Summary
Bu makalede, uzun zaman atlamalı konfokal mikroskopi için kırılgan zebra balığı embriyoları monte etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu düşük maliyetli yöntem herhangi bir ters mikroskop görüntüleme için düzenli cam alt mikroskopi yemekleri kullanarak gerçekleştirmek kolaydır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır.
Abstract
Gelişim dinamikleri, belirli doku veya hücrelerde floresans ifade canlı transgenik zebra balığı embriyolarının konfokal zaman atlamalı mikroskobu ile takip edilebilir. Tüm embriyo gelişimini görüntülemede bir zorluk zebra balığı embriyolarının uzunlukları önemli ölçüde büyümek olduğunu. Düzenli olarak% 0.3-1 düşük erime agarose yapılır monte edildiğinde, agarose yumuşak embriyo vücudunda bozulmalara yol açan, büyüme kısıtlaması uygular. Ancak, konfokal zaman atlamalı mikroskopi yapmak için, embriyo immobilize edilmelidir. Bu makalede, sınırsız büyüme için izin verirken embriyoların hareketliliğini kısıtlayan zebra balığı embriyoları için katmanlı bir montaj yöntemi açıklanmaktadır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır. Bu yöntemin kullanılabilirliğini göstermek için, tüm embriyo vasküler, nöronal ve kas gelişimi transgenik balıklarda 55 saat üst üste görüntülendi. Bu montaj yöntemi kalıp veya özel ekipman gereksinimleri olmadan ters mikroskoplar kullanarak tüm zebra balığı embriyolarının kolay, düşük maliyetli görüntüleme için kullanılabilir.
Introduction
Zebra balığı uzun gelişimbiyolojisi için örnek bir organizma olmuştur ve mikroskopi embriyonik gelişimi görselleştirmek için önemli bir yöntemdir. Gelişimsel çalışmalar için zebra balığı embriyoları kullanmanın avantajları küçük boyut, optik netlik, hızlı gelişme ve yetişkin balıkların yüksek fecundity içerir. Bazı doku veya hücrelerde floresans ifade transgenik zebra balığı hatları nesil büyük omurgalı hayvanlar ile mümkün olmayan şekillerde doku gelişiminin doğrudan görselleştirilmesi için izin verdi. Zaman atlamalı mikroskopi ile birlikte doku gelişiminin ayrıntıları ve dinamikleri kolayca incelenebilir.
Zebra balığı gelişimini görüntülemede bir zorluk, embriyoların uzunluklarının önemli ölçüde büyümesidir; embriyo yaşamın ilk 3 gün içinde dört kez uzunluğunu uzatır1. Ayrıca, erken embriyo vücut yumuşak, ve büyüme sınırlı ise kolayca deforme olur. Ancak, konfokal mikroskopi yapmak için, embriyo immobilize edilmelidir. Konfokal zaman atlamalı görüntüleme için embriyoları sabit bir pozisyonda tutmak için düzenli olarak anestezi edilir ve %0.3-1 düşük erime li agarose monte edilirler. Bu embriyo hareketlerini kısıtlarken, belirli bir süre için görüntüleme sırasında bazı büyüme için izin avantajı vardır. Embriyonun bazı bölümleri verimli bir şekilde bu şekilde görüntülenebilir. Ancak, uzun süre tüm embriyo görüntüleme için bu yöntem kullanılarak, bozulmalar nedeniyle sınırlı büyüme nedeniyle agarose neden görülür. Bu nedenle, diğer montaj yöntemleri gereklidir. Kaufmann ve arkadaşları hafif levha mikroskopisi için zebra balığı embriyolarının alternatif montaj tarif var, seçici düzlem aydınlatma mikroskopisi gibi (SPIM), florlu etilen propilen embriyolar embriyolar monte ederek (FEP) agarose veya metilselüloz düşük konsantrasyonlarda içeren tüpler2. Bu teknik zaman içinde embriyogenezin mükemmel bir görselleştirme üretir. Schmid ve ark. bir görüntüleme seansında çeşitli embriyoların görselleştirilmesini sağlayan ışık sayfası mikroskopisi3 için FEB tüplerinde agarose'da altı embriyonun montajını tanımlar. Kalıplar embriyoların daha büyük sayıda verimli montaj için embriyo dizileri oluşturmak için kullanılmıştır4. Masselkink ve ark. farklı aşamalarında zebrabalığı embriyoları yerleştirilebilir silikon dökümleri yapmak için kullanılabilecek 3D baskılı plastik kalıplar inşa etmiş, görüntüleme için sabit bir konumda montaj sağlayan, confocalgörüntülemedahil 5 . 3D baskı da 96-iyiformat6zebra balığı embriyolarının tutarlı konumlandırma için kalıp yapmak için kullanılmıştır. Bazı kalıplar belirli aşamalar için özelleştirilmiştir ve uzun süreler boyunca sınırsız büyümeye izin vermezken, diğer kalıplar daha esnektir. Son zamanlarda, Weijts ve ark. zebrabalığı embriyolarının canlı görüntüleme için dört kuyulu bir çanak tasarım ve imalat yayınlandı7. Bu çanak, kuyruk ve anestezi balık embriyolarının gövde bir cep oluşturmak için bir kapak cam hemen üzerinde bağlı net bir silikon çatı altında manuel olarak yerleştirilir. Embriyo daha sonra % 0.4 agarose ilavesi ile bu pozisyonda sabitlenir. Bu montaj embriyonun yaklaşık 2 mm uzunluğundaki arka kısmının (gövde ve kuyruk) görüntülenmesine olanak sağlar ve her kuyuya 12 embriyo monte edilebildiği için, yöntem birden fazla numunenin görüntülenmesine olanak sağlar. Benzer şekilde, Hirsinger ve Steventon son zamanlarda balık başı agarose monte edildiği bir yöntem sundu, kuyruk serbestçe büyüyebilir iken, ve bu yöntem de verimli embriyo gövde ve kuyruk bölgesinin görüntüleme kolaylaştırır8.
Bu makalede, sınırsız büyüme için izin verirken embriyoların hareketlerini kısıtlayan zebra balığı embriyoları için katmanlı bir montaj yöntemi açıklanmaktadır. Bu montaj yönteminin avantajları, herhangi bir ters mikroskop kullanarak görüntüleme için çeşitli aşamalarda embriyomonte etmek için düşük maliyetli, hızlı ve kolay bir yöntem olmasıdır. Montaj embriyo gelişimi sırasında tüm vücudun uzun süreli görüntüleme izin verir (baş, gövde ve kuyruk). Bu yöntemin kullanılabilirliğini göstermek için transgenik balıklarda tüm embriyo vasküler, nöronal ve kas gelişimi görüntülendi. Seans başına iki embriyo, 3Boyutlu iki dalga boyunda, doku gelişimi filmlerini işlemek için 55 saat üst üste hızlandırılmış mikroskopi ile görüntülendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada sunulan hayvan çalışmaları Houston Üniversitesi ve Indiana Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUCs) tarafından onaylanmıştır.
1. Balık yetiştiriciliği
NOT: Omurgalı modelleri ile çalışmak iACUC onaylı bir protokol gerektirir. İlgili ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak yürütülmelidir.
- Daha önce yayınlanmış literatürde açıklandığı gibi yetişkin zebra balığı koruyun9.
- Öğleden sonra, üreme tankları yetişkin zebra balığı yerleştirin. Erkekleri dişilere 1:2 oranında yetiştirin.
2. Çözümlerin hazırlanması
- Embriyo medyasında %1 düşük erime agarose bir stok çözeltisi olun (E3: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, pH 7.0 ayarlanır). Aliquot stok çözeltisi 1,5 mL tüpler halinde ve 4 °C'de saklayın.
- Distile suda %4 (w/v) Tricaine (MS-222) stok çözeltisi yapın. 4 °C'de koyu renkli bir şişede saklayın.
DİkKAT: Triain toksiktir ve tartılmalı ve duman kaputunda çözülmelidir. - Distile suda 20 mM N-fenilthiourea (PTU) stok çözeltisi yapın. -20 °C'de saklayın.
3. Embriyoların hazırlanması
- Miteledikten sonra, E3'teki embriyoları petri kabında hasat edin ve montajdan önce 26.5 °C'de yaklaşık 28 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu embriyoların gelişimini yavaşlatar, böylece embriyolar görüntülemenin başlangıcında yaklaşık 30 somite evresindedir. - E3'te %0.016-0.020 Trikaine embriyoları anestezi. Pigmentasyonu inhibe etmek için, 200 μM konsantrasyonuna PTU ekleyin.
- Embriyoları bir diseksiyon mikroskobu altında forceps kullanarak dechorionate. İki forceps kullanarak, kavrama ve yavaşça ayrı embriyo serbest bırakmak için chorion çekin.
4. Agarose montaj
NOT: Geliştirilen montaj yöntemi, gerektiğinde %0,02 Tricaine ve PTU ile E3'te iki farklı düşük erime agarose konsantrasyonu gerektirir. İlk agarose çözeltisi distorsiyon ve hareketliliğin en az olduğu optimal agarose konsantrasyonu içerir. Optimizasyon aşağıdaki adım 5'te açıklanmıştır.
- Isı iki tabaka için agarose çözeltileri (konsantrasyon aşağıda adım 5 ve% 1 tanımlanan) 65 °C'ye kadar. Agarose'un montajdan hemen önce yaklaşık 30 °C'ye soğumasını bekleyin ki embriyo ısıdan zarar görmesin. Montaj için, No. 0 kapaklı cam alt 35 mm cam alt tabaklar kullanın. Yemeğin dibine takılan kapak camı, embriyonun yerleştirilmeye devam edilebilecek 10 mm sığ (yaklaşık 1,2 mm derinliğinde) bir kuyu oluşturur.
NOT: Bu durumda en az hareketlilik ve distorsiyoniçeren konsantrasyon %0,025 ile %0,040 arasında ydı. - Yavaşça bir cam pipet veya mikropipet kullanarak yemeğin altına doğru onun yanal yanlarından biri ile dechorionated embriyo yerleştirin. Bir mikropipet kullanıyorsanız, embriyoya uyacak şekilde açıklığın boyutunu artırmak için ucun dış kısmını kesin(Şekil 1A). Kalan E3'leri mikropipetle dikkatlice çıkarın.
- Embriyoyu (Katman 1) kapsayacak şekilde yemeğin altına bağlı kapak camı tarafından oluşturulan küçük kuyuya ilk agarose çözeltisini ekleyin(Şekil 1B). Agarose küçük kuyuyu kapladığından emin olun ama taşmaz.
- İki kapak gözlüğü arasında embriyo ile dar bir agarose dolu alan oluşturmak için bir kapak camı (22 mm x 22 mm)(Şekil 1C)ile küçük kuyukapağı.
- Yemeğin alt kısmında ki kapak camı nın üzerine%1'likagarose çözeltisi katmanı yerleştirin (Katman 2) (Şekil 1D). Bu tabaka katılanınca kapak camı yerinde tutar.
- Sistemin sulu kalmasını sağlamak için yemeğin kalan kısmını %0,02 Trikain içeren E3 ile doldurun (Katman 3)(Şekil 1E).
NOT: Bu kurulumda, kapak camı ve %1 agarose alt katmanı seyreltmekten korur.
5. Katman 1 için agarose çözeltisinin optimizasyonu
- Katman 1 için agarose'un en uygun konsantrasyonunu belirlemek için çok ölçekli ızgara arama yaklaşımını kullanın. Agarose artan konsantrasyonlarda Montaj embriyolar% 0.01 ile% 1 arasında değişen embriyo büyüme kısıtlaması ve görüş alanında hareketlilik zaman atlamalı görüntüleme izledi. Hem distorsiyon hem de hareketliliğin minimum olduğu konsantrasyonları belirleyin.
- Agarose konsantrasyonunu daha da optimize etmek için, embriyoları adım 5.1'de en iyi olduğu tespit edilen konsantrasyona bağlı olarak (örn. 0.025 ile %0.040 arasında) daha ince bir agarose konsantrasyonaralığı (örn. 0.025 ile %0.040 agarose) kullanarak monte edin (örn. %0.025, %0.028, %0.031, vb.).
NOT: Laboratuvarımızda optimal agarose konsantrasyonu %0.03 civarındaydı.
6. Hızlandırılmış görüntüleme
NOT: Bu montaj yöntemi floresan ve parlak alan görüntüleme için zaman atlamalı işlevselliği ile herhangi bir ters mikroskop için çalışır.
- 55 saate kadar tüm embriyo veya parçaları için hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin. Birkaç embriyo görüntüleme için, çanak başına monte edilmiş bir embriyo ile çeşitli yemekler tutan bir sahne adaptörü kullanın. Embriyolar yaklaşık yatay olarak göz tarafından belirlenen konumlandırılmış böylece bulaşıkları tek tek döndürün. Optimal embriyo büyümesi ve gelişimi için, 28,5 °C'de ayarlanmış bir kuvözlü mikroskop aşaması kullanın.
- Mikroskop yazılımında düşük büyütme hedefi seçin. Göz parçasının altında, parlak alan aydınlatması kullanarak yemekleri yatay olarak embriyoları bulun ve ince bir şekilde hizalayarak ve konumlarını yazılıma kaydedin. Verilerin otomatik olarak kaydedilmesi için bir dosya adı oluşturun.
NOT: Bu deneyde, embriyoların yerlerini kaydetmek için bir apo λ 4x 0.2 NA hedefi ve ND kazanım penceresi içindeki XY sekmesi kullanılmıştır. Veriler .nd2 biçiminde kaydedildi. Amaç, Ti Pad sekmesindeki simgelerine tıklayarak seçildi. - İğne deliği boyutunu, tarayıp hızını, görüntü boyutunu ve yakınlaştırmayı ayarlayın. Ardından, görüntüleri yakalamak için daha yüksek bir büyütme hedefi seçin.
NOT: Bu deneyde, tüm embriyoların görüntülenmesi için bir plan-apo 10x 0.45 NA hedefi, embriyoparçalarının daha yüksek büyütme görüntülemesi için süper flor 20x 0.75 NA hedefi kullanılmıştır. İğne deliği 1,2 AU (10x lens için 19,2 m) olarak ayarlanmış, taramaya hız 2,4 μs piksel çalışma süresi için ayarlanmış ve görüntü boyutu 10x lens için 1,24 μm piksel boyutu vererek, bir tazyik yakınlaştırma ile 1024 x 1024 piksel olarak ayarlanmışve 20x lens için 0,62 m. - Floresan için görüntülenecek kanalları seçin. Görüntü yakalama ayarlarını her seferinde bir kanalda ayarlayın. Her floresan kanalı için lazer gücünü ve dedektör yüksek voltajını ayarlayın, doygunluğu önlerken ve fotobeyazrlamayı sınırlandırırken mümkün olan en iyi dinamik aralığı topladığızdan emin olun.
NOT: Bu deneyde, GFP 488 yeşil kanal ile görüntülendi , (488 nm lazer ve emisyon arasında 500 ve 550 nm), ve RFP 561 kırmızı kanal (561 nm lazer ve emisyon arasında 570 ve 600 nm), ve iletim görüntü 561 nm lazer ve iletilen ışık dedektörü(TD kanalı)kullanılarak toplandı. - 10x hedefi ile tüm embriyo görüntü için, örtüşme ile görüş çeşitli alanlarda görüntü ve mikroskop yazılımı kullanarak onları bir araya dikiş.
NOT: Embriyolar görüntüleme sırasında önemli ölçüde büyüyeceğinden, görme ön ve embriyo posterior alanında yer olduğundan emin olun. ND edinme penceresinin Büyük Görüntü Takını sekmesini kullanın ve dört bitişik görüş alanını yakalamak için %10 çakışan 4 x 1 deseni seçin. - Mikroskop yazılımını kullanarak Z-yığınlarını yakalamak için ayarları yapılandırın.
NOT: Embriyo cam kabın dibine yakın monte olduğundan, merkezi büyüdükçe alttan uzaklaşacaktır. ND edinme penceresinin Z sekmesini kullanın ve Asimetrik göreli aralığıseçin. Bu yöntemle, mevcut odak düzlemi Referans düzlemi olarak kullanılır ve uçakların geri kalanı asimetrik olarak z-yığın hacmi içinde tüm embriyo dahil etmek için yukarıda ve aşağıda dağıtılır, numunenin büyümesini hesaba katmak için yeterli alan ile. Tüm deneylerde, aralık 11 μm ve yaklaşık 45 düzlemler için toplam aralığı ayarlandı. - Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme sırasında birden fazla embriyonun odak noktasını korumak için otomatik bir odak kullanın. Birkaç embriyo görüntüleseniz, her embriyo için ayrı ofset düzeylerini Referans düzlemineodaklanmak için ayarlayın.
NOT: Bu deneyde lazer tabanlı odak sabitleme sistemi kullanılmıştır. - Mikroskop yazılımında ve görüntüde yaklaşık 1 saat aralıklarla 55 saat süreyle hızlandırılmış parametreler ayarlayın. Her döngüde, iki embriyo veri kümesini sırayla yakalayın ve her döngüden sonra verileri otomatik olarak kaydedin.
- Mikroskop yazılımının çevrimiçi veya çevrimdışı sürümünü kullanarak görüntüleri işleyin. Birden fazla embriyo görüntülenmişse, görüntüleme nin konumuna göre veri kümesini bölerek her embriyo için bağımsız dosyalar oluşturun. 3B zaman veri kümelerini 2B zaman veri kümelerine dönüştürmek için maksimum yoğunlukprojeksiyonlarını veya benzer bir aracı kullanın. Dosya biçimi olarak .avi'yi seçerek menü olarak Kaydet seçeneğini kullanarak film dosyaları oluşturun. 5 kare /s oynatma hızı için 200 ms aralıklı Sıkıştırma Yok seçeneğini seçin.
NOT: Bu deneydeki iki embriyonun orijinal veri kümesi, yazılımdaki Split konumları işlevi kullanılarak bölündü (Dosya | İthalat /İhracat | Çok Noktaları Böl). 3B zaman veri kümeleri Maksimum yoğunluklu projeksiyon işlevi kullanılarak 2B zaman veri kümelerine dönüştürüldü (Resim | ND İşleme| Z'de Maksimum Yoğunluklu Projeksiyon Görüntüsü Oluşturun).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Montaj yönteminin geliştirilmesi
Bu çalışmanın temel amacı, zebra balığı gelişiminin uzun süreler boyunca hızlandırılmış görüntülemesi için düşük maliyetli bir montaj tekniği geliştirmektir. Katmanlı montaj yöntemi kırılgan zebra balığı embriyo vücudunun tam büyümesini sağlamak için geliştirilmiştir, hareketlerini kısıtlarken. 1. tabakanın agarose konsantrasyonu çok yüksekse, embriyolar bozulur ve eğrileşir (Şekil 2). %0.1 ve %0.5 agarose'da yetişen embriyolar kuyrukları, çarpık yüzgeçleri ve kavisli kafaları kısaltmıştır. Aksine, eğer agarose konsantrasyonu çok düşükse, embriyolar zaman atlamalı mikroskopi sırasında görüş alanının dışına taşınırlar, anestezili olsalar bile, büyüyen kuyruk embriyo gövdesinden dışarı sallanır ve hareket etmesine neden olur. Elimize göre optimal agarose konsantrasyonu farklı gruplar arasında %0.028 ile %0.034 arasında değişmektedir. %0.025'in altına inen agarose, embriyonun görüş alanında kalması için yeterli direnç sağlayamadı.
Vasküler, nöronal ve kas gelişiminin uzun süreli görüntüleme
Yukarıda açıklanan montaj yöntemi optimize edildikten sonra, zaman atlamalı konfokal mikroskopi görüntüleri 55 saat boyunca ele geçirildi. Farklı dokularda GFP veya RFP ifade eden canlı transgenik zebra balıkları görüntüledik. Zaman atlamalı görüntüleme için endojen floresan ile transgenik balık kullanmanın bir avantajı, GFP ve RFP gibi floresan moleküllerinin canlı embriyoda sürekli olarak üretilmeleridir ve böylece kolayca fotoğraf ağartıcı olmaz. İlk olarak, Tg(kdr1: EGFP)mitfab692/b69210 ve Ubi-zebrabow11 bir haç embriyolar görüntülendi. Bu embriyolarda RFP, genel embriyo yapısının görselleştirilmesine olanak sağlayan tüm embriyo hücrelerinde ifade edilir. GFP vaskülatür endotel hücrelerinde ifade edilir. Çift transgenik embriyolar, 0.45 NA ile 10x hedefi kullanılarak baş ve vücuttaki vasküler gelişimi(Şekil 3 ve Ek Film S1)görselleştirmek için yaklaşık 30 somite evresinden 55 saat boyunca görüntülendi. İki embriyo/seans z-yığınları ve bir döngü içinde zaman atlamalı olarak görüntülendi, böylece ilk embriyo iki farklı dalga boyunda görüntülendikten sonra, ikincisi daha sonra görüntülendi ve sonra ilki tekrar. Şekil 3 intersegmental damar (ISV) filizlenme gösterir, subintestinal damarların gelişimi ve baş vaskülatür, ve gövde uzantısı ile birlikte kaudal ven pleksus yoğuşma. Tüm embriyonun vaskülatürle görüntülenmesi, ISV'nin sinitler arasında başladığını ve nöral tüpün noktasına kadar dorsally büyüdüğünü ve ISV'lerin farklı bir yol izlediği ve bir sonraki anterior somite sınırına doğru bir yönde filizlendirdiğini göstermektedir.
Daha sonra, Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 ve Ubi-zebrabow bir haç embriyolar motornöron gelişimi görselleştirmek için 30 somite aşamasından yaklaşık 55 saat için görüntülenmiştir(Şekil 4 ve Ek Film S2). Tg(mnx:GFP) ilk mitfab692/b692 (her ikisi de Oregon Üniversitesi'nde Zebrafish Uluslararası Kaynak Merkezi, OR) Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629üretmek için geçti olmuştu. Motornöron aksonları ventral nöral tüpten embriyonun ventral tarafına doğru somitler üzerinde filizlenir. Somitler arasında filizlenen intersegmental damarların aksine, aksonların ortasından, chevron şeklindeki somitlerin üzerinde filizlenir. Filizlenme nöral tüpün ön ucuna doğru başlar, nöral tüpten düz bir açıyla, ve posterior yayılır. Somite/yolk arabirimi ile filizlenme ön ve arka filizlenme ye yön değiştirir. Ön nöritler tarafından gelişmekte olan kalbin innervasyon dikkat edin.
Ayrıca, Tg(kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 (Tg(kdr:enl.memRFP ve mitfab692/b692)ve Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692 çaprazı görüntülendi. Eski embriyolarda, kırmızı vasküler floresan 36 saat sonra döllenme (hpf) kadar görünür değildi, ve bu nedenle 2 dpf daha sonraki bir zaman noktasında görüntüleme başladı. Biz gövdenin bir parçası, sarısı kese uzantısı dorsally, daha yüksek büyütme (20x objektif) kullanarak görüntülenmiştir. Bu film, embriyoların yüksek büyütmede iyi görüntüleme kalitesi için yeterli olduğunu gösteriyor. Motornöron aksonların intersegmental damarların konumuna göre dorsal filizlenmesi nin birlikte geliştirilmesi takip edilmiştir (Şekil 5 ve Ek Film S3). Bu filmlerde ventral akson filizlenmenin ince ayrıntıları görülebilir ve nöronal aksonların ve intersegmental damarların birlikte göç ettiği bir noktaya kadar nöral tüpten çıkan dorsal akson görülebilir. Kaudal ven pleksus yoğuşması da açıkça gösterilmiştir. Bir neurite filiz ilerlik kuyruk arka ucuna doğru eksik olduğunu unutmayın (sağ taraftan 12inci neurit pozisyonunda), en yakın posterior nöron nötritler arasındaki alanı kapsayacak şekilde embriyonun ön kısmına doğru uzanır 11 ve 13.
Son olarak, HGn39b12birhaç,13 ve Ubi-zebrabow görüntülendi. HGn39b ısı şokprotein ATPase homolog 1 (AHA1) geninin aktivatör GFP eklemek ile bir zTRAP hattıdır(http://kawakami.lab.nig.ac.jp/) ve somites kaslarında GFP ifade eder (Şekil 6 ve Ek Film S4). Somit sayıları arttıkça, somitler de uzunluk ve genişlik olarak genişletir. Bu film aynı zamanda güzel Ubi-zebrabow balık hattı kırmızı floresan kalp gelişimini gösterir.
Şekil 1 : Montaj yönteminin tanımı. (A) 35 mm çanak cam alt tarafından oluşturulan küçük kuyuya zebrabalığı embriyo ekleyin. (B) Embriyoyu kapsayacak şekilde küçük kuyuya agarose katmanı 1 ekleyin. (C) Küçük kuyunun üzerine bir cam kapağını dikkatlice yerleştirin. (D) 35 mm'lik kabın tüm altına agarose tabakası 2 ekleyin. (E) Yemeğe E3 ekleyin. (F) Montaj kurulunun bir kesitinin şematik çizimi. (G) Son montajda zebrabalığı embriyosundaki mikroskop görüntüsü (5x objective). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Embriyo büyüme kısıtlaması ve farklı konsantrasyonlarda gelişimsel gecikme. Embriyolar farklı agarose konsantrasyonlarında monte edildi ve boyut ve gelişim leri 48 hpf olarak görüntülendi. Dijital mikroskop renkli kamera (2.5x objektif) ve beraberindeki mikroskop yazılımı ile donatılmış bir mikroskop tarafından çekilen görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Vaskülatür gelişiminin görselleştirilmesi. Çapraz Tg(kdr1: EGFP)mitfab692/b692 ve Ubi-zebrabow bir konfokal mikroskop üzerinde 55 h için yaklaşık 30 somite aşamasından görüntülenmiş. Yeşil ve kırmızı diğer tüm hücrelerde vaskülatür. Ölçek çubuğu 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Nöronların ve neurit filizlenmesinin görselleştirilmesi. Çapraz Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 ve Ubi-zebrabow bir konfokal mikroskop üzerinde 55 h için yaklaşık 30 somite aşamasından görüntülenmiş. Motornöronlar yeşil, diğer tüm hücreler kırmızı. Ölçek çubuğu 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Nöronların ve vaskülatürlerin birlikte gelişiminin görselleştirilmesi. Çapraz Tg(kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 ve Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692 yaklaşık 2 dpf bir konfokal mikroskop üzerinde 55 saat boyunca görüntülendi. Kırmızı da vaskülatür, yeşil motornöronlar. Ölçek çubuğu 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Somitlerde kas GFP ekspresyonunun görüntülenmesi. HGn39b ve Ubi-zebrabow çapraz yaklaşık 30 somite aşamasından 55 saat için bir konfokal mikroskop üzerinde görüntülendi. Yeşil de kas, kırmızı daki diğer tüm hücreler. Ölçek çubuğu 500 μm Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Film S1: Tg(kdr1:EGFP)mitfab692/b692 ve Ubi-zebrabow bir çapraz bir embriyo film 10x amacı kullanarak bir konfokal mikroskop üzerinde 55 saat için yaklaşık 30 somite aşamasından görüntülenmiş. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Film S2: Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 ve Ubi-zebrabow bir çapraz bir embriyo film 10x amacı kullanarak bir konfokal mikroskop üzerinde 55 h için yaklaşık 30 somite aşamasından görüntülenmiş. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Film S3: Tg bir çapraz bir embriyo film (kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 ve Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692 20x objektif kullanarak bir confokal mikroskop üzerinde 55 h için yaklaşık 2 dpf görüntülendi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Film S4: HGn39b ve Ubi-zebrabow bir çapraz bir embriyo film 10x amacı kullanarak bir konfokal mikroskop üzerinde 55 h için yaklaşık 30 somite aşamasından görüntülendi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm zebra balığı embriyolarının uzun süreli konfokal mikroskopisi için bir montaj yöntemi burada açıklanmıştır. Montaj yöntemi için en kritik adım sınırsız zebra balığı embriyo büyümesi için izin verecek agarose optimal konsantrasyonu belirlemek için, ve aynı zamanda konfokal görüntüleme için tamamen sabit bir konumda embriyotutmak. Agarose'un optimum konsantrasyonu çok dar olduğundan, bu değer çözeltinin hazırlanması sırasında agarose'un ağırlığının ve E3 hacminin ölçülmesindeki hatalara karşı çok hassastır. Optimal konsantrasyon da sıcaklık ve embriyonun evrebağlı olabilir. Bu nedenle, farklı konsantrasyonlarda testlerin tekrarı ile agarose çözeltisinin her yeni parti için en uygun konsantrasyonun yeniden tanımlanması gerekecektir.
Montaj yönteminde bir diğer kritik adım da agarose'un ikinci tabakasının eklenmesidir. İkinci katman, kapak camı yerinde tutar. Kapak camı hareket etmesi için bir seferde biraz dikkatli bir şekilde eklenmelidir. İkinci katman da E3 için geçirilebilir bir bariyer olarak hizmet vermektedir. E3 olmadan, embriyolar görüntüleme sırasında kuruyacak. Agarose ikinci tabaka olmadan, kapak cam ve embriyo yüzen başlayacak.
Önerilen montaj yönteminin bir sınırlaması, ters mikroskoplar için iyi çalışsa da, dik mikroskoplar için çalışmamasıdır. Cam alt çanağı E3 ile doldurarak, parafilmle kapatarak ve ters çevirerek dik bir mikroskop kullanarak hızlandırılmış görüntüleme yapmak için çeşitli girişimlerde bulunuldu. Ancak, genellikle bu montaj görüntüleme boyunca yarıya çöktü sonuçlandı. Bu lazer ışığına uzun maruz kaldıktan sonra örnekte artan ısı neden olabilir, hangi katılaşmış agarose tabakası erimesine neden olur.
Zaman atlamalı mikroskopi sonunda embriyolarda perikardiyal ödem göstermeye başladı. Farklı deneyler arasında değişen ödem 35-50 saat arasında görüntüleme gözlendi. Bunun embriyo immobilizasyonundan mı yoksa anesteziklerin etkisinden mi kaynaklandığı şu anda bilinmemektedir. Trikalin iskelet ve kardiyak kasların kasılması bastırmak için bilinmektedir. Sonuç olarak, Tricaine yetişkin balık14 ve embriyolar15kalp hızını etkiler. Diğer çalışmalar da Tricaine tedavisi zebrabalığı embriyolarında perikardiyal ödem neden olduğunu bildirdin2,16. Bu makalede, Tricaine konsantrasyonu (0.016-0.020%) zebra balığı araştırmalarında yaygın olarak kullanılan; yine de görüntüleme dönemimizin sonunda perikardiyal ödem meydana geldi. Perikardiyal ödem, embriyoların daha uzun süre görüntülemesini sağlamak için ana bir kısıtlama oluşturmuştur. Bu kardiyak toksisiteyi azaltmanın potansiyel yolları, Tricaine ile eugenol gibi iki farklı anestezikmaddeyi birleştirmek veya anestezikler için α-bungarotoxin mRNA enjeksiyonu kullanmakdır16; kombinatoryal veya alternatif anestezi bileşiklerinin yararlı etkileri zebrabalığı gelişiminin uzun süreli görüntülemeiçin daha fazla araştırılması gerekir.
Sonuç olarak, açıklanan montaj yöntemi hızlı, kolay, uygun maliyetli dir ve herhangi bir ters mikroskop üzerinde çalışır. Düzenli cam alt tabaklar ve düşük eritme agarose kullanılabilir ve özel kalıplar, ekipman veya enstrümantasyon gereklidir. Katmanlı montaj yöntemi embriyo büyümesini sağlarken aynı zamanda embriyoları sabit bir konumda tutar. Tüm organizmanın uzun süreli görüntülemesi kullanılarak doku gelişimi hakkında yeni bilgiler elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Albert Pan ve Arndt Sieakmann'a transgenik balık hediyeleri için teşekkür ederiz. Biz Genetik Ulusal Enstitüsü'nde Koichi Kawakami teşekkür, Eğitim Bakanlığı Ulusal BiyoKaynak Projesi, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Japonya transgenik zebra balığı HGn39bhediye için . Ayrıca Fatima Merchant ve Kathleen Gajewski'ye konfokal mikroskopi konusunda yardımcı lıkları için ve Tracey Theriault'a da fotoğraflar için teşekkür ederiz.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'nün (p30ES023512 hibe numarası ve HHSN2732015000010C) hibeleri ile desteklenmiştir. SU Keck Hesaplamalı Kanser Biyolojisi programı (Gulf Coast Consortia CPRIT hibe RP140113) ve Hugh Roy ve Lillie Bağış Fonu tarafından bir burs tarafından desteklendi. J-Å G, Robert A. Welch Vakfı (E-0004) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
