Summary
本文介绍了一种将脆弱的斑马鱼胚胎用于延长延时共聚焦显微镜的方法。这种低成本的方法很容易使用常规玻璃底显微镜盘在任何倒置显微镜上成像。安装以不同浓度的甘蔗层进行。
Abstract
发育动力学可以跟随活转基因斑马鱼胚胎在特定组织或细胞中表达荧光的共聚焦延后显微镜。成像整个胚胎发育的一个困难是斑马鱼胚胎长得很大。当像定期安装在0.3-1%低熔胶甘蔗中一样，甘蔗会施加生长限制，导致软胚胎体变形。然而，要进行共聚焦延时显微镜，胚胎必须固定。本文介绍了斑马鱼胚胎的分层安装方法，该方法限制了胚胎的活力，同时允许不受限制的生长。安装以不同浓度的甘蔗层进行。为了证明这种方法的可用性，整个胚胎血管、神经元和肌肉发育在转基因鱼中连续55小时成像。这种安装方法可用于使用倒置显微镜对整个斑马鱼胚胎进行简单、低成本的成像，无需模具或特殊设备。
Introduction
斑马鱼长期以来一直是发育生物学的模型生物，显微镜是可视化胚胎发育的主要方法。使用斑马鱼胚胎进行发育研究的优点包括体积小、光学清晰度高、发育迅速和成年鱼的繁殖性高。转基因斑马鱼线在某些组织或细胞中表达荧光，使得组织发育能够以大型脊椎动物所无法得到的方式直接可视化。结合延时显微镜，可以很容易地研究组织发育的细节和动态。
成像斑马鱼发育的一个困难是胚胎长得很大;胚胎在生命前3天内伸展其长度4次。此外，早期胚胎的身体是软的，如果生长受到限制，很容易被扭曲。然而，要进行共聚焦显微镜，胚胎必须固定。为了保持胚胎在固定位置进行共聚焦延时成像，它们定期进行麻醉，并安装在0.3-1%的低熔胶胶胶中。这样做的好处是允许在一定时期内在成像过程中进行一些生长，同时限制胚胎的运动。胚胎的某些部分可以有效地成像像这样。然而，当使用这种方法对整个胚胎进行长时间的成像时，由于生长受限，生长受限，观察到扭曲。因此，需要其他安装方法。考夫曼及其同事通过将斑马鱼胚胎安装在含有低浓度的琼脂糖或甲基纤维素2的氟化乙烯丙烯（FEP）管中，描述了一种用于光片显微镜的替代安装斑马鱼胚胎，如选择性平面照明显微镜（SPIM）。该技术可以随着时间的推移对胚胎的产生产生产生极好的可视化效果。Schmidi等人描述了在FEB管中为光片显微镜3在Agarose中安装多达6个胚胎，在一次成像中提供了多个胚胎的可视化效果。模具已经被用来创造胚胎阵列，以有效地安装更多的胚胎4。Masselkink等人已经构建了3D打印塑料模具，可用于制造硅铸件，斑马鱼胚胎可以放置在不同阶段，使安装在一个恒定的位置成像，包括共聚焦成像5。3D打印也被用来制造模具，以96井格式6一致定位斑马鱼胚胎。有些模具是针对特定阶段定制的，可能不允许长时间无限制的生长，而其他模具则更灵活。最近，Weijts等人发表了一种四井盘的设计和制造，用于斑马鱼胚胎的活成像7。在这个菜中，麻醉鱼胚胎的尾巴和躯干被手动放置在一个清晰的硅胶屋顶下，紧贴在盖玻璃的上方，形成一个口袋。然后，通过添加0.4%的甘蔗，将胚胎固定在这个位置。这种安装允许对胚胎的约 2 mm 长的后部（树干和尾部）进行成像，并且由于每个井可以安装多达 12 个胚胎，该方法允许对多个样本进行成像。同样，希辛格和史蒂文顿最近提出了一种方法，其中鱼的头部安装在甘蔗，而尾巴可以自由生长，这种方法也有效地促进成像的树干和尾部区域的胚胎8。
本文介绍了斑马鱼胚胎的分层安装方法，该方法限制胚胎的运动，同时允许不受限制的生长。这种安装方法的优点是，它是一种低成本、快速、简便的方法，可使用任何倒置显微镜安装不同阶段的胚胎进行成像。在胚胎发育过程中，安装允许对全身（头部、躯干和尾部）进行长期成像。为了展示这种方法的可用性，整个胚胎血管，神经元和肌肉发育在转基因鱼的图像。每期两个胚胎，在3D的两个波长被图像的延时显微镜连续55小时，以呈现电影的组织发展。
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Protocol
这里展示的动物工作得到了休斯敦大学和印第安纳大学的机构动物护理和使用委员会（IACUCs）的批准。
1. 鱼类养殖
注：使用脊椎动物模型需要IACUC批准的协议。它应按照相关的国家和国际准则进行。
- 保持成年斑马鱼如先前出版的文献9所述。
- 下午，将成年斑马鱼放入繁殖箱。以1：2的比例培育雄性与雌性。
2. 准备解决方案
- 在胚胎介质中制作1%低熔胶甘草的库存溶液（E3：5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4，调整至pH 7.0）。将库存溶液与1.5 mL管中分用，并将其储存在4°C。
- 在蒸馏水中制作 4% （w/v） 三丁酸 （MS-222） 的库存溶液。储存在4°C的暗瓶中。
注意：三重肌是有毒的，应该称重并溶解在烟罩中。 - 在蒸馏水中制作20 mM N-苯基尿酸（PTU）的库存溶液。储存在-20°C。
3. 胚胎的制备
- 交配后，在培养皿中收获E3中的胚胎，并在26.5°C孵育约28小时，然后再安装。
注：这减慢了胚胎的发育速度，使胚胎在成像开始时大约处于30个索米特阶段。 - 在E3中用0.016-0.020%三合一的麻醉胚胎。为了抑制色素沉着，将PTU添加到200μM的浓度。
- 在解剖显微镜下用钳子分离胚胎。使用两个钳子，握紧并轻轻地拉开胆囊以释放胚胎。
4. 安装在阿加罗斯
注：开发的安装方法需要E3中两种不同浓度的低熔胶甘蔗，并根据需要使用0.02%三聚苯基和PTU。第一种甘蔗溶液含有甘蔗的最佳浓度，其中变形和活力最小。下面的步骤 5 描述了优化。
- 加热两层的甘蔗溶液（在下面的步骤 5 和 1 中定义浓度）到65°C。在安装前，让角玫瑰冷却到大约30°C，这样胚胎就不会受到热的伤害。对于安装，请使用带 0 号盖玻璃底的 35 mm 玻璃底板。附在盘子底部的盖玻璃可形成10毫米浅（约1.2毫米深）的井，其中胚胎将被放置。
注：在这种情况下，运动性和变形性最小的浓度在0.025到0.040%之间。 - 使用玻璃移液器或微移液器，将具有一侧之一的减缩胚胎轻轻放置到盘子底部。如果使用微移液器，切切尖端的外侧以增加开口的大小以适合胚胎（图1A）。用微移液器小心地取出剩余的 E3。
- 将第一个角玫瑰溶液加入由附在盘子底部的盖玻璃所造的小井中，以覆盖胚胎（第 1 层）（图1B）。确保甘蔗覆盖小井，但不会溢出它。
- 用盖玻璃（22毫米x22毫米）（图1C）盖住小井，在两个盖眼镜之间形成一个狭窄的角胶填充空间，填充胚胎。
- 在盘子底部的盖玻璃上放置一层 1% 的甘蔗溶液（图 1D）。当此层凝固时，它将盖玻璃固定在原位。
- 用含有0.02%三氯酸酯的E3填充菜的其余部分，以保持系统水分（第3层）（图1E）。
注：在此设置中，盖玻璃和 1% 角玫瑰可保护底层免受稀释。
5. 第 1 层的甘蔗溶液优化
- 要确定第 1 层甘蔗的最佳浓度，请使用多尺度网格搜索方法。在增加的甘蔗酶浓度从0.01%到1%之间安装胚胎，然后是胚胎生长限制和视野中运动力的延时成像。确定变形和运动力都最小的浓度。
- 为了进一步优化腺化酶的浓度，根据步骤5.1中发现的最佳浓度（例如0.025%、0.028%、0.031%等），使用更精细的腺化酶（例如，0.025%和0.031%等）来安装胚胎。
注：在我们的实验室中，最佳的甘蔗浓度约为0.03%。
6. 延时成像
注：此安装方法适用于任何具有荧光和明亮场成像延时功能的倒置显微镜。
- 对整个胚胎或其部分进行延时成像，长达 55 小时。对于多个胚胎的成像，使用一个舞台适配器，该适配器可容纳多个菜肴，每盘安装一个胚胎。逐个旋转洗碗，使胚胎大致水平定位，由眼睛确定。为了获得最佳的胚胎生长和发育，请使用显微镜阶段，将培养箱设置为28.5°C。
- 在显微镜软件中选择低放大镜。在眼片下，使用明亮的场照明旋转洗盘，并水平定位并精细地对齐胚胎，并在软件中记录其位置。创建文件名以自动保存数据。
注：在本实验中，使用计划 apo = 4x 0.2 NA 目标和ND 采集窗口中的XY选项卡来记录胚胎的位置。数据以 .nd2 格式保存。通过单击Ti Pad选项卡中的图标来选择目标。 - 设置针孔大小、扫描速度、图像大小和缩放。接下来，选择一个更高的放大目标来捕捉图像。
注：在本实验中，用于整胚胎成像的平面-apo 10x 0.45 NA目标，以及用于胚胎部分更高放大倍率成像的超荧光20x 0.75 NA物镜。针孔设置为 1.2 AU（10x 镜头为 19.2 μm），扫描速度设置为 2.4 μs 的像素停机时间，图像大小设置为 1024 x 1024 像素，扫描变焦为 1，10x 镜头的像素大小为 1.24 μm，20x 镜头为 0.62 μm。 - 选择要成像荧光的通道。一次调整一个通道的图像捕获设置。对于每个荧光通道，调整激光功率和探测器的高压，确保收集尽可能最佳的动态范围，同时避免饱和和限制光漂白。
注：在本实验中，GFP使用488绿色通道（488nm激光和500至550nm之间的发射）和RFP（561nm激光，发射570至600nm之间）进行成像，并使用561nm激光和透射光探测器（TD通道）收集传输图像。 - 要用10倍目标对整个胚胎进行成像，用重叠的视角来描绘几个视场，并使用显微镜软件将它们拼接在一起。
注：由于胚胎在成像过程中会大量增大，因此请确保在胚胎的前视场和后视场有空间。使用ND 采集窗口的"扫描大图像"选项卡，选择具有 10% 重叠的 4 x 1 模式来捕获四个相邻的视场。 - 配置使用显微镜软件捕获 Z 堆栈的设置。
注：由于胚胎安装在玻璃盘底部附近，因此其中心在生长时会从底部移开。使用ND 采集窗口的Z选项卡并选择非对称相对范围。使用此方法，当前焦点平面用作参考平面，其余平面在 Z 堆栈体积内非对称分布，以包括整个胚胎，并有足够的空间来说明标本的生长。在所有实验中，间隔设置为11μm，总范围设置为约45个平面。 - 为了在长期延时成像期间保持多个胚胎的焦点，请使用自动聚焦。如果成像多个胚胎，则调整每个胚胎的单个偏移水平，以聚焦在参考平面上。
注：在本实验中，使用了基于激光的对焦稳定系统。 - 以大约 1 小时为间隔在显微镜软件和图像中设置 55 h 的持续时间延时参数。在每个周期中，按顺序捕获两个胚胎数据集，并在每个周期后自动保存数据。
- 使用显微镜软件的线上或线下版本处理图像。如果对多个胚胎进行了成像，则通过根据成像位置拆分数据集为每个胚胎创建独立的文件。使用最大强度投影或类似工具将 3D 时间数据集转换为 2D 时间数据集。使用"另存为菜单"选项创建影片文件，选择 .avi 作为文件格式。选择具有 200 ms 间隔的"无压缩"选项，播放速度为 5 帧 /s。
注：此实验中两个胚胎的原始数据集使用软件中的"拆分位置"函数进行拆分（文件|导入/导出 |分割多点。使用最大强度投影函数将 3D 时间数据集转换为 2D 时间数据集（图像 |ND 处理*在 Z 中创建最大强度投影图像。
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Representative Results
安装方法的开发
这项工作的主要目的是开发一种低成本的安装技术，用于长期对斑马鱼发育进行延时成像。分层安装方法的制定是为了允许脆弱的斑马鱼胚胎体完全生长，同时限制其运动。如果第1层的Agarose浓度过高，胚胎将变形和弯曲（图2）。生长在0.1%和0.5%的胚胎的甘蔗有缩短的尾巴，扭曲的鳍和弯曲的头。相反，如果生长的胶着胶浓度过低，胚胎在延时显微镜期间会移出视野，即使它们被麻醉，因为生长的尾巴从胚胎体中摆动并导致其移动。在我们手中，最佳的甘蔗浓度在0.028%和0.034%的甘蔗酸不同批次的甘蔗。安装在0.025%以下的甘蔗没有提供足够的阻力，胚胎留在视野中。
血管、神经元和肌肉发育的延时成像
在优化上述安装方法后，在 55 h 的跨度内捕获时移共聚焦显微镜图像。我们拍摄了在不同组织中表达GFP或RFP的活转基因斑马鱼。使用具有内源荧光的转基因鱼进行延时成像的一个优点是，荧光分子（如GFP和RFP）在活胚胎中连续产生，因此不容易产生光漂白剂。首先，对Tg（kdr1：EGFP）mitfab692/b69210和Ubi-zebrabow11的十字架的胚胎进行了成像。在这些胚胎中，RFP在胚胎的所有细胞中表达，允许一般胚胎结构的可视化。GFP在血管内皮细胞中表达。双转基因胚胎从大约30个索米特阶段成像55小时，用0.45 NA的10倍目标来可视化头部和身体的血管发育（图3和补充电影S1）。两个胚胎/会话在循环中用z堆栈和延时成像，这样，在以两种不同波长成像第一个胚胎后，第二个胚胎随后被成像，然后第一个再次成像。图3显示了分段间血管（ISV）发芽、子肠血管和头血管发育、牛脉丛凝结与躯干延伸。用血管成像整个胚胎表明，ISV发芽开始于索米特之间，并生长到神经管的点，其中ISV采取不同的路径，并朝一个方向发芽到下一个前索米特边界。
接下来，从30个索米特阶段大约将Tg（mnx：GFP）mitfab692/b629和Ubi-Zebrabow的十字架的胚胎成像55小时，以可视化运动神经元发育（图4和辅助电影S2）。Tg（mnx：GFP）首先被越过到mitfab692/b692（均来自俄勒冈州的斑马鱼国际资源中心），以生产Tg（mnx：GFP）mitfab692/b629。运动神经元斧头从腹腔神经管发芽，越过索米特，朝向胚胎的腹侧。与在索米特之间发芽的跨段容器不同，斧头在长角形成的索米特的中间发芽。发芽开始朝神经管的前一端，从神经管的直角，并扩散后。通过苏米特/蛋黄界面，发芽改变方向，以前和后发芽。注意前神经酸盐对发育的心脏的内在。
此外，Tg（kdr：enl.memRFP）的十字架的胚胎b692/b692（Tg（kdr：enl.memRFP和mitfab692/b692）的十字架和Tg（mnx：GFP）mitfab692/b692的交叉被成像。 在前胚胎中，红色血管荧光直到受精后36小时才可见，因此我们在2 dpf的稍后时间点开始成像。我们使用更高的放大倍率（20x物镜）对树干的一部分进行成像，并成像蛋黄囊延伸。这部电影表明，胚胎仍然足以在更高的放大倍率良好的成像质量。随后，电机神经元斧头的背发芽与段间血管的位置有关（图5和补充电影S3）的共同发展。在这些电影中，腹腔斧头发芽的精细细节是可见的，以及背离的斧头从神经管发芽到神经元斧头和分段间血管共同迁移的点。牛脉丛凝结也清楚地显示。请注意，由于神经质芽在尾部的后端（在右侧第12个神经质的位置）丢失时，最接近的后神经元向胚胎的前部分延伸，以覆盖神经质 11 和 13 之间的区域。
最后，一个HGn39b12，13和Ubi-Zebrabow的十字架被成像。HGn39b是一种 zTRAP 线，其 GFP 插入热休克蛋白 ATPase 同源 1 （ AHA1 ）基因（ http : / / kawakami . lab . . ac . jp / ）的活化剂中，它表达在索米特的肌肉中的 GFP （图 6和辅助电影 S4）。随着索米特数量的增加，索米特的长度和宽度也会延长。这部电影还很好地展示了来自乌比-泽布拉鱼线的红荧光中的心脏发育。
图 1 ： 安装方法的说明。（A） 将斑马鱼胚胎加入35毫米盘子的玻璃底所造的小井中。（B） 将甘蔗花第1层添加到小井中，以覆盖胚胎。（C） 小心地在小井上放一个盖玻璃。（D） 在 35 mm 盘子的整个底部加入甘蔗2层。（E） 在菜中加入E3.（F） 安装设置的横截面的示意图。（G） 斑马鱼胚胎在最后蒙太奇中的显微镜图像（5倍物位）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：不同浓度的甘蔗的胚胎生长限制和发育迟缓。胚胎以不同的蔗甘度浓度安装，其大小和发育图像为48 hpf。配备数字显微镜彩色照相机（2.5 倍物镜）和随附的显微镜软件的显微镜拍摄的图像。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：血管发育的可视化。Tg（kdr1：EGFP）mitfab692/b692和Ubi-Zebrabow的交叉，从约30个索米特级成像，在共聚焦显微镜上拍摄55小时。绿色血管和所有其他红色细胞。比例尺500μm。请点击这里查看此图的较大版本。
图4：神经元发育可视化和神经质发芽。Tg（mnx：GFP）mitfab692/b629和Ubi-Zebrabow的交叉，从大约30个索米特阶段成像，在共聚焦显微镜上拍摄55小时。绿色运动神经元，所有其他红色细胞。比例尺500μm。请点击这里查看此图的较大版本。
图5：神经元和血管共同发展的可视化。Tg（kdr：enl.memRFP）mitfab692/b692和Tg（mnx：GFP）mitfab692/b692的交叉，从共聚焦显微镜上约 2 dpf 成像 55 小时。红色血管，绿色运动神经元。比例尺500μm。请点击这里查看此图的较大版本。
图6：肌肉GFP表达在苏米特的可视化。HGn39b和Ubi-Zebrabow的交叉在共聚焦显微镜上被成像55小时，从大约30个索米特阶段。肌肉是绿色的，所有其他细胞都是红色的。缩放栏 500 μm请点击此处查看此图的较大版本。
补充电影 S1： Tg （kdr1：EGFP） mitfab692/b692的十字架的胚胎电影，以及从大约 30 个索米特阶段成像的Ubi-Zebrabow，在共聚焦显微镜上使用 10 倍物镜拍摄 55 小时。请点击此处下载此文件。
补充电影 S2： Tg（mnx：GFP）mitfab692/b629的十字架的胚胎电影，以及从大约 30 个索米特阶段成像的Ubi-Zebrabow，在共聚焦显微镜上使用 10 倍物镜拍摄 55 小时。请点击此处下载此文件。
补充电影 S3： Tg（kdr：enl.memRFP）的十字架的胚胎电影（mitfab692/b692和Tg（mnx：GFP）mitfab692/b692在使用 20 倍物镜的共聚焦显微镜上从大约 2 dpf 成像 55 小时。请点击此处下载此文件。
补充电影 S4： HGn39b和Ubi-Zebrabow十字架的胚胎在共聚焦显微镜上使用 10 倍物镜在 55 h 上成像的胚胎。请点击此处下载此文件。
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Discussion
本文介绍了一种用于延长整个斑马鱼胚胎的延时共聚焦显微镜的安装方法。安装方法最关键的步骤是确定琼脂糖的最佳浓度，允许不受限制的斑马鱼胚胎生长，同时使胚胎处于完全固定的位置进行共聚焦成像。由于甘蔗的最佳浓度非常窄，因此此值对在制备溶液期间测定甘蔗重量和E3体积时的错误非常敏感。最佳浓度也可能取决于胚胎的温度和阶段。因此，需要通过重复不同浓度的试验，为每一批新一批甘蔗解重新定义最佳浓度。
另一个关键步骤是在安装方法是添加第二层甘蔗。第二层将盖玻璃固定在原位。必须一次小心地将其添加到盘子中，以免导致盖玻璃移动。第二层还充当 E3 的渗透屏障。如果没有E3，胚胎将在成像过程中干涸。如果没有第二层甘蔗，盖玻璃和胚胎将开始漂浮。
建议的安装方法的一个限制是，虽然它适用于倒置显微镜，但它不适用于直立显微镜。几次尝试使用立式显微镜进行延时成像，将玻璃底部盘填充 E3，用副胶片密封，然后倒置。但是，这通常会导致安装在成像的中途坍塌。这可能是由于长时间暴露在激光下样品中热量增加，导致凝固的甘蔗层融化。
在延时显微镜结束时，胚胎开始出现腹腔水肿。不同实验之间观察到水肿在35至50小时成像之间。这是由胚胎固定引起的，还是麻醉剂的作用，目前尚不清楚。众所周知，三叶草能抑制骨骼和心脏肌肉的收缩。因此，三丁鱼影响成年鱼14和胚胎15的心率。其他研究也报道，三叶草治疗导致斑马鱼胚胎2，16的心肌水肿。在本文中，三聚一苯的浓度（0.016-0.020%）用于斑马鱼研究;然而，近疤水肿发生在我们的成像期结束时。包外水肿是胚胎成像时间甚至更长时间的主要限制。降低这种心脏毒性的潜在方法是将两种不同的麻醉剂结合在一起，如三氯苯酚与欧根醇，或使用β-bungaro毒素mRNA注射用于麻醉剂16;对斑马鱼发育的延时成像，需要进一步研究组合或替代麻醉化合物的有益作用。
总之，所述的安装方法快速、简单、经济高效，适用于任何倒置显微镜。可使用常规玻璃底盘和低熔融角甘蔗，无需特殊模具、设备或仪器仪表。分层安装方法允许胚胎生长，同时使胚胎保持在固定位置。通过对整个生物体的延时成像，可以获得组织发育的新知识。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢阿尔伯特·潘和阿恩特·西亚克曼赠送的转基因鱼。我们感谢日本教育、文化、体育、科学和技术部的国家生物资源项目国家遗传学研究所的川口孝一为转基因斑马鱼HGn39b的礼物。我们还感谢法蒂玛商人和凯瑟琳·加耶夫斯基在共聚焦显微镜方面的协助，以及特雷西·特里奥特的照片。
这项工作得到了国家卫生研究院国家环境卫生科学研究所的赠款支持（赠款号P30ES023512和合同编号HHSN273201500010C）。SU得到了凯克计算癌症生物学项目（海湾海岸联合体CPRIT赠款RP140113）和休·罗伊和莉莉捐赠基金的资助。J-+G得到了罗伯特·韦尔奇基金会（E-0004）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
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