES-D3 세포의 증식 결핍을 구출하지 못했다. 이러한 한계를 극복하기 위해 GM-CSF를 과발현하는 단일 ES-D3 세포가 부모 ES-D3 세포와 함께 도금되었습니다. 이 도금 접근법은 GM-CSF 표현 단일 ES-D3 클론의 생존가능성을 향상시켰으며, 복제 확산 과 확장을 용이하게 했습니다. 일단 전감염되면, 단일 ES-D3 클론은 분명히 조직 배양 판에 부착됩니다. 그(것)들은 그밖 ES-D3 세포의 존재에 관계없이 증식, 부모 ES-D3 세포가 도금된 후에 48 h를 제거했기 때문에, 단지 전감염된 단 하나 ES-D3 세포가 성장할 수 있었습니다.
전반적으로, 다른 질병 조건에서 면역 반응을 자극할 수 있는 잠재력을 가진 ESC로부터 GM-CSF를 운반하는 엑소좀 농축 전기자동차를 성공적으로 생성하는 프로토콜이 개발되었다. 더욱이, 최근 발표된 연구결과에 따르면 ESC의 GM-CSF 베어링 엑소좀 농축 전기자동차는암(28)에대한 세포 없는 예방 백신역할을 할 수 있다는 것을 보여준다.
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Disclosures
카비타 야다나푸디, 치 리, 존 W. 이튼은 미국 특허 출원을 제출 "엔지니어링 배아 줄기 세포 유래 엑소좀과 그 사용 방법을 포함하는 조성물."
Acknowledgments
우리는 전송 전자 현미경 이미지를 획득하기 위한 Arkadiusz Slusarczyk 및 켄터키 생물 의학 연구 인프라 네트워크 (KBRIN, P20GM103436)에 감사드립니다. 이 작품은 NIH AA018016-01 (J.W.E.), 켄터키 연구 챌린지 트러스트 펀드 (J.W.E.), NIH CA106599 및 CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.), 무료 호흡 연구 (K.Y.)의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
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