Summary
Denne artikkelen beskriver en metode for å montere skjøre sebrafisk embryo for utvidet tidsforløp konfokalmikroskopi mikroskopi. Denne rimelige metoden er enkel å utføre ved hjelp av vanlige glass-bunn mikroskopi retter for bildebehandling på noen invertert mikroskop. Monteringen utføres i lag av agarose i ulike konsentrasjoner.
Abstract
Dynamikken i utviklingen kan etterfølges av konfokalmikroskopi time-lapse mikroskopi av levende transgene sebrafisk embryo uttrykker fluorescens i bestemte vev eller celler. Et problem med Imaging hele embryoutvikling er at sebrafisk embryo vokse betydelig i lengde. Når montert som regelmessig gjort i 0,3-1% lav smelte agarose, pålegger agarose vekst restriksjon, som fører til skjevheter i den myke embryo kroppen. Likevel, for å utføre konfokalmikroskopi time-lapse mikroskopi, må fosteret være immobilisert. Denne artikkelen beskriver en lagdelt montering metode for sebrafisk embryo som begrenser motilitet av embryo samtidig gir for Ubegrenset vekst. Monteringen utføres i lag av agarose i ulike konsentrasjoner. For å demonstrere brukbarheten av denne metoden, ble hele embryo vaskulær, neuronal og muskelutvikling avbildet i transgene fisk for 55 sammenhengende timer. Denne monteringsmetoden kan brukes for enkel, rimelig Imaging av hele sebrafisk embryo bruker invertert mikroskop uten krav til mugg eller spesialutstyr.
Introduction
Sebrafisk har lenge vært en modell organisme for utviklingsmessige biologi, og mikroskopi er den viktigste metoden for å visualisere embryoutvikling. Fordelene ved å bruke sebrafisk embryo for utviklingsstudier inkluderer liten størrelse, optisk klarhet, rask utvikling, og høy fekunditet av den voksne fisken. Generering av transgene sebrafisk linjer som uttrykker fluorescens i visse vev eller celler har tillatt for en direkte visualisering av vev utvikling på måter som ikke er mulig med større virveldyr dyr. I kombinasjon med tidsforløp mikroskopi, detaljer og dynamikk av vev utvikling kan lett studert.
Et problem med Imaging sebrafisk utvikling er at embryo vokser betydelig i lengde; embryo utvider sin lengde fire ganger i løpet av de første 3 dagene av livet1. Dessuten er kroppen av de tidlige embryo myk, og lett blir forvrengt hvis veksten er begrenset. Likevel, for å utføre konfokalmikroskopi mikroskopi, må fosteret være immobilisert. For å holde embryo i en fast posisjon for konfokalmikroskopi time-lapse Imaging, de er regelmessig anesthetized og montert i 0,3-1% lav-smelte agarose. Dette har fordelen av å la for noen vekst under Imaging for en viss tid, mens begrense bevegelsene til fosteret. Deler av fosteret kan effektivt bli avbildet som dette. Men når du bruker denne metoden for Imaging av hele embryo for lengre tidsperioder, er skjevheter observert på grunn av begrenset vekst forårsaket av agarose. Dermed er andre monteringsmetoder nødvendig. Kaufmann og kolleger har beskrevet en alternativ montering av sebrafisk embryo for lys ark mikroskopi, for eksempel selektiv fly belysning mikroskopi (SPIM), ved å montere embryo i fluoriserte etylen propylenglykol (FEP) rør som inneholder lave konsentrasjoner av agarose eller methylcellulose2. Denne teknikken gir en suveren visualisering av embryogenesis over tid. Schmid et al. beskriver montering av opptil seks embryo i agarose i FEBRUAR-rør for mikroskopi3 som gir visualisering av flere embryo i en bilde økt. Muggsopp har blitt brukt til å lage embryo arrays for effektiv montering av større antall embryo4. Masselkink et al. har bygget 3D trykt plast muggsopp som kan brukes til å lage silisium kaster som sebrafisk embryo på ulike stadier kan plasseres i, slik at montering i en konstant posisjon for Imaging, inkludert konfokalmikroskopi Imaging5. 3D-utskrift har også blitt brukt til å lage former for konsistent posisjonering av sebrafisk embryo i 96-brønn format6. Noen former er tilpasset for visse stadier og kan ikke tillate Ubegrenset vekst for lang tidsperioder, mens andre formene er mer fleksible. Nylig, Weijts et al. publisert design og fabrikasjon av en fire-brønn parabolen for Live Imaging av sebrafisk embryo7. I denne parabolen, er halen og stammen av anesthetized fisk embryo plassert manuelt under en klar silikon tak festet like over et deksel glass for å danne en lomme. Fosteret blir deretter fast i denne posisjonen ved tilsetning av 0,4% agarose. Denne monteringen gjør det mulig for Imaging av ca 2 mm lang bakre del (trunk og hale) av fosteret, og som opp til 12 embryo kan monteres per brønn, gir metoden for Imaging av flere prøver. På samme måte, Hirsinger og Steventon nylig presentert en metode der leder av fisken er montert i agarose, mens halen kan fritt vokse, og denne metoden også effektivt forenkler Imaging av stammen og halen regionen av embryo8.
Denne artikkelen beskriver en lagdelt montering metode for sebrafisk embryo som begrenser bevegelsene til embryo samtidig gir for Ubegrenset vekst. Fordelene med denne monteringsmetoden er at det er en rimelig, rask og enkel metode for å montere embryo av ulike stadier for bildebehandling ved hjelp av noen invertert mikroskop. Monteringen tillater lang tids avbildning av hele kroppen (hode, stamme og hale) under utviklingen av embryo. For å vise frem brukbarheten av denne metoden, ble hele embryo vaskulær, neuronal og muskelutvikling avbildet i transgene fisk. To embryo per økt, på to bølgelengder i 3D ble avbildet av time-lapse mikroskopi for 55 sammenhengende timer for å gjengi filmer av vev utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyret arbeidet som presenteres her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer (IACUCs) ved University of Houston og Indiana University.
1. fiskeoppdrett
Merk: arbeid med virveldyr modeller krever en IACUC godkjent protokoll. Det bør gjennomføres i henhold til relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer.
- Vedlikehold voksen sebrafisk som beskrevet i tidligere publisert litteratur9.
- På ettermiddagen, sted voksen sebrafisk inne formering tank. Avle menn til kvinner i forholdet 1:2.
2. utarbeidelse av løsninger
- Lag en lagerløsning av 1% lav smelte agarose i embryo Media (E3:5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mm MgSO4, justert til pH 7,0). Alikvot lager løsningen i 1,5 mL rør og oppbevar dem ved 4 ° c.
- Lag en lagerløsning på 4% (w/v) Tricaine (MS-222) i destillert vann. Oppbevares ved 4 ° c i en mørk flaske.
FORSIKTIG: Tricaine er giftig og bør veies og oppløses i en avtrekksvifte. - Lag en lagerløsning på 20 mM N-phenylthiourea (PTU) i destillert vann. Oppbevares ved-20 ° c.
3. utarbeidelse av embryo
- Etter mating, høste embryo i E3 i en Petri parabol og ruge dem ved 26,5 ° c i ca 28 h før montering.
Merk: Dette bremser ned utviklingen av embryo slik at embryo er omtrent på 30 somite scenen i begynnelsen av Imaging. - Bedøve embryo i 0.016-0.020% Tricaine i E3. For å hemme pigmentering, Legg PTU til en konsentrasjon på 200 μM.
- Dechorionate embryo med tang under et dissekere mikroskop. Ved hjelp av to tang, grep og forsiktig trekke chorionic fra hverandre for å frigjøre fosteret.
4. montering i agarose
Merk: den utviklede monteringsmetoden krever to ulike konsentrasjoner av lav-smelte agarose i E3 med 0,02% Tricaine og PTU etter behov. Den første agarose løsningen inneholder en optimal konsentrasjon av agarose der forvrengningen og motilitet er på et minimum. Optimaliseringen er beskrevet i trinn 5 nedenfor.
- Varm opp agarose løsninger for de to lagene (konsentrasjon definert i trinn 5 under og 1%) til 65 ° c. La agarose avkjøles til ca. 30 ° c like før montering, slik at fosteret ikke skades av varmen. For montering, bruk 35 mm glassbunn retter med en no. 0 deksel glassbunn. Dekkglasset festet til bunnen av fatet skaper en 10 mm grunne (ca. 1,2 mm dyp) brønn, hvor fosteret skal plasseres.
Merk: i dette tilfellet var konsentrasjonen med minst motilitet og skjevheter mellom 0,025 til 0,040% agarose. - Forsiktig plassere et dechorionated embryo med en av sine laterale sider mot bunnen av fatet ved hjelp av et glass pipette eller micropipette. Hvis du bruker en micropipette, kutt den ytre delen av spissen for å øke størrelsen på åpningen for å passe fosteret (figur 1a). Fjern forsiktig eventuelle gjenværende E3 med en micropipette.
- Legg den første agarose løsningen til den lille brønnen skapt av dekselet glass festet til bunnen av fatet for å dekke embryo (Layer 1) (figur 1B). Sørg for at agarose dekker den lille brønnen, men vil ikke renne over den.
- Dekk den lille brønnen med et deksel glass (22 mm x 22 mm) (figur 1C) for å lage en smal agarose fylt plass med fosteret mellom de to dekke brillene.
- Plasser et lag med 1% agarose løsning på toppen av dekselet glass over bunnen av fatet (Layer 2) (figur 1D). Som dette laget stivner, holder det dekselet glasset på plass.
- Fyll den resterende delen av fatet med E3 inneholder 0,02% Tricaine å holde systemet hydrert (Layer 3) (figur 1E).
Merk: i dette oppsettet, dekselet glass og 1% agarose beskytte det nederste laget fra å bli fortynnet.
5. optimalisering av agarose løsning for lag 1
- Hvis du vil identifisere den optimale konsentrasjonen av agarose for lag 1, bruker du en multiscale søkemetode for rutenett. Mount embryo i økende konsentrasjoner av agarose spenner fra 0,01% til 1% etterfulgt av time-lapse Imaging av embryo vekst restriksjon og motilitet i synsfeltet. Identifiser konsentrasjonene der både forvrengningen og motilitet er på et minimum.
- For å optimalisere konsentrasjonen av agarose ytterligere, Monter embryo ved hjelp av et finere spekter av konsentrasjoner av agarose (f. eks mellom 0,025 og 0,040% agarose) avhengig av konsentrasjonen funnet å være best i trinn 5,1 (f. eks, 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
Merk: i laboratoriet vårt var den optimale agarose konsentrasjonen rundt 0,03%.
6. tid-lapse tenkelig
Merk: denne monteringsmetoden fungerer for alle invertert mikroskop med time-lapse funksjonalitet for fluorescens og lyse felt Imaging.
- Utfør time-lapse Imaging for hele embryo eller deler av det for opp til 55 h. For Imaging av flere embryo, bruk en scene adapter som inneholder flere retter med ett embryo montert per tallerken. Roter rettene en etter en slik at embryo er omtrent horisontalt posisjonert som bestemmes av øyet. For optimal embryo vekst og utvikling, bruk et mikroskop scene med en inkubator satt ved 28,5 ° c.
- Velg et mål med lav forstørrelse i programvaren for mikroskopet. Under øyet stykke, finne og fint justere embryo horisontalt ved å rotere rettene ved hjelp av lyse felt belysning og spille inn sine steder i programvaren. Opprett et filnavn for automatisk lagring av dataene.
Merk: i dette eksperimentet, en plan Apo λ 4X 0,2 NA mål og XY tab i nd oppkjøpet vinduet ble brukt til å registrere plasseringen av embryo. Data ble lagret i. nd2 format. Målet ble valgt ved å klikke på ikonene i ti pad kategorien. - Angi pinhole størrelse, skannehastighet, bildestørrelse og zoom. Neste, velge en høyere forstørrelsen mål for fanger avbildningene.
Merk: i dette eksperimentet, en plan-Apo 10x 0,45 NA målet ble brukt for avbildning av hele embryo, og en super-fluor 20x 0,75 NA målet ble brukt for høyere forstørrelse Imaging av deler av fosteret. Den pinhole ble satt til 1,2 AU (19,2 μm for 10x objektiv), skanningen hastigheten ble satt for en pixel botid på 2,4 μs og bildestørrelsen ble satt til 1024 x 1024 piksler med en skanning zoom av en, noe som gir en pikselstørrelse på 1,24 μm for 10x objektiv og 0,62 μm for den 20x linsen. - Velg kanalene for fluorescens som skal vises. Juster innstillingene for bildeopptak én kanal om gangen. For hver fluorescens kanal justere laser kraft og detektor høy spenning, og pass på å samle den beste dynamiske området mulig samtidig unngå metning og begrense photobleaching.
Merk: i dette eksperimentet ble GFP avbildet med 488 Green Channel (488 NM laser og utslipp mellom 500 og 550 NM), og RFP med den 561 røde kanalen (561 NM laser og utslipp mellom 570 og 600 NM), og overføring bildet ble samlet inn ved hjelp av 561 NM laser og overført lys detektor (TD kanal). - For å avbilde hele embryo med 10x mål, bilde flere felt av visningen med overlapping og sy dem sammen ved hjelp av mikroskop programvare.
Merk: som embryo vil vokse betydelig i størrelse under bildebehandling, sørg for at det er plass i synsfeltet fremre og bakre til fosteret. Bruk kategorien Skann stort bilde i anskaffelses vinduet for nd , og velg et 4 x 1-mønster med 10% overlapping for å fange fire tilstøtende visningsfelt. - Konfigurer innstillingene for å fange Z-stakker ved hjelp av mikroskop programvaren.
Merk: fordi fosteret er montert nær bunnen av glass fatet, vil dens sentrum bevege seg bort fra bunnen som den vokser. Bruk kategorien Z i vinduet for Anskaffelse , og velg det asymmetriske relative området. Med denne metoden, er gjeldende fokus planet brukes som referanseplanet og resten av flyene er asymmetrisk fordelt over og under for å inkludere hele embryo innenfor Z-stakken volum, med nok plass til å ta hensyn til prøven vekst. I alle eksperimenter ble intervallet satt til 11 μm og det totale området til ca 45 fly. - For å opprettholde fokus for flere embryo under lang tidsforløp Imaging, bruk et automatisert fokus. Hvis Imaging flere embryo, justere de enkelte offset nivåer for hvert embryo å fokusere på referanseplanet.
Merk: i dette eksperimentet ble det brukt et Laserbasert fokus stabiliserings system. - Sett opp tids forløps parametre i mikroskop programvaren og bildet for en varighet på 55 timer ved omtrent 1 timeintervaller. Ved hver syklus, ta to embryo datasett sekvensielt og lagre data automatisk etter hver syklus.
- Behandle bilder ved hjelp av en on-line eller off-line versjon av mikroskop programvaren. Hvis mer enn ett embryo ble avbildet, opprette uavhengige filer for hvert embryo ved å splitte datasettet basert på plasseringen av Imaging. Bruk maksimal intensitet anslag eller et lignende verktøy for å konvertere 3D tid datasett i 2D tid datasett. Lag filmfiler ved hjelp av alternativet Lagre som meny, velge. avi som filformat. Velg Ingen komprimering alternativet med 200 MS intervaller for en avspillingshastighet på 5 bilder/s.
Merk: det opprinnelige datasettet med to embryo i dette eksperimentet ble delt ved hjelp av Split Locations -funksjonen i programvaren (fil | Import/eksport | Split Multipoints). datasett med 3D-tid ble konvertert til 2D-klokkeslett med maksimal intensitet projeksjon funksjon (bilde | Nd behandling | Lag maksimal intensitet projeksjon bilde i Z).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvikling av monteringsmetoden
Hovedformålet med dette arbeidet var å utvikle en rimelig monteringsteknikk for tidsforløp avbildning av sebrafisk utvikling i lengre perioder. Den lagdelte monteringsmetoden ble utviklet for å muliggjøre full vekst av den skjøre sebrafisk embryo kroppen, samtidig som den begrenser dens bevegelser. Hvis agarose konsentrasjon av lag 1 er for høy, vil embryo bli forvrengt og buet (figur 2). Embryo dyrket på 0,1% og 0,5% agarose har forkortet haler, forvrengt finnene, og buede hoder. Tvert imot, hvis agarose konsentrasjon er for lav, vil embryo flytte ut av synsfeltet under time-lapse mikroskopi, selv om de er anesthetized, som den voksende halen svinger ut fra fosteret kroppen og får den til å flytte. I våre hender varierte den optimale agarose konsentrasjonen mellom 0,028% og 0,034% agarose mellom ulike partier av agarose. Montering under 0,025% agarose ikke tilstrekkelig motstand for fosteret å bo i synsfeltet.
Utvidet tidsforløp avbildning av vaskulær, neuronal og muskelutvikling
Etter optimalisere monteringsmetoden beskrevet ovenfor, tid forfalle konfokalmikroskopi mikroskopi bilder ble tatt over et spenn på 55 h. Vi avbildet levende transgene sebrafisk uttrykker GFP eller RFP i ulike vev. En fordel med å bruke transgene fisk med endogene fluorescens for time lapse Imaging er at fluorescens molekyler, som GFP og RFP, produseres kontinuerlig i levende embryo, og dermed gjør det ikke lett bilde blekemiddel. For det første ble embryo av et kors av TG (kdr1: EGFP) mitfab692/B69210 og ubi-zebrabow11 avbildet. I disse embryo, RFP uttrykkes i alle celler av fosteret, som tillater visualisering av den generelle embryo struktur. GFP uttrykkes i de endothelial cellene i blodkar. Dobbel transgene embryo ble avbildet for 55 timer fra ca 30 somite scenen for å visualisere vaskulær utvikling i hode og kropp (Figur 3 og supplerende Movie S1) med et 10X mål med 0,45 na. To embryo/Session ble avbildet med z-stabler og time-lapse i en løkke slik at etter Imaging første embryo på to forskjellige bølgelengder, den andre ble senere avbildet og deretter den første igjen. Figur 3 viser arteria intersegmentalis FARTØY (ISV) spirende, utvikling av subintestinal fartøy og hodet blodkar, og caudal vene plexus kondens sammen med trunk forlengelse. Imaging av hele embryo med blodkar viser at ISV-spirende starter mellom somites og vokser dorsalt opp til det punktet av Neural tube, der ISV tar en annen bane og spirer i retning over til neste fremre somite grensen.
Neste embryo av et kors av TG (mnx: GFP) mitfab692/b629 og ubi-zebrabow ble avbildet for 55 timer ca fra 30 somite scenen for å visualisere Motorneuron utvikling (Figur 4 og supplerende Movie S2). TG (mnx: GFP) hadde først blitt krysset til mitfab692/B692 (begge fra sebrafisk internasjonale Ressurssenter ved Universitetet i Oregon, eller) for å produsere TG(mnx: GFP) mitfab692/b629. Den motorneuron axons spire fra ventrale neural tube over somites mot ventrale siden av fosteret. I motsetning til arteria intersegmentalis fartøy som spire i mellom somites, den axons spire over midten over Chevron-formede somites. Spirende starter mot fremre enden av Neural tube, i en rett vinkel fra neural tube, og sprer seg bakre. Ved somite/eggeplomme-grensesnittet endrer spirende retning til fremre og bakre spirende. Legg merke til innervasjon av utviklings hjertet ved den fremre neurites.
Også embryo av et kors av TG (KDR: ENL. memRFP) mitfab692/b692 (korset av TG (KDR: ENL. memRFP og mitfaB692/b692) og TG (mnx: GFP) mitfab692/b692 ble avbildet. I det tidligere embryo, den røde vaskulære fluorescens var ikke synlig før 36 timer etter befruktning (hpf), og derfor vi startet Imaging på et senere tidspunkt på 2 DPF. Vi avbildet en del av stammen, dorsalt til eggeplomme SAC forlengelse, ved hjelp av høyere forstørrelse (20x objektiv). Denne filmen viser at embryo lå stille nok for god bildekvalitet ved høyere forstørrelse. Co-utviklingen av rygg spirende av motorneuron axons i forhold til plasseringen av arteria intersegmentalis fartøy ble fulgt (figur 5 og supplerende Movie S3). I disse filmene, de finere detaljer om ventrale axon spirende er synlige, samt rygg axon spirende fra nevrale rør til et punkt der neuronal axons og arteria intersegmentalis fartøy co-migrere. Den caudal vene plexus kondens er også tydelig vist. Merk at som en neurite spire mangler mot bakre enden av halen (i plasseringen av de 12th neurite fra høyre side), den nærmeste bakre Nevron strekker seg mot den fremre delen av fosteret å dekke området mellom neurites 11 og 13.
Til slutt ble det avbildet et kors av HGn39b12,13 og ubi-zebrabow . HGn39b er en zTRAP linje med GFP sette inn i aktivator av varme sjokk protein ATPase homologe 1 (AHA1) genet (http://Kawakami.Lab.Nig.ac.jp/) og det uttrykker GFP i musklene i somites (figur 6 og supplerende Movie S4). Som somite tall øker, somites også forlenge i lengde og bredde. Denne filmen også pent viser hjerte utvikling i rødt fluorescens fra ubi-zebrabow fisk linje.
Figur 1: beskrivelse av monteringsmetode. (A) tilsett sebrafisk embryo til den lille brønnen skapt av glasset bunnen i 35 mm parabolen. (B) Legg agarose lag 1 til den lille brønnen for å dekke fosteret. (C) forsiktig plassere et dekkglass over den lille brønnen. (D) Legg agarose lag 2 på hele bunnen av 35 mm parabolen. (E) Legg E3 til parabolen. (F) skjematisk tegning av et tverrsnitt av monterings oppsettet. (G) mikroskop bilde (5x objektiv) av sebrafisk embryo i den endelige montasje. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: embryo vekst restriksjon og utviklingsmessige forsinkelser i ulike konsentrasjoner av agarose. Embryo ble montert i ulike agarose konsentrasjoner og deres størrelse og utvikling avbildet på 48 hpf. Bilder tatt med et mikroskop utstyrt med et digitalt mikroskop farge kamera (2,5 x objektiv) og tilhørende mikroskop programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: visualisering av utviklingen av blodkar. Cross of TG (kdr1: EGFP) mitfab692/b692 og ubi-zebrabow avbildet fra ca 30 somite scenen for 55 h på et konfokalmikroskopi mikroskop. Blodkar i grønt og alle andre celler i rødt. Scale bar 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: visualisering av utviklingen av neurons og neurite spirende. Cross of TG (mnx: GFP) mitfab692/b629 og ubi-zebrabow avbildet fra ca 30 somite scenen for 55 h på et konfokalmikroskopi mikroskop. Motorneurons i grønt, alle andre celler i rødt. Scale bar 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: visualisering av co-utvikling av neurons og blodkar. Cross of TG (KDR: ENL. memRFP) mitfab692/b692 og TG (mnx: GFP) mitfab692/b692 avbildet for 55 timer fra ca 2 DPF på et konfokalmikroskopi mikroskop. Blodkar i rødt, motorneurons i grønt. Scale bar 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: visualisering av muskel GFP uttrykk i somites. Cross of HGn39b og ubi-zebrabow ble avbildet på et konfokalmikroskopi mikroskop for 55 h fra ca 30 somite scenen. Muskel i grønt, alle andre celler i rødt. Scale bar 500 μm Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende film S1: film av et embryo av et kors av TG (KDR1: EGFP) mitfab692/b692 og ubi-zebrabow avbildet fra ca 30 somite scenen for 55 h på et konfokalmikroskopi mikroskop med et 10x objektiv. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Movie S2: film av et embryo av et kors av TG (MNX: GFP) mitfab692/b629 og ubi-zebrabow avbildet fra ca 30 somite scenen for 55 h på et konfokalmikroskopi mikroskop med et 10x objektiv. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Utfyllende Movie S3: film av et embryo av et kors av TG (KDR: ENL. memRFP) mitfab692/b692 og TG (mnx: GFP) mitfab692/b692 fotografert fra ca 2 DPF for 55 h på en konfokalmikroskopi mikroskop med en 20x objektiv. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Movie S4: film av et embryo av et kors av HGn39b og ubi-zebrabow avbildet fra ca 30 somite scenen for 55 h på et konfokalmikroskopi mikroskop med et 10x objektiv. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives en monteringsmetode for utvidet tidsforløp konfokalmikroskopi mikroskopi av hele sebrafisk embryo. Den mest kritiske skritt for montering metoden er å identifisere den optimale konsentrasjonen av agarose som vil tillate for ubegrenset sebrafisk embryo vekst, og samtidig holde embryo i en helt fast posisjon for konfokalmikroskopi Imaging. Fordi den optimale konsentrasjonen av agarose er veldig smal, er denne verdien svært følsom for feil i måling av vekten av agarose og volumet av E3 under utarbeidelse av løsningen. Den optimale konsentrasjonen kan også avhenge av temperatur og stadium av fosteret. Dermed vil den optimale konsentrasjonen må være re-definert for hver ny gruppe med agarose løsning gjennom repetisjon av tester av ulike konsentrasjoner.
Et annet kritisk trinn er i monteringsmetoden er tillegg av det andre laget av agarose. Det andre laget holder dekselet glasset på plass. Det må legges nøye til parabolen litt om gangen slik at det ikke fører til at dekselet glass for å flytte. Det andre laget fungerer også som en gjennomtrengelig barriere for E3. Uten E3, vil embryo tørke ut under Imaging. Uten det andre laget av agarose, vil dekselet glass og embryo starte flytende.
En begrensning av den foreslåtte monteringsmetoden er at mens det fungerer godt for invertert mikroskop, det fungerer ikke for oppreist mikroskop. Flere forsøk ble gjort for å utføre time-lapse Imaging ved hjelp av en oppreist mikroskop, ved å fylle glasset bunnen parabolen med E3, tetting den med parafilm, og snu den opp ned. Men ofte dette resulterte i at monteringen kollapset halvveis gjennom bildebehandling. Dette kan ha blitt forårsaket av økt varme i prøven etter den lange eksponeringen til laser lys, noe som fører til at befestet agarose lag smelter.
Ved slutten av tidsforløp mikroskopi embryo begynte å vise perikard ødem. Varierende mellom ulike eksperimenter, ble ødem observert mellom 35 og 50 timer med bildebehandling. Hvorvidt dette var forårsaket av embryo immobilisering, eller en effekt av anestesi, er foreløpig ikke kjent. Tricaine er kjent for å undertrykke sammentrekning av skjelettlidelser og hjerte muskler. Følgelig, Tricaine påvirker hjertefrekvensen i voksen fisk14 og embryo15. Andre studier har også rapportert at Tricaine behandling forårsaker perikard ødem i sebrafisk embryo2,16. I denne artikkelen, en konsentrasjon av Tricaine (0.016-0.020%) ble brukt som vanligvis brukes i sebrafisk forskning; fortsatt, perikard ødem skjedde ved slutten av vår tenkelig perioden. Den perikard ødem utgjorde en hoved restriksjon for å muliggjøre bildebehandling av embryo for enda lengre perioder av gangen. Potensielle måter å redusere denne hjerte toksisitet er å kombinere to forskjellige anestesi, slik som Tricaine med eugenol, eller ved hjelp av α-bungarotoxin mRNA injeksjon for anestesi16; gunstige effekter av Kombinatorisk eller alternative anesthetizing forbindelser må undersøkes ytterligere for utvidet tidsforløp avbildning av sebrafisk utvikling.
Som konklusjon, den beskrevne monteringsmetoden er rask, enkel, kostnadseffektiv og fungerer på alle invertert mikroskop. Regelmessige glassbunn retter og lav smelte agarose kan brukes, og ingen spesielle muggsopp, utstyr eller instrumentering er nødvendig. Den lagdelte montering metoden gir embryo vekst, mens på samme tid holde embryo i en fast posisjon. Ved å bruke utvidet tid-lapse Imaging av hele organismen ny kunnskap om vev utvikling kan fås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Albert pan og Arndt Sieakmann for gaver av transgene fisk. Vi takker Koichi Kawakami ved National Institute of genetikk, National BioResource Project fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan for gave de transgene sebrafisk HGn39b. Vi takker også Fatima Merchant og Kathleen Gajewski for assistanse på konfokalmikroskopi mikroskopi, og Tracey Theriault for fotografier.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Environmental Health Sciences i National Institutes of Health (Grant nummer P30ES023512 og kontraktnummer HHSN273201500010C). SU ble støttet av et fellesskap fra Keck beregningsorientert Cancer Biology program (Gulf Coast konsortier CPRIT Grant RP140113) og av Hugh Roy og Lillie legat fondet. J-å G ble støttet av Robert A. Welch Foundation (E-0004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
