Summary
Artiklen beskriver trin klog rettet differentiering af inducerede pluripotente stamceller til tre-dimensionelle hele lungeorganoider, der indeholder både proksimale og distale epitel lungeceller sammen med mesenchyme.
Abstract
Menneskets lungeudvikling og sygdom har været vanskelig at studere på grund af manglen på biologisk relevante in vitro-modelsystemer . Human induceret pluripotente stamceller (hiPSCs) kan differentieres trinvist i 3D multicellulære lungeorganoider, lavet af både epitel og mesenkymale cellepopulationer. Vi generobrer embryonale udviklingssignaler ved tidsmæssigt at introducere en række vækstfaktorer og små molekyler til effektivt at generere endelige endoderm, forreste foregut endoderm og efterfølgende lunge stamfaderceller. Disse celler er derefter indlejret i vækstfaktor reduceret (GFR)-kælder membran matrix medium, så de spontant kan udvikle sig til 3D lungeorganoider som reaktion på eksterne vækstfaktorer. Hele disse lungeorganoider (WLO) gennemgår tidlige lungeudviklingsfaser, herunder forgrening af morfogenese og modning efter eksponering for dexamethason, cyklisk AMP og isobutylxanthine. WLOs besidder luftvejs epitelceller, der udtrykker markørerNE KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) og MUC5AC (pokal) samt alveolær epitelceller, der udtrykker HOPX (alveolær type I) og SP-C (alveolær type II). Mesenkymale celler er også til stede, herunder glat muskel actin (SMA), og blodplade-afledt vækstfaktor receptor A (PDGFRα). iPSC afledte WLOs kan opretholdes i 3D-kulturforhold i mange måneder og kan sorteres for overflademarkører for at rense en bestemt cellepopulation. iPSC afledte WLOs kan også udnyttes til at studere menneskets lunge udvikling, herunder signalering mellem lunge epitel og mesenchyme, at modellere genetiske mutationer på human lungecellefunktion og udvikling, og at bestemme cytotoksiciteten af infektiøs midler.
Introduction
Lungen er et kompliceret, heterogent, dynamisk organ, der udvikler sig i seks forskellige stadier - embryonale, pseudoglandære, kanalkulære, sakkalære, alveolær, og mikrovaskulær modning1,2. De to sidstnævnte faser forekommer før og postnatalt i menneskets udvikling, mens de første fire faser udelukkende forekommer under fostrets udvikling, medmindre der forekommer for tidlig fødsel3. Den embryonale fase begynder i endodermalt kimlag og afsluttes med den spirende luftrør og lungeknopper. Lungeudvikling sker til dels via signalering mellem epitel og mesenkymale celler4. Disse interaktioner resulterer i lunge forgrening, spredning, cellulær skæbne bestemmelse og cellulære differentiering af den udviklende lunge. Lungen er opdelt i ledende zoner (luftrør til terminalen bronkier) og luftvejeszoner (respiratoriske bronkier til alveoler). Hver zone indeholder entydige epitelcelletyper. herunder basal, sekretorisk, cilieret, børste, neuroendokrine og ionocytceller i de ledende luftveje5, efterfulgt af alveolær type I og II-celler i respiratorisk epitel6. Meget er stadig ukendt om udviklingen og reaktionen på skade af de forskellige celletyper. iPSC afledte lungeorganoid modeller muliggøre undersøgelse af mekanismer, der driver menneskelige lunge udvikling, virkningerne af genetiske mutationer på lungefunktion, og reaktionen af både epitel og mesenchyme til infektiøse stoffer uden behov for primære menneskelige lungevæv.
Markører svarende til de forskellige stadier af embryonal differentiering omfatter CXCR4, cKit, FOXA2, og SOX17 for endelige endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1, og SOX2 for forreste foregut endoderm (AFE)8, og NKX2-1 for tidlige lunge stamfader celler9. I embryonale lunge udvikling, foregut opdeler i dorsale spiserøret og ventral luftrør. Knopperne i højre og venstre lunger fremstår som to uafhængige outpouchings omkring tracheal bud10. Under forgrening morfogenese, mesenchyme omkring epitel producerer elastisk væv, glat muskel, brusk, og vaskulatur11. Samspillet mellem epitel og mesenchyme er afgørende for normal lungeudvikling. Dette omfatter udskillelsen af FGF1012 af mesenchyme og SHH13 produceret af epitelet.
Her beskriver vi en protokol for den målrettede differentiering af hiPSCs i tredimensionelle (3D) hele lungeorganoider (WLO). Mens der er lignende tilgange, der omfatter isolering af lunge stamfader celler via sortering på LPC fase for at gøre alveolær-lignende14,15 (distal) organoider eller luftveje16 (proksimale) organoider, eller generere ventral-anterior foregut spheroids at gøre menneskelige lunge organoider udtrykke alveolær-celle og mesenkymal markører og bud tip stamfader organoider17 , styrken af denne metode er inddragelsen af både lunge epitel og mesenkymal celletyper til mønster og orkestrere lunge forgrening morfogenese, modning, og ekspansion in vitro.
Denne protokol bruger små molekyler og vækstfaktorer til at lede differentiering af pluripotente stamceller gennem endelige endoderm, forreste foregut endoderm, og lunge stamfader celler. Disse celler er derefter induceret i 3D hele lungeorganoider gennem vigtige udviklingsmæssige trin, herunder forgrening og modning. Sammenfatningen af differentieringsprotokollen er vist i figur 1a med repræsentative lysbilleder af endodermal og organoiddifferentiering vist i figur 1b. Figur 1c,d viser genekspression detaljer om endodermal differentiering samt genekspression af både de proksimale og distale populationer af lungeepilele celler efter at have afsluttet differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse protokol blev godkendt af Institutional Review Board af UCSD's Human Research Protections Program (181180).
1. Endelig endoderm induktion fra inducerede pluripotente stamceller (Dag 1 - 3)
- Langsomt optø vækstfaktor reduceret (GFR)-kælder membran (BM) matrix medium på is 30 minutter før brug. I kold DMEM/F12 fortyndes GFR BM matrixmediet 1:1, således at det udgør 50% af dette medium. Placer P1000 pipettespidser i fryseren for at køle af før brug.
- Coat hver brønd af en 12-brønd plade med 500 μL af 50% GFR-kælder membran matrix medium forberedt i iskold DMEM/F12. Når det ønskede antal brønde er belagt, fjernes overskydende medium blanding og/eller bobler fra brønde og pladen placeres på is eller køleskab ved 4 °C i 20 minutter for at indstille. Flyt derefter pladen til inkubatoren ved 37 °C natten over til gel og tør.
- Når hiPSCs når 70-90% sammenløb, tilsættes 10 μM Rho-associerede kinase (ROCK) Inhibitor Y-27632 i timen før dissociation. Aspirere ud af medierne og vask en gang med Fosfat buffered saltvand (PBS). Dissociere hiPSCs ved at tilføje celle løsrivelse medium (0,5 mL / brønd af en 12-brønd plade) og inkubere i 20 min ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
- Pladerne fjernes fra inkubatoren, og der tilsættes 0,5 mL/12 brønd stamcellepas (tabel 1) til brøndene. forsigtigt triturere celler ved hjælp af en P1000 spids for at opnå enkeltcellet suspension. Overfør dissocierede celler til et 15 mL konisk centrifugerør; centrifuge i 5 min ved 300 x g.
- Aspirere af mediet og genbruge cellepillen med 1 mL mTeSR Plus medier suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer (Y-27632). Udfør et celletal. Tilføj 2,0 x 105 hiPSCs i 1 mL mTeSR suppleret med ROCK Inhibitor Y-27632 pr brønd af en 12-brønd GFR-kælder membran medium belagt plade. Inkuberes ved 37 °C natten over.
BEMÆRK: Cellesåningsnummeret skal optimeres pr. cellelinje. 24 timer efter plating skal brønde være 50%-70% sammenløb. - På dag 1 skal du aspirere mTeSR Plus og tilføje Definitive Endoderm (DE) induktionsmedier (tabel 1) suppleret med 100 ng/mL af human aktivitet i A og 5 μM GSK3β-hæmmer/Wnt-aktivator CHIR99021.
BEMÆRK: DE-medier med GSK3β-hæmmer/Wnt-aktivator CHIR99021 skal fjernes inden for 20-24 timer fra dag 1 DE induktion for vellykket differentiering. - På dag 2 og dag 3 suppleres ændring til DE-induktionsmedier med kun 100 ng/mL aktivi A.
BEMÆRK: DE differentiering bør ikke overstige i alt 72 timer, eller effekten vil falde. På dag 4, hvis der observeres store celle die-off, reducere den samlede DE medier eksponeringstid med 6-12 h. - For at analysere DE-effektiviteten skal du bekræfte mere end 90% CXCR4 og/eller cKit-udtryk via flowcytometri eller immunofluorescenceanalyse af FOXA2 og/eller SOX17 (Figur 2a).
2. Forreste foregut endoderm (AFE) induktion (Dag 4 - 6)
- På dag 4 skal du skifte medie til serumfrit basalmedie (SFBM) (tabel 1) suppleret med 10 μM SB431542 og 2 μM Dorsomorphin til AFE-induktion. Skift AFE-medier dagligt i 3 dage (dag 4, dag 5 og dag 6).
- For at analysere AFE-effektivitet skal du bekræfte robust udtryk for SOX2, TBX1 og FOXA2 via immunofluorescence farvning (Figur 2b).
3. Lunge stamfader celle (LPC) differentiering (Dag 7 - 16)
- På dag 7 optøs GFR-kældermembranmatrix medium på is. Aspirere off AFE medier og vaske godt med 1x PBS. Der tilsættes 1 mL celleløsning og inkuberes i 10 min ved 37 °C.
- Der tilsættes 1 mL af quenching medium (2% FBS i DMEM/F12) til brønde indeholdende celleløsning. Hold celler som aggregater ved pipetter op og ned forsigtigt. Sørg for, at alle celler løsnes og overføres til et 15 mL konisk centrifugerør. Centrifuge i 5 min ved 300 x g.
- Supernatanten fjernes, og cell pelleten tages i brug igen i quenchingmedium suppleret med 10 ng/mL af humant rekombinant knoglemorphogenic protein-4 (BMP4), 0,1 μM af all-trans retinoinsyre (RA), 3 μM GSK3β inhibitor/Wnt aktivator CHIR99021 og 10 μM rock inhibitor Y-27632.
- Udfør et celletal. Tilsæt 2,5 x 105 celler til 100 μL kold GFR-kælder membran matrix medium, bland godt, og sted dråbe i en brønd af en 12-brønds plade. Inkuberes pladen ved 37 °C i 30-60 min, så mediet kan polymeriseres. Der tilsættes 1 mL LPC-medier suppleret med 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 pr. brønd, hvilket sikrer, at mediumdråbet er helt nedsænket og inkuberer ved 37 °C natten over.
- På dag 8, 24 timer efter LPC induktion, ændre LPC medium til at fjerne ROCK Inhibitor Y-27632. Skift LPC medium hver anden dag i alt 9-11 dage.
BEMÆRK: Hvis mediet bliver gult inden for 24 timer, skal du skifte medium hver dag. - Hvis du vil analysere LPC-effektiviteten, skal du bekræfte det robuste udtryk for den intracellulære transskriptionsfaktor NKX2-1 eller udføre flowcytometri for overflademarkører CD47hi/CD26low15 eller CPM18 (Figur 2c). Groft, LPC spheroids bør være runde og gennemsigtige (Figur 2c).
BEMÆRK: Fortsæt ikke med lungeorganoiddifferentiering, hvis effektiviteten af NKX2-1 er under 30%.
4.3D lungeorganoid induktion (Dag 16 - 22)
- På dag 17 optø GFR-kældermembran matrix medium på is. Aspirere LPC induktion medium. Tilsæt derefter 2 μg/mL dispase (1 mL) til brønden og genbrug medium / dispase blandingen med en P1000 pipette. Inkuberes ved 37 °C i 15 min. Triturere blandingen igen og inkuberes ved 37 °C i yderligere 15 min.
- Overfør dispase og celler i en 15 mL konisk centrifuge rør. Brug kølet PBS (2-3 mL) til at vaske brønden og genbruge dispase/celleblandingen. Centrifuge i 5 min ved 400 x g. Fjern supernatanten manuelt, idet du skal passe på ikke at desarmeret mellem- og cellepillelaget. Gentag den afkølede PBS vask, og centrifuge den koniske centrifuge rør i yderligere 5 min ved 400 x g.
- Fjern supernatanten manuelt, og tilsæt derefter 2 mL trypsinbaseret dissociationsopløsning til det koniske centrifugerør. Inkuberes ved 37 °C i 12 min.
- Efter inkubation, genbruge celler med en P1000 pipette spids. Derefter tilsættes en lige stor mængde slukkende medier til det koniske centrifugerør og spin ned ved 400 x g i 5 min. Aspirere supernatant og resuspend celler i quenching medium + 10 μM af ROCK Inhibitor Y-27632.
BEMÆRK: Vellykket induktion af lungeorganoider opstår, når celler integreres som aggregater, ikke enkelte celler, justerer pipettering i overensstemmelse hermed. - Udfør et celletal. Beregn den mængde, der er nødvendig for at opnå 5,0-8,0 x 104 celler pr. Brønd. Aliquot LPC celle aggregater i 1,5 mL mikrocentrifuge rør og centrifuge i 5 min ved 400 x g. Fjern overskydende supernatant, pas på ikke at omrøre cellepillen. Lad kun 10 μL resterende medier.
- Re-suspendere celle pellet i 200 μL af kold GFR-kælder membran matrix medium og tilføje til celle kultur membran skær (6,5 mm diameter, 0,4 μm pore, polyester membran). Inkuberes pladen ved 37 °C i 30-60 min, så GFR-kældermembranmatrixmediet kan polymeriseres.
- Der tilsættes 1 mL 3D organoidinduktionsmedium (tabel 1) suppleret med fibroblastvækstfaktor-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), GSK3β-hæmmer/Wnt-aktivator CHIR (3 μM), epidermal vækstfaktor (EGF) (10 ng/mL) og 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 til membranindsatsens basolaterale kammer. Skift medium hver anden dag i 6 dage.
5.3D Lunge organoid forgrening (Dag 23 - 28)
- På dag 23 ændres til 3D-forgreningsmedium (tabel 1) suppleret med FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), GSK3β-hæmmer/Wnt-aktivator CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) / placental vækstfaktor (PlGF) (10 ng/mL). Skift medium hver anden dag i 6 dage.
BEMÆRK: På dag 6 af 3D-forgreningsdifferentiering bør der være flere forgrenede organoider (figur 2).
6.3D lungeorganoid modning (Dag 29 - 34)
- På dag 29 ændres til 3D-modning medium (tabel 1), som er det samme som 3D-forgreningsmedium, men med tilsætning af dexamethason (50 nM), cAMP (100 μM) og og 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), en fosfodiesterasehæmmer også med isobutylxanthin (100 μM). Skift medium hver anden dag i 6 dage.
BEMÆRK: Inden for 24 timer efter 3D-modning skal de forgrenede organoider udvide sig og skifte til gennemsigtige kugler.
7.3D Lungeorganoid immuncytokemi
- For 3D hele lunge organoid analyse, fastsætte GFR-kælder membran matrix medium i membranen indsætter med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time ved 4 °C. Integrer i paraffinvoks, og fastslut på dias pr. standard publicerede protokoller.
- Udfør antigenudtagning før farvning. Luftvejsmarkører omfatter KRT5, MUC5AC og SCGB3A2. Alveolær markører omfatter SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 og HOPX (figur 3).
8. Fjernelse af hele lungeorganoider fra GFR-kældermembranmatrixmedie til passage, FACS eller kryopræservering
- For at adskille organoiderne fra GFR-kældermembranmatrixmediet fjernes mediet, fjern mediet fra basalkammeret og der tilsættes 2 μg/mL dispase (1 mL) i det apikale kammer.
- Triturer forsigtigt medium /dispase blandingen med en P1000 pipette og læg i inkubatoren i 15 min. Terner forsigtigt blandingen igen og inkuberes i yderligere 15 minutter.
- Der tilsættes 1 mL kølet PBS (4 °C) og overfør organoider med matrixmediet til et 15 mL konisk centrifugerør. Drej ved 400 x g i 5 min. Fjern supernatanten forsigtigt, for ikke at forstyrre cellepillen.
- Vask igen med 1 mL kølet PBS og drej ned ved 400 x g i 5 min. Fjern supernatanten forsigtigt, for ikke at forstyrre medium/celleblandingen.
- Tilsæt 1 mL celleløsning til det koniske centrifugerør, forsigtigt triturat, der genanvender GFR-Basement membranematrix mellem- og celleblandingen. Placer i inkubatoren i 12 min for passaging celler som aggregater eller for cryopreservation), eller 20 min for enkelt celle suspension.
- Tilsæt lige stor mængde slukkende medier og drej ned ved 400 x g i 5 min. Resuspend i quenching medium + 10 μM af ROCK Inhibitor Y-27632.
BEMÆRK: På dette trin må der ikke ses noget resterende kældermembranmedie i røret. Hvis der stadig er restmedie tilbage, gentages trin 8.5 og 8.6. - Udfør et celletal. Beregn den mængde, der er nødvendig for downstream-programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
24 timer efter plating, dag 1, bør iPSCs være 50%-90% sammenløb. På dag 2 skal DE være 90%-95% sammenflyttet. Under DE induktion er det almindeligt at observere betydelig celledød på dag 4, men vedhæftede celler bevarer en kompakt brostensbelagt morfologi (Figur 2b). Ophør differentiering, hvis de fleste klæbende celler løsner sig og overvejer at forkorte eksponeringen for DE-medier med aktivin A med 6-12 timer. Under AFE induktion, celledød er minimal, og cellerne forbliver klæbende, men vil fremstå mindre og mere heterogen. Passaging cellerne på dag 7 må kun ske, hvis udbyttet af dobbelt positiv SOX2 og FOXA2 er >80%. Efter at have passeret ind i kælderen membran matrix for 3D LPC induktion, små spheroids vil først vises, derefter vokse og nogle kan begynde at filial. Genekspression profiler for vellykket endodermal differentiering omfatter øget SOX17 på DE, øget FOXA2 og SOX2 med faldende SOX17 og det første udseende af NKX2-1, og øget NKX2-1, sammen med tilstedeværelsen af SOX2 og FOXA2. I overensstemmelse med tidlig embryonal udvikling, ventralization af AFE sker for lunge knop udvikling (NKX2-1 +) og dorsalisering af AFE sker for gastrointestinal udvikling (SOX2 +). Kulturer på LPC vil have en blanding af både lunge-og mave stamfaderer.
Lungeorganoid induktion fra LPC er blevet udført ved hjælp af forskellige metoder. Nogle grupper sorterer cellerne ved hjælp af NKX2-1 fluorescerende journalister eller en overfladeantigen proxy (CPM, CD26lowCD47high). Men disse lungeorganoider indeholder alveolær type II som celler uden alveolær type I celler eller mesenchyme. Andre grupper har indsamlet celle klumper, der knop off AFE / LPC monolayer og indlejret dem i kælderen membran matrix. Disse organoider indeholder en blandet population af lungeepælle- og mesenkymale celler, men tager måneder til kultur19. Vores protokol omfatter både tilstedeværelsen af epitelceller og mesenkymale celler. WLOs udtrykker proksimale epitelcellemarkører p63 og KRT5 (basalceller) og SCGB3A2 (klubceller) samt distale epitelcellemarkører HOPX (ATI) og proSPC, SPB og NKX2-1 (ATII). De udtrykker også mesenchymal markør Vimentin på LPC fase, samt i hele lunge organoider. PDGFRα er en markør for fibroblaster, der har en vigtig funktion i lungen under sacculation og alveolarization20 og er co-udtrykt med transskription faktor vigtigt i distal celledifferentiering, SOX9 (Figur 3).
Vores metode genererer effektivt NKX2-1-udtrykkende LPC 3D-kulturer ved hjælp af signalmolekyler, der forekommer i fostrets lungeudvikling til at danne tidlige lungeorganoider. Når du overfører LPCs i GFR-kælder membran matrix medium for lunge organoid induktion, er det bydende nødvendigt ikke at over-dissociere i en enkelt celle suspension, men i stedet at bevare små klumper af celler (10 celler / klump). Celletælling vil ikke være helt nøjagtig, men stadig nødvendig for at undgå over sammenløb under 3-ugers lungeorganoiddifferentiering.
Lungeorganoid induktion bør give små, forgrenede organoider ved dag 6 af induktion (dag 23 af differentiering). Disse bør fortsætte med at vokse under organoid forgrening trin og modning trin. 24 timer efter indførelsen af dexamethason, cAMP og IBMX skal filialerne udvides til gennemsigtige sfærer. Hele lungeorganoidanalyse kan udføres i slutningen af differentieringen, eller WLOs kan passere ind i frisk kældermembranmatrix med GFR eller kryopreserveret ved at fryse ned i 10% DMSO.
Figur 1: Samlet skematisk for hele lungeorganoid (WLO) differentiering fra hiPSC'er og repræsentative data. a) Skematisk for WLO-differentiering fra hiPSC'er. Cirkler repræsenterer endodermal celletype med identifikationsmærker. Tidslinje for differentiering er angivet i sorte bjælker. Vækstfaktorer og/eller små molekyler til induktion af endodermale og lungeorganoide populationer. Sammenfattende differentieres stamceller til endelige endoderm, forreste foregut endoderm og i lunge stamfader celler i cirka 16 dage. Disse celler er derefter passage i GFR-kælder membran matrix medium, der indeholder medium skær og gennemgå lunge organoid induktion, forgrening, og modning. Den samlede differentiering tager cirka 35 dage. b) Repræsentative fasekontrastbilleder af cellerne i større endodermale stadier og 3D-billeder af hele lungeorganoider. Skaler søjlestørrelsen som angivet i panelet. c) qRT-PCR-analyse af lungeudviklingsmarkører under endoderm og d) hele lungeorganoiddifferentiering af proksimale og distale cellemarkører. Alle data repræsenterer et gennemsnit på 3-5 biologiske replikerer. Fejllinjer repræsenterer standardfejl i middelværdien og normaliseres til at handle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Karakterisering af endodermdifferentiering efter flowcytometri og immunocytokemi. a) Flowcytometri af endelig endodermmarkør CXCR4. Venstre panel viser gating mod den farvede befolkning, mens den midterste panel viser CXCR4 positive befolkning. Det højre panel viser immunocytokemi billede af SOX17 (rød) overlejret med kerner (blå). b) Immunocytokemibillede af AFE-markører FOXA2 og SOX2 overlejret med kerner (blå). (c) Endogen udtryk for NKX2-1-GFP i en reporter celle linje i 3D LPC. Billeder taget fra levende cellekultur i brightfield og GFP. Flowcytometri af lunge stamfader intracellulær markør NKX2-1 efter fiksering og permeabilisering. Skalalinjestørrelse = 50 μM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Karakterisering af 3D hele lungeorganoider efter 3-ugers differentiering ved immuncytokemi. a) Proksimale lungemarkører. Venstre panel viser SOX2 (hvid) og SOX9 (rød) overlejret af kerner (blå). Disse markører er vigtige forgrening morfogenese og repræsenterer de proksimale og distale epitelpopulationer. Midterste paneler viser P63 (rød) og KRT5 (rød), begge markører af basalceller. Det højre panel viser SCGB3A2, en markør for klubceller. b) Distale lungemarkører. Venstre panel skildrer pro-SPC (PSPC), (grøn) og HOPX (rød), markører af alveolær type II ad I celler, henholdsvis overlejret med kerner (blå). Mellempanelet viser pro-SPC (PSPC) (grøn) og SPB (rød), markører af alveolær type II celler, overlejret med kerner (blå). Højre panel viser NKX2-1 (rød) og ZO1 (grøn) overlejret med kerner (blå). c) Markører for lungemesenkyme. Venstre panel viser PDGFRA (rød) og SOX9 (hvid), der repræsenterer distal mesenchyme. Højre panel viser Vimentin (rød), som er spredt i hele lungen. Skalalinjestørrelse = 50 μM. Klik her for at se en større version af dette tal.
| REAGENSER OG LØSNINGER - For firmanavne se tabel over materialer List |
| 3D organoid induktion medium (dag 17-22) |
| Serumfrit basalmedium (se opskrift) suppleret med: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| 3D organoid forgrening medium (dag 23-28) |
| Serumfrit basalmedium (se opskrift) suppleret med: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| All-trans retinoinsyre (0,1 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| VEGF/PIGF (10 ng/mL) |
| 3D organoid modning medium (dag 29-34) |
| Serumfrit basalmedium (se opskrift) suppleret med: |
| Dexamethason (50 nM) |
| BR-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| AFE induktion medium (dag 4-6) |
| Serumfrit basalmedium (se opskrift) suppleret med: |
| SB431542 (10 μM) |
| Dorsomorphin (2 μM) |
| DE induktion medium (dag 1-3) |
| 48,5 mL RPMI1640 + Glutamax |
| 1 mL B27 uden retinsyre |
| 500 μl HEPES (1%) |
| 500 μl pen/strep |
| Menneskelig aktivitet A (100 ng/mL) |
| CHIR99021 (5 μM) - kun inden for de første 24 timer |
| LPC induktion medium (dag 7-16) |
| Serumfrit basalmedium (se opskrift) suppleret med: |
| BMP4 (10 ng/mL) |
| All-trans retinoinsyre (RA) (0,1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Dæmpningsmedium |
| 49 mL DMEM/F12 |
| 1 mL FBS |
| Serumfrit basalmedium (SFBM) |
| 375 mL Iscoves Modificerede Dulbecco's Medium (IMDM) + Glutamax |
| 125 mL Skinke's F12 |
| 5 mL B27 uden retinsyre |
| 2,5 mL N2 |
| 500 μl ascorbinsyre, 50 mg/mL |
| 13 μl monothioglycerol/1 ml IMDM" bruger 300ul af 0,4 mM monothioglycerol pr. 100 ml serumfrie medier |
| 3,75 mL kvæg serum albumin (BSA) Fraktion V, 7,5% opløsning |
| 500 μl pen/strep |
| Stamcellepasaging medium (dag 0) |
| 500 mL DMEM/F12 |
| 129 mL Knockout serum udskiftning (KSR) |
| 6,5 mL Glutamax |
| 6,5 mL NEAA |
| 1,3 mL 2-mercaptoethanol |
| 6,5 mL pen/strep |
Tabel 1: Medietabel.
| Problem | Opløsning |
| DE differentiering ikke effektiv | 24 timer efter plating i stamcellemedium skal cellerne være 50-70% sammenløb |
| GSK3β-hæmmer/Wnt-aktivator CHIR99021 skal fjernes inden for 20-24 timer efter dag 1 DE induktion | |
| DE differentiering bør ikke overstige i alt 72 timer | |
| AFE differentiering ikke effektiv | Sørg for, at DE differentiering var vellykket, og cellerne udtrykke > 80% CXCR4 |
| Sørg for, at der dagligt tilføjes nye vækstfaktorer/små molekyler til medierne | |
| LPC differentiering ikke effektiv | Sørg for, at AFE-differentiering var vellykket, og cellerne udtrykker > 80% FOXA2/SOX2 |
| Sørg for, at AFE-cellerne er passager som aggregater af 4-10 celler og ikke en enkeltcellede | |
| 3D lungeorganoider vokser eller differentierer ikke | Sørg for, at LPC-differentationen lykkedes, og cellerne udtrykker > 30% NKX2-1 |
| Sørg for, at LPCs blev passager som aggregater af 4-10 celler og ikke enkeltcellede | |
| Sørg for, at der ikke er nogen restmåtte fra LPCs under | |
| Tilføj ROCK-hæmmer Y-27632 med hver medieændring | |
| Sørg for, at mediet ændres til tiden, og at der tilsættes nye vækstfaktorer/små molekyler | |
| Sørg for, at koncentrationen af vækstfaktorer/små molekyler er korrekt |
Tabel 2: Fejlfinding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vellykkede differentiering af 3D hele lungeorganoider (WLO) er afhængig af en flertrins, 6-ugers protokol med sans for detaljer, herunder tidspunktet for eksponering for vækstfaktorer og små molekyler, cellulær tæthed efter passaging og kvaliteten af hiPSCs. Du kan finde fejlfinding i tabel 2. hiPSC'er bør være ca. 70%-80% sammenflydende, med mindre end 5% spontan differentiering før dissociation. Denne protokol kræver "mTeSR plus" medium; men almindeligt "mTeSR" medium er også blevet brugt med sammenlignelige resultater og er billigere. Til den ekstracellulære matrix bruger vi GFR kældermembranmatrix medium. Vi sender hiPSCs ved hjælp af ReLesR (se Tabel over materialer) for at reducere differentiering.
Under endoderm differentiering, celler skal visualiseres dagligt før og efter medieændringer. Specificerede vækstfaktorer/små molekyler bør tilsættes frisk dagligt til basismediet for at forhindre for tidlig nedbrydning. Celledød i endelig endoderm (DE) er almindelig, men bør begrænses under forreste foregut endoderm (AFE) og lunge stamfader celle (LPC) induktion. Hvis der er en stor dør ud på den tredje dag i DE (dag 4), reducere den samlede tid på DE med 6-12 h. Nye iPSC cellelinjer kan være nødvendigt at blive optimeret til en vellykket endoderm differentiering. Udfør flowcytometri ved DE for CXCR4 for at bekræfte vellykket induktion (>85% CXCR4 + celler). Cellerne skal være relativt stabile på AFE og vil ændre morfologisk med lidt dø ud.
Adgang til LPC er en anden proces, der skal optimeres til celletype. Hvis celler med for lav densitet (<50 %) replatingsceller med for lav densitet (<50 %), vil det resultere i ineffektiv differentiering. Bekræft vellykket LPC-induktion med immuncytokemi til NKX2-1 eller flowcytometri til CPM18 eller CD26low/CD47high15. Vellykket LPC induktion skal have >40% NKX2-1, ellers organoider vil have større overflod af dorsal AFE. For LPC-induktion skal vækstfaktorer føjes til basismedier med hver medieændring. Hvis mediet bliver gult senere i LPC-induktion, kan du overveje at øge mængden af friske medier eller ændre mediet hver dag. Under 3D hele lungeorganoid induktion, plating nummer og vedligeholdelse af celle klynger er nøglen til en vellykket organoid vækst. GFR-kælder membran matrix medium er svært at håndtere og meget temperaturfølsom, så altid holde det på is. Hvis GFR-kældermembranmatrixen medium geler for tidligt, vil LPC-cellerne ikke integreres i den. Vi anbefaler optøning 1 mL aliquots af GFR-kælder membran matrix medium på is 30 minutter før passaging. Når cellerne/klyngerne er talt og passende aliquots lavet, placere cellepillen på is. Vi foreslår at forberede plader, mærkning og tilsætning af cellekulturmembranindsatser før GFR-kældermembranmatrix medium håndtering.
Brug pipette tips til at tilføje korrekt volumen af flydende GFR-kælder membran matrix medium straks til celle pellet, holde på is. Pipette op og ned hurtigt, men forsigtigt (nuanceret håndtering) for ikke at introducere bobler, og læg derefter røret tilbage på isen. Tilsæt cellen og GFR-kælder membran matrix medium blanding til den apikale del af transwell i forberedte plader. Blandingen skal spredes og belægge hele transwell; vip forsigtigt pladen for at sikre belægning. Efter gelering i inkubatoren i 30-60 min, skal der være synlige celle klynger i GFR-kælder membran matrix medium. Tilsæt passende lungeinduktionsmedier til basalkammeret suppleret med 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 og overvåg organoidvækst hver anden dag.
Fremtidige anvendelser af organoider genereret af denne protokol omfatter undersøgelse af de molekylære veje, der styrer tidlig lunge afstamning engagement og celle skæbne specifikation21,22,23. Samspillet mellem epitel og mesenchyme kan bestemmes ved at udnytte gen knock out modeller24. Organoiderne kunne også dyrkes sammen med endotelceller for at bestemme betydningen af vævsspecifikt co-mønster signalering mellem lungeepilet, mesenchyme og endotel25. Lungeudvikling sker parallelt med vaskulær udvikling, og dette forhold kan fremkalde vigtige molekylære mekanismer, der er nødvendige for korrekt lungeudvikling. Vi har også vist, at hele disse lungeorganoider er funktionelle gennem overfladeaktive sekretion assays efter GFR-kælder membran matrix medium blev fjernet efterfulgt af kortsigtet kultur i ultra-lav vedhæftet fil brønde26. Andre strategier omfatter sortering af cellerne til celleoverflademarkører såsom NGFR (basalceller)27 og HTII-280 (ATII-celler)28 og udskiftning af dem som homogene organoider eller en monolag i luftvæske interfasekulturforhold. Hele, proksimale og distale lungeorganoider er også blevet brugt til at studere de cellulære mål og patofysiologi af SARS-CoV-2 virusinfektion for bedre at forstå og screene for lægemidler, der kan bekæmpe COVID-19.
Denne protokol er robust og reproducerbar, men der er stadig mange udfordringer. Mange forskellige iPSC- og ESC-linjer er blevet testet (>20 linjer), men protokollen skal optimeres for hver cellelinje. På trods af robust DE og AFE induktion, LPC induktion kan være vanskeligt at opnå >40% af NKX2-1 + celler. Andre protokoller omfatter en sortering skridt for overflade markører af NKX2-1 celler15,18, men dem, der kun giver alveolær type II som organoider uden mesenchyme og stadig indeholder gastriske og levercellepopulationer trods rensning af lunge stamfader befolkning29. Vi har også bemærket en lille mængde mave- og leverceller i både LPC og hele lungeorganoider, muligvis på grund af tilstedeværelsen af dorsale forreste foregutceller, der forurener LPC'erne. Derfor er differentiering af rene lungeorganoider endnu ikke opnået, og mere forskning i udviklingen af lunge stamfadercellerne i humant væv skal færdiggøres. Downstream-analyser skal være kraftigt benchmarket med gen- og proteinekspression fra primær humant lungevæv. Mens den mest frugtbare brug af lungeorganoider til dato har været i modelleringssygdomme og screening for lægemidler in vitro, er transplantationen af hiPSC-afledte lungeorganoider til patienter til regenerativ medicin blevet overvejet som en fremtidig behandling for en række betingelser. Men, forud for behandlingen af sådanne interventioner, en hel del af kvalitetskontrol skal perfektioneres, herunder identifikation og fjernelse af forurenende, uønskede, potentielt tumorigenic hiPSC derivater. Desuden er der stadig behov for bedre funktionelle analyser in vitro og bedre dyremodeller af lungesygdom.
Specifikt skal funktionaliteten og sikkerheden af hiPSC-afledte celler bekræftes. Udifferentierede celler skal udelukkes, da de har kapacitet til at generere teratomer. En metode til at bestemme udifferentierede stamceller i endelige endoderm er at sortere cellerne ud ved hjælp af pluripotency markør SSEA4. Marker gener for udifferentierede hiPSCs blev for nylig opdaget ved hjælp af enkelt celle RNA sekventering30. ESRG, CNMD og SFRP2 kan bruges til at validere udifferentierede celler ved ethvert differentieringstrin. Når renhed er bekræftet, fordelen ved autologe iPSC afledte behandlinger er evnen for de transplanterede celler til at undgå afvisning, da de kommer fra patientens egne celler. Ulemperne omfatter den tid, det tager at differentiere cellerne fuldt ud, gennemgå strenge kliniske grade test, og transplantere cellerne i en patient med en akut skade (respiratorisk nød syndrom, myokardieinfarkt, eller spinal skade). Alternativet er at udnytte bankede allogene iPSC afledte celler31. Disse kan opbevares og let tilgængelige for patienter med human leukocyt antigen (HLA) matchede donorer, og de vil have gennemgået grundig test for forurening. Den største ulempe er muligheden for immunafstødning. Immunsuppression kan være nødvendig i allogen celletransplantation, som er den nuværende virkelighed af allogen hele vævstransplantationer. Strategier er ved at blive udtænkt for at gøre det muligt for de allogene iPSC afledte celler at unddrage sig immunresponset til sikkert at transplantere dem til patienter32.
Til sidst, iPSC afledt hele lunge organoider vil blive udnyttet til at studere patient-specifikke sygdom modeller, skræddersy therapeutics, og forbedre regenerativ medicinsk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A.
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X.
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C.
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
