Summary
लेख में प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के चरणवार निर्देशित विभेदन का वर्णन किया गया है जो मेसेनकाइम के साथ-साथ समीपस्थ और डिस्टल उपकला फेफड़ों की कोशिकाओं दोनों से युक्त तीन आयामी पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स के लिए होता है।
Abstract
विट्रो मॉडल प्रणालियों में जैविक रूप से प्रासंगिक की कमी के कारण मानव फेफड़ों के विकास और बीमारी का अध्ययन करना मुश्किल हो गया है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hiPSCs) को 3 डी बहुकोशिकीय फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स में चरणबद्ध रूप से विभेदित किया जा सकता है, जो उपकला और मेसेनकाइमल सेल आबादी दोनों से बना है। हम अस्थायी रूप से निश्चित एंडोडर्म, पूर्वकाल फोरगट एंडोडर्म, और बाद में फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए विभिन्न प्रकार के विकास कारकों और छोटे अणुओं को पेश करके भ्रूण विकास के संकेतों को दोहराते हैं। इन कोशिकाओं को तब विकास कारक कम (जीएफआर) -तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम में एम्बेडेड किया जाता है, जिससे उन्हें बाहरी विकास कारकों के जवाब में अनायास 3 डी फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स में विकसित करने की अनुमति मिलती है। ये पूरे फेफड़े के ऑर्गेनोइड्स (डब्ल्यूएलओ) प्रारंभिक फेफड़ों के विकास के चरणों से गुजरते हैं, जिसमें डेक्सामेथासोन, चक्रीय एएमपी और आइसोब्यूटिलक्सैंथिन के संपर्क में आने के बाद शाखाओं मॉर्फोजेनेसिस और परिपक्वता शामिल है। WLOs के पास वायुमार्ग उपकला कोशिकाएं होती हैं जो मार्करों KRT5 (बेसल), SCGB3A2 (क्लब) और MUC5AC (goblet) के साथ-साथ वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं को व्यक्त करती हैं जो HOPX (वायुकोशीय प्रकार I) और एसपी-सी (वायुकोशीय प्रकार II) को व्यक्त करती हैं। मेसेनकाइमल कोशिकाएं भी मौजूद हैं, जिनमें चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए), और प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर ए (पीडीजीएफआरएक्स) शामिल हैं। iPSC व्युत्पन्न WLOs को कई महीनों तक 3 डी संस्कृति स्थितियों में बनाए रखा जा सकता है और एक विशिष्ट सेल आबादी को शुद्ध करने के लिए सतह मार्करों के लिए क्रमबद्ध किया जा सकता है। आईपीएससी व्युत्पन्न डब्ल्यूएलओ का उपयोग मानव फेफड़ों के विकास का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें फेफड़ों के उपकला और मेसेनकाइम के बीच सिग्नलिंग शामिल है, मानव फेफड़ों के सेल फ़ंक्शन और विकास पर आनुवंशिक उत्परिवर्तन को मॉडल करने के लिए, और संक्रामक एजेंटों की साइटोटॉक्सिसिटी निर्धारित करने के लिए।
Introduction
फेफड़े एक जटिल, विषम, गतिशील अंग है जो छह अलग-अलग चरणों में विकसित होता है - भ्रूण, स्यूडोग्लैंडुलर, कैनेलिकुलर, सैक्युलर, वायुकोशीय, और माइक्रोवैस्कुलर परिपक्वता1,2। बाद के दो चरण मानव विकास में पूर्व और प्रसवोत्तर होते हैं जबकि पहले चार चरण विशेष रूप से भ्रूण के विकास के दौरान होते हैं जब तक कि अपरिपक्व जन्म नहीं होता है। भ्रूण चरण एंडोडर्मल रोगाणु परत में शुरू होता है और श्वासनली और फेफड़ों की कलियों के नवोदित के साथ समाप्त होता है। फेफड़े का विकास उपकला और मेसेनकाइमल कोशिकाओं के बीच सिग्नलिंग के माध्यम से भाग में होता है4। इन इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप फेफड़ों की शाखाओं, प्रसार, सेलुलर भाग्य निर्धारण और विकासशील फेफड़ों के सेलुलर भेदभाव होते हैं। फेफड़े को संचालन क्षेत्रों (टर्मिनल ब्रोन्किओल्स के लिए श्वासनली) और श्वसन क्षेत्रों (एल्वियोली के लिए श्वसन ब्रोन्किओल्स) में विभाजित किया गया है। प्रत्येक क्षेत्र में अद्वितीय उपकला सेल प्रकार होते हैं; बेसल, स्रावी, ciliated, ब्रश, neuroendocrine, और ionocyte कोशिकाओं के संचालन वायुमार्ग 5 में शामिल हैं, श्वसन उपकला 6 में वायुकोशीय प्रकार I और II कोशिकाओं के बाद। विभिन्न सेल प्रकारों के विकास और चोट की प्रतिक्रिया के बारे में अभी भी बहुत कुछ अज्ञात है। आईपीएससी व्युत्पन्न फेफड़े organoid मॉडल तंत्र है कि मानव फेफड़ों के विकास ड्राइव के अध्ययन को सक्षम, फुफ्फुसीय समारोह पर आनुवंशिक उत्परिवर्तन के प्रभाव, और प्राथमिक मानव फेफड़ों के ऊतकों की आवश्यकता के बिना संक्रामक एजेंटों के लिए उपकला और मेसेनकाइम दोनों की प्रतिक्रिया.
भ्रूण भेदभाव के विभिन्न चरणों के अनुरूप मार्करों में CXCR4, cKit, FOXA2, और SOX17 निश्चित एंडोडर्म (DE) 7, FOXA2, TBX1, और SOX2 के लिए पूर्वकाल foregut endoderm (AFE) 8, और NKX2-1 के लिए प्रारंभिक फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं के लिए शामिल हैं9। भ्रूण फेफड़ों के विकास में, अग्रभाग पृष्ठीय अन्नप्रणाली और वेंट्रल ट्रेकिआ में विभाजित होता है। दाएं और बाएं फेफड़ों की कलियां श्वासनली की कली 10 के चारों ओर दो स्वतंत्र आउटपाउचिंग के रूप में दिखाई देती हैं। ब्रांचिंग मॉर्फोजेनेसिस के दौरान, उपकला के आसपास मेसेनकाइम लोचदार ऊतक, चिकनी मांसपेशी, उपास्थि और वास्कुलचर 11 का उत्पादन करता है। उपकला और मेसेनकाइम के बीच बातचीत सामान्य फेफड़ों के विकास के लिए आवश्यक है। इसमें मेसेनकाइम द्वारा FGF1012 का स्राव और उपकला द्वारा उत्पादित SHH13 शामिल है।
यहां, हम तीन आयामी (3 डी) पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स (डब्ल्यूएलओ) में हिप्ससी के निर्देशित भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। जबकि इसी तरह के दृष्टिकोण हैं जो वायुकोशीय-जैसे 14,15 (डिस्टल) ऑर्गेनोइड्स या वायुमार्ग 16 (समीपस्थ) ऑर्गेनोइड्स बनाने के लिए एलपीसी चरण में छंटाई के माध्यम से फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं के अलगाव को शामिल करते हैं, या वायुकोशीय-कोशिका और मेसेनकाइमल मार्करों और कली टिप पूर्वज ऑर्गेनोइड्स को व्यक्त करने के लिए मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स बनाने के लिए वेंट्रल-पूर्वकाल फोरेगट गोलाकार उत्पन्न करते हैं। , इस विधि की ताकत दोनों फेफड़ों के उपकला और मेसेनकाइमल सेल प्रकारों को पैटर्न और ऑर्केस्ट्रेट करने के लिए शामिल है फेफड़ों की शाखाओं morphogenesis, परिपक्वता, और विट्रो में विस्तार orchestrate.
यह प्रोटोकॉल निश्चित एंडोडर्म, पूर्वकाल फोरगट एंडोडर्म और फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं के माध्यम से प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को निर्देशित करने के लिए छोटे अणुओं और विकास कारकों का उपयोग करता है। इन कोशिकाओं को तब शाखाओं और परिपक्वता सहित महत्वपूर्ण विकासात्मक चरणों के माध्यम से 3 डी पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स में प्रेरित किया जाता है। विभेदन प्रोटोकॉल का सारांश चित्र 1a में दिखाया गया है जिसमें एंडोडर्मल और ऑर्गेनोइड भेदभाव की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां दिखाई गई हैं, जो चित्र 1 b में दिखाई गई हैं। चित्रा 1c, d एंडोडर्मल भेदभाव के जीन अभिव्यक्ति विवरण के साथ-साथ भेदभाव को पूरा करने के बाद फेफड़ों की उपकला कोशिकाओं की समीपस्थ और दूरस्थ आबादी दोनों की जीन अभिव्यक्ति को दर्शाता है।
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Protocol
इस अध्ययन प्रोटोकॉल को UCSD के मानव अनुसंधान संरक्षण कार्यक्रम (181180) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से निश्चित एंडोडर्म प्रेरण (दिन 1 - 3)
- धीरे-धीरे पिघलने वाले विकास कारक को कम कर दिया गया (जीएफआर) - तहखाने झिल्ली (बीएम) मैट्रिक्स माध्यम का उपयोग करने से 30 मिनट पहले बर्फ पर। ठंडे DMEM / F12 में, मिश्रण, GFR BM मैट्रिक्स माध्यम 1: 1 को पतला करें ताकि यह इस माध्यम का 50% का गठन करे। उपयोग करने से पहले ठंडा करने के लिए फ्रीजर में P1000 पिपेट युक्तियाँ रखें।
- बर्फ-ठंडे DMEM / F12 में तैयार किए गए 50% GFR-तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम के 500 μL के साथ एक 12-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं को कोट करें। एक बार जब कुओं की वांछित संख्या लेपित हो जाती है, तो कुओं से किसी भी अतिरिक्त मध्यम मिश्रण और / या बुलबुले को हटा दें और प्लेट को सेट करने के लिए 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ या रेफ्रिजरेटर पर रखें। फिर, जेल और सूखने के लिए प्लेट को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में ले जाएं।
- एक बार hiPSCs 70-90% confluency तक पहुँचने के बाद, Rho-associated kinase (ROCK) Inhibitor Y-27632 के 10 μM को पृथक्करण से एक घंटे पहले जोड़ें। मीडिया को बंद करें और फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ एक बार धोएं। सेल टुकड़ी माध्यम (0.5 मिलीलीटर / 12-अच्छी तरह से प्लेट का अच्छी तरह से) जोड़कर hiPSCs को अलग करें और 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेटर से प्लेटों को हटा दें और कुओं में स्टेम सेल पासिंग माध्यम (तालिका 1) के 0.5 मिलीलीटर / 12-अच्छी तरह से जोड़ें; एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए P1000 टिप का उपयोग करके धीरे-धीरे कोशिकाओं को ट्राइट्यूरेट करें। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में विघटित कोशिकाओं को स्थानांतरित करें; 300 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
- माध्यम से aspirate और 10 μM रॉक अवरोधक (Y-27632) के साथ पूरक mTeSR प्लस मीडिया के 1 mL के साथ सेल गोली resuspend. कोई कक्ष गणना निष्पादित करें. एक 12-अच्छी तरह से GFR-तहखाने झिल्ली मध्यम लेपित प्लेट के प्रति अच्छी तरह से रॉक इनहिबिटर Y-27632 के साथ पूरक mTeSR के 1 mL में 2.0 x 105 hiPSCs जोड़ें। रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट:: सेल सीडिंग संख्या प्रति कक्ष पंक्ति ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए। चढ़ाना के बाद 24 घंटे, कुओं को 50% -70% confluent होना चाहिए। - दिन 1 पर, mTeSR Plus को aspirate करें और निश्चित एंडोडर्म (DE) प्रेरण मीडिया (तालिका 1) को 100 ng / mL मानव activin A और GSK3 के 5 μM के साथ पूरक जोड़ें अवरोधक / WNT उत्प्रेरक CHIR99021।
नोट: GSK3 के साथ DE मीडिया π अवरोधक / WNT उत्प्रेरक CHIR99021 को सफल भेदभाव के लिए दिन 1 DE प्रेरण के 20-24 घंटे के भीतर हटा दिया जाना चाहिए। - दिन 2 और दिन 3 पर, डीई प्रेरण मीडिया में परिवर्तन केवल 100 एनजी / एमएल के साथ पूरक है।
नोट: DE विभेदन कुल 72 h से अधिक नहीं होना चाहिए, या प्रभावकारिता कम हो जाएगी। दिन 4 पर, यदि बड़े सेल डाई-ऑफ मनाया जाता है, तो कुल डीई मीडिया एक्सपोजर समय को 6-12 घंटे तक कम करें। - डीई दक्षता का विश्लेषण करने के लिए, 90% से अधिक CXCR4 और / या cKit अभिव्यक्ति की पुष्टि करें प्रवाह साइटोमेट्री या FOXA2 और / या SOX17 के immunofluorescence विश्लेषण के माध्यम से (चित्रा 2a)।
2. पूर्वकाल foregut endoderm (AFE) प्रेरण (दिन 4 - 6)
- दिन 4 पर, सीरम मुक्त बेसल माध्यम (SFBM) (तालिका 1) के लिए मीडिया बदलें 10 μM SB431542 और 2 μM Dorsomorphin AFE प्रेरण के लिए के साथ पूरक. 3 दिनों के लिए दैनिक AFE मीडिया बदलें (दिन 4, दिन 5, और दिन 6)।
- AFE दक्षता का विश्लेषण करने के लिए, SOX2, TBX1, और FOXA2 की मजबूत अभिव्यक्ति की पुष्टि immunofluorescence धुंधला (चित्रा 2b) के माध्यम से करें।
3. फेफड़े के पूर्वज सेल (LPC) भेदभाव (दिन 7 - 16)
- दिन 7 पर, बर्फ पर जीएफआर-तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम को पिघलाएं। AFE मीडिया बंद aspirate और 1x PBS के साथ अच्छी तरह से धोना. सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- सेल टुकड़ी समाधान युक्त कुओं के लिए शमन माध्यम (DMEM / F12 में 2% FBS) के 1 mL जोड़ें। धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा समुच्चय के रूप में कोशिकाओं को रखें। सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को हटा दिया जाता है और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया जाता है। 300 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
- supernatant निकालें और मानव पुनः संयोजक हड्डी morphogenic प्रोटीन -4 (BMP4) के 10 ng / mL के साथ पूरक शमन माध्यम में सेल गोली resuspend, सभी ट्रांस रेटिनोइक एसिड (आरए) के 0.1 μM, GSK3 के 3 μM अवरोधक / WNT उत्प्रेरक CHIR99021, और रॉक इनहिबिटर Y-27632 के 10 μM।
- कोई कक्ष गणना निष्पादित करें. ठंडे जीएफआर-तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम के 100 μL में 2.5 x 105 कोशिकाओं को जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण करें, और 12-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में बूंद रखें। माध्यम को पॉलिमराइज़ करने की अनुमति देने के लिए 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। एलपीसी मीडिया के 1 mL जोड़ें रॉक इनहिबिटर Y-27632 प्रति अच्छी तरह से यह सुनिश्चित करने के लिए कि मध्यम ड्रॉप पूरी तरह से जलमग्न है और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट के 10 μM के साथ पूरक है।
- दिन 8 पर, LPC प्रेरण के बाद 24 ज, रॉक अवरोधक Y-27632 को हटाने के लिए LPC माध्यम परिवर्तित करें। कुल 9-11 दिनों के लिए हर दूसरे दिन एलपीसी माध्यम बदलें।
नोट: यदि माध्यम 24 घंटे के भीतर पीला हो जाता है, तो हर दिन माध्यम बदलें। - LPC दक्षता का विश्लेषण करने के लिए, इंट्रासेल्युलर प्रतिलेखन कारक NKX2-1 की मजबूत अभिव्यक्ति की पुष्टि करें या सतह मार्करों CD47hi / CD26low15 या CPM18 (चित्रा 2c) के लिए प्रवाह साइटोमेट्री करें। मोटे तौर पर, एलपीसी गोलाकार गोल और पारदर्शी होना चाहिए (चित्रा 2 सी)।
नोट: फेफड़ों organoid भेदभाव के साथ आगे मत बढ़ो यदि NKX2-1 की दक्षता 30% से नीचे है।
4.3D फेफड़े organoid प्रेरण (दिन 16 - 22)
- दिन 17 पर, बर्फ पर जीएफआर-तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम को पिघलाएं। LPC प्रेरण माध्यम aspirate. फिर अच्छी तरह से 2 μg / mL डिस्पेज़ (1 mL) जोड़ें और P1000 पिपेट के साथ मध्यम / डिस्पेज़ मिश्रण को फिर से निलंबित करें। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। मिश्रण को फिर से ट्राइट्यूरेट करें और एक और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- डिस्पेज़ और कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। अच्छी तरह से धोने के लिए ठंडा पीबीएस (2-3 मिलीलीटर) का उपयोग करें और डिस्पेज़ / सेल मिश्रण को फिर से निलंबित करें। 400 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। मैन्युअल रूप से supernatant निकालें, सावधान किया जा रहा है मध्यम / सेल गोली परत distub नहीं जा रहा है. ठंडा पीबीएस धोने को दोहराएं, और 400 x g पर एक और 5 मिनट के लिए शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
- मैन्युअल रूप से supernatant निकालें, और फिर शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए ट्रिप्सिन-आधारित पृथक्करण समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 12 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद, P1000 पिपेट टिप के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। फिर शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में शमन मीडिया की एक समान मात्रा जोड़ें और 5 मिनट के लिए 400 x g पर नीचे स्पिन करें। रॉक इनहिबिटर Y-27632 के 10 μM शमन माध्यम + 10 μM में supernatant और resuspend कोशिकाओं aspirate.
नोट: सफल फेफड़े organoid प्रेरण तब होता है जब कोशिकाओं समुच्चय के रूप में एम्बेडेड कर रहे हैं, नहीं एकल कोशिकाओं, तदनुसार pipetting समायोजित करें। - कोई कक्ष गणना निष्पादित करें. प्रति अच्छी तरह से 5.0-8.0 x 104 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें। एलपीसी सेल समुच्चय 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में और 400 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज में समुच्चय करता है। अतिरिक्त supernatant निकालें, सेल गोली उत्तेजित नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है. अवशिष्ट मीडिया के केवल 10 μL छोड़ दें।
- ठंडे जीएफआर-तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम के 200 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और सेल संस्कृति झिल्ली आवेषण (6.5 मिमी व्यास, 0.4 μm रंध्र, पॉलिएस्टर झिल्ली) में जोड़ें। जीएफआर-तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम को पॉलिमराइज़ करने की अनुमति देने के लिए 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
- 3डी ऑर्गेनोइड प्रेरण माध्यम (तालिका 1) के 1 एमएल को फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर -7 (एफजीएफ 7) (10 एनजी / एमएल), एफजीएफ 10 (10 एनजी / एमएल), जीएसके 3 π अवरोधक / डब्ल्यूएनटी एक्टिवेटर सीआईआर (3 μM), एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) (10 एनजी / एमएल), और रॉक इनहिबिटर वाई -27632 के 10 μM के साथ पूरक जोड़ें झिल्ली डालने के बेसोलेटरल कक्ष में। 6 दिनों के लिए हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
5.3D फेफड़ों organoid ब्रांचिंग (दिन 23 - 28)
- दिन 23 पर FGF7 (10 ng / mL), FGF10 (10 ng / mL), GSK3π अवरोधक / WNT उत्प्रेरक CHIR99021 (3 μM), RA (0.1 μM), EGF (10 ng / mL), और संवहनी एंडोथेलियल विकास कारक (VEGF) / प्लेसेंटल विकास कारक (PlGF) (10 ng / mL) (10 ng / mL) के साथ पूरक 3 डी ब्रांचिंग माध्यम (तालिका 1) में बदल जाता है। 6 दिनों के लिए हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
नोट: 3 डी ब्रांचिंग भेदभाव के दिन 6 पर, कई ब्रांचिंग ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 2) होने चाहिए।
6.3D फेफड़े organoid परिपक्वता (दिन 29 - 34)
- दिन 29 पर, 3 डी परिपक्वता माध्यम (तालिका 1) में परिवर्तन, जो 3 डी ब्रांचिंग माध्यम के समान है, लेकिन डेक्सामेथासोन (50 एनएम), सीएएमपी (100 μM), और 3-आइसोब्यूटिल -1-मिथाइलक्सैंथिन (आईबीएमएक्स) के अलावा, एक फॉस्फोडिएस्टेरेस अवरोधक को आइसोब्यूटिलक्सैंथिन (100 μM) भी कहा जाता है। 6 दिनों के लिए हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
नोट: 3 डी परिपक्वता के बाद 24 घंटे के भीतर, ब्रांचिंग ऑर्गेनोइड्स को पारदर्शी क्षेत्रों में विस्तार और बदलना चाहिए।
7.3D फेफड़ों organoid immunocytochemistry
- 3 डी पूरे फेफड़ों organoid विश्लेषण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ झिल्ली आवेषण में जीएफआर-तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम को ठीक करें। पैराफिन मोम में एम्बेड करें और मानक प्रकाशित प्रोटोकॉल प्रति स्लाइड पर माउंट करें।
- धुंधला करने से पहले एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें। वायुमार्ग मार्करों में KRT5, MUC5AC और SCGB3A2 शामिल हैं। वायुकोशीय मार्करों में एसपी-सी, एसपी-बी, एफटीआईआई -280, एचटीआई -56 और एचओपीएक्स (चित्रा 3) शामिल हैं।
8. जीएफआर से पूरे फेफड़ों organoids के हटाने तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पारित होने के लिए माध्यम, FACS, या cryopreservation
- GFR-तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम से organoids को अलग करने के लिए, बेसल कक्ष से मीडिया को हटा दें और एपिकल कक्ष में डिस्पैज़ (1 एमएल) के 2 μg / mL जोड़ें।
- धीरे से एक P1000 पिपेट के साथ माध्यम / dispase मिश्रण triturate और 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में जगह. धीरे से मिश्रण को फिर से ट्राइटुरेट करें और एक और 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- ठंडा PBS (4 °C) के 1 mL जोड़ें और एक 15 mL शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मैट्रिक्स माध्यम के साथ organoids हस्तांतरण। 5 मिनट के लिए 400 x g पर स्पिन करें। supernatant ध्यान से निकालें, सेल गोली परेशान करने के लिए नहीं।
- 1 एमएल ठंडा पीबीएस के साथ एक बार फिर से धोएं और 5 मिनट के लिए 400 x g पर नीचे स्पिन करें। supernatant ध्यान से निकालें, मध्यम / सेल मिश्रण को परेशान करने के लिए नहीं।
- शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें, धीरे से जीएफआर-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मध्यम / सेल मिश्रण को फिर से निलंबित करें। समुच्चय के रूप में या क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए पासिंग कोशिकाओं के लिए 12 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें, या एकल सेल निलंबन के लिए 20 मिनट।
- शमन मीडिया की समान मात्रा जोड़ें और 5 मिनट के लिए 400 x g पर नीचे स्पिन करें। शमन माध्यम + रॉक अवरोधक Y-27632 के 10 μM में resuspend.
नोट: इस चरण में, ट्यूब में कोई अवशिष्ट तहखाने झिल्ली माध्यम नहीं देखा जाना चाहिए। यदि अवशिष्ट माध्यम रहता है, तो चरण 8.5 और 8.6 को दोहराएँ। - कोई कक्ष गणना निष्पादित करें. डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक वॉल्यूम की गणना करें.
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Representative Results
चढ़ाना के 24 घंटे बाद, दिन 1, iPSCs 50% -90% confluent होना चाहिए। दिन 2 पर, डीई 90% -95% confluent होना चाहिए। डीई प्रेरण के दौरान, दिन 4 पर महत्वपूर्ण सेल मृत्यु का निरीक्षण करना आम है, लेकिन संलग्न कोशिकाएं एक कॉम्पैक्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान (चित्रा 2 बी) को बनाए रखेंगी। भेदभाव बंद करें यदि अनुयायी कोशिकाओं के बहुमत अलग हो जाते हैं और 6-12 घंटे तक एक्टिविन ए के साथ डीई मीडिया के संपर्क को कम करने पर विचार करते हैं। एएफई प्रेरण के दौरान, सेल मृत्यु न्यूनतम होती है, और कोशिकाएं अनुयायी रहती हैं, लेकिन छोटी और अधिक विषम दिखाई देंगी। दिन 7 पर कोशिकाओं को पास करना केवल तभी किया जाना चाहिए जब डबल पॉजिटिव SOX2 और FOXA2 की उपज >80% है। 3 डी एलपीसी प्रेरण के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में पास करने के बाद, छोटे गोलाकार पहले दिखाई देंगे, फिर बढ़ेंगे और कुछ शाखा शुरू कर सकते हैं। सफल एंडोडर्मल भेदभाव के लिए जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल में डीई में SOX17 में वृद्धि, SOX17 में कमी और NKX2-1 की पहली उपस्थिति के साथ FOXA2 और SOX2 में वृद्धि हुई, और SOX2 और FOXA2 की उपस्थिति के साथ NKX2-1 में वृद्धि हुई। प्रारंभिक भ्रूण विकास के अनुरूप, एएफई का वेंट्रलाइजेशन फेफड़ों की कली के विकास (एनकेएक्स 2-1 +) के लिए होता है और एएफई का पृष्ठीयकरण जठरांत्र संबंधी विकास (SOX2+) के लिए होता है। एलपीसी में संस्कृतियों में फेफड़ों और गैस्ट्रिक पूर्वजों दोनों का मिश्रण होगा।
एलपीसी से फेफड़ों के ऑर्गेनोइड प्रेरण को विभिन्न तरीकों का उपयोग करके किया गया है। कुछ समूह NKX2-1 फ्लोरोसेंट रिपोर्टर या एक सतह एंटीजन प्रॉक्सी (CPM, CD26lowCD47high) का उपयोग करके कोशिकाओं को सॉर्ट करते हैं। लेकिन उन फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स में वायुकोशीय प्रकार I कोशिकाओं या मेसेनकाइम के बिना वायुकोशीय प्रकार II जैसी कोशिकाएं होती हैं। अन्य समूहों ने सेल clumps एकत्र किए हैं जो AFE / LPC मोनोलेयर से कली करते हैं और उन्हें तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेडेड करते हैं। उन ऑर्गेनोइड्स में फेफड़ों के उपकला और मेसेनकाइमल कोशिकाओं की मिश्रित आबादी होती है, लेकिन संस्कृति 19 में महीनों लगते हैं। हमारे प्रोटोकॉल में उपकला और मेसेनकाइमल कोशिकाओं की उपस्थिति दोनों शामिल हैं। WLOs समीपस्थ उपकला सेल मार्कर p63 और KRT5 (बेसल कोशिकाओं) और SCGB3A2 (क्लब कोशिकाओं) के साथ-साथ डिस्टल एपिथेलियल सेल मार्करों HOPX (ATI) और proSPC, SPB, और NKX2-1 (ATII) को व्यक्त करते हैं। वे एलपीसी चरण में मेसेनकाइमल मार्कर विमेंटिन को भी व्यक्त करते हैं, साथ ही साथ पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स में भी व्यक्त करते हैं। PDGFRα फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए एक मार्कर है जिसमें sacculation और वायुकोशीयकरण 20 के दौरान फेफड़ों में एक महत्वपूर्ण कार्य होता है और डिस्टल सेल भेदभाव, SOX9 (चित्रा 3) में महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक के साथ सह-व्यक्त किया जाता है।
हमारी विधि कुशलतापूर्वक NKX2-1-व्यक्त LPC 3D संस्कृतियों को सिग्नलिंग अणुओं का उपयोग करके उत्पन्न करती है जो भ्रूण के फेफड़ों के विकास में प्रारंभिक फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स बनाने के लिए होती हैं। फेफड़ों के ऑर्गेनोइड प्रेरण के लिए जीएफआर-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम में एलपीसी को पास करते समय, यह आवश्यक है कि एक एकल सेल निलंबन में अधिक अलग न करें, बल्कि इसके बजाय कोशिकाओं के छोटे clumps (10 कोशिकाओं / सेल गिनती पूरी तरह से सटीक नहीं होगी, लेकिन अभी भी 3 सप्ताह के फेफड़ों के ऑर्गेनोइड भेदभाव के दौरान संगम से बचने के लिए आवश्यक है।
फेफड़े के ऑर्गेनोइड प्रेरण को प्रेरण के दिन 6 (विभेदन के दिन 23) द्वारा छोटे, ब्रांचिंग ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करना चाहिए। इन्हें ऑर्गेनोइड ब्रांचिंग चरण और परिपक्वता चरण के दौरान बढ़ना जारी रखना चाहिए। डेक्सामेथासोन, सीएएमपी और आईबीएमएक्स की शुरुआत के चौबीस घंटे बाद, शाखाओं को पारदर्शी क्षेत्रों में विस्तार करना चाहिए। पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड विश्लेषण को भेदभाव के अंत में किया जा सकता है, या डब्ल्यूएलओ को जीएफआर के साथ ताजा तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में पारित किया जा सकता है या 10% डीएमएसओ में ठंड से क्रायोप्रिजर्व किया जा सकता है।
चित्रा 1: hipscs और प्रतिनिधि डेटा से पूरे फेफड़ों organoid (WLO) विभेदन की समग्र योजनाबद्ध. (a) hiPSCs से WLO विभेदन की योजनाबद्ध. वृत्त मार्करों की पहचान के साथ एंडोडर्मल सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं। विभेदन की समयरेखा काले सलाखों में इंगित की जाती है। एंडोडर्मल और फेफड़ों के ऑर्गेनोइड आबादी के प्रेरण के लिए विकास कारक और / या छोटे अणु। संक्षेप में, स्टेम कोशिकाओं को लगभग 16 दिनों में निश्चित एंडोडर्म, पूर्वकाल फोरगट एंडोडर्म और फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं में विभेदित किया जाता है। इन कोशिकाओं को तब जीएफआर-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम में पारित किया जाता है जिसमें मध्यम आवेषण होता है और फेफड़ों के ऑर्गेनोइड प्रेरण, ब्रांचिंग और परिपक्वता से गुजरता है। कुल विभेदन में लगभग 35 दिन लगते हैं। (ख) प्रमुख एंडोडर्मल चरणों में कोशिकाओं की प्रतिनिधि चरण कंट्रास्ट छवियां और पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स की 3 डी छवियां। स्केल बार आकार के रूप में पैनल में इंगित किया गया है. (ग) एंडोडर्म के दौरान फेफड़ों के विकास मार्करों का क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण और (घ) समीपस्थ और डिस्टल सेल मार्करों का संपूर्ण फेफड़ों का ऑर्गेनोइड विभेदन। सभी डेटा 3-5 जैविक प्रतिकृतियों के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं और एक्टिन के लिए सामान्यीकृत होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: प्रवाह साइटोमेट्री और immunocytochemistry द्वारा एंडोडर्म भेदभाव का लक्षण वर्णन. (a) निश्चित एंडोडर्म मार्कर CXCR4 के प्रवाह cytometry. बाएं पैनल unstained आबादी के खिलाफ गेटिंग दिखाता है जबकि मध्य पैनल CXCR4 सकारात्मक आबादी से पता चलता है। सही पैनल SOX17 (लाल) नाभिक (नीले) के साथ overlaid की immunocytochemistry छवि से पता चलता है। (ख) नाभिक (नीले) के साथ AFE मार्कर FOXA2 और SOX2 overlaid की immunocytochemistry छवि। (ग) 3डी एलपीसी में एक रिपोर्टर सेल लाइन में एनकेएक्स2-1-जीएफपी की अंतर्जात अभिव्यक्ति। Brightfield और GFP में लाइव सेल संस्कृति से ली गई छवियां। फेफड़ों के पूर्वज इंट्रासेल्युलर मार्कर NKX2-1 के प्रवाह cytometry निर्धारण और permeabilization के बाद. स्केल बार का आकार = 50 μM. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3: immunocytochemistry द्वारा 3 सप्ताह के भेदभाव के बाद 3 डी पूरे फेफड़ों organoids के लक्षण वर्णन. (ए) समीपस्थ फेफड़ों मार्करों. बाएं पैनल SOX2 (सफेद) और SOX9 (लाल) नाभिक (नीले) द्वारा overlaid से पता चलता है. ये मार्कर मॉर्फोजेनेसिस को ब्रांच करने में महत्वपूर्ण हैं और समीपस्थ और डिस्टल उपकला आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। मध्य पैनल P63 (लाल) और KRT5 (लाल), बेसल कोशिकाओं के दोनों मार्करों को दिखाते हैं। सही पैनल SCGB3A2, क्लब कोशिकाओं का एक मार्कर से पता चलता है. (ख) डिस्टल लंग मार्कर। बाएं पैनल में प्रो-एसपीसी (पीएसपीसी), (हरा) और एचओपीएक्स (लाल), वायुकोशीय प्रकार II विज्ञापन I कोशिकाओं के मार्करों को दर्शाया गया है, क्रमशः, नाभिक (नीले) के साथ ओवरलेड। मध्य पैनल प्रो-एसपीसी (पीएसपीसी) (हरा) और एसपीबी (लाल), वायुकोशीय प्रकार द्वितीय कोशिकाओं के मार्करों को दिखाता है, जो नाभिक (नीले रंग) के साथ ओवरलेड होता है। सही पैनल NKX2-1 (लाल) और ZO1 (हरा) नाभिक (नीले) के साथ overlaid से पता चलता है। (ग) फेफड़ों के मेसेनकाइम के मार्कर। बायां पैनल PDGFRA (लाल) और SOX9 (सफेद) दिखाता है, जो डिस्टल मेसेनकाइम का प्रतिनिधित्व करता है। दाहिना पैनल विमेंटिन (लाल) दिखाता है, जो पूरे फेफड़े में बिखरा हुआ है। स्केल बार का आकार = 50 μM. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| अभिकर्मकों और समाधान - कंपनी के नामों के लिए कृपया सामग्री सूची की तालिका देखें |
| 3डी ऑर्गेनोइड प्रेरण माध्यम (दिन 17-22) |
| सीरम मुक्त बेसल माध्यम (नुस्खा देखें) के साथ पूरक: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| 3डी ऑर्गेनोइड ब्रांचिंग माध्यम (दिन 23-28) |
| सीरम मुक्त बेसल माध्यम (नुस्खा देखें) के साथ पूरक: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड (0.1 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| VEGF/PIGF (10 ng/mL) |
| 3डी ऑर्गेनोइड परिपक्वता माध्यम (दिन 29-34) |
| सीरम मुक्त बेसल माध्यम (नुस्खा देखें) के साथ पूरक: |
| डेक्सामेथासोन (50 nM) |
| Br-camp (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| AFE प्रेरण माध्यम (दिन 4-6) |
| सीरम मुक्त बेसल माध्यम (नुस्खा देखें) के साथ पूरक: |
| SB431542 (10 μM) |
| डोरसोमोर्फिन (2 μM) |
| डीई प्रेरण माध्यम (दिन 1-3) |
| 48.5 mL RPMI1640 + ग्लूटामैक्स |
| रेटिनोइक एसिड के बिना 1 मिलीलीटर बी 27 |
| 500 μl HEPES (1%) |
| 500 μl पेन/ |
| मानव गतिविधि A (100 ng/mL) |
| CHIR99021 (5 μM) - केवल पहले 24 घंटों में |
| LPC प्रेरण माध्यम (दिन 7-16) |
| सीरम मुक्त बेसल माध्यम (नुस्खा देखें) के साथ पूरक: |
| BMP4 (10 ng/mL) |
| ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड (आरए) (0.1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| शमन माध्यम |
| 49 mL DMEM/F12 |
| 1 mL FBS |
| सीरम मुक्त बेसल माध्यम (SFBM) |
| 375 mL है Iscove संशोधित Dulbecco मध्यम (IMDM) + ग्लूटामैक्स |
| 125 mL हैम का F12 |
| रेटिनोइक एसिड के बिना 5 मिलीलीटर बी 27 |
| 2.5 mL N2 |
| 500 μl ascorbic एसिड, 50 mg/ |
| 13 μl monothioglycerol / 1ml IMDM "सीरम मुक्त मीडिया के प्रति 100 मिलीलीटर प्रति 0.4mM मोनोथिओग्लिसरॉल के 300ul का उपयोग करें |
| 3.75 mL गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) अंश V, 7.5% समाधान |
| 500 μl पेन/ |
| स्टेम सेल passaging माध्यम (दिन 0) |
| 500 mL DMEM/ |
| 129 मिलीलीटर नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (केएसआर) |
| 6.5 mL ग्लूटामैक्स |
| 6.5 mL NEAA |
| 1.3 mL 2-mercaptoethanol |
| 6.5 mL पेन/ |
तालिका 1: मीडिया की तालिका।
| समस्या | घोल |
| DE विभेदन कुशल नहीं | स्टेम सेल माध्यम में चढ़ाना के 24 घंटे बाद, कोशिकाओं को 50-70% confluent होना चाहिए |
| GSK3 π अवरोधक / WNT उत्प्रेरक CHIR99021 को दिन के 20-24 घंटों के भीतर हटा दिया जाना चाहिए 1 डीई प्रेरण | |
| डीई भेदभाव कुल 72 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए | |
| AFE भेदभाव कुशल नहीं है | सुनिश्चित करें कि डीई भेदभाव सफल रहा और कोशिकाएं 80% CXCR4 > व्यक्त करती हैं |
| सुनिश्चित करें कि ताजा विकास कारकों / छोटे अणुओं को दैनिक रूप से मीडिया में जोड़ा जा रहा है | |
| LPC विभेदन कुशल नहीं है | सुनिश्चित करें कि AFE भेदभाव सफल रहा था और > कोशिकाएं 80% FOXA2/ |
| सुनिश्चित करें कि AFE कोशिकाओं को 4-10 कोशिकाओं के समुच्चय के रूप में पारित किया जाता है और एकल सेल नहीं किया जाता है | |
| 3 डी फेफड़ों organoids बढ़ या differentiating नहीं | सुनिश्चित करें कि LPC भिन्नता सफल रही और कोशिकाएं 30% NKX2-1 > व्यक्त करती हैं |
| सुनिश्चित करें कि एलपीसी को 4-10 कोशिकाओं के समुच्चय के रूप में पारित किया गया था और एकल सेल नहीं किया गया था | |
| सुनिश्चित करें कि पासिंग के दौरान एलपीसी से कोई अवशिष्ट मैट्रिगेल नहीं है | |
| प्रत्येक मीडिया परिवर्तन के साथ रॉक अवरोधक Y-27632 जोड़ें | |
| सुनिश्चित करें कि मीडिया समय पर बदल गया है और ताजा विकास कारकों / छोटे अणुओं को जोड़ा जाता है | |
| सुनिश्चित करें कि विकास कारकों / छोटे अणुओं की एकाग्रता सही है |
तालिका 2: समस्या निवारण.
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Discussion
3 डी पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स (डब्ल्यूएलओ) का सफल भेदभाव एक बहु-चरण, विस्तार पर ध्यान देने के साथ 6-सप्ताह के प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, जिसमें विकास कारकों और छोटे अणुओं के संपर्क में आने का समय, पासिंग के बाद सेलुलर घनत्व, और एचआईपीएससी की गुणवत्ता शामिल है। समस्या निवारण के लिए, तालिका 2 देखें. hiPSCs लगभग 70% -80% confluent होना चाहिए, पृथक्करण से पहले 5% से कम सहज भेदभाव के साथ। यह प्रोटोकॉल "mTeSR प्लस" माध्यम के लिए कहता है; हालांकि, सादा "mTeSR" माध्यम भी तुलनीय परिणामों के साथ इस्तेमाल किया गया है और कम महंगा है. एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स के लिए, हम जीएफआर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम का उपयोग करते हैं। हम विभेदन को कम करने के लिए ReLesR ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके hiPSCs को पारित करते हैं।
एंडोडर्म भेदभाव के दौरान, कोशिकाओं को मीडिया परिवर्तनों से पहले और बाद में दैनिक रूप से कल्पना की जानी चाहिए। समय से पहले गिरावट को रोकने के लिए निर्दिष्ट विकास कारकों /छोटे अणुओं को आधार माध्यम में दैनिक रूप से ताजा जोड़ा जाना चाहिए। निश्चित एंडोडर्म (डीई) में कोशिका मृत्यु आम है, लेकिन पूर्वकाल फोरेगट एंडोडर्म (एएफई) और फेफड़े के पूर्वज सेल (एलपीसी) प्रेरण के दौरान सीमित होनी चाहिए। यदि डीई (दिन 4) के तीसरे दिन एक बड़ी मृत्यु होती है, तो डीई के कुल समय को 6-12 घंटे तक कम कर दें। नई आईपीएससी सेल लाइनों को सफल एंडोडर्म भेदभाव के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। सफल प्रेरण (>85% CXCR4 + कोशिकाओं) की पुष्टि करने के लिए CXCR4 के लिए DE पर प्रवाह साइटोमेट्री निष्पादित करें। कोशिकाओं को एएफई में अपेक्षाकृत स्थिर होना चाहिए और रूपात्मक रूप से थोड़ा मरने के साथ बदल जाएगा।
LPC में passaging एक और प्रक्रिया है जिसे सेल प्रकार के लिए ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए। बहुत कम घनत्व (<50%) पर कोशिकाओं को फिर से प्लेट करने के परिणामस्वरूप अक्षम भेदभाव होगा। NKX2-1 के लिए immunocytochemistry या CPM18 या CD26low / CD47high15 के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के साथ सफल LPC प्रेरण की पुष्टि करें। सफल एलपीसी प्रेरण में >40% NKX2-1 होना चाहिए, अन्यथा ऑर्गेनोइड्स में पृष्ठीय AFE की अधिक से अधिक बहुतायत होगी। LPC प्रेरण के लिए, विकास कारकों को प्रत्येक मीडिया परिवर्तन के साथ आधार मीडिया में जोड़ा जाना चाहिए। यदि मीडिया बाद में एलपीसी प्रेरण में पीला हो जाता है, तो ताजा मीडिया की मात्रा बढ़ाने पर विचार करें, या हर दिन मीडिया को बदलें। 3 डी पूरे फेफड़ों organoid प्रेरण के दौरान, चढ़ाना संख्या और सेल क्लस्टर को बनाए रखने सफल organoid विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। जीएफआर-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम को संभालना मुश्किल है और अत्यधिक तापमान संवेदनशील है, इसलिए इसे हमेशा बर्फ पर रखें। यदि जीएफआर-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम जैल बहुत जल्दी है, तो एलपीसी कोशिकाएं इसके भीतर एकीकृत नहीं होंगी। हम जीएफआर-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम के 1 एमएल एलीकोट को पास करने से 30 मिनट पहले बर्फ पर पिघलने की सलाह देते हैं। एक बार जब कोशिकाओं / समूहों की गणना की जाती है और उचित एलीकोट बनाया जाता है, तो सेल पैलेट को बर्फ पर रखें। हम जीएफआर-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मध्यम हैंडलिंग से पहले प्लेटों, लेबलिंग और सेल संस्कृति झिल्ली आवेषण के अलावा तैयार करने का सुझाव देते हैं।
तरल GFR-तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम की सही मात्रा को जोड़ने के लिए पिपेट युक्तियों का उपयोग करें तुरंत सेल गोली के लिए, बर्फ पर रखते हुए। पिपेट जल्दी से ऊपर और नीचे लेकिन धीरे से (बारीक हैंडलिंग) बुलबुले पेश नहीं करने के लिए, फिर ट्यूब को बर्फ पर वापस रखें। तैयार प्लेटों में ट्रांसवेल के एपिकल भाग में सेल और जीएफआर-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मध्यम मिश्रण जोड़ें। मिश्रण को फैलना चाहिए और पूरे ट्रांसवेल को कोट करना चाहिए; कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को धीरे से झुकाएं। 30-60 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में जेलिंग के बाद, जीएफआर-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम में दृश्यमान सेल क्लस्टर होना चाहिए। 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 के साथ पूरक बेसल चैंबर में उपयुक्त फेफड़े प्रेरण मीडिया जोड़ें और हर दूसरे दिन ऑर्गेनोइड विकास की निगरानी करें।
इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के भविष्य के अनुप्रयोगों में आणविक मार्गों का अध्ययन करना शामिल है जो प्रारंभिक फेफड़ों के वंश प्रतिबद्धता और सेल भाग्य विनिर्देश 21,22,23 को नियंत्रित करते हैं। उपकला और मेसेनकाइम के बीच बातचीत को जीन नॉक आउट मॉडल 24 का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। फेफड़े के उपकला, मेसेनकाइम और एंडोथेलियम 25 के बीच ऊतक विशिष्ट सह-पैटर्न सिग्नलिंग के महत्व को निर्धारित करने के लिए ऑर्गेनोइड्स को एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत भी किया जा सकता है। फेफड़ों का विकास संवहनी विकास के समानांतर होता है और यह संबंध उचित फेफड़ों के विकास के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण आणविक तंत्र को प्राप्त कर सकता है। हमने यह भी दिखाया है कि ये पूरे फेफड़े के ऑर्गेनोइड्स जीएफआर-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम को हटा दिए जाने के बाद सर्फेक्टेंट स्राव के माध्यम से कार्यात्मक हैं, जिसके बाद अल्ट्रा-कम अनुलग्नक कुओं में अल्पकालिक संस्कृति को हटा दिया गया था26। अन्य रणनीतियों में सेल सतह मार्करों जैसे कि NGFR (बेसल कोशिकाओं) 27 और HTII-280 (ATII कोशिकाओं) 28 के लिए कोशिकाओं को सॉर्ट करना और उन्हें समरूप ऑर्गेनोइड्स या एयर लिक्विड इंटरफेज कल्चर स्थितियों में एक मोनोलेयर के रूप में बदलना शामिल है। पूरे, समीपस्थ और डिस्टल फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग सार्स-कोव -2 वायरल संक्रमण के सेलुलर लक्ष्यों और पैथोफिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है ताकि कोविड -19 का मुकाबला करने वाली दवाओं के लिए बेहतर ढंग से समझा जा सके और स्क्रीन की जा सके।
यह प्रोटोकॉल मजबूत और पुन: प्रस्तुत करने योग्य है, लेकिन कई चुनौतियां अभी भी मौजूद हैं। कई अलग-अलग आईपीएससी और ईएससी लाइनों का परीक्षण किया गया है (>20 लाइनें) लेकिन प्रोटोकॉल को प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। मजबूत डीई और एएफई प्रेरण के बावजूद, एलपीसी प्रेरण को एनकेएक्स 2-1 + कोशिकाओं के >40% प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। अन्य प्रोटोकॉल में एनकेएक्स 2-1 कोशिकाओं 15,18 की सतह मार्करों के लिए एक छंटाई चरण शामिल है, लेकिन वे केवल मेसेनकाइम के बिना ऑर्गेनोइड्स की तरह वायुकोशीय प्रकार II उत्पन्न करते हैं और अभी भी फेफड़ों के पूर्वज आबादी को शुद्ध करने के बावजूद गैस्ट्रिक और यकृत कोशिका आबादी होती है29। हमने एलपीसी और पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स दोनों में गैस्ट्रिक और यकृत कोशिकाओं की एक छोटी राशि का भी उल्लेख किया है, संभवतः एलपीसी को दूषित करने वाली पृष्ठीय पूर्वकाल फोरेगट कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण। इसलिए, शुद्ध फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स का भेदभाव अभी तक प्राप्त नहीं किया गया है, और मानव ऊतक में फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं के विकास पर अधिक शोध पूरा किया जाना चाहिए। डाउनस्ट्रीम assays सख्ती से प्राथमिक मानव फेफड़ों के ऊतकों से जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ बेंचमार्क किया जाना चाहिए. जबकि, आज तक, फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स का सबसे उपयोगी उपयोग विट्रो में दवाओं के लिए मॉडलिंग बीमारियों और स्क्रीनिंग में किया गया है, पुनर्योजी चिकित्सा के लिए रोगियों में hiPSC-व्युत्पन्न फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स के प्रत्यारोपण को कई स्थितियों के लिए भविष्य की चिकित्सा के रूप में माना गया है। हालांकि, इस तरह के हस्तक्षेपों पर विचार करने से पहले, गुणवत्ता नियंत्रण का एक अच्छा सौदा पूरा किया जाना चाहिए, जिसमें दूषित, अवांछनीय, संभावित रूप से ट्यूमरजेनिक एचईपीएससी डेरिवेटिव की पहचान और निष्कासन शामिल है। इसके अलावा, विट्रो में बेहतर कार्यात्मक assays और फुफ्फुसीय रोग के बेहतर पशु मॉडल अभी भी विकसित करने की आवश्यकता है।
विशेष रूप से, hiPSC-व्युत्पन्न कोशिकाओं की कार्यक्षमता और सुरक्षा की पुष्टि की जानी चाहिए। अविभाजित कोशिकाओं को बाहर रखने की आवश्यकता है क्योंकि उनके पास टेराटोमास उत्पन्न करने की क्षमता है। निश्चित एंडोडर्म में अविभाजित स्टेम कोशिकाओं को निर्धारित करने का एक तरीका यह है कि कोशिकाओं को प्लुरिबिलिटी मार्कर एसएसईए 4 का उपयोग करके क्रमबद्ध किया जाए। अविभाजित hiPSCs के लिए मार्कर जीन हाल ही में एकल सेल आरएनए sequencing30 का उपयोग करके पता लगाया गया था। ESRG, CNMD, और SFRP2 का उपयोग किसी भी विभेदन चरण में अविभाजित कोशिकाओं को मान्य करने के लिए किया जा सकता है। एक बार शुद्धता की पुष्टि हो जाने के बाद, ऑटोलॉगस आईपीएससी व्युत्पन्न उपचारों का लाभ प्रतिरोपित कोशिकाओं के लिए अस्वीकृति से बचने की क्षमता है क्योंकि वे रोगी की अपनी कोशिकाओं से आते हैं। कमियों में कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग करने, कठोर नैदानिक ग्रेड परीक्षण से गुजरने और कोशिकाओं को तीव्र चोट (श्वसन संकट सिंड्रोम, मायोकार्डियल रोधगलन, या रीढ़ की हड्डी की चोट) वाले रोगी में प्रत्यारोपित करने में लगने वाला समय शामिल है। विकल्प बैंक्ड एलोजेनिक आईपीएससी व्युत्पन्न cells31 का उपयोग करना है। इन्हें मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) मिलान दाताओं वाले रोगियों के लिए संग्रहीत और आसानी से उपलब्ध किया जा सकता है और वे संदूषण के लिए पूरी तरह से परीक्षण से गुजरेंगे। सबसे बड़ी खामी प्रतिरक्षा अस्वीकृति की संभावना है। एलोजेनिक सेल प्रत्यारोपण में इम्यूनोसप्रेशन आवश्यक हो सकता है, जो एलोजेनिक पूरे ऊतक प्रत्यारोपण की वर्तमान वास्तविकता है। एलोजेनिक आईपीएससी व्युत्पन्न कोशिकाओं को रोगियों में सुरक्षित रूप से प्रत्यारोपित करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने की अनुमति देने के लिए रणनीतियां तैयार की जा रही हैं।
आखिरकार, आईपीएससी व्युत्पन्न पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग रोगी-विशिष्ट रोग मॉडल, दर्जी चिकित्सीय का अध्ययन करने और पुनर्योजी चिकित्सा अनुसंधान को बढ़ाने के लिए किया जाएगा।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट फॉर रीजेनरेटिव मेडिसिन (सीआईआरएम) (DISC2-COVID19-12022) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
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