Summary
ويصف المقال خطوة الحكمة الموجهة التمايز من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى الأجهزة الرئوية الكاملة ثلاثية الأبعاد التي تحتوي على كل من خلايا الرئة الظهارية القريبة والقاصية جنبا إلى جنب مع mesenchyme.
Abstract
كان من الصعب دراسة نمو الرئة البشرية والمرض بسبب عدم وجود نظم نموذجية ذات صلة بيولوجيا في المختبر . يمكن تمييز الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSCs) بشكل تدريجي إلى أعضاء رئوية متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد ، مصنوعة من مجموعات خلايا ظهارية ونسينشيمالية. نحن تلخيص الإشارات التنموية الجنينية من خلال إدخال زمنيا مجموعة متنوعة من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة لتوليد بكفاءة endoderm نهائي، الأمامية الأمامية الاندوديرم، وبعد ذلك خلايا السلف الرئة. ثم يتم تضمين هذه الخلايا في عامل النمو خفضت (GFR) الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط، مما يسمح لهم لتطوير عفويا إلى organoids الرئة 3D استجابة لعوامل النمو الخارجية. تخضع هذه الأعضاء الرئوية الكاملة (WLO) لمراحل نمو الرئة المبكرة بما في ذلك مورفوجينيسيس المتفرع والنضج بعد التعرض للديكساميثازون والتضخيم الدوري والإيزوبوتيلكانثين. تمتلك WLOs خلايا ظهارية مجرى الهواء تعبر عن علامات KRT5 (القاعدية) وSCGB3A2 (النادي) وMUC5AC (الكؤوس) وكذلك الخلايا الظهارية السنفية التي تعبر عن HOPX (النوع السنفي الأول) وSP-C (النوع الثاني من السنفية). الخلايا الميسينشيمالية موجودة أيضا، بما في ذلك أكتين العضلات الملساء (SMA)، ومستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية A (PDGFRα). يمكن الحفاظ على WLOs المشتقة من iPSC في ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد لعدة أشهر ويمكن فرزها لعلامات السطح لتنقية مجموعة خلايا محددة. ويمكن أيضا استخدام WLOs iPSC المستمدة لدراسة نمو الرئة البشرية، بما في ذلك الإشارات بين ظهارة الرئة وmesenchyme، لنموذج الطفرات الوراثية على وظيفة خلايا الرئة البشرية والتنمية، وتحديد السمية الخلوية للعوامل المعدية.
Introduction
الرئة هي معقدة، غير متجانسة، الجهاز الديناميكي الذي يتطور في ست مراحل متميزة - الجنينية، الزائفة، القناني، saccular، الحويصلات، والنضج الأوعية الدموية الدقيقة1،2. تحدث المرحلتان الأخيرتان قبل الولادة وبعدها في النمو البشري بينما تحدث المراحل الأربع الأولى حصريا أثناء نمو الجنين ما لم تحدث الولادة المبتسرة3. تبدأ المرحلة الجنينية في طبقة جرثومة الجلد وتنتهي ببراعم القصبة الهوائية والرئة الناشئة. يحدث تطور الرئة جزئيا عن طريق الإشارة بين الخلايا الظهارية والخلايا الظهارية4. هذه التفاعلات تؤدي إلى تفريع الرئة، والانتشار، وتحديد المصير الخلوي والتمايز الخلوي للرئة النامية. تنقسم الرئة إلى مناطق إجراء (القصبة الهوائية إلى الشعب الهوائية الطرفية) ومناطق الجهاز التنفسي (القصبات الهوائية التنفسية إلى الحويصلات الهوائية). كل منطقة تحتوي على أنواع فريدة من الخلايا الظهارية; بما في ذلك القاعدية، إفراز، ciliated، فرشاة، الغدد الصماء العصبية، والخلايا الأيونية في مجرى الهواء إجراء5، تليها الخلايا السنفية النوع الأول والثاني في ظهارة الجهاز التنفسي6. الكثير لا يزال غير معروف حول تطوير والاستجابة لإصابة أنواع الخلايا المختلفة. تمكن نماذج الأعضاء الرئوية المشتقة من iPSC من دراسة الآليات التي تدفع نمو الرئة البشرية ، وآثار الطفرات الوراثية على الوظيفة الرئوية ، واستجابة كل من الظهارة والميسينشيم للعوامل المعدية دون الحاجة إلى أنسجة الرئة البشرية الأولية.
علامات المقابلة لمختلف مراحل التمايز الجنيني وتشمل CXCR4، cKit، FOXA2، وS SOX17 لاندوديرم نهائي (DE)7، FOXA2، TBX1، وS SOX2 لاندوديرم الأمامية (AFE)8، وNKX2-1 لخلايا السلف الرئة في وقت مبكر9. في تطور الرئة الجنينية ، يقسم الرغوت إلى المريء الظهري والرغامى البطنية. براعم الرئتين اليمنى واليسارية تظهر كما اثنين من النعومات المستقلة حول bud10 القصبة الهوائية. أثناء المورفوجين المتفرع ، ينتج الميسنشيم المحيط بالظهارة أنسجة مرنة وعضلات ناعمة وغضاريف وvasculature11. التفاعل بين الظهارة والميسينشيم ضروري لتطور الرئة الطبيعي. وهذا يشمل إفراز FGF1012 من قبل mesenchyme وSHH13 التي تنتجها ظهارة.
هنا، ونحن نصف بروتوكول للتمايز الموجه من hiPSCs إلى ثلاثي الأبعاد (3D) الأجهزة الرئوية كلها (WLO). في حين أن هناك نهج مماثلة التي تتضمن عزل خلايا السلف الرئة عن طريق الفرز في مرحلة LPC لجعل الأجهزة العضوية مثل السنفية 14,15 (البعيدة) أو organoids airway16 (قريبة) ، أو توليد الفيرويدات الأمامية البطنية لجعل أعضاء الرئة البشرية التي تعبر عن الخلايا الحويصلة الهوائية وعلامات الميسنشيمال وبراعم تلميح ، قوة هذه الطريقة هي إدراج كل من أنواع الخلايا الظهارية الرئوية والخلية الظهارية mesenchymal لنمط وتنسيق مورفوجينيسيس متفرعة الرئة، والنضج، والتوسع في المختبر.
يستخدم هذا البروتوكول جزيئات صغيرة وعوامل نمو لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات من خلال بطانة الرحم النهائية ، واندوديرم الأمامي ، وخلايا سلف الرئة. ثم يتم حث هذه الخلايا في 3D الأجهزة الرئوية الكاملة من خلال خطوات النمو الهامة، بما في ذلك المتفرعة والنضج. 10- يرد موجز بروتوكول التمايز في الشكل 1 أ مع صور تمثيلية من التمايز بين الاندوديرمال والأعضاء تظهر في الشكل 1ب. الشكل 1c،d تظهر تفاصيل التعبير الجيني للتمايز إندوديرمال، فضلا عن التعبير الجيني لكل من المجموعات القريبة والبعدية من الخلايا الظهارية الرئة بعد الانتهاء من التمايز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة هذا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لبرنامج حماية الأبحاث البشرية في UCSD (181180).
1. التعريفي endoderm نهائي من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (اليوم 1 - 3)
- عامل نمو ذوبان ببطء خفضت (GFR) الطابق السفلي غشاء (BM) مصفوفة المتوسطة على الجليد 30 دقيقة قبل الاستخدام. في DMEM/F12 الباردة، خليط، تمييع مصفوفة GFR BM المتوسطة 1:1 بحيث يشكل 50٪ من هذه الوسيلة. ضع نصائح ماصة P1000 في الثلاجة للاسترخاء قبل الاستخدام.
- معطف كل بئر من لوحة 12 جيدا مع 500 ميكروغرام من 50٪ GFR-الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة المعدة في الجليد الباردة DMEM/F12. بمجرد أن يتم طلاء العدد المطلوب من الآبار، قم بإزالة أي خليط متوسط زائد و / أو فقاعات من الآبار ووضع الطبق على الثلج أو الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لتعيينها. ثم، نقل لوحة إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها إلى هلام والجافة.
- مرة واحدة hiPSCs تصل إلى التقاء 70-90٪، إضافة 10 ميكرومتر من كيناز المرتبطة رو (روك) المانع Y-27632 ساعة قبل الانفصال. يستنشق قبالة وسائل الإعلام ويغسل مرة واحدة مع الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (PBS). hiPSCs ينفصم عن طريق إضافة الخلية مفرزة المتوسطة (0.5 مل / بئر من لوحة 12 بئرا) واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.
- إزالة لوحات من الحاضنة وإضافة 0.5 مل/12-بئر من الخلايا الجذعية تمرير المتوسطة (الجدول 1) إلى الآبار; خلايا تريتورات بلطف باستخدام طرف P1000 للحصول على تعليق خلية واحدة. نقل الخلايا المفككة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل؛ جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × ز.
- أسبيرات قبالة المتوسطة وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 1 مل من وسائل الإعلام mTeSR زائد تكملها مع مثبطات روك 10 ميكرومتر (Y-27632). إجراء عدد خلايا. إضافة 2.0 × 105 hiPSCs في 1 مل من mTeSR تكملها مع مثبط ROCK Y-27632 لكل بئر من 12 جيدا GFR-الطابق السفلي غشاء لوحة مغلفة المتوسطة. حضانة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يجب تحسين رقم البذر الخلية لكل سطر خلية. 24 ساعة بعد الطلاء، وينبغي أن تكون الآبار التقاء 50٪-70٪. - في اليوم 1، يستنشق قبالة mTeSR زائد وإضافة Endoderm نهائي (DE) وسائل الإعلام التعريفي (الجدول 1) تكملها مع 100 نانوغرام / مل من activin الإنسان A و 5 ميكرومتر من مثبط GSK3β / Wnt المنشط CHIR99021.
ملاحظة: يجب إزالة وسائط DE مع مثبط GSK3β / منشط WNT CHIR99021 في غضون 20-24 ساعة من اليوم 1 DE التعريفي للتمايز الناجح. - في اليوم 2 واليوم 3، تغيير إلى وسائل الإعلام التعريفي DE تكملها مع 100 نانوغرام / مل من activin A فقط.
ملاحظة: يجب أن لا يتجاوز تمايز DE إجمالي 72 ساعة، أو ستنخفض الفعالية. في اليوم 4، إذا لوحظ موت الخلايا الكبيرة، تقليل إجمالي الوقت التعرض وسائل الإعلام DE من قبل 6-12 ساعة. - لتحليل كفاءة DE، تأكد من وجود أكثر من 90٪ CXCR4 و/أو تعبير cKit عبر قياس التدفق الخلوي أو تحليل الفلورة المناعية ل FOXA2 و/أو SOX17 (الشكل 2أ).
2. الأمامية الأمامية endoderm (AFE) التعريفي (اليوم 4 - 6)
- في اليوم 4، تغيير الوسائط إلى مصل المتوسط القاعدية الحرة (SFBM) (الجدول 1) تكملها مع 10 ميكرومتر SB431542 و 2 ميكرومتر دورسومورفين للتحريض AFE. تغيير وسائط AFE يوميا لمدة 3 أيام (اليوم 4، اليوم 5، واليوم 6).
- لتحليل كفاءة AFE، تأكد من التعبير القوي عن SOX2 و TBX1 و FOXA2 عن طريق تلطيخ immunofluorescence (الشكل 2ب).
3. الرئة سلف الخلية (LPC) التمايز (يوم 7 - 16)
- في اليوم 7، إذابة GFR-الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة على الجليد. يستنشق قبالة وسائل الإعلام AFE ويغسل جيدا مع برنامج تلفزيوني 1x. إضافة 1 مل من محلول مفرزة الخلية واحتضان لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- إضافة 1 مل من وسائل التبريد (2٪ FBS في DMEM/F12) إلى الآبار التي تحتوي على محلول مفرزة الخلية. الحفاظ على الخلايا والمجاميع عن طريق pipetting صعودا وهبوطا بلطف. تأكد من إزاحة جميع الخلايا ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × ز.
- إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في وسط Quenching تكملها 10 نانوغرام / مل من البروتين مورفوجينيك العظام المؤتلف البشرية-4 (BMP4)، 0.1 ميكرومتر من حمض الريتينويك جميع عبر (RA)، 3 ميكرومتر من مثبط GSK3β / WNT المنشط CHIR99021، و 10 ميكرومتر من مثبط الصخور Y-27632.
- إجراء عدد خلايا. إضافة 2.5 × 105 خلايا إلى 100 ميكرولتر من البارد GFR الطابق السفلي مصفوفة مصفوفة المتوسطة، مزيج جيد، ووضع قطرة في بئر من لوحة 12 جيدا. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة للسماح للوسط لبوليمرة. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام LPC تستكمل مع 10 ميكرومتر من مثبط ROCK Y-27632 لكل بئر ضمان انخفاض المتوسطة مغمورة بالكامل واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم 8، 24 ساعة بعد التعريفي LPC، تغيير LPC المتوسطة لإزالة مثبط ROCK Y-27632. تغيير متوسط LPC كل يومين لمدة إجمالية 9-11 يوما.
ملاحظة: إذا أصبح الوسط أصفر خلال 24 ساعة، قم بتغيير الوسط كل يوم. - لتحليل كفاءة LPC، تأكد من التعبير القوي عن عامل النسخ داخل الخلايا NKX2-1 أو قم بإجراء قياس التدفق الخلوي للعلامات السطحية CD47hi/CD26low15 أو CPM18 (الشكل 2c). بشكل صارخ، يجب أن تكون كرويدات LPC مستديرة وشفافة (الشكل 2c).
ملاحظة: لا المضي قدما مع التمايز الجهازي الرئة إذا كانت كفاءة NKX2-1 أقل من 30٪.
4.3D تحريض الجهازية الرئوية (اليوم 16 - 22)
- في اليوم 17، إذابة GFR-الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة على الجليد. يستنشق وسيطة التعريفي LPC. ثم أضف 2 ميكروغرام/مل من ديسباس (1 مل) إلى البئر وإعادة إنفاق الخليط المتوسط/التفكيكي مع ماصة P1000. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تريتورات الخليط مرة أخرى واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أخرى.
- نقل ديسباس والخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل. استخدام برنامج تلفزيوني المبردة (2-3 مل) لغسل البئر وإعادة إنفاق خليط ديسباس / الخلية. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × ز. إزالة يدويا supernatant، مع الحرص على عدم distub طبقة بيليه المتوسطة / الخلية. كرر غسل PBS المبرد ، والطرد المركزي أنبوب الطرد المركزي المخروطي لمدة 5 دقائق أخرى في 400 × ز.
- إزالة يدويا supernatant، ومن ثم إضافة 2 مل من حل التفكك القائم على التريبسين إلى أنبوب الطرد المركزي مخروطي. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
- بعد الحضانة، وإعادة إنفاق الخلايا مع طرف ماصة P1000. ثم أضف حجما متساويا من وسائط التبريد إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي وتدور لأسفل عند 400 × ز لمدة 5 دقائق. يستنشق الخلايا الفائقة و resuspend في وسط التبريد + 10 ميكرومتر من مثبط ROCK Y-27632.
ملاحظة: يحدث تحريض الجهاز الرئوي الناجح عندما يتم تضمين الخلايا كمجاميع ، وليس خلايا واحدة ، وضبط pipetting وفقا لذلك. - إجراء عدد خلايا. حساب حجم اللازمة للحصول على 5.0-8.0 × 104 خلايا في بئر. تجمع خلية LPC في أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × ز. إزالة supernatant الزائدة، مع الحرص على عدم هياج بيليه الخلية. اترك 10 ميكرولتر فقط من الوسائط المتبقية.
- إعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من البارد GFR الطابق السفلي مصفوفة غشاء المتوسطة وإضافة إلى إدراج غشاء ثقافة الخلية (قطر 6.5 ملم، 0.4 ميكرومتر المسام، غشاء البوليستر). احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة للسماح GFR الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة لبوليمرات.
- إضافة 1 مل من 3D organoid التعريفي المتوسط (الجدول 1) تستكمل مع عامل نمو الخلايا الليفية-7 (FGF7) (10 نانوغرام / مل), FGF10 (10 نانوغرام / مل), GSK3β المانع / W المنشط CHIR (3 ميكرومتر)، عامل نمو البشرة (EGF) (10 نانوغرام / مل)، و 10 ميكرومتر من مثبط ROCK Y-27632 إلى غرفة البازلات لإدراج الغشاء. تغيير المتوسطة كل يومين لمدة 6 أيام.
5.3D الرئة organoid المتفرعة (اليوم 23 - 28)
- في اليوم 23 تغيير إلى 3D المتفرعة المتوسطة (الجدول 1) تكملها FGF7 (10 نانوغرام / مل)، FGF10 (10 نانوغرام / مل)، GSK3β المانع / Wnt المنشط CHIR9902 1 (3 ميكرومتر)، RA (0.1 ميكرومتر)، EGF (10 نانوغرام/مل)، وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) / عامل نمو المشيمة (PlGF) (10 نانوغرام/مل). تغيير المتوسطة كل يومين لمدة 6 أيام.
ملاحظة: في اليوم السادس من التمايز المتفرع ثلاثي الأبعاد، يجب أن تكون هناك عضويات متفرعة متعددة (الشكل 2).
6.3D نضوج الجهاز الرئوي (اليوم 29 - 34)
- في اليوم 29 ، قم بالتغيير إلى متوسط النضج ثلاثي الأبعاد (الجدول 1) ، وهو نفس متوسط التفريع ثلاثي الأبعاد ولكن مع إضافة ديكساميثازون (50 nM) ، cAMP (100 ميكرومتر) ، و 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) ، وهو مثبط فوسفوديستيراز يطلق عليه أيضا إيزوبوتيل زانثين (100 ميكرومتر). تغيير المتوسطة كل يومين لمدة 6 أيام.
ملاحظة: في غضون 24 ساعة بعد النضج 3D، يجب توسيع organoids المتفرعة وتغييرها إلى مجالات شفافة.
7.3D الكيمياء المناعية العضوية الرئة
- لتحليل الجهازي الرئة كله 3D، إصلاح GFR-الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط في إدراج الغشاء مع 4٪ paraformaldehyde (PFA) لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية. تضمين في شمع البارافين وجبل على الشرائح وفقا للبروتوكولات المنشورة القياسية.
- إجراء استرجاع مستضد قبل تلطيخ. وتشمل علامات مجرى الهواء KRT5، MUC5AC، وSCGB3A2. تتضمن علامات Alveolar SP-C و SP-B و HTII-280 و HTI-56 و HOPX (الشكل 3).
8. إزالة الجهازيات الرئة كاملة من GFR الطابق السفلي مصفوفة مصفوفة المتوسطة للمرور، FACS، أو cryopreservation
- لإلغاء نأي الأعضاء عن مصفوفة الغشاء GFR-basement المتوسطة، قم بإزالة الوسائط من الغرفة القاعدية وأضف 2 ميكروغرام/مل من التفكيك (1 مل) في الغرفة القاعدية.
- triturate بلطف خليط المتوسطة / dispase مع ماصة P1000 ومكان في الحاضنة لمدة 15 دقيقة. تريتورات بلطف الخليط مرة أخرى واحتضان لمدة 15 دقيقة أخرى.
- إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني المبردة (4 درجة مئوية) ونقل organoids مع مصفوفة المتوسطة في أنبوب الطرد المركزي مخروطية 15 مل. تدور في 400 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant بعناية، وليس لإزعاج بيليه الخلية.
- يغسل مرة أخرى مع 1 مل المبردة PBS وتدور أسفل في 400 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant بعناية، وليس لإزعاج خليط متوسط / الخلية.
- إضافة 1 مل من محلول مفرزة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي، triturate بلطف resuspend مصفوفة الغشاء GFR-الطابق السفلي خليط متوسط / الخلية. ضع في الحاضنة لمدة 12 دقيقة لخلايا التمرير كمجاميع أو لالتبريد) ، أو 20 دقيقة لتعليق الخلية الواحدة.
- إضافة حجم متساو من وسائل الإعلام إخماد وتدور أسفل في 400 × ز لمدة 5 دقائق. Resuspend في إخماد المتوسطة + 10 ميكرومتر من مثبط روك Y-27632.
ملاحظة: في هذه الخطوة، لا ينبغي أن ينظر إلى أي وسيطة غشاء الطابق السفلي المتبقية في الأنبوب. إذا بقي متوسط متبقي، كرر الخطوتين 8.5 و8.6. - إجراء عدد خلايا. حساب حجم الصوت المطلوب للتطبيقات المتلقين للمعلومات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
24 ساعة بعد الطلاء، اليوم 1، يجب أن تكون iPSCs التقاء 50٪-90٪. في اليوم الثاني، يجب أن يكون التقاء DE 90٪-95٪. أثناء تحريض DE ، من الشائع ملاحظة موت الخلايا بشكل كبير في اليوم 4 ولكن الخلايا المرفقة ستحتفظ مورفولوجيا حصاة مدمجة (الشكل 2ب). وقف التفريق إذا كانت غالبية الخلايا الملتصقة فصل والنظر في تقصير التعرض لوسائل الإعلام DE مع activin A من قبل 6-12 ساعة. أثناء تحريض AFE ، يكون موت الخلية ضئيلا ، وتظل الخلايا متمسكة ، ولكنها تبدو أصغر وأكثر تغايرا. يجب أن يتم تمرير الخلايا في اليوم 7 فقط إذا كان العائد من SOX2 إيجابية مزدوجة وFOXA2 هو >80٪. بعد تمرير في مصفوفة غشاء الطابق السفلي ل3D LPC التعريفي، سوف تظهر لأول مرة كرويدات صغيرة، ثم تنمو وبعض قد تبدأ في فرع. وتشمل ملامح التعبير الجيني للتمايز endodermal ناجحة زيادة SOX17 في DE، وزيادة FOXA2 وS SOX2 مع خفض SOX17 وأول ظهور من NKX2-1، وزيادة NKX2-1، جنبا إلى جنب مع وجود SOX2 وFOXA2. بما يتفق مع التطور الجنيني المبكر ، يحدث تهوية AFE لتطوير برعم الرئة (NKX2-1 +) ويحدث دورة AFE لتطوير الجهاز الهضمي (SOX2+). الثقافات في LPC سيكون لها مزيج من كل من الرئة وذرى المعدة.
وقد أجريت تحريض الجهازية الرئة من LPC باستخدام أساليب مختلفة. بعض المجموعات فرز الخلايا باستخدام المراسلين NKX2-1 الفلورسنت أو وكيل مستضد سطح (CPM، CD26lowCD47high). ولكن تلك الأجهزة الرئوية تحتوي على النوع الثاني من السنفات مثل الخلايا دون خلايا من النوع الأول من السنف أو ميسنشيم. وقد جمعت مجموعات أخرى كتل الخلية التي برعم قبالة طبقة أحادية AFE / LPC وجزءا لا يتجزأ منها في مصفوفة غشاء الطابق السفلي. تحتوي هذه الأعضاء على مجموعة مختلطة من الخلايا الظهارية والنسنشية الرئوية ولكنها تستغرق أشهرا حتى الثقافة19. بروتوكولنا يتضمن وجود خلايا ظهارية و صرعية. WLOs التعبير عن علامات الخلايا الظهارية القريبة p63 و KRT5 (الخلايا القاعدية) وSCGB3A2 (خلايا النادي) وكذلك علامات الخلايا الظهارية البعيدة HOPX (ATI) و proSPC، SPB، وNKX2-1 (ATII). كما أنها تعبر عن علامة mesenchymal Vimentin في مرحلة LPC ، وكذلك في أعضاء الرئة بأكملها. PDGFRα هو علامة للخلايا الليفية التي لها وظيفة هامة في الرئة أثناء التراكم والتشكيل الحراري20 ويتم التعبير عنه بشكل مشترك مع عامل النسخ المهم في تمايز الخلايا البعيدة ، SOX9 (الشكل 3).
لدينا طريقة يولد بكفاءة NKX2-1 التعبير LPC 3D الثقافات باستخدام جزيئات الإشارات التي تحدث في نمو الرئة الجنين لتشكيل organoids الرئة في وقت مبكر. عند تمرير LPCs إلى GFR-basement مصفوفة غشاء المتوسطة للتحريض الجهازي الرئة، فمن الضروري عدم الإفراط في الانفصال إلى تعليق خلية واحدة، ولكن بدلا من ذلك للاحتفاظ كتل صغيرة من الخلايا (10 خلايا / كتلة). لن يكون عد الخلايا دقيقا تماما ، ولكنه لا يزال ضروريا لتجنب الالتقاء خلال التمايز العضوي الرئوي لمدة 3 أسابيع.
يجب أن ينتج تحريض الجهاز الرئوي عن أعضاء صغيرة متفرعة بحلول اليوم السادس من الحث (اليوم 23 من التمايز). وينبغي أن تستمر هذه في النمو خلال خطوة المتفرعة organoid وخطوة النضج. بعد 24 ساعة من إدخال ديكساميثازون، CAMP، وIBMX، يجب توسيع الفروع إلى مجالات شفافة. يمكن إجراء تحليل الجهاز الرئوي كله في نهاية التمايز ، أو يمكن أن تكون WLOs مرورا إلى مصفوفة غشاء الطابق السفلي الطازجة مع GFR أو cryopreserved عن طريق التجميد في DMSO بنسبة 10٪.
الشكل 1: التخطيطي العام للتمايز العضوي الرئوي الكامل (WLO) عن hiPSCs والبيانات التمثيلية. (أ) تخطيطي لتمايز WLO عن hiPSCs. تمثل الدوائر نوع الخلية الداخلية مع علامات تعريف. يشار إلى الجدول الزمني للتمايز في القضبان السوداء. عوامل النمو و / أو جزيئات صغيرة لتحريض السكان بطانة الجلد والرئة organoid. باختصار، يتم تمييز الخلايا الجذعية إلى بطانة الرحم النهائية، والاندود الرغوتي الأمامي وخلايا السلف الرئة في حوالي 16 يوما. ثم يتم تمرير هذه الخلايا إلى GFR-basement مصفوفة الغشاء المتوسطة التي تحتوي على إدراج المتوسطة والخضوع للتحريض الجهازي الرئة, تتفرع, والنضج. التمايز الكلي يستغرق حوالي 35 يوما. (ب) صور التباين المرحلي التمثيلي للخلايا في مراحل الإندرمال الرئيسية والصور ثلاثية الأبعاد لأجهزة الرئة الكاملة. حجم شريط المقياس كما هو مبين في اللوحة. (ج) تحليل qRT-PCR لعلامات نمو الرئة أثناء التمايز الإندوديرم و(د) التمايز العضوي الرئوي الكامل لعلامات الخلايا القريبة والنازرة. وتمثل جميع البيانات ما متوسطه 3-5 نسخ بيولوجية متماثلة. تمثل أشرطة الخطأ خطأ قياسي من المتوسط ويتم تسويتها إلى actin. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توصيف تمايز الاندودرم حسب قياس التدفق الخلوي والكيمياء المناعية. (أ) قياس التدفق الخلوي لعلامة الاندوديرم النهائية CXCR4. تظهر اللوحة اليسرى النطاط ضد السكان غير الملطخين بينما تظهر اللوحة الوسطى السكان الإيجابيين CXCR4. تظهر اللوحة اليمنى صورة الكيمياء المناعية ل SOX17 (أحمر) مضافا إليها نواة (زرقاء). (ب) صورة الكيمياء المناعية لعلامات AFE FOXA2 و SOX2 مضاف إليها نواة (زرقاء). (ج) التعبير الداخلي عن NKX2-1-GFP في خط خلية مراسل في LPC ثلاثي الأبعاد. الصور المأخوذة من ثقافة الخلايا الحية في برايتفيلد وGFP. تدفق قياس الخلايا من السلف الرئة داخل الخلايا علامة NKX2-1 بعد التثبيت والبيرميليشن. حجم شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيف الأعضاء الرئوية الكاملة ثلاثية الأبعاد بعد تمايز لمدة 3 أسابيع عن طريق الكيمياء المناعية. (أ) علامات الرئة القريبة. تظهر اللوحة اليسرى SOX2 (أبيض) و SOX9 (أحمر) مضافا إليها نواة (زرقاء). هذه العلامات مهمة في تفريع مورفوجينيسيس وتمثل المجموعات الظهارية القريبة والنازلة. تظهر الألواح الوسطى P63 (أحمر) و KRT5 (أحمر)، وكلاهما علامات للخلايا القاعدية. تظهر اللوحة اليمنى SCGB3A2، وهي علامة على خلايا النادي. (ب) علامات الرئة البعيدة. لوحة اليسار يصور الموالية للSPC (PSPC)، (الأخضر) و HOPX (الأحمر)، علامات من النوع السنخي الثاني الخلايا الإعلانية الأول، على التوالي، مضافا إليها نواة (الأزرق). لوحة الأوسط يظهر الموالية SPC (PSPC) (الأخضر) وSPB (الأحمر)، علامات من الخلايا نوع السنفية الثاني، مضافا إليها نواة (الأزرق). تظهر اللوحة اليمنى NKX2-1 (أحمر) وZO1 (أخضر) مضافا إليها نواة (زرقاء). (ج) علامات الميسينشيم الرئوي. تظهر اللوحة اليسرى PDGFRA (أحمر) و SOX9 (أبيض) ، مما يمثل mesenchyme البعيدة. تظهر اللوحة اليمنى Vimentin (أحمر) ، والذي ينتشر في جميع أنحاء الرئة. حجم شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكواشف والحلول - لأسماء الشركات يرجى الاطلاع على قائمة جدول المواد |
| 3D الجهازية التعريفي المتوسط (اليوم 17-22) |
| المتوسط القاعدي الخالي من المصل (انظر الوصفة) المكمل بما يلي: |
| FGF7 (10 نانوغرام/مل) |
| FGF10 (10 نانوغرام/مل) |
| CHIR99021 (3 ميكرومتر) |
| EGF (10 نانوغرام/مل) |
| 3D organoid المتفرعة المتوسطة (اليوم 23-28) |
| المتوسط القاعدي الخالي من المصل (انظر الوصفة) المكمل بما يلي: |
| FGF7 (10 نانوغرام/مل) |
| FGF10 (10 نانوغرام/مل) |
| CHIR99021 (3 ميكرومتر) |
| حمض الريتينويك المتحول بالكامل (0.1 ميكرومتر) |
| EGF (10 نانوغرام/مل) |
| VEGF/PIGF (10 نانوغرام/مل) |
| 3D الجهازية النضج المتوسط (اليوم 29-34) |
| المتوسط القاعدي الخالي من المصل (انظر الوصفة) المكمل بما يلي: |
| ديكساميثازون (50 nM) |
| Br-cAMP (100 ميكرومتر) |
| آي بي إم إكس (100 ميكرومتر) |
| AFE التعريفي المتوسط (اليوم 4-6) |
| المتوسط القاعدي الخالي من المصل (انظر الوصفة) المكمل بما يلي: |
| SB431542 (10 ميكرومتر) |
| دورسومورفين (2 ميكرومتر) |
| DE التعريفي المتوسط (اليوم 1-3) |
| 48.5 مل RPMI1640 + الغلوتاماكس |
| 1 مل B27 بدون حمض الريتينويك |
| 500 ميكرولتر من الهبس (1٪) |
| 500 ميكرولتر قلم/ بكتيريا |
| الإنسان أكتيفين A (100 نانوغرام / مل) |
| CHIR99021 (5 ميكرومتر) - فقط في أول 24 ساعة |
| LPC التعريفي المتوسط (اليوم 7-16) |
| المتوسط القاعدي الخالي من المصل (انظر الوصفة) المكمل بما يلي: |
| BMP4 (10 نانوغرام/مل) |
| حمض الريتينويك المتحول (RA) (0.1 ميكرومتر) |
| CHIR99021 (3 ميكرومتر) |
| وسيطة إخماد |
| 49 مل DMEM/F12 |
| 1 مل FBS |
| وسيطة القاعدية الخالية من المصل (SFBM) |
| 375 مل إيسكوف تعديل دولبيكو المتوسطة (IMDM) + الجلوتاماكس |
| 125 مل هام F12 |
| 5 مل B27 بدون حمض الريتينويك |
| 2.5 مل N2 |
| 500 ميكرولتر حمض الأسكوربيك، 50 ملغم/مل |
| 13 ميكرولتر أحادية الوثيوغليسيرول/1 مل من IMDM" استخدام 300ul من 0.4m monothioglycerol لكل 100ml من وسائل الإعلام الحرة المصل |
| 3.75 مل مصل البقر الألبومين (جيش العمل الأميركي) كسر الخامس، حل 7.5٪ |
| 500 ميكرولتر قلم/ بكتيريا |
| الخلايا الجذعية تمرير المتوسطة (اليوم 0) |
| 500 مل DMEM/F12 |
| 129 مل استبدال مصل خروج المغلوب (KSR) |
| 6.5 مل الغلوتاماكس |
| 6.5 مل NEAA |
| 1.3 مل 2 ميركابتوثانول |
| 6.5 مل قلم/بكتيريا |
الجدول 1: جدول وسائط الإعلام.
| مشكلة | حل |
| DE التمايز غير فعالة | بعد 24 ساعة من الطلاء في الخلايا الجذعية المتوسطة ، يجب أن تكون الخلايا التقاء 50-70٪ |
| GSK3β المانع / WNT المنشط CHIR99021 ينبغي إزالتها في غضون 20-24 ساعة من اليوم 1 DE التعريفي | |
| يجب ألا يتجاوز تمايز DE ما مجموعه 72 ساعة | |
| تمايز AFE غير فعال | تأكد من نجاح تمايز DE وتعبير الخلايا > CXCR4 بنسبة 80٪ |
| ضمان عوامل النمو الجديدة / يتم إضافة جزيئات صغيرة إلى وسائل الإعلام يوميا | |
| LPC التمايز غير فعالة | تأكد من نجاح التمايز AFE والخلايا تعبر عن > 80٪ FOXA2/SOX2 |
| تأكد من أن خلايا AFE يتم تمريرها كمجاميع من 4-10 خلايا وليس وحيد الخلية | |
| 3D الأجهزة الرئوية لا تنمو أو التفريق | تأكد من نجاح اختلاف LPC والخلايا تعبر عن > NKX2-1 بنسبة 30٪ |
| ضمان مرور LPCs كمجاميع من 4-10 خلايا وليس وحيد الخلية | |
| تأكد من عدم وجود ماتريجيل المتبقية من LPCs أثناء passaging | |
| إضافة مثبط ROCK Y-27632 مع كل تغيير وسائل الإعلام | |
| ضمان تغيير الوسائط في الوقت المحدد وإضافة عوامل نمو جديدة / جزيئات صغيرة | |
| ضمان تركيز عوامل النمو / جزيئات صغيرة هو الصحيح |
الجدول 2: استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعتمد التمايز الناجح لأجهزة الرئة الكاملة ثلاثية الأبعاد (WLO) على بروتوكول متعدد الخطوات لمدة 6 أسابيع مع الاهتمام بالتفاصيل ، بما في ذلك وقت التعرض لعوامل النمو والجزيئات الصغيرة ، والكثافة الخلوية بعد التمرير ، ونوعية hiPSCs. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، راجع الجدول 2. يجب أن تكون hiPSCs التقاء 70٪ -80٪ تقريبا ، مع أقل من 5٪ تمييز عفوي قبل الانفصال. يستدعي هذا البروتوكول وسيط "mTeSR زائد"; ومع ذلك، عادي "mTeSR" تم استخدام متوسط أيضا مع نتائج قابلة للمقارنة وأقل تكلفة. للمصفوفة خارج الخلية، ونحن نستخدم GFR الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط. نحن مرور hiPSCs باستخدام ReLesR (انظر جدول المواد) للحد من التمايز.
أثناء التمايز بين الخلايا، يجب تصور الخلايا يوميا قبل وبعد تغييرات الوسائط. وينبغي إضافة عوامل النمو المحددة / جزيئات صغيرة طازجة يوميا إلى الوسط الأساسي لمنع التدهور المبكر. موت الخلية في endoderm نهائي (DE) أمر شائع ولكن ينبغي أن تكون محدودة خلال الأمامية الأمامية الاندوديرم (AFE) والرئة سلف الخلية (LPC) التعريفي. إذا كان هناك موت كبير في اليوم الثالث من DE (اليوم 4) ، تقليل إجمالي الوقت DE بنسبة 6-12 ساعة. خطوط الخلايا iPSC جديدة قد تحتاج إلى تحسين لتمايز endoderm ناجحة. إجراء قياس التدفق الخلوي في DE لCXCR4 لتأكيد التعريفي الناجح (>85٪ CXCR4 + الخلايا). يجب أن تكون الخلايا مستقرة نسبيا في AFE وسوف تتغير بشكل مورفولوجي مع موت القليل.
التمرير إلى LPC هو عملية أخرى يجب تحسينها لنوع الخلية. إعادة صياغة الخلايا في كثافة منخفضة جدا (<50٪) سيؤدي إلى تمايز غير فعال. تأكيد نجاح تحريض LPC مع الكيمياء المناعية لNKX2-1 أو قياس التدفق الخلوي لCPM18 أو CD26low/CD47high15. يجب أن يكون التعريفي LPC ناجحة >40٪ NKX2-1، وإلا فإن organoids سيكون وفرة أكبر من AFE الظهرية. بالنسبة إلى تعريف LPC، يجب إضافة عوامل النمو إلى الوسائط الأساسية مع كل تغيير في الوسائط. إذا أصبحت الوسائط صفراء لاحقا في تعريف LPC ، ففكر في زيادة حجم الوسائط الجديدة ، أو غير الوسائط كل يوم. خلال 3D الحث الجهازي الرئة الكاملة، والطلاء عدد والحفاظ على مجموعات الخلايا هي المفتاح لنمو الجهازية الناجحة. GFR-basement مصفوفة الغشاء المتوسطة من الصعب التعامل مع ودرجة حرارة عالية حساسة، لذلك يبقيه دائما على الجليد. إذا كانت مصفوفة الغشاء GFR-basement المواد الهلامية المتوسطة في وقت مبكر جدا، ثم خلايا LPC لن تتكامل داخله. نوصي بإذابة 1 مل من مصفوفة الغشاء GFR-basement المتوسطة على الجليد قبل 30 دقيقة من التمرير. مرة واحدة وقد تم عد الخلايا / المجموعات وأدلى aliquots المناسبة، ووضع بيليه الخلية على الجليد. نقترح إعداد لوحات، ووضع العلامات، وإضافة إدراج غشاء ثقافة الخلية قبل GFR-الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة المناولة.
استخدام نصائح ماصة لإضافة الحجم الصحيح من السائل GFR الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة على الفور إلى بيليه الخلية، وحفظ على الجليد. Pipette صعودا وهبوطا بسرعة ولكن بلطف (التعامل مع دقيق) لعدم إدخال فقاعات، ثم وضع أنبوب مرة أخرى على الجليد. إضافة الخلية وGFR-الطابق السفلي مصفوفة الغشاء خليط متوسط إلى الجزء apical من transwell في لوحات المعدة. وينبغي أن ينتشر الخليط ومعطف transwell كامل; إمالة بلطف لوحة لضمان الطلاء. بعد التبلور في الحاضنة لمدة 30-60 دقيقة ، يجب أن تكون هناك مجموعات خلايا مرئية في متوسط مصفوفة الغشاء GFR-basement. إضافة وسائل الإعلام التعريفي الرئة المناسبة إلى غرفة القاعدية تكملها 10 ميكرومتر روك المانع Y-27632 ورصد نمو organoid كل يومين.
وتشمل التطبيقات المستقبلية للأعضاء التي يولدها هذا البروتوكول دراسة المسارات الجزيئية التي تتحكم في الالتزام المبكر نسب الرئة ومواصفات مصير الخلية21,22,23. يمكن تحديد التفاعل بين الظهارة والميسنشيم باستخدام نماذج ضرب الجينات24. يمكن أيضا أن تشارك في زراعة الأجهزة العضوية مع الخلايا البطانية لتحديد أهمية الأنسجة المحددة نمط مشترك الإشارات بين ظهارة الرئة، mesenchyme، وال endothelium25. يحدث تطور الرئة بالتوازي مع تطور الأوعية الدموية وقد تثير هذه العلاقة آليات جزيئية مهمة ضرورية لتطوير الرئة بشكل صحيح. لقد أظهرنا أيضا أن هذه organoids الرئة كلها تعمل من خلال مقايسات إفراز السطحي بعد إزالة GFR-basement مصفوفة الغشاء المتوسطة تليها ثقافة قصيرة الأجل في الآبار مرفق منخفضة جدا26. وتشمل الاستراتيجيات الأخرى فرز الخلايا لعلامات سطح الخلية مثل NGFR (الخلايا القاعدية)27 وHTII-280 (خلايا ATII)28 واستبدالها كأعضاء متجانسة أو طبقة أحادية في ظروف زراعة سائل الهواء بين المراحل. كما تم استخدام الأعضاء الرئوية الكاملة وال القريبة وال البعيدة لدراسة الأهداف الخلوية والفيزيولوجيا المرضية للعدوى الفيروسية سارس-كوف-2 من أجل فهم وفحص أفضل للأدوية التي قد تكافح COVID-19.
هذا البروتوكول قوي وقابل للاستنساخ، ولكن لا تزال هناك تحديات كثيرة. تم اختبار العديد من خطوط iPSC و ESC المختلفة (>20 سطرا) ولكن يجب تحسين البروتوكول لكل خط خلية. على الرغم من الحث القوي DE و AFE ، قد يكون من الصعب تحقيق التعريفي LPC >40٪ من خلايا NKX2-1 + . وتشمل البروتوكولات الأخرى خطوة فرز للعلامات السطحية للخلايا NKX2-115,18 ، ولكن تلك تسفر فقط عن النوع الثاني من السنخية مثل الأجهزة العضوية بدون mesenchyme ولا تزال تحتوي على مجموعات خلايا المعدة والخلايا الكبدية على الرغم من تنقية السكان سلف الرئة29. لاحظنا أيضا كمية صغيرة من خلايا المعدة والكرب في كل من LPC والأعضاء الرئوية الكاملة ، ربما بسبب وجود خلايا الرغوت الأمامي الظهري التي تلوث LPCs. لذلك ، لم يتم بعد تحقيق تمايز أعضاء الرئة النقية ، ويجب إكمال المزيد من الأبحاث حول تطوير خلايا سلف الرئة في الأنسجة البشرية. يجب قياس المقايسات المصب بقوة مع التعبير الجيني والبروتين من أنسجة الرئة البشرية الأولية. في حين أن الاستخدام الأكثر فائدة حتى الآن لأجهزة الرئة كان في نمذجة الأمراض وفحص الأدوية في المختبر ، فقد تم التفكير في زرع أعضاء الرئة المشتقة من hiPSC في المرضى للطب التجديدي كعلاج مستقبلي لمجموعة من الحالات. ومع ذلك، قبل النظر في مثل هذه التدخلات، يجب اتقان قدر كبير من مراقبة الجودة، بما في ذلك تحديد وإزالة مشتقات hiPSC الملوثة وغير المرغوب فيها والتي يحتمل أن تكون ورمية. وعلاوة على ذلك، لا تزال هناك حاجة إلى تطوير فحوصات وظيفية أفضل في المختبر ونماذج حيوانية أفضل للمرض الرئوي.
على وجه التحديد، يجب التأكد من وظائف وسلامة الخلايا المشتقة من hiPSC. الخلايا غير المتمايزة تحتاج إلى استبعاد لأنها لديها القدرة على توليد المسخ. طريقة واحدة لتحديد الخلايا الجذعية غير المتمايزة في endoderm نهائي هو لفرز الخلايا باستخدام علامة متعددة الخلايا SSEA4. تم الكشف مؤخرا عن جينات العلامة ل hiPSCs غير المتمايزة باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية30. يمكن استخدام ESRG و CNMD و SFRP2 للتحقق من صحة الخلايا غير المتمايزة في أي خطوة تمييز. بمجرد تأكيد النقاء ، فإن فائدة العلاجات المشتقة من iPSC الذاتية هي قدرة الخلايا المزروعة على تجنب الرفض لأنها تأتي من خلايا المريض نفسه. وتشمل العيوب الوقت الذي يستغرقه التفريق الكامل بين الخلايا، والخضوع لاختبار دقيق للدرجة السريرية، وزرع الخلايا في مريض يعاني من إصابة حادة (متلازمة الضائقة التنفسية، احتشاء عضلة القلب، أو إصابة العمود الفقري). البديل هو الاستفادة من الخلايا المشتقة من iPSC allogenic المصرفية31. ويمكن تخزين هذه ومتاحة بسهولة للمرضى الذين يعانون من مستضد الكريات البيض البشري (HLA) مطابقة المتبرعين وأنها سوف تخضع لاختبار شامل للتلوث. العيب الأكبر هو إمكانية الرفض المناعي. قد يكون من الضروري تثبيط المناعة في زرع الخلايا المسببة للسرطان ، وهو الواقع الحالي لعمليات زرع الأنسجة الكاملة. ويجري وضع استراتيجيات للسماح للخلايا المشتقة من iPSC allogenic للتهرب من الاستجابة المناعية لزرعها بأمان في المرضى32.
في نهاية المطاف ، سيتم استخدام الأعضاء الرئوية الكاملة المشتقة من iPSC لدراسة نماذج الأمراض الخاصة بالمرضى ، وتكييف العلاجات ، وتعزيز البحوث الطبية التجديدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من قبل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A.
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X.
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C.
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
