Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage zerbrechlicher Zebrafischembryonen für eine längere konfokale Zeitraffermikroskopie. Diese kostengünstige Methode ist einfach mit normalen Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.
Abstract
Auf die Entwicklungsdynamik kann eine konfokale Zeitraffermikroskopie lebender transgener Zebrafischembryonen folgen, die Fluoreszenz in bestimmten Geweben oder Zellen ausdrücken. Ein Problem bei der Bildgebung der entwicklung ganzer Embryonen ist, dass Zebrafischembryonen erheblich in der Länge wachsen. Bei regelmäßiger Montage in 0,3-1% niedriger Schmelzagarose erzwingt die Agarose Wachstumseinschränkungen, was zu Verzerrungen im weichen Embryokörper führt. Doch um eine konfokale Zeitraffermikroskopie durchführen zu können, muss der Embryo immobilisiert werden. Dieser Artikel beschreibt eine geschichtete Montagemethode für Zebrafischembryonen, die die Beweglichkeit der Embryonen einschränken und gleichzeitig das uneingeschränkte Wachstum ermöglichen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen. Um die Nutzbarkeit dieser Methode zu demonstrieren, wurde die entwicklung von ganzen Embryonen, Neuronalen und Muskeln 55 Stunden lang in transgenen Fischen abgebildet. Dieses Montageverfahren kann zur einfachen, kostengünstigen Abbildung ganzer Zebrafischembryonen mit invertierten Mikroskopen ohne Anforderungen an Formen oder spezielle Ausrüstung eingesetzt werden.
Introduction
Der Zebrafisch ist seit langem ein Modellorganismus für die Entwicklungsbiologie, und die Mikroskopie ist die wichtigste Methode, um die embryonale Entwicklung zu visualisieren. Die Vorteile der Verwendung von Zebrafischembryonen für Entwicklungsstudien sind geringe Größe, optische Klarheit, schnelle Entwicklung und hohe Fruchtbarkeit der erwachsenen Fische. Die Erzeugung transgener Zebrafischlinien, die Fluoreszenz in bestimmten Geweben oder Zellen exdrücken, hat eine direkte Visualisierung der Gewebeentwicklung auf eine Weise ermöglicht, die bei größeren Wirbeltieren nicht möglich ist. In Kombination mit der Zeitraffermikroskopie lassen sich Details und Dynamiken der Gewebeentwicklung leicht untersuchen.
Ein Problem bei der Bildgebung der Zebrafischentwicklung ist, dass die Embryonen erheblich in der Länge wachsen; der Embryo verlängert seine Länge viermal innerhalb der ersten 3 Tage des Lebens1. Auch der Körper des frühen Embryos ist weich und wird leicht verzerrt, wenn das Wachstum eingeschränkt wird. Doch um eine konfokale Mikroskopie durchführen zu können, muss der Embryo immobilisiert werden. Um Embryonen in einer festen Position für konfokale Zeitraffer-Bildgebung zu halten, werden sie regelmäßig beäscht und in 0,3-1% niedrigschmelzender Agarose montiert. Dies hat den Vorteil, dass während der Bildgebung für einen bestimmten Zeitraum ein gewisses Wachstum ermöglicht wird, während gleichzeitig die Bewegungen des Embryos eingeschränkt werden. Teile des Embryos können effizient so abgebildet werden. Bei der Verwendung dieser Methode zur Bildgebung des gesamten Embryos über einen längeren Zeitraum werden jedoch Verzerrungen aufgrund des durch die Agarose verursachten eingeschränkten Wachstums beobachtet. Daher sind weitere Montagemethoden erforderlich. Kaufmann und Kollegen haben eine alternative Montage von Zebrafischembryonen für die Lichtbogenmikroskopie beschrieben, wie z.B. die selektive Ebenenbeleuchtungsmikroskopie (SPIM), indem die Embryonen in fluorierten Ethylenpropylen (FEP)-Röhren montiert werden, die geringe Konzentrationen von Agarose oder Methylcellulose2enthalten. Diese Technik erzeugt eine hervorragende Visualisierung der Embryogenese im Laufe der Zeit. Schmid et al. beschreiben die Montage von bis zu sechs Embryonen in Agarose in FEB-Röhren für die Lichtbogenmikroskopie3, die die Visualisierung mehrerer Embryonen in einer Bildgebungssitzung ermöglicht. Formen wurden verwendet, um Embryo-Arrays für die effiziente Montage einer größeren Anzahl von Embryonen zu erstellen4. Masselkink et al. haben 3D-gedruckte Kunststoffformen konstruiert, die verwendet werden können, um Siliziumgüsse herzustellen, in denen Zebrafischembryonen in verschiedenen Stadien platziert werden können, was die Montage in einer konstanten Position für die Bildgebung ermöglicht, einschließlich konfokaler Bildgebung5. 3D-Druck wurde auch verwendet, um Formen für die konsistente Positionierung von Zebrafisch-Embryonen im 96-Well-Format6zu machen. Einige Formen sind für bestimmte Stufen angepasst und erlauben möglicherweise nicht uneingeschränktes Wachstum für längere Zeiträume, während andere Formen flexibler sind. Vor kurzem veröffentlichten Weijts et al. das Design und die Herstellung einer Vier-Brunnen-Schale für die Live-Bildgebung von Zebrafisch-Embryonen7. In dieser Schale werden Schwanz und Rumpf von anästhesierten Fischembryonen manuell unter einem klaren Silikondach platziert, das knapp über einem Deckglas befestigt ist, um eine Tasche zu bilden. Der Embryo wird dann in dieser Position durch die Zugabe von 0,4% Agarose fixiert. Diese Montage ermöglicht die Abbildung des etwa 2 mm langen hinteren Teils (Stamm und Schwanz) des Embryos, und da bis zu 12 Embryonen pro Bohrgut montiert werden können, ermöglicht das Verfahren die Abbildung mehrerer Proben. In ähnlicher Weise präsentierten Hirsinger und Steventon vor kurzem eine Methode, bei der der Kopf des Fisches in Agarose montiert ist, während der Schwanz frei wachsen kann, und diese Methode erleichtert auch effizient die Bildgebung des Rumpf- und Schwanzbereichs desEmbryos 8.
Dieser Artikel beschreibt eine geschichtete Montagemethode für Zebrafischembryonen, die die Bewegungen der Embryonen einschränken und gleichzeitig ein uneingeschränktes Wachstum ermöglichen. Die Vorteile dieser Montagemethode sind, dass es sich um eine kostengünstige, schnelle und einfache Methode zur Montage von Embryonen verschiedener Stadien für die Bildgebung mit jedem invertierten Mikroskop handelt. Die Montage ermöglicht eine langzeitige Bildgebung des ganzen Körpers (Kopf, Rumpf und Schwanz) während der Embryoentwicklung. Um die Nutzbarkeit dieser Methode zu zeigen, wurde die entwicklung von ganzen Embryonastagen, Neuronalen und Muskeln in transgenen Fischen dargestellt. Zwei Embryonen pro Sitzung, bei zwei Wellenlängen in 3D, wurden durch Zeitraffermikroskopie für 55 aufeinander folgende Stunden abgebildet, um Filme der Gewebeentwicklung zu rendern.
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Protocol
Die hier vorgestellte Tierarbeit wurde von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUCs) der University of Houston und der Indiana University genehmigt.
1. Fischzucht
HINWEIS: Die Arbeit mit Wirbeltiermodellen erfordert ein von der IACUC zugelassenes Protokoll. Sie sollte nach den einschlägigen nationalen und internationalen Leitlinien durchgeführt werden.
- Pflegen Sie erwachsene Zebrafische, wie in der zuvor veröffentlichten Literaturbeschrieben 9.
- Am Nachmittag erwachsene Zebrafische in Zuchtbecken aufstellen. Züchtemännchen zu Weibchen im Verhältnis 1:2.
2. Vorbereitung von Lösungen
- Machen Sie eine Lagerlösung von 1% niedriger Schmelzagarose in Embryomedien (E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, angepasst auf pH 7,0). Aliquot die Lagerlösung in 1,5 ml Rohre und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Machen Sie eine Lagerlösung von 4% (w/v) Tricaine (MS-222) in destilliertem Wasser. Bei 4 °C in einer dunklen Flasche aufbewahren.
VORSICHT: Tricain ist giftig und sollte gewogen und in einer Dunstabzugshaube gelöst werden. - Machen Sie eine Lagerlösung von 20 mM N-Phenylthiourea (PTU) in destilliertem Wasser. Bei -20 °C lagern.
3. Zubereitung von Embryonen
- Nach der Paarung Embryonen in E3 in einer Petrischale ernten und bei 26,5 °C ca. 28 h vor der Montage bebrüten.
HINWEIS: Dies verlangsamt die Entwicklung der Embryonen, so dass die Embryonen zu Beginn der Bildgebung ungefähr 30 Jahre alt sind. - Anästhetisieren Sie Embryonen in 0,016-0,020% Tricain in E3. Um die Pigmentierung zu hemmen, fügen Sie PTU zu einer Konzentration von 200 M hinzu.
- Dechorionate die Embryonen mit Zangen unter einem Sezieren Mikroskop. Mit zwei Zangen greifen und ziehen Sie den Chorion vorsichtig auseinander, um den Embryo freizusetzen.
4. Montage in Agarose
HINWEIS: Das entwickelte Montageverfahren erfordert zwei verschiedene Konzentrationen von Niedrigschmelz-Agarose in E3 mit 0,02% Tricain und PTU bei Bedarf. Die erste Agaroselösung enthält eine optimale Konzentration von Agarose, bei der die Verzerrung und Beweglichkeit minimal sind. Die Optimierung wird in Schritt 5 unten beschrieben.
- Erhitzen Sie die Agarose-Lösungen für die beiden Schichten (Konzentration definiert in Schritt 5 unten und 1%) bis 65 °C. Lassen Sie die Agarose kurz vor der Montage auf ca. 30 °C abkühlen, damit der Embryo durch die Hitze nicht geschädigt wird. Für die Montage verwenden Sie 35 mm Glasbodenschalen mit einem Abdeckungsboden Nr. 0. Das an der Unterseite der Schale befestigte Abdeckglas erzeugt einen 10 mm flachen (ca. 1,2 mm tiefen) Brunnen, in dem der Embryo platziert werden soll.
HINWEIS: In diesem Fall lag die Konzentration mit der geringsten Beweglichkeit und Verzerrung zwischen 0,025 und 0,040% Agarose. - Legen Sie einen dechorionierten Embryo mit einer seiner Seiten mit einer Glaspipette oder Mikropipette vorsichtig zur Unterseite der Schale. Wenn Sie eine Mikropipette verwenden, schneiden Sie den äußeren Teil der Spitze, um die Größe der Öffnung zu erhöhen, um den Embryo zu passen (Abbildung 1A). Entfernen Sie alle verbleibenden E3 sorgfältig mit einer Mikropipette.
- Fügen Sie die erste Agarose-Lösung zu dem kleinen Brunnen hinzu, der durch das an der Unterseite der Schale befestigte Abdeckglas geschaffen wurde, um den Embryo zu bedecken (Schicht 1)(Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass die Agarose den kleinen Brunnen bedeckt, aber nicht überfließen wird.
- Bedecken Sie den kleinen Brunnen mit einem Deckglas (22 mm x 22 mm)(Abbildung 1C), um einen schmalen Agarose gefüllten Raum mit dem Embryo zwischen den beiden Deckgläsern zu schaffen.
- Legen Sie eine Schicht von 1% Agarose Lösung auf der Oberseite des Deckglases auf der untere Seite der Schale (Schicht 2)(Abbildung 1D). Wenn diese Schicht verfestigt, hält sie das Deckglas an Ort und Stelle.
- Füllen Sie den restlichen Teil der Schale mit E3, das 0,02% Tricain enthält, um das System hydratisiert zu halten (Schicht 3) (Abbildung 1E).
HINWEIS: In diesem Setup schützen das Deckglas und 1% Agarose die untere Schicht vor Verdünnung.
5. Optimierung der Agarose-Lösung für Schicht 1
- Um die optimale Konzentration von Agarose für Layer 1 zu identifizieren, verwenden Sie einen mehrskalen Rastersuchansatz. Mount-Embryonen in zunehmenden Konzentrationen von Agarose im Bereich von 0,01% bis 1%, gefolgt von Zeitraffer-Bildgebung von Embryo-Wachstumsbeschränkung und Beweglichkeit im Sichtfeld. Identifizieren Sie die Konzentrationen, bei denen sowohl die Verzerrung als auch die Beweglichkeit minimal sind.
- Um die Konzentration von Agarose weiter zu optimieren, montieren Sie die Embryonen mit einem feineren Bereich von Agarosekonzentrationen (z. B. zwischen 0,025 und 0,040% Agarose), je nach der Konzentration, die in Schritt 5.1 am besten ist (z. B. 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
HINWEIS: In unserem Labor lag die optimale Agarosekonzentration bei etwa 0,03%.
6. Zeitraffer-Bildgebung
HINWEIS: Dieses Montageverfahren funktioniert für jedes invertierte Mikroskop mit Zeitrafferfunktionalität für Fluoreszenz und Lichtfeldbildgebung.
- Zeitraffer-Bildgebung für den gesamten Embryo oder Teile davon für bis zu 55 h durchführen. Für die Bildgebung mehrerer Embryonen verwenden Sie einen Bühnenadapter, der mehrere Gerichte mit einem Embryo pro Schale hält. Drehen Sie die Gerichte nacheinander, so dass die Embryonen ungefähr horizontal positioniert sind, wie vom Auge bestimmt. Für ein optimales Embryowachstum und eine optimale Entwicklung verwenden Sie ein Mikroskopstadium mit einem Inkubator-Set bei 28,5 °C.
- Wählen Sie ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung in der Mikroskopsoftware aus. Unter dem Augenstück, lokalisieren und fein ausrichten die Embryonen horizontal durch Drehen der Gerichte mit hellen Feldbeleuchtung und erfassen ihre Positionen in der Software. Erstellen Sie einen Dateinamen für das automatische Speichern der Daten.
HINWEIS: In diesem Experiment wurden ein Plan-Apo-Objektiv 4x 0,2 NA und die Registerkarte XY im ND-Erfassungsfenster verwendet, um die Positionen der Embryonen aufzuzeichnen. Die Daten wurden im .nd2-Format gespeichert. Das Ziel wurde ausgewählt, indem Sie auf die Symbole in der Registerkarte Ti Pad klicken. - Legen Sie die Lochgröße, die Scangeschwindigkeit, die Bildgröße und den Zoom fest. Wählen Sie als Nächstes ein höheres Vergrößerungsziel für die Aufnahme der Bilder aus.
HINWEIS: In diesem Experiment wurde ein Plan-Apo-10x 0,45-NA-Objektiv für die Abbildung ganzer Embryonen verwendet, und ein Superfluor-20x 0,75-NA-Objektiv wurde für die höhere Vergrößerungsbildgebung von Teilen des Embryos verwendet. Das Loch wurde auf 1,2 AE (19,2 m für das 10-fache Objektiv) eingestellt, die Scangeschwindigkeit wurde für eine Pixelverweilzeit von 2,4 s eingestellt und die Bildgröße auf 1024 x 1024 Pixel mit einem Scan-Zoom von einem, was eine Pixelgröße von 1,24 'm für das 10x-Objektiv und 0,62 m für das 20-fache Objektiv. - Wählen Sie die Kanäle für die fluoreszenz, die abgebildet werden soll. Passen Sie die Einstellungen für die Bildaufnahme jeweils einen Kanal an. Passen Sie für jeden Fluoreszenzkanal die Laserleistung und die Hochspannung des Detektors an, um den bestmöglichen Dynamikbereich zu erfassen und gleichzeitig die Sättigung zu vermeiden und photobleichen zu begrenzen.
HINWEIS: In diesem Experiment wurde GFP mit dem 488 grünen Kanal (488 nm Laser und Emission zwischen 500 und 550 nm) und RFP mit dem 561 roten Kanal (561 nm Laser und Emission zwischen570 und 600 nm) abgebildet, und das Übertragungsbild wurde mit dem 561 nm Laser und dem Übertragenlichtdetektor(T D-Kanal)gesammelt. - Um den gesamten Embryo mit dem 10-fachen Objektiv abzubilden, bilden Sie mehrere Sichtfelder mit Überlappung ab und nähen sie mit der Mikroskopsoftware zusammen.
HINWEIS: Da die Embryonen während der Bildgebung erheblich an Größe zunehmen, stellen Sie sicher, dass es Platz im Sichtfeld vor und hinter dem Embryo gibt. Verwenden Sie die Registerkarte Großes Bild scannen des ND-Erfassungsfensters, und wählen Sie ein 4 x 1-Muster mit 10 % Überlappung aus, um vier benachbarte Ansichtsfelder zu erfassen. - Konfigurieren Sie die Einstellungen für die Erfassung der Z-Stacks mit der Mikroskopsoftware.
HINWEIS: Da der Embryo in der Nähe des Bodens der Glasschale montiert ist, bewegt sich sein Zentrum vom Boden weg, während er wächst. Verwenden Sie die Registerkarte Z des ND-Erfassungsfensters, und wählen Sie den asymmetrischen relativen Bereich aus. Bei dieser Methode wird die aktuelle Fokusebene als Referenzebene verwendet und der Rest der Ebenen ist asymmetrisch über und unten verteilt, um den gesamten Embryo innerhalb des Z-Stack-Volumens einzuschließen, mit genügend Platz, um das Wachstum der Probe zu berücksichtigen. In allen Experimenten wurde das Intervall auf 11 m und der Gesamtbereich auf etwa 45 Ebenen eingestellt. - Um den Fokus mehrerer Embryonen während der Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung zu erhalten, verwenden Sie einen automatisierten Fokus. Wenn Sie mehrere Embryonen bildgeben, passen Sie die einzelnen Offset-Werte für jeden Embryo an, um sich auf die Referenzebenezu konzentrieren.
HINWEIS: In diesem Experiment wurde ein laserbasiertes Fokusstabilisierungssystem eingesetzt. - Zeitrafferparameter in der Mikroskopsoftware und im Bild für eine Dauer von 55 h in ca. 1 h Intervallen einrichten. Erfassen Sie in jedem Zyklus zwei Embryo-Datasets sequenziell und speichern Sie Daten automatisch nach jedem Zyklus.
- Verarbeiten Sie Bilder mit einer Online- oder Off-Line-Version der Mikroskopsoftware. Wenn mehr als ein Embryo abgebildet wurde, erstellen Sie unabhängige Dateien für jeden Embryo, indem Sie den Datensatz basierend auf dem Speicherort der Bildgebung aufteilen. Verwenden Sie Projektionen mit maximaler Intensität oder ein ähnliches Werkzeug, um 3D-Zeitdatensätze in 2D-Zeitdatensätze umzuwandeln. Erstellen Sie Filmdateien, indem Sie die Menüoption Speichern als verwenden und .avi als Dateiformat auswählen. Wählen Sie die Option Keine Komprimierung mit 200 ms Intervallen für eine Wiedergabegeschwindigkeit von 5 Frames /s.
ANMERKUNG: Der ursprüngliche Datensatz von zwei Embryonen in diesem Experiment wurde mit der Split-Locations-Funktion in der Software geteilt (Datei | Import/Export | Split Multipoints). 3D-Zeitdatensätze wurden mithilfe der Projektionsfunktion Maximale Intensität in 2D-Zeitdatensätze konvertiert ( Bild| ND-Verarbeitung| Erstellen Sie ein Projektionsbild mit maximaler Intensität in Z).
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Representative Results
Entwicklung des Montageverfahrens
Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer kostengünstigen Montagetechnik für die Zeitraffer-Bildgebung der Zebrafischentwicklung über einen längeren Zeitraum. Die geschichtete Montagemethode wurde entwickelt, um das volle Wachstum des zerbrechlichen Zebrafisch-Embryokörpers zu ermöglichen und gleichzeitig seine Bewegungen einzuschränken. Wenn die Agarosekonzentration der Schicht 1 zu hoch ist, werden die Embryonen verzerrt und gekrümmt (Abbildung 2). Embryonen, die mit 0,1% und 0,5% Agarose angebaut werden, haben verkürzte Schwänze, verzerrte Flossen und gekrümmte Köpfe. Im Gegenteil, wenn die Agarosekonzentration zu niedrig ist, werden sich die Embryonen während der Zeitraffermikroskopie aus dem Sichtfeld entfernen, obwohl sie beästhestisiert sind, da der wachsende Schwanz aus dem Embryokörper herausschwingt und ihn bewegt. In unseren Händen schwankte die optimale Agarosekonzentration zwischen 0,028% und 0,034% Agarose zwischen verschiedenen Chargen von Agarose. Die Montage unter 0,025% Agarose lieferte nicht genügend Widerstand, damit der Embryo im Sichtfeld bleiben kann.
Erweiterte Zeitraffer-Bildgebung der Gefäß-, Neuronal- und Muskelentwicklung
Nach der Optimierung der oben beschriebenen Montagemethode wurden konfokale Mikroskopiebilder mit Zeitraffer über einen Zeitraum von 55 h aufgenommen. Wir haben lebende transgene Zebrafische abgebildet, die GFP oder RFP in verschiedenen Geweben exzieren. Ein Vorteil der Verwendung transgener Fische mit endogener Fluoreszenz für die Zeitraffer-Bildgebung besteht darin, dass die Fluoreszenzmoleküle wie GFP und RFP kontinuierlich im lebenden Embryo produziert werden und somit nicht leicht Photobleichmittel darstellen. Zunächst wurden Embryonen eines Kreuzes von Tg(kdr1: EGFP)mitfab692/b69210 und Ubi-zebrabow11 abgebildet. In diesen Embryonen wird RFP in allen Zellen des Embryos exprimiert, was eine Visualisierung der allgemeinen Embryostruktur ermöglicht. GFP wird in den Endothelzellen der Vaskulatur exprimiert. Doppelte transgene Embryonen wurden 55 Stunden lang ab etwa 30 Jahren abgebildet, um die Gefäßentwicklung im Kopf und Körper zu visualisieren (Abbildung 3 und Ergänzender Film S1) mit einem 10-fachen Objektiv mit 0,45 NA. Zwei Embryonen/Sitzungen wurden mit Z-Stacks und Zeitraffer in einer Schleife abgebildet, so dass nach der Abbildung des ersten Embryos bei zwei verschiedenen Wellenlängen der zweite dann abgebildet und dann der erste wieder abgebildet wurde. Abbildung 3 zeigt das intersegmentale Gefäß (ISV), das Sprießen, die Entwicklung von Subintestinalgefäßen und Kopfvaskulatur sowie die kaudale Venenplexuskondensation zusammen mit der Stammverlängerung. Die Abbildung des gesamten Embryos mit der Vaskulatur zeigt, dass das ISV-Keimen zwischen den Sods beginnt und dorsal bis zum Neuronderöhre wächst, wo die ISVs einen anderen Weg einschlagen und in Richtung hin zur nächsten vorderen Grenze sprießen.
Als nächstes wurden Embryonen eines Kreuzes von Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 und Ubi-zebrabow für 55 Stunden ungefähr aus dem 30-Stufigen Stadium abgebildet, um die Motorneuronentwicklung zu visualisieren (Abbildung 4 und Ergänzender Film S2). Tg(mnx:GFP) war zuerst mitfab692/b692 (beide vom Zebrafish International Resource Center an der University of Oregon, OR) gekreuzt worden, um Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629zu produzieren. Die Motorneuronaxone sprießen aus dem ventralen Neuralrohr über die Sodes zur ventralen Seite des Embryos. Im Gegensatz zu den intersegmentalen Gefäßen, die zwischen den Soden sprießen, sprießen die Axone über der Mitte über die chevronförmigen Sos. Das Keimen beginnt in Richtung des vorderen Endes des Neuralrohrs, in einem geraden Winkel vom Neuralrohr, und breitet sich hinter enden aus. Durch die Sod/Gelb-Schnittstelle ändert sich die Richtung des Keimens in vorderes und hinteres Keimen. Beachten Sie die Innervation des sich entwickelnden Herzens durch die vorderen Neuriten.
Auch Embryonen eines Kreuzes von Tg(kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 (Kreuz von Tg(kdr:enl.memRFP und mitfab692/b692) und Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692 wurden abgebildet. In den ehemaligen Embryonen war die rote Gefäßfluoreszenz erst nach 36 Stunden nach der Befruchtung (hpf) sichtbar, und deshalb begannen wir die Bildgebung zu einem späteren Zeitpunkt bei 2 dpf. Wir haben einen Teil des Stammes, dorsal zur Dottersackverlängerung, mit höherer Vergrößerung (20x Objektiv) abgebildet. Dieser Film zeigt, dass die Embryonen noch genug für eine gute bildgebende Qualität bei höherer Vergrößerung lagen. Die Mitentwicklung des dorsalen Keimens von Motorneuronaxonen in Bezug auf die Position der intersegmentalen Gefäße wurde verfolgt (Abbildung 5 und Ergänzender Film S3). In diesen Filmen sind die feineren Details des ventralen Axonkeimens sichtbar, ebenso wie dorsales Axon, das aus dem Neuralrohr zu einem Punkt sprießen, an dem neuronale Axone und intersegmentale Gefäße mitmigrieren. Die kaudale Venenplexuskondensation wird ebenfalls deutlich dargestellt. Beachten Sie, dass, da ein Neuritensprossen in Richtung des hinteren Endes des Schwanzes fehlt (in der Position des12. Neuriten von der rechten Seite), das nächste hintere Neuron sich in Richtung des vorderen Teils des Embryos erstreckt, um den Bereich zwischen den Neuriten 11 und 13 zu bedecken.
Schließlich wurde eine Kreuzung aus HGn39b12,13 und Ubi-Zebrabow abgebildet. HGn39b ist eine zTRAP-Linie mit dem GFP-Einsatz im Aktivator des Hitzeschockproteins ATPase homolog 1 (AHA1) Gen (http://kawakami.lab.nig.ac.jp/) und drückt GFP in den Muskeln der Sos aus (Abbildung 6 und Ergänzender Film S4). Mit zunehmender Zahl verlängern sich die Soden auch in Länge und Breite. Dieser Film zeigt auch schön Herzentwicklung in roter Fluoreszenz aus der Ubi-Zebrabogen-Fischlinie.
Abbildung 1: Beschreibung der Montagemethode. (A) Fügen Sie den Zebrafisch-Embryo zu dem kleinen Brunnen hinzu, der durch den Glasboden in der 35 mm Schale geschaffen wurde. (B) Fügen Sie der Agaroseschicht 1 den kleinen Brunnen hinzu, um den Embryo zu bedecken. (C) Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über den kleinen Brunnen. (D) Fügen Sie AgaroseSchicht 2 auf der gesamten Unterseite der 35 mm Schale hinzu. (E) Fügen Sie E3 zum Gericht hinzu. (F) Schematische Zeichnung eines Querschnitts der Montageeinrichtung. (G) Mikroskopbild (5x Objektiv) des Zebrafisch-Embryos in der Endmontage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Embryowachstumsbeschränkung und Entwicklungsverzögerung bei verschiedenen Konzentrationen von Agarose. Embryonen wurden in verschiedenen Agarosekonzentrationen montiert und ihre Größe und Entwicklung bei 48 hpf abgebildet. Bilder, die von einem Mikroskop aufgenommen wurden, das mit einer digitalen Mikroskop-Farbkamera (2,5-faches Objektiv) und der dazugehörigen Mikroskopsoftware ausgestattet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Visualisierung der Entwicklung der Vaskulatur. Kreuz von Tg(kdr1: EGFP)mitfab692/b692 und Ubi-zebrabow ab ca. 30 uhr für 55 h auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Vaskulatur in grün und alle anderen Zellen in rot. Skala Bar 500 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Visualisierung der Entwicklung von Neuronen und Neuritenkeimen. Kreuz von Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 und Ubi-zebrabow ab ca. 30 uhr für 55 h auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Motorneuronen in grün, alle anderen Zellen rot. Skala Bar 500 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Visualisierung der Ko-Entwicklung von Neuronen und Vaskulatur. Kreuz von Tg(kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 und Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692 ab ca. 2 dpf auf einem konfokalen Mikroskop. Vaskulatur in rot, Motorneuronen in grün. Skala Bar 500 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Visualisierung des Muskel-GFP-Ausdrucks in Somites. Kreuz von HGn39b und Ubi-Zebrabow wurden auf einem konfokalen Mikroskop für 55 h von etwa 30 so e Bühne abgebildet. Muskel in grün, alle anderen Zellen in rot. Maßstabsleiste 500 'm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Zusatzfilm S1: Film eines Embryos eines Kreuzes von Tg(kdr1:EGFP)mitfab692/b692 und Ubi-zebrabow ab ca. 30-30-Stufen für 55 h auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzfilm S2: Film eines Embryos eines Kegelkreuzes mit einem 10-fachen Objektiv mit einem 10-fachen Objektiv mitfab692/b629 und Ubi-zebrabow aus etwa 30 Jahren für 55 h auf einem konfokalen Mikroskop. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzfilm S3: Film eines Embryos eines Kreuzes von Tg(kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 und Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692 von ca. 2 dpf für 55 h auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 20x Objektiv. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzfilm S4: Film eines Embryos eines Kreuzes aus HGn39b und Ubi-Zebrabow, der von ca. 30 auf 55 h auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv abgebildet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Hier wird ein Montageverfahren zur erweiterten zeitraffenenkonfokalen Mikroskopie ganzer Zebrafischembryonen beschrieben. Der wichtigste Schritt für die Montagemethode besteht darin, die optimale Konzentration von Agarose zu identifizieren, die ein uneingeschränktes Wachstum von Zebrafischembryonen ermöglicht und gleichzeitig die Embryonen in einer vollständig fixierten Position für die konfokale Bildgebung hält. Da die optimale Konzentration von Agarose sehr gering ist, ist dieser Wert sehr empfindlich auf die Fehler bei der Messung des Gewichts von Agarose und des Volumens von E3 während der Herstellung der Lösung. Die optimale Konzentration kann auch von der Temperatur und dem Stadium des Embryos abhängen. Daher muss die optimale Konzentration für jede neue Charge von Agarose-Lösung durch Wiederholung von Tests unterschiedlicher Konzentrationen neu definiert werden.
Ein weiterer kritischer Schritt ist die Zugabe der zweiten Agaroseschicht. Die zweite Schicht hält das Deckglas an Ort und Stelle. Es muss sorgfältig zu der Schale ein wenig zu einer Zeit hinzugefügt werden, so dass es nicht dazu führt, dass das Deckglas zu bewegen. Die zweite Schicht dient auch als durchlässige Barriere für E3. Ohne E3 trocknen die Embryonen während der Bildgebung aus. Ohne die zweite Schicht von Agarose, das Deckglas und der Embryo beginnen zu schweben.
Eine Einschränkung der vorgeschlagenen Montagemethode ist, dass es zwar gut für invertierte Mikroskope funktioniert, aber nicht für aufrechte Mikroskope funktioniert. Es wurden mehrere Versuche unternommen, Zeitraffer-Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop durchzuführen, indem die Glasbodenschale mit E3 gefüllt, mit Parafilm versiegelt und auf den Kopf gestellt wurde. Oft führte dies jedoch dazu, dass die Montage auf halbem Weg durch die Bildgebung zusammenbrach. Dies könnte durch erhöhte Hitze in der Probe nach der langen Exposition gegenüber Laserlicht verursacht worden sein, wodurch die erstarrte Agaroseschicht schmilzt.
Am Ende der Zeitraffermikroskopie begannen die Embryonen, Perikardödeme zu zeigen. Je nach Versuch wurde ein Ödem zwischen 35 und 50 Stunden Bildgebung beobachtet. Ob dies durch embryonale Immobilisierung oder eine Wirkung von Anästhetika verursacht wurde, ist derzeit nicht bekannt. Tricain ist dafür bekannt, die Kontraktion der Skelett- und Herzmuskeln zu unterdrücken. Folglich, Tricaine beeinflusst herzfrequenz bei erwachsenen Fischen14 und Embryonen15. Andere Studien haben auch berichtet, dass Tricain-Behandlung verursacht Perikardödem in Zebrafisch Embryonen2,16. In diesem Artikel wird eine Konzentration von Tricain (0,016-0,020%) wurde verwendet, die häufig in der Zebrafischforschung verwendet wird; dennoch trat das Perikardödem am Ende unserer Bildgebungsphase auf. Das Perikardödem stellte eine Hauptbeschränkung dar, um die Bildgebung der Embryonen für noch längere Zeiträume zu ermöglichen. Mögliche Möglichkeiten, diese Herztoxizität zu verringern, sind die Kombination von zwei verschiedenen Anästhetika, wie Tricain mit Eugenol, oder mit der Verwendung von -Bungarotoxin mRNA Injektion für Anästhetika16; positive Wirkungen von kombinatorischen oder alternativen Anästhesisierungsverbindungen müssen auf eine längere Zeitraffer-Bildgebung der Zebrafischentwicklung weiter untersucht werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebene Montagemethode schnell, einfach, kostengünstig ist und an jedem invertierten Mikroskop funktioniert. Regelmäßige Glasbodenschalen und niedrigschmelzende Agarose können verwendet werden, und es sind keine speziellen Formen, Geräte oder Instrumente erforderlich. Die geschichtete Montagemethode ermöglicht das Wachstum von Embryonen und hält gleichzeitig die Embryonen in einer festen Position. Durch die Verwendung einer erweiterten Zeitraffer-Bildgebung ganzer Organismen können neue Erkenntnisse über die Gewebeentwicklung gewonnen werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Albert Pan und Arndt Sieakmann für die Geschenke von transgenen Fischen. Wir danken Koichi Kawakami vom National Institute of Genetics, dem National BioResource Project des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie Japans für die Gabe des transgenen Zebrafisches HGn39b. Wir danken auch Fatima Merchant und Kathleen Gajewski für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und Tracey Theriault für Fotos.
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Institute of Environmental Health Sciences der National Institutes of Health (Grant-Nummer P30ES023512 und Vertragsnummer HHSN273201500010C) unterstützt. SU wurde durch ein Stipendium des Keck Computational Cancer Biology Programms (Gulf Coast Consortia CPRIT Grant RP140113) und von Hugh Roy und Lillie Endowment Fund unterstützt. Unterstützt wurde er von der Robert A. Welch Foundation (E-0004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
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