Summary
Cet article décrit une méthode pour monter les embryons fragiles de poisson zèbre pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée. Cette méthode à faible coût est facile à exécuter en utilisant des plats de microscopie à fond de verre réguliers pour l'imagerie sur n'importe quel microscope inversé. Le montage est effectué en couches d'agarose à différentes concentrations.
Abstract
La dynamique du développement peut être suivie d'une microscopie confocale en accéléré d'embryons transgéniques vivants de poissons zèbres exprimant la fluorescence dans des tissus ou des cellules spécifiques. Une difficulté avec le développement entier d'embryon d'imagerie est que les embryons de poisson zèbre se développent sensiblement dans la longueur. Lorsqu'elle est montée comme régulièrement fait dans 0.3-1% agarose basse de fonte, l'agarose impose la restriction de croissance, menant aux distorsions dans le corps mou d'embryon. Pourtant, pour effectuer une microscopie confocale en time-lapse, l'embryon doit être immobilisé. Cet article décrit une méthode de montage en couches pour les embryons de poisson zèbre qui limitent la motilité des embryons tout en permettant la croissance sans restriction. Le montage est effectué en couches d'agarose à différentes concentrations. Pour démontrer la facilité d'utilisation de cette méthode, le développement vasculaire, neuronal et musculaire d'embryon entier a été imaged dans les poissons transgéniques pendant 55 heures consécutives. Cette méthode de montage peut être utilisée pour l'imagerie facile et peu coûteuse d'embryons entiers de poisson zèbre à l'aide de microscopes inversés sans exigences de moules ou d'équipement spécial.
Introduction
Le poisson zèbre a longtemps été un organisme modèle pour la biologie du développement, et la microscopie est la principale méthode pour visualiser le développement embryonnaire. Les avantages de l'utilisation d'embryons de poisson zèbre pour les études de développement comprennent la petite taille, la clarté optique, le développement rapide et la fécondité élevée des poissons adultes. La génération de lignées transgéniques de poissons zèbres exprimant la fluorescence dans certains tissus ou cellules a permis une visualisation directe du développement des tissus d'une manière qui n'est pas possible avec les plus grands vertébrés. En combinaison avec la microscopie time-lapse, les détails et la dynamique du développement des tissus peuvent être facilement étudiés.
Une difficulté avec le développement de poisson zèbre d'imagerie est que les embryons se développent sensiblement dans la longueur ; l'embryon étend sa longueur quatre fois dans les 3 premiers jours de la vie1. En outre, le corps de l'embryon précoce est mou, et devient facilement déformé si la croissance est limitée. Pourtant, pour effectuer une microscopie confocale, l'embryon doit être immobilisé. Pour maintenir les embryons dans une position fixe pour l'imagerie confocale en accéléré, ils sont régulièrement anesthésiés et montés en agarose à faible fonte de 0,3 à 1 %. Cela a l'avantage de permettre une certaine croissance pendant l'imagerie pendant une certaine période de temps, tout en limitant les mouvements de l'embryon. Certaines parties de l'embryon peuvent être efficacement représentées comme ceci. Cependant, lors de l'utilisation de cette méthode pour l'imagerie de l'embryon entier pendant de longues périodes de temps, des distorsions sont observées en raison de la croissance restreinte causée par l'agarose. Ainsi, d'autres méthodes de montage sont nécessaires. Kaufmann et ses collègues ont décrit un montage alternatif d'embryons de poisson zèbre pour la microscopie par feuille de lumière, comme la microscopie sélective d'éclairage d'avion (SPIM), en montant les embryons dans des tubes de propylène d'éthylène fluoré (FEP) contenant de faibles concentrations d'agarose ou de méthylcellulose2. Cette technique produit une superbe visualisation de l'embryogenèse au fil du temps. Schmid et coll. décrivent le montage de jusqu'à six embryons dans l'agarose dans les tubes FEB pour la microscopie de feuille de lumière3 fournissant la visualisation de plusieurs embryons dans une session d'imagerie. Les moules ont été utilisées pour créer des tableaux d'embryons pour le montage efficace d'un plus grand nombre d'embryons4. Masselkink et coll. ont construit des moules en plastique imprimés en 3D qui peuvent être utilisés pour fabriquer des moulages de silicium dans lequel les embryons de poissons zèbres à différents stades peuvent être placés, permettant le montage dans une position constante pour l'imagerie, y compris l'imagerie confocale5. L'impression 3D a également été utilisée pour fabriquer des moules pour un positionnement cohérent des embryons de poissons zèbres dans le format6de 96 puits. Certains moules sont personnalisés pour certaines étapes et peuvent ne pas permettre une croissance illimitée pendant de longues périodes, tandis que d'autres moules sont plus flexibles. Récemment, Weijts et coll. ont publié la conception et la fabrication d'un plat à quatre puits pour l'imagerie en direct des embryons de poissons zèbres7. Dans ce plat, la queue et le tronc des embryons de poissons anesthésiés sont placés manuellement sous un toit en silicone transparent fixé juste au-dessus d'un verre de couverture pour former une poche. L'embryon est alors fixé dans cette position par l'ajout de 0,4% agarose. Ce montage permet l'imagerie de la partie postérieure d'environ 2 mm de long (tronc et queue) de l'embryon, et comme jusqu'à 12 embryons peuvent être montés par puits, la méthode permet l'imagerie de plusieurs échantillons. De même, Hirsinger et Steventon ont récemment présenté une méthode où la tête du poisson est montée en agarose, tandis que la queue peut se développer librement, et cette méthode facilite également efficacement l'imagerie de la région du tronc et de la queue de l'embryon8.
Cet article décrit une méthode de montage en couches pour les embryons de poisson zèbre qui restreignent les mouvements des embryons tout en permettant une croissance illimitée. Les avantages de cette méthode de montage sont qu'il s'agit d'une méthode peu coûteuse, rapide et facile pour monter des embryons de différentes étapes pour l'imagerie à l'aide de n'importe quel microscope inversé. Le montage permet l'imagerie à long terme de l'ensemble du corps (tête, tronc et queue) pendant le développement de l'embryon. Pour mettre en valeur la convivialité de cette méthode, le développement vasculaire, neuronal et musculaire de l'embryon entier a été représenté chez des poissons transgéniques. Deux embryons par session, à deux longueurs d'onde en 3D ont été photographiés par microscopie en time-lapse pendant 55 heures consécutives pour rendre des films de développement de tissu.
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Protocol
Le travail animalier présenté ici a été approuvé par les Comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux (CCIA) de l'Université de Houston et de l'Université de l'Indiana.
1. Élevage de poissons
REMARQUE : Le travail avec des modèles de vertébrés nécessite un protocole approuvé par l'IACUC. Elle doit être menée conformément aux directives nationales et internationales pertinentes.
- Maintenir le poisson zèbre adulte tel que décrit dans la littérature publiée précédemment9.
- L'après-midi, placez le poisson zèbre adulte dans des réservoirs de reproduction. Races mâles/femelles à un rapport de 1:2.
2. Préparation de solutions
- Faire une solution de stock de 1% de faible fonte agarose dans les médias embryonnaires (E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, ajusté au pH 7,0). Aliquot la solution de stock dans des tubes de 1,5 ml et les stocker à 4 oC.
- Faire une solution de stock de 4% (w/v) Tricaine (MS-222) dans de l'eau distillée. Conserver à 4 oC dans une bouteille foncée.
CAUTION: La tricaine est toxique et doit être pesée et dissoute dans une hotte de fumée. - Faire une solution de stock de 20 mM N-phénylthiourea (PTU) dans de l'eau distillée. Conserver à -20 oC.
3. Préparation des embryons
- Après l'accouplement, récoltez les embryons en E3 dans un plat Petri et incubez-les à 26,5 oC pendant environ 28 h avant de monter.
REMARQUE : Cela ralentit le développement des embryons de sorte que les embryons soient environ à 30 stadesomite au début de l'imagerie. - Anesthésiez les embryons en 0,016-0,020% Tricaine dans l'E3. Pour inhiber la pigmentation, ajouter le PTU à une concentration de 200 M.
- Déchorionate les embryons à l'aide de forceps sous un microscope à disséquer. À l'aide de deux forceps, agrippez-le et tirez doucement le chorion pour libérer l'embryon.
4. Montage en agarose
REMARQUE : La méthode de montage développée exige deux concentrations différentes d'agarose à faible fusion dans l'E3 avec 0,02% de Tricaine et de PTU au besoin. La première solution agarose contient une concentration optimale d'agarose à laquelle la distorsion et la motilité sont au minimum. L'optimisation est décrite à l'étape 5 ci-dessous.
- Chauffer les solutions d'agarose pour les deux couches (concentration définie à l'étape 5 ci-dessous et 1%) à 65 oC. Laisser l'agarose refroidir à environ 30 oC juste avant le montage afin que l'embryon ne soit pas endommagé par la chaleur. Pour le montage, utilisez des plats à fond de verre de 35 mm avec un fond de verre de couverture no 0. Le verre de couverture fixé au fond du plat crée un puits de 10 mm de profondeur (environ 1,2 mm de profondeur), dans lequel l'embryon doit être placé.
REMARQUE: Dans ce cas, la concentration avec le moins de motilité et de distorsions se situent entre 0,025 et 0,040% agarose. - Placez délicatement un embryon déchorionavec l'un de ses côtés latéraux vers le fond du plat à l'aide d'une pipette en verre ou d'une micropipette. Si vous utilisez une micropipette, couper la partie extérieure de la pointe pour augmenter la taille de l'ouverture pour s'adapter à l'embryon (Figure 1A). Retirez soigneusement l'E3 restant à l'eau avec une micropipette.
- Ajouter la première solution d'agarose au petit puits créé par le verre de couverture fixé au fond du plat pour couvrir l'embryon (couche 1) (Figure 1B). Assurez-vous que l'agarose couvre le petit puits, mais ne sera pas le déborder.
- Couvrir le petit puits d'un verre de couverture (22 mm x 22 mm) (Figure 1C) pour créer un espace étroit rempli d'agarose avec l'embryon entre les deux verres de couverture.
- Placer une couche de 1% de solution d'agarose sur le dessus du verre de couverture sur tout le fond du plat (couche 2) (Figure 1D). Comme cette couche se solidifie, elle maintient le verre de couverture en place.
- Remplissez la partie restante du plat avec e3 contenant 0,02% de Tricaine pour garder le système hydraté (couche 3) (Figure 1E).
REMARQUE: Dans cette configuration, le verre de couverture et 1% agarose protéger la couche inférieure de se diluer.
5. Optimisation de la solution agarose pour la couche 1
- Pour identifier la concentration optimale d'agarose pour la couche 1, utilisez une approche de recherche de grille à plusieurs échelles. Montdes embryons dans des concentrations croissantes d'agarose allant de 0,01% à 1% suivie par l'imagerie en time-lapse de la restriction de la croissance des embryons et la motilité dans le domaine de vision. Identifiez les concentrations où la distorsion et la motilité sont au minimum.
- Pour optimiser davantage la concentration d'agarose, monter les embryons à l'aide d'une gamme plus fine de concentrations d'agarose (p. ex., entre 0,025 et 0,040% d'agarose) en fonction de la concentration jugée la meilleure à l'étape 5.1 (p. ex. 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
REMARQUE : Dans notre laboratoire, la concentration optimale d'agarose était d'environ 0,03%.
6. Imagerie en accéléré
REMARQUE : Cette méthode de montage fonctionne pour n'importe quel microscope inversé avec la fonctionnalité time-lapse pour la fluorescence et l'imagerie lumineuse de champ.
- Effectuez l'imagerie en accéléré pour l'embryon entier ou les parties de celui-ci jusqu'à 55 h. Pour l'imagerie de plusieurs embryons, utilisez un adaptateur de scène qui contient plusieurs plats avec un embryon monté par plat. Faites pivoter les plats un par un de sorte que les embryons soient placés à peu près horizontalement selon les yeux. Pour une croissance et un développement optimaux de l'embryon, utilisez un stade de microscope avec un incubateur fixé à 28,5 oC.
- Sélectionnez un objectif de grossissement faible dans le logiciel de microscope. Sous l'œil, localiser et aligner finement les embryons horizontalement en tournant les plats à l'aide d'un éclairage lumineux du champ et enregistrer leurs emplacements dans le logiciel. Créez un nom de fichier pour l'enregistrement automatique des données.
REMARQUE : Dans cette expérience, un objectif de plan apo 4x 0.2 NA et l'onglet XY dans la fenêtre d'acquisition ND ont été utilisés pour enregistrer l'emplacement des embryons. Les données ont été enregistrées en format .nd2. L'objectif a été sélectionné en cliquant sur ses icônes dans l'onglet Ti Pad. - Définir la taille du sténopé, la vitesse d'analyse, la taille de l'image et le zoom. Ensuite, sélectionnez un objectif de grossissement plus élevé pour capturer les images.
REMARQUE : Dans cette expérience, un objectif plan-apo 10x 0,45 NA a été utilisé pour l'imagerie d'embryons entiers, et un objectif de super-fluor 20x 0,75 NA a été utilisé pour l'imagerie de grossissement plus élevée de parties de l'embryon. Le trou d'épingle a été fixé à 1,2 UA (19,2 m pour l'objectif 10x), la vitesse d'analyse a été fixée pour un temps de séjour de pixel de 2,4 's et la taille de l'image a été fixée à 1024 x 1024 pixels avec un zoom de balayage d'un, donnant une taille de pixel de 1,24 m pour l'objectif 10x et 0,62 m pour l'objectif 20x. - Sélectionnez les canaux pour que la fluorescence soit représentée. Ajustez les paramètres de capture d'image un canal à la fois. Pour chaque canal de fluorescence ajuster la puissance laser et le détecteur de haute tension, en veillant à recueillir la meilleure plage dynamique possible tout en évitant la saturation et en limitant le photoblanchiment.
REMARQUE: Dans cette expérience, GFP a été photographié avec le canal vert 488, (488 nm laser et l'émission entre 500 et 550 nm), et la DP avec le canal 561 rouge (561 nm laser et l'émission entre 570 et 600 nm), et l'image de transmission a été recueillie à l'aide du laser 561 nm et le détecteur de lumière transmis( canalTD ). - Pour imager l'embryon entier avec l'objectif 10x, imagez plusieurs champs de vision avec chevauchement et assemblez-les à l'aide du logiciel de microscope.
REMARQUE : Comme les embryons croissent considérablement en taille pendant l'imagerie, assurez-vous qu'il y a de l'espace dans le champ de vision antérieur et postérieur à l'embryon. Utilisez l'onglet Scan Large Image de la fenêtre d'acquisition ND et sélectionnez un modèle 4 x 1 avec un chevauchement de 10 % pour capturer quatre champs de vision adjacents. - Configurer les paramètres pour capturer les piles Z à l'aide du logiciel microscope.
REMARQUE : Comme l'embryon est monté près du fond du plat en verre, son centre s'éloignera du fond au fur et à mesure qu'il grandit. Utilisez l'onglet Z de la fenêtre d'acquisition ND et sélectionnez la plage relative asymétrique. Avec cette méthode, le plan de mise au point actuel est utilisé comme plan de référence et le reste des plans sont répartis asymétriquement au-dessus et en dessous pour inclure l'embryon entier dans le volume De la pile Z, avec suffisamment d'espace pour tenir compte de la croissance du spécimen. Dans toutes les expériences, l'intervalle a été fixé à 11 m et la portée totale à environ 45 avions. - Afin de maintenir l'accent sur plusieurs embryons pendant l'imagerie time-lapse à long terme, utilisez une mise au point automatisée. Si l'imagerie de plusieurs embryons, ajuster les niveaux de compensation individuels pour chaque embryon de se concentrer sur le plan de référence.
REMARQUE : Dans cette expérience, un système de stabilisation de mise au point laser a été utilisé. - Configurez des paramètres de time-lapse dans le logiciel et l'image de microscope pour une durée de 55 h à environ 1 h d'intervalles. À chaque cycle, capturez deux ensembles de données embryonnaires de façon séquentielle et enregistrez automatiquement les données après chaque cycle.
- Traiter les images à l'aide d'une version en ligne ou hors ligne du logiciel microscope. Si plus d'un embryon a été photographié, créez des fichiers indépendants pour chaque embryon en fractionnant l'ensemble de données en fonction de l'emplacement de l'imagerie. Utilisez des projections d'intensité maximale ou un outil similaire pour convertir les ensembles de données de temps 3D en ensembles de données de temps 2D. Créez des fichiers de films en utilisant l'option Enregistrer comme menu, en sélectionnant .avi comme format de fichier. Sélectionnez l'option Pas de compression avec des intervalles de 200 ms pour une vitesse de lecture de 5 images /s.
REMARQUE : Le jeu de données original de deux embryons dans cette expérience a été divisé à l'aide de la fonction d'emplacements Split dans le logiciel (Fichier Importation/Exportation Split Multipoints). Les jeux de données temporels 3D ont été convertis en ensembles de données temporelles 2D à l'aide de la fonction de projection d'intensité maximale (Image Traitement ND Créer l'image de projection d'intensité maximale en Z).
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Representative Results
Développement de la méthode de montage
L'objectif principal de ce travail était de développer une technique de montage à faible coût pour l'imagerie en accéléré du développement du poisson zèbre pendant de longues périodes de temps. La méthode de montage en couches a été développée pour permettre la pleine croissance du corps fragile d'embryons de poisson zèbre, tout en limitant ses mouvements. Si la concentration d'agarose de la couche 1 est trop élevée, les embryons seront déformés et courbés (figure 2). Les embryons cultivés à 0,1 % et 0,5 % d'agarose ont des queues raccourcies, des nageoires déformées et des têtes courbées. Au contraire, si la concentration d'agarose est trop faible, les embryons sortiront du champ de vision pendant la microscopie en time-lapse, même s'ils sont anesthésiés, car la queue croissante s'évade du corps embryonnaire et la fait bouger. Dans nos mains, la concentration optimale d'agarose variait entre 0,028% et 0,034% d'agarose entre les différents lots d'agarose. Monter en dessous de 0,025% agarose n'a pas fourni assez de résistance pour l'embryon de rester dans le champ de vision.
Imagerie en accéléré prolongée du développement vasculaire, neuronal et musculaire
Après avoir optimisé la méthode de montage décrite ci-dessus, des images de microscopie confocale de laps de temps ont été capturées sur une envergure de 55 h. Nous avons photographié des poissons zèbres transgéniques vivants exprimant le PPM ou la DP dans différents tissus. Un avantage de l'utilisation de poissons transgéniques avec fluorescence endogène pour l'imagerie par laps de temps est que les molécules de fluorescence, telles que le GFP et la DP, sont produites en continu dans l'embryon vivant, et, par conséquent, il n'est pas facile de photo de l'eau de Javel. Tout d'abord, des embryons d'une croix de Tg(kdr1: EGFP)mitfab692/b69210 et Ubi-zebrabow11 ont été photographiés. Dans ces embryons, la DP est exprimée dans toutes les cellules de l'embryon, ce qui permet la visualisation de la structure générale de l'embryon. Le GFP est exprimé dans les cellules endothéliales de la vascularisation. Des embryons transgéniques doubles ont été photographiés pendant 55 heures à partir d'environ 30 stadesomite pour visualiser le développement vasculaire dans la tête et le corps (Figure 3 et Film supplémentaire S1) en utilisant un objectif 10x avec 0,45 NA. Deux embryons/session ont été photographiés avec des z-stacks et time-lapse dans une boucle de sorte qu'après l'imagerie du premier embryon à deux longueurs d'onde différentes, le second a été plus tard imaged et puis le premier à nouveau. La figure 3 montre la germination du vaisseau intersegmentaire (ISV), le développement de vaisseaux sous-intestins et de la vascularisation de la tête, et la condensation de plexus veinecale caudale ainsi que l'extension du tronc. L'imagerie de l'embryon entier avec la vascularisation montre que la germination de l'ISV commence entre les somites et pousse dorement jusqu'au point du tube neural, où les ISV prend un chemin différent et pousse dans une direction au-dessus de la prochaine limite antérieure somite.
Ensuite, des embryons d'une croix de Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 et Ubi-zebrabow ont été photographiés pendant 55 heures environ à partir du stade de 30 somite pour visualiser le développement du moteur neuronal (Figure 4 et Film supplémentaire S2). Tg (mnx:GFP) avait d'abord été traversé à mitfab692/b692 (tous deux de Zebrafish International Resource Center à l'Université de l'Oregon, OU) pour produire Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629. Les axones de motorneuron germent du tube neural ventral au-dessus des somites vers le côté ventral de l'embryon. Contrairement aux vaisseaux intersegmental qui germent entre les somites, les axones germent au-dessus du milieu au-dessus des somites formés par le chevron. La germination commence vers l'extrémité antérieure du tube neural, dans un angle droit du tube neural, et se propage postérieure. Par l'interface somite/jaune, la germination change de direction pour la germination antérieure et postérieure. Notez l'innervation du cœur en développement par les neurites antérieures.
En outre, les embryons d'une croix de Tg(kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 (croisement de Tg (kdr:enl.memRFP et mitfab692/b692) et Tg (mnx:GFP)mitfab692/b692 ont été photographiés. Dans les anciens embryons, la fluorescence vasculaire rouge n'était pas visible jusqu'à 36 heures après la fécondation (hpf), et donc nous avons commencé l'imagerie à un moment ultérieur à 2 dpf. Nous avons imaginé une partie du tronc, dorsally à l'extension sac jaune, en utilisant un grossissement plus élevé (objectif 20x). Ce film montre que les embryons étaient encore assez pour une bonne qualité d'imagerie à un grossissement plus élevé. Le co-développement de la germination dorsal des axones de motorneuron par rapport à la position des vaisseaux intersegmental a été suivi (Figure 5 et Film supplémentaire S3). Dans ces films, les détails plus fins de la germination de l'axone ventral sont visibles, ainsi que l'axone dorsale poussant du tube neural à un point où les axones neuronaux et les vaisseaux intersegmental co-migrent. La condensation de plexus de veine caudale est également clairement montrée. Notez qu'à mesure qu'il manque une pousse de neurite vers l'extrémité postérieure de la queue (dans la position du 12e neurite du côté droit), le neurone postérieur le plus proche s'étend vers la partie antérieure de l'embryon pour couvrir la zone entre les névrites 11 et 13.
Enfin, une croix de HGn39b12,13 et Ubi-zebrabow a été photographié. HGn39b est une ligne zTRAP avec l'insert GFP dans l'activateur de la protéine de choc thermique ATPase homolog 1 (AHA1) gène (http://kawakami.lab.nig.ac.jp/) et il exprime GFP dans les muscles des somites (Figure 6 et Film supplémentaire S4). Comme les nombres de somite augmentent, les somites s'étendent également dans la longueur et la largeur. Ce film montre également bien le développement du cœur en fluorescence rouge de la ligne de poissons Ubi-zebrabow.
Figure 1 : Description de la méthode de montage. (A) Ajouter l'embryon de poisson zèbre au petit puits créé par le fond de verre dans le plat de 35 mm. (B) Ajouter la couche d'agarose 1 au petit puits pour couvrir l'embryon. (C) Placez soigneusement un verre de couverture sur le petit puits. (D) Ajouter la couche d'agarose 2 sur tout le fond du plat de 35 mm. (E) Ajouter l'E3 au plat. (F) Dessin schématique d'une section transversale de la mise en place du montage. (G) Image de microscope (objectif 5x) de l'embryon de poisson zèbre dans le montage final. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Restriction de la croissance des embryons et retard de développement dans différentes concentrations d'agarose. Les embryons ont été montés dans différentes concentrations d'agarose et leur taille et leur développement ont été représentés à 48 hpf. Images capturées par un microscope équipé d'une caméra couleur microscope numérique (objectif 2.5x) et le logiciel de microscope d'accompagnement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Visualisation du développement de la vascularisation. Croix de Tg(kdr1: EGFP)mitfab692/b692 et Ubi-zebrabow photographié à partir d'environ 30 stade somite pendant 55 h sur un microscope confocal. Vasculature en vert et toutes les autres cellules en rouge. Barre d'échelle de 500 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Visualisation du développement des neurones et de la germination des neurites. Croix de Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 et Ubi-zebrabow photographié à partir d'environ 30 stade somite pendant 55 h sur un microscope confocal. Motorneurons en vert, toutes les autres cellules en rouge. Barre d'échelle de 500 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Visualisation du co-développement des neurones et de la vascularisation. Croix de Tg(kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 et Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692 imaged pendant 55 heures à partir d'environ 2 dpf sur un microscope confocal. Vasculature en rouge, motorneurons en vert. Barre d'échelle de 500 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Visualisation de l'expression musculaire de GFP chez les somites. La croix de HGn39b et d'Ubi-zebrabow ont été imaginées sur un microscope confocal pendant 55 h à partir d'environ 30 stades somite. Muscle en vert, toutes les autres cellules en rouge. Échelle barre 500 m S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film supplémentaire S1: Film d'un embryon d'une croix de Tg(kdr1:EGFP)mitfab692/b692 et Ubi-zebrabow image d'environ 30 stade somite pendant 55 h sur un microscope confocal à l'aide d'un objectif 10x. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Film supplémentaire S2: Film d'un embryon d'une croix de Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 et Ubi-zebrabow image d'environ 30 stade somite pendant 55 h sur un microscope confocal à l'aide d'un objectif 10x. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Film supplémentaire S3: Film d'un embryon d'une croix de Tg(kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 et Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692 image d'environ 2 dpf pour 55 h sur un microscope confocal en utilisant un objectif 20x. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Film supplémentaire S4: Film d'un embryon d'une croix de HGn39b et Ubi-zebrabow photographié à partir d'environ 30 stade somite pour 55 h sur un microscope confocal en utilisant un objectif 10x. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Une méthode de montage pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre est décrite ici. L'étape la plus critique pour la méthode de montage est d'identifier la concentration optimale d'agarose qui permettra une croissance sans restriction des embryons de poisson zèbre, et en même temps de garder les embryons dans une position complètement fixe pour l'imagerie confocale. Parce que la concentration optimale d'agarose est très étroite, cette valeur est très sensible aux erreurs de mesure du poids de l'agarose et du volume de l'E3 lors de la préparation de la solution. La concentration optimale peut également dépendre de la température et du stade de l'embryon. Ainsi, la concentration optimale devra être redéfinie pour chaque nouveau lot de solution d'agarose par la répétition de tests de différentes concentrations.
Une autre étape critique est dans la méthode de montage est l'ajout de la deuxième couche d'agarose. La deuxième couche maintient le verre de couverture en place. Il doit être ajouté soigneusement au plat un peu à la fois afin qu'il ne provoque pas le verre de couverture de se déplacer. La deuxième couche sert également de barrière perméable pour l'E3. Sans E3, les embryons se dessèchent pendant l'imagerie. Sans la deuxième couche d'agarose, le verre de couverture et l'embryon commenceront à flotter.
Une limitation de la méthode de montage proposée est que si elle fonctionne bien pour les microscopes inversés, il ne fonctionne pas pour les microscopes droits. Plusieurs tentatives ont été faites pour effectuer l'imagerie time-lapse à l'aide d'un microscope droit, en remplissant le plat en verre de fond avec E3, le sceller avec du parafilm, et le tourner à l'envers. Cependant, souvent ceci a eu comme conséquence que le montage s'est effondré à mi-chemin par l'image. Cela pourrait avoir été causé par l'augmentation de la chaleur dans l'échantillon après la longue exposition à la lumière laser, ce qui provoque la couche d'agarose solidifiée à fondre.
À la fin de la microscopie time-lapse, les embryons ont commencé à présenter un oedème péricardique. Variant entre les différentes expériences, l'odema a été observé entre 35 et 50 heures d'imagerie. On ne sait pas encore si cela a été causé par l'immobilisation d'embryons ou par un effet d'anesthésique. Tricaine est connu pour supprimer la contraction des muscles squelettiques et cardiaques. Par conséquent, Tricaine affecte la fréquence cardiaque chez les poissons adultes14 et les embryons15. D'autres études ont également rapporté que le traitement de Tricaine cause l'oedème péricardique dans les embryons de poissons zèbres2,16. Dans cet article, une concentration de Tricaine (0.016-0.020%) a été utilisé qui est couramment utilisé dans la recherche sur le poisson zèbre; encore, l'oedème péricardique s'est produit à la fin de notre période de formation image. L'œdème péricardique constituait une restriction principale pour permettre l'imagerie des embryons pendant des périodes encore plus longues. Les moyens potentiels de diminuer cette toxicité cardiaque combinent deux anesthésiques différents, comme la tricaine et l'eugénol, ou l'utilisation de l'injection d'ARNm de bungarotoxine pour les anesthésiques16; les effets bénéfiques des composés d'anesthésie combinatoires ou alternatifs doivent être étudiés plus avant pour l'imagerie de temps-lapse prolongée du développement de zèbre.
En conclusion, la méthode de montage décrite est rapide, facile, rentable et fonctionne sur n'importe quel microscope inversé. Des plats en verre réguliers et une faible fonte de l'agarose peuvent être utilisés, et aucun moule, équipement ou instrumentation spécial n'est requis. La méthode de montage en couches permet la croissance des embryons tout en maintenant les embryons dans une position fixe. En utilisant l'imagerie de time-lapse prolongée de l'organisme entier de nouvelles connaissances du développement des tissus peuvent être obtenus.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Albert Pan et Arndt Sieakmann pour les dons de poissons transgéniques. Nous remercions Koichi Kawakami à l'Institut national de génétique, le projet national bioresource du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie du Japon pour le don du poisson zèbre transgénique HGn39b. Nous remercions également Fatima Merchant et Kathleen Gajewski pour leur aide en microscopie confocale, et Tracey Thériault pour ses photographies.
Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national des sciences de la santé environnementale des National Institutes of Health (numéro de subvention P30ES023512 et numéro de contrat HHSN27320150010C). SU a reçu l'appui d'une bourse du programme de biologie du cancer computationnelle Keck (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) et du Hugh Roy and Lillie Endowment Fund. La Fondation Robert A. Welch (E-0004) a soutenu la Fondation Robert A. Welch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
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