Summary
המאמר מתאר הבחנה מכוונת צעד של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים לאורגנואידים תלת ממדיים שלמים של ריאות המכילים תאי ריאה אפיתל פרוקסימליים ודיסטליים יחד עם מזנכיים.
Abstract
התפתחות ריאות אנושיות ומחלות כבר קשה ללמוד בשל היעדר רלוונטי ביולוגית במערכות מודל במבחנה . תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSCs) ניתן להבדיל צעד לתוך organoids ריאות רב תאיים 3D, עשוי הן אוכלוסיות אפיתל ותאים mesenchymal. אנו מסכמים רמזים התפתחותיים עובריים על ידי החדרה זמנית של מגוון גורמי גדילה ומולקולות קטנות כדי ליצור ביעילות אנדודרם סופי, אנדודרם חותם מראש, ולאחר מכן תאי אב ריאה. תאים אלה מוטמעים לאחר מכן בגורם גדילה מופחת (GFR)-מרתף מטריצת ממברנה מדיום, המאפשר להם להתפתח באופן ספונטני לתוך organoids ריאות 3D בתגובה לגורמי גדילה חיצוניים. אלה אורגנוידים ריאות שלם (WLO) לעבור שלבים התפתחותיים ריאות מוקדם כולל מורפוגנזה המסתעפת והתבגרות לאחר חשיפה דקסמתזון, AMP מחזורי ואיזובוטילקסנתין. WLOs מחזיקים בתאי אפיתל דרכי הנשימה המבטאים את הסמנים KRT5 (בזאל), SCGB3A2 (מועדון) ו- MUC5AC (גביע) כמו גם תאי אפיתל מכתשיים המבטאים HOPX (סוג מכתשי I) ו- SP-C (סוג מכתשי II). תאים mesenchymal נוכחים גם, כולל אקטין שריר חלק (SMA), קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם A (PDGFRα). ניתן לשמור על WLOs נגזר iPSC בתנאי תרבות תלת-ממדית במשך חודשים רבים וניתן למיין עבור סמני שטח כדי לטהר אוכלוסיית תאים ספציפית. ניתן להשתמש ב-WLOs שמקורם ב-iPSC גם כדי לחקור את התפתחות הריאות האנושיות, כולל איתות בין אפיתל הריאות למזנשים, כדי לדגמן מוטציות גנטיות על תפקוד והתפתחות תאי הריאה האנושיים, ולקבוע את הציטוקסיות של חומרים מדביקים.
Introduction
הריאה היא איבר מסובך, הטרוגני ודינמי המתפתח בשישה שלבים נפרדים - התבגרות עוברית, פסאודו-לנדולרית, תעלה, סקוקולרית, מכתשית ומיקרו-וסקולרית1,2. שני השלבים האחרונים מתרחשים לפני ולאחר הלידה בהתפתחות האנושית בעוד ארבעת השלבים הראשונים מתרחשים אך ורק במהלך התפתחות העובר אלא אם כן מתרחשת לידה מוקדמת3. השלב העוברי מתחיל בשכבת הנבט האנדיודרמלי ומסתיים עם ניצני קנה הנשימה וניצני הריאות. התפתחות הריאות מתרחשת בחלקה באמצעות איתות בין התאים האפיתל והמנשימלי4. אינטראקציות אלה גורמות להסתעפות ריאות, התפשטות, קביעת גורל תאי ובידול תאי של הריאה המתפתחת. הריאה מחולקת לאזורי ניצוח (קנה הנשימה לספונכיולים סופניים) ולאזורי נשימה (ברונכיולים נשימתיים אל הנפתים). כל אזור מכיל סוגי תאי אפיתל ייחודיים; כולל תאי בסיס, הפרשה, סילציה, מברשת, נוירואנדוקרינית, ויונוציטים בדרכי הנשימה מוליך5, ואחריו תאי I ו- II מכתשיים באפיתל הנשימה6. הרבה עדיין לא ידוע על ההתפתחות והתגובה לפגיעה של סוגי התאים השונים. מודלים אורגנויד ריאות נגזר iPSC לאפשר מחקר של מנגנונים המניעים את התפתחות הריאות האנושיות, את ההשפעות של מוטציות גנטיות על תפקוד הריאות, ואת התגובה של האפיתל ואת mesenchyme לסוכנים זיהומיים ללא צורך ברקמת ריאה אנושית ראשונית.
סמנים המתאימים לשלבים השונים של בידול עוברי כוללים CXCR4, cKit, FOXA2 ו- SOX17 עבור אנדודרם סופי (DE)7, FOXA2, TBX1 ו- SOX2 עבור אנדודרם נוקב מראש (AFE)8, ו- NKX2-1 עבור תאי אב ריאה מוקדמים9. בהתפתחות הריאות העובריות, הניטור מתחלק לוושט הגחון ולקמה הגחוני. ניצני הריאות הימניות והשמאליות מופיעים כשתי ריאות עצמאיות סביב ניצן קנה הנשימה10. במהלך הסתעפות מורפוגנזה, mesenchyme המקיף את האפיתל מייצר רקמה אלסטית, שריר חלק, סחוס, vasculature11. האינטראקציה בין האפיתל למנשים חיונית להתפתחות תקינה של הריאות. זה כולל את הפרשת FGF1012 על ידי mesenchyme ו SHH13 המיוצר על ידי האפיתל.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידול מכוון של hiPSCs לאורגנואידים תלת ממדיים (3D) ריאות שלמות (WLO). אמנם ישנן גישות דומות המשלבות בידוד של תאי אב ריאה באמצעות מיון בשלב LPC כדי להפוך אורגנוידים דמויי כתשית 14,15 (דיסטליים) או אורגנוידים (פרוקסימליים), או ליצור פרונואידים foregut גחוני-קדמוני כדי להפוך אורגנוידים ריאות אנושיים מבטאים תאי מצוחקים וסמנים mesenchymal ו organoids אב ניצן קצה17 כוחה של שיטה זו הוא הכללת סוגי תאי אפיתל ריאות ומזנכימליים לתבנית ולתזמר מורפוגנזה מסועפת ריאות, התבגרות והתרחבות במבחנה.,
פרוטוקול זה משתמש במולקולות קטנות וגורמי גדילה כדי לכוון את ההבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות אנדודרם מוחלט, אנדודרם חיצוני, ותאי צאצא ריאות. תאים אלה מושרים לאחר מכן לתוך אורגנוידים ריאות שלמות 3D באמצעות צעדים התפתחותיים חשובים, כולל הסתעפות והתבגרות. סיכום פרוטוקול הבידול מוצג באיור 1a עם תמונות ייצוגיות של בידול אנדודרמלי ואורגנויד המוצג באיור 1b. איור 1c,d להראות את פרטי ביטוי הגן של בידול אנדודרמלי, כמו גם את ביטוי הגן של אוכלוסיות פרוקסימליות ודיסטליות של תאי אפיתל ריאות לאחר השלמת ההבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול מחקר זה אושר על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של תוכנית הגנות המחקר האנושי של UCSD (181180).
1. אינדוקציה אנדודרמית מוחלטת מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (יום 1 - 3)
- לאט לאט להפשיר גורם גדילה מופחת (GFR)-מרתף ממברנה (BM) מטריצה בינונית על קרח 30 דקות לפני השימוש. ב DMEM / F12 קר, תערובת, לדלל את מטריצת GFR BM בינוני 1:1, כך שהוא מהווה 50% של מדיום זה. מכניסים טיפים לפיפטה P1000 למקפיא לצינון לפני השימוש.
- יש לכסות כל באר של צלחת 12 בארות עם 500 μL של מטריצת ממברנה 50% GFR-מרתף מוכן DMEM / F12 קר כקרח. לאחר מספר הבארות הרצוי מצופים, להסיר כל תערובת בינונית עודף ו / או בועות מבארות ומניחים את הצלחת על קרח או מקרר ב 4 °C (75 °F) במשך 20 דקות להגדיר. לאחר מכן, להעביר את הצלחת לאינקובטור ב 37 °C (50 °F) לילה כדי ג'ל ויבש.
- ברגע hiPSCs להגיע 70-90% השפעה, להוסיף 10 מיקרומטר של מעכב קינאז הקשורים Rho (ROCK) מעכב Y-27632 שעה לפני הניתוק. שאפו את התקשורת ולשטוף פעם אחת עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). נתק hiPSCs על ידי הוספת בינוני ניתוק תאים (0.5 מ"ל / באר של צלחת 12 טוב) ודגרה במשך 20 דקות ב 37 °C בחממה CO2 5%.
- הסר צלחות מן החממה ולהוסיף 0.5 מ"ל / 12-באר של תאי גזע עובר בינוני (טבלה 1) לבארות; תצמצם בעדינות תאים באמצעות קצה P1000 כדי להשיג השעיה של תא בודד. העבר תאים מנותקים לתוך צינור צנטריפוגה חרוט 15 מ"ל; צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם.
- לשאוף את המדיום resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של mTeSR פלוס מדיה בתוספת עם 10 מעכב רוק מיקרומטר (Y-27632). בצע ספירת תאים. הוסף 2.0 x 105 hiPSCs ב 1 מ"ל של mTeSR בתוספת מעכב ROCK Y-27632 לבאר של 12-באר GFR-מרתף קרום בינוני מצופה צלחת. דגירה ב 37 °C (50 °F) לילה.
הערה: יש למטב את מספר זריעת התא לכל שורת תא. 24 שעות לאחר ה ציפוי, בארות צריך להיות 50%-70% מפגש. - ביום 1, שאפו את mTeSR פלוס ולהוסיף סופי אנדודרם (DE) אינדוקציה מדיה (טבלה 1) בתוספת 100 ננוגרם / מ"ל של activin אנושי A ו 5 מיקרומטר של מעכב GSK3β / מפעיל Wnt CHIR99021.
הערה: DE מדיה עם מעכב GSK3β / מפעיל Wnt CHIR99021 יש להסיר בתוך 20-24 שעות של יום 1 דה אינדוקציה לבידול מוצלח. - ביום 2 ויום 3, שינוי למדיית אינדוקציה DE בתוספת 100 ננוגרם / מ"ל של activin A בלבד.
הערה: דיפרנציה של DE לא תעלה על סך של 72 שעות, או שהיעילות תרד. ביום 4, אם צופים תמותה של תאים גדולים, צמצם את זמן החשיפה הכולל למדיה של DE ב-6-12 שעות. - כדי לנתח את יעילות DE, אשר יותר מ- 90% CXCR4 ו/או ביטוי cKit באמצעות ציטומטריית זרימה או ניתוח אימונופלואורסצנטיות של FOXA2 ו/או SOX17 (איור 2a).
2. אינדוקציה של אנדודרם חיצוני (AFE) (יום 4 – 6)
- ביום 4, לשנות מדיה כדי סרום בינוני בזאלי חינם (SFBM) (טבלה 1) בתוספת 10 μM SB431542 ו 2 μM דורסומורפין עבור אינדוקציה AFE. שנה את מדיה של AFE מדי יום למשך 3 ימים (יום 4, יום 5 ויום 6).
- כדי לנתח את יעילות AFE, אשר ביטוי חזק של SOX2, TBX1 ו-FOXA2 באמצעות כתמי אימונופלואורסצנטיות (איור 2b).
3. בידול תא אבות ריאות (LPC) (יום 7 - 16)
- ביום 7, להפשיר GFR-מרתף מטריצת ממברנה מדיום על קרח. שאפו את מדיה AFE לשטוף היטב עם PBS 1x. הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק התא ודגרה במשך 10 דקות ב 37 °C (7 °F).
- הוסף 1 מ"ל של בינוני מרווה (2% FBS ב- DMEM/F12) לבארות המכילות פתרון ניתוק תאים. שמור על התאים כצברגים על-ידי צנרת למעלה ולמטה בעדינות. ודא שכל התאים מפורקים ומועברים לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם.
- הסר את supernatant ו resuspend גלולה התא במדיום מרווה בתוספת 10 ng/mL של חלבון מורפוגני עצם רקומביננטי אנושי-4 (BMP4), 0.1 מיקרומטר של חומצה ראטינואית כל טרנס (RA), 3 מיקרומטר של מעכב GSK3β מעכב / Wnt activator CHIR99021, ו 10 מיקרומטר של מעכב סלע Y-27632.
- בצע ספירת תאים. הוסיפו 2.5 x 105 תאים ל-100 מיקרו-ל' של מטריצת ממברנה קרה במרתף GFR, ערבבו היטב והכניסו טיפה לבאר של צלחת של 12 בארות. לדגור על הצלחת ב 37 °C (30°F) במשך 30-60 דקות כדי לאפשר בינוני כדי פולימר. הוסף 1 מ"ל של מדיה LPC בתוספת 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632 לכל טוב להבטיח את הירידה הבינונית הוא שקוע לחלוטין דגירה ב 37 °C (50 °F) לילה.
- ביום 8, 24 שעות לאחר אינדוקציה LPC, לשנות LPC בינוני כדי להסיר מעכב רוק Y-27632. שנה את מדיום LPC כל יומיים במשך סך של 9-11 ימים.
הערה: אם המדיום הופך לצהוב בתוך 24 שעות, החלף מדיום מדי יום. - כדי לנתח את יעילות LPC, אשר ביטוי חזק של גורם התמלול התאי NKX2-1 או בצע ציטומטריית זרימה עבור סמני שטח CD47hi / CD26low15 או CPM18 (איור 2c). באופן גס, כדורי LPC צריכים להיות עגולים ושקופים (איור 2c).
הערה: אין להמשיך עם בידול organoid ריאות אם היעילות של NKX2-1 הוא מתחת 30%.
4.3D אינדוקציה אורנואיד ריאות (יום 16 - 22)
- ביום ה-17, מפשירים מטריצת ממברנה במרתף GFR על קרח. שאפו את מדיום האינדוקציה LPC. לאחר מכן להוסיף 2 מיקרוגרם / מ"ל של dispase (1 מ"ל) לבאר resuspend תערובת בינונית / dispase עם פיפטה P1000. דגירה ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות. טריטוריאטים שוב את התערובת ודגרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות נוספות.
- מעבירים את הדיספאז והתאים לצינור צנטריפוגה חרוט של 15 מ"ל. השתמש PBS צונן (2-3 מ"ל) כדי לשטוף את הבאר resuspend תערובת dispase / תא. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם. הסר באופן ידני את supernatant, נזהר לא לדחס את שכבת גלולה בינונית / תא. חזור על שטיפת PBS צוננת, וצנטריפוגה צינור צנטריפוגה חרוטית עוד 5 דקות ב 400 x גרם.
- הסר באופן ידני את supernatant, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של פתרון דיסוציאציה מבוסס טריפסין לצינור צנטריפוגה חרוט. דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 12 דקות.
- לאחר הדגירה, resuspend תאים עם קצה פיפטה P1000. לאחר מכן להוסיף נפח שווה של מדיה מרווה לצינור צנטריפוגה חרוט ולסובב למטה ב 400 x g במשך 5 דקות. שאפו את תאי supernatant ו resuspend במדיום מרווה + 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632.
הערה: אינדוקציה אורגנויד ריאות מוצלחת מתרחשת כאשר תאים מוטבעים כצברגים, לא תאים בודדים, להתאים pipetting בהתאם. - בצע ספירת תאים. חשב את אמצעי האחסון הדרוש כדי להשיג 5.0-8.0 x 104 תאים לבאר. Aliquot תא LPC מצטבר לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x g. הסר עודף supernatant, נזהר לא להתסיס את גלולה התא. השאירו רק 10 μL של מדיה שיורית.
- להשעות מחדש את גלולה התא ב 200 μL של מטריצת ממברנה GFR-מרתף קר ולהוסיף מוסיף קרום תרבית התא (קוטר 6.5 מ"מ, 0.4 מיקרומטר נקבובית, קרום פוליאסטר). לדגור על הצלחת ב 37 °C (30-60 דקות) כדי לאפשר מטריצת ממברנה GFR-מרתף בינוני כדי פולימר.
- הוסף 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה אורגנויד 3D (טבלה 1) בתוספת גורם גדילה פיברובלסט-7 (FGF7) (10 ננוגרם / מ"ל), FGF10 (10 ng/ mL), מעכב GSK3β / Wnt activator CHIR (3 מיקרומטר), גורם גדילה אפידרמלי (EGF) (10 ננוגרם / מ"ל), ו 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632 לתא basolateral של תוספת הממברנה. לשנות את המדיום כל יומיים במשך 6 ימים.
5.3D הסתעפות אורנואיד ריאות (יום 23 - 28)
- ביום 23 שינוי בינוני הסתעפות 3D (טבלה 1) בתוספת FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), מעכב GSK3β / מפעיל Wnt CHIR99021 (3 מיקרומטר), RA (0.1 μM), EGF (10 ננוגרם / מ"ל), ומקדם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) / גורם גדילה שלייתי (PlGF) (10 ננוגרם / מ"ל). לשנות את המדיום כל יומיים במשך 6 ימים.
הערה: ביום 6 של בידול הסתעפות תלת-ממדית, אמורים להיות מספר אורגניואידים מסועפים (איור 2).
6.3D התבגרות אורגנויד ריאות (יום 29 - 34)
- ביום 29, לשנות למדיום התבגרות 3D (טבלה 1), אשר זהה 3D הסתעפות בינוני אבל עם תוספת של dexamethasone (50 ננומטר), cAMP (100 מיקרומטר) ו 3-איזובוטיל-1-מתילקסנתין (IBMX), מעכב פוספודיסטראז המכונה גם איזובוטילקסנתין (100 מיקרומטר). לשנות את המדיום כל יומיים במשך 6 ימים.
הערה: בתוך 24 שעות לאחר ההתבגרות 3D, organoids המסתעף צריך להרחיב ולשנות לספירות שקופות.
7.3D אימונוציטוכימיה של אורגנואיד ריאות
- לניתוח אורגנויד ריאות שלם תלת-ממדי, תקן מטריצת ממברנה במרתף GFR בתוספת הממברנה עם 4% paraformaldehyde (PFA) עבור 1 שעות ב 4 °C (7 °F). הטמע בשעווה פרפין והרכב על שקופיות לפי פרוטוקולים סטנדרטיים שפורסמו.
- בצע אחזור אנטיגן לפני הכתם. סמני דרכי הנשימה כוללים KRT5, MUC5AC ו- SCGB3A2. סמנים משועים כוללים SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 ו-HOPX (איור 3).
8. הסרת אורגנוידים שלמים של ריאות ממטריצת ממברנה במרתף GFR למדיום למעבר, FACS או cryopreservation
- כדי לנתק את האורגנוידים ממדיום מטריצת הממברנה במרתף GFR, הסר מדיה מתא הבזל והוסף 2 מיקרוגרם /מ"ל של dispase (1 מ"ל) בתא האפיטל.
- טריטוריאטים בעדינות את התערובת הבינונית/דיספאזה עם פיפטה P1000 ומניחים באינקובטור למשך 15 דקות. טריטוריה בעדינות את התערובת שוב ודגרה במשך 15 דקות נוספות.
- הוסיפו 1 מ"ל של PBS צונן (4 °C) והעבירו אורגנוידים עם המדיום של המטריצה לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. ספין ב 400 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant בזהירות, לא להפריע גלולה התא.
- לשטוף שוב עם 1 מ"ל מצונן PBS ולסובב למטה ב 400 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant בזהירות, לא להפריע תערובת בינוני / תא.
- הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לצינור הצנטריפוגה החרוט, תמזגו בעדינות את מטריצת הממברנה GFR-Basement בתערובת בינונית/תאים. מניחים באינקובטור למשך 12 דקות עבור העברת תאים כצבירים או עבור שימור קריופאורציה), או 20 דקות עבור השעיית תא בודד.
- הוסף נפח שווה של מדיה מרווה וסיבוב כלפי מטה ב- 400 x g למשך 5 דקות. Resuspend בינוני מרווה + 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632.
הערה: בשלב זה, אין מדיום קרום מרתף שיורית צריך להיראות בצינור. אם נשאר מדיום שיורית, חזור על שלבים 8.5 ו- 8.6. - בצע ספירת תאים. חשב את אמצעי האחסון הדרוש עבור יישומים במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
24 שעות לאחר ה ציפוי, יום 1, iPSCs צריך להיות 50%-90% מפגש. ביום 2, DE צריך להיות 90%-95% confluent. במהלך אינדוקציה של DE, מקובל לצפות במוות תאים משמעותי ביום 4, אך תאים מחוברים ישמרו על מורפולוגיה קומפקטית מרוצפת אבן (איור 2b). הפסק את הבידול אם רוב התאים החסידים מתנתקים ושוקל לקצר את החשיפה למדיית DE באמצעות activin A ב-6-12 שעות. במהלך אינדוקציה AFE, מוות תאים הוא מינימלי, ותאים להישאר דבקים, אבל ייראה קטן יותר והטרוגני יותר. העברת התאים ביום 7 חייבת להיעשות רק אם התשואה של SOX2 חיובי כפול ו FOXA2 היא >80%. לאחר העברת מטריצת ממברנה במרתף עבור אינדוקציה LPC 3D, כדוריות קטנות יופיעו תחילה, לאחר מכן לגדול וכמה עשוי להתחיל להסתעף. פרופילי ביטוי גנים לבידול אנדודרמלי מוצלח כוללים SOX17 מוגבר ב- DE, FOXA2 מוגבר ו- SOX2 עם ירידה ב- SOX17 והופעה ראשונה של NKX2-1, ו- NKX2-1 מוגבר, יחד עם נוכחות של SOX2 ו- FOXA2. בהתאם להתפתחות העוברית המוקדמת, הגחון של AFE מתרחשת להתפתחות ניצני ריאות (NKX2-1+) וגב של AFE מתרחש להתפתחות מערכת העיכול (SOX2+). תרבויות ב LPC יהיה שילוב של אבות ריאות וקיבה.
אינדוקציה אורגנויד ריאות מ LPC בוצעה בשיטות שונות. קבוצות מסוימות ממיין את התאים באמצעות כתבים פלואורסצנטיים NKX2-1 או פרוקסי אנטיגן פני השטח (עלות לאלף חשיפות, CD26lowCD47high). אבל האורגנוידים של הריאות האלה מכילים סוג תכתשי II כמו תאים ללא תאים מסוג תכתשי I או מזנשים. קבוצות אחרות אספו גושי תאים שניצנו מהמונו-שכבתית AFE/LPC והטביעו אותם במטריצת ממברנה במרתף. אורגנוידים אלה מכילים אוכלוסייה מעורבת של אפיתל ריאות ותאים mesenchymal אבל לקחת חודשים לתרבות19. הפרוטוקול שלנו כולל הן את נוכחותם של תאים אפיתלים ומזנכימליים. ה- WLOs מבטאים סמני תאי אפיתל פרוקסימליים p63 ו- KRT5 (תאי בזאלי) ו- SCGB3A2 (תאי מועדון) כמו גם סמני תאי אפיתל דיסטליים HOPX (ATI) ו- proSPC, SPB ו- NKX2-1 (ATII). הם גם מבטאים את הסמן המזנכימלי Vimentin בשלב LPC, כמו גם את האורגנוידים ריאות כולו. PDGFRα הוא סמן לפיברובלסטים בעלי תפקיד חשוב בריאה במהלך ההשבחה וההשמדה20, והוא בא לידי ביטוי בשיתוף עם גורם התמלול החשוב בהבחנה בין תאים דיסטליים, SOX9 (איור 3).
השיטה שלנו מייצרת ביעילות תרביות LPC תלת-ממדיות המבטאות NKX2-1 באמצעות מולקולות איתות המתרחשות בהתפתחות הריאות העובריות כדי ליצור אורגנוידים מוקדמים של הריאות. בעת העברת LPCs לתוך GFR-מרתף מטריצת ממברנה מדיום עבור אינדוקציה organoid ריאות, זה הכרחי לא יתר על המידה להתנתק לתוך השעיה תא אחד, אלא במקום לשמור על גושים קטנים של תאים (10 תאים / גוש). ספירת תאים לא תהיה מדויקת לחלוטין, אבל עדיין יש צורך להימנע ממפגש יתר במהלך בידול אורגנויד ריאות 3 שבועות.
אינדוקציה אורנואידית ריאות צריך להניב אורגנוידים קטנים, הסתעפות ביום 6 של אינדוקציה (יום 23 של בידול). אלה צריכים להמשיך לגדול במהלך שלב הסתעפות האורגנויד וצעד ההבשלה. עשרים וארבע שעות לאחר כניסתם של דקסמתזון, המחנה ו- IBMX, הענפים צריכים להתרחב לספירות שקופות. ניתוח אורגנויד ריאות שלם יכול להתבצע בסוף הבידול, או WLOs יכול להיות מעבר לתוך מטריצת קרום מרתף טרי עם GFR או cryop שמורות על ידי הקפאה למטה ב 10% DMSO.
איור 1: סכמטי כולל של בידול אורגניואיד ריאות שלם (WLO) מהי-מחשבים אישיים ונתונים מייצגים. (א) סכמטי של בידול WLO מ- hiPSCs. עיגולים מייצגים סוג תא אנדודרמלי עם סמנים מזהים. ציר הזמן של ההבחנה מצוין בפסי שחורים. גורמי גדילה ו/או מולקולות קטנות עבור אינדוקציה של אוכלוסיות אורגניואיד אנדודרמליות וריאות. לסיכום, תאי גזע נבדלים אנדודרם מוחלט, endoderm מראש ולתאים אבות ריאות בכ 16 ימים. תאים אלה עוברים לאחר מכן למדיום מטריצת הממברנה במרתף GFR המכיל תוספות בינוניות ועוברים אינדוקציה, הסתעפות והבשלה של אורגנויד ריאות. ההבחנה הכוללת אורכת כ-35 יום. (ב) תמונות ניגודיות שלב מייצגות של התאים בשלבים אנדודרמליים עיקריים ותמונות תלת-ממדיות של אורגנוידים של ריאות שלמות. גודל סרגל קנה המידה כפי שצוין בחלונית. (ג) ניתוח qRT-PCR של סמני התפתחות ריאות במהלך אנדודרם ו -(ד) הבחנה אורגנויד ריאות שלם של סמני תאים פרוקסימליים ודיסטליים. כל הנתונים מייצגים ממוצע של 3-5 שכפולים ביולוגיים. קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע והם מנורמלים לפעול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אפיון של בידול אנדודרם על ידי ציטומטריית זרימה ואימונוציטוכימיה. (א) ציטומטריית זרימה של סמן אנדודרם סופי CXCR4. החלונית השמאלית מציגה את הג'יטינג נגד האוכלוסייה הלא נגועה בעוד החלונית האמצעית מציגה את האוכלוסייה החיובית CXCR4. החלונית הימנית מציגה תמונת אימונוציטוכימיה של SOX17 (אדום) מצופה גרעינים (כחול). (ב) תמונת אימונוציטוכימיה של סמני AFE FOXA2 ו- SOX2 עם גרעינים (כחול). (ג) ביטוי אנדוגני של NKX2-1-GFP בשורת תא כתב ב- LPC תלת-ממדי. תמונות שצולמו מתרבות תאים חיים בברייטפילד וב-GFP. ציטומטריית זרימה של סמן תאי ריאה NKX2-1 לאחר קיבעון ו permeabilization. גודל סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אפיון של אורגנוידים של ריאות שלמים תלת-ממדיים לאחר בידול של 3 שבועות על ידי אימונוציטוכימיה. (א) סמני ריאות פרוקסימליים. החלונית השמאלית מציגה SOX2 (לבן) ו- SOX9 (אדום) עם גרעין (כחול). סמנים אלה חשובים בהסתעפות מורפוגנזה ומייצגים את האוכלוסיות האפיתל הפרוקסימליות והדיסטליות. לוחות אמצעיים מראים P63 (אדום) ו KRT5 (אדום), שני סמנים של תאי בזאלי. החלונית הימנית מציגה SCGB3A2, סמן של תאי מועדון. (ב) סמני ריאות דיסטליים. החלונית השמאלית מתארת פרו-SPC (PSPC), (ירוק) ו-HOPX (אדום), סמנים של תאי מודעה I מכתשיים מסוג II, בהתאמה, מצופים בגרעינים (כחול). החלונית האמצעית מציגה פרו-SPC (PSPC) (ירוק) ו- SPB (אדום), סמנים של תאי מכתם מסוג II, מצופים גרעין (כחול). החלונית הימנית מציגה NKX2-1 (אדום) ו- ZO1 (ירוק) מצופה גרעינים (כחול). (ג) סמנים של מזנשים ריאות. החלונית השמאלית מציגה PDGFRA (אדום) ו- SOX9 (לבן), המייצגים מזנשים דיסטליים. החלונית הימנית מציגה וימנטין (אדום), אשר מפוזר בכל רחבי הריאה. גודל סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ריאגנטים ופתרונות - לשמות חברות עיין ברשימת רשימת החומרים |
| בינוני אינדוקציה אורגנויד תלת-ממדי (יום 17-22) |
| מדיום בזאלי ללא סרום (ראו מתכון) בתוספת: |
| FGF7 (10 ננוגרם/מ"ל) |
| FGF10 (10 ננוגרם/מ"ל) |
| CHIR99021 (3 מיקרומטר) |
| EGF (10 ננוגרם/מ"ל) |
| מדיום הסתעפות אורגנויד תלת מימדי (יום 23-28) |
| מדיום בזאלי ללא סרום (ראו מתכון) בתוספת: |
| FGF7 (10 ננוגרם/מ"ל) |
| FGF10 (10 ננוגרם/מ"ל) |
| CHIR99021 (3 מיקרומטר) |
| חומצה רטינואית טרנסית (0.1 מיקרומטר) |
| EGF (10 ננוגרם/מ"ל) |
| VEGF/PIGF (10 ננוגרם/מ"ל) |
| בינוני התבגרות אורגנויד תלת-ממדי (יום 29-34) |
| מדיום בזאלי ללא סרום (ראו מתכון) בתוספת: |
| דקסמתזון (50 ננומטר) |
| Br-cAMP (100 מיקרומטר) |
| יבמקס (100 מיקרומטר) |
| מדיום אינדוקציה AFE (יום 4-6) |
| מדיום בזאלי ללא סרום (ראו מתכון) בתוספת: |
| SB431542 (10 מיקרומטר) |
| דורסומורפין (2 מיקרומטר) |
| DE אינדוקציה בינונית (יום 1-3) |
| 48.5 מ"ל RPMI1640 + גלוטמקס |
| 1 מ"ל B27 ללא חומצה רטינואית |
| 500 μl HEPES (1%) |
| 500 μl עט / סטרפטוץ ' |
| מעשה אנושי A (100 ננוגרם/מ"ל) |
| CHIR99021 (5 מיקרומטר) - רק ב-24 השעות הראשונות |
| LPC אינדוקציה בינונית (יום 7-16) |
| מדיום בזאלי ללא סרום (ראו מתכון) בתוספת: |
| BMP4 (10 ננוגרם/מ"ל) |
| חומצה רטינואית טרנס (RA) (0.1 מיקרומטר) |
| CHIR99021 (3 מיקרומטר) |
| בינוני מרווה |
| 49 מ"ל DMEM/F12 |
| 1 מ"ל FBS |
| מדיום בזאלי ללא סרום (SFBM) |
| 375 מ"ל האיסקובי שונה של דולבקו בינוני (IMDM) + גלוטמקס |
| 125 מ"ל האם F12 |
| 5 מ"ל B27 ללא חומצה רטינואית |
| 2.5 מ"ל N2 |
| 500 μl חומצה אסקורבית, 50 מ"ג /מ"ל |
| 13 μl מונותיוגליצל/1 מ"ל של IMDM" להשתמש 300ul של 0.4mM מונותיוגליצרל לכל 100 מ"ל של מדיה חופשית בסרום |
| אלבומין סרום בקר (BSA) ב-3.75 מ"ל( BSA), 7.5% פתרון |
| 500 μl עט / סטרפטוץ ' |
| העברת תאי גזע בינונית (יום 0) |
| 500 מ"ל DMEM/F12 |
| החלפת סרום נוקאאוט ב-129 מ"ל (KSR) |
| גלוטמקס 6.5 מ"ל |
| 6.5 מ"ל NEAA |
| 1.3 מ"ל 2-מרקפטונול |
| 6.5 מ"ל עט/סטרפטוץ' |
טבלה 1: טבלת מדיה.
| בעיה | תמיסה |
| די-בידול לא יעיל | 24 שעות לאחר ציפוי בתאי גזע בינוני, תאים צריכים להיות 50-70% confluent |
| מעכב GSK3β / מפעיל Wnt CHIR99021 יש להסיר בתוך 20-24 שעות של יום 1 אינדוקציה דה | |
| בידול DE לא יעלה על סך של 72 שעות | |
| בידול AFE אינו יעיל | ודא שהבדל DE הצליח והתאים מבטאים > 80% CXCR4 |
| ודא גורמי גדילה טריים / מולקולות קטנות מתווספים לתקשורת מדי יום | |
| בידול LPC אינו יעיל | ודא שההבחנה של AFE הצליחה והתאים מבטאים > 80% FOXA2/SOX2 |
| ודא שתאי AFE מועברים כצברגים של 4-10 תאים ולא תא בודד | |
| אורנואידים ריאות תלת-ממדיים לא גדלים או מבדילים | ודא שההפרשה של LPC הצליחה והתאים מבטאים > 30% NKX2-1 |
| ודא ש- LPCs הועברו כצברגים של 4-10 תאים ולא תא בודד | |
| ודא שאין שאריות מ- LPCs במהלך המעבר | |
| הוסף מעכב ROCK Y-27632 עם כל שינוי מדיה | |
| ודא שהמדיה משתנה בזמן וגורמי גדילה טריים/מולקולות קטנות מתווספים | |
| ודא ריכוז של גורמי גדילה /מולקולות קטנות נכון |
טבלה 2: פתרון בעיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההבחנה המוצלחת של אורגנוידים של ריאות שלמים תלת-ממדיים (WLO) מסתמכת על פרוטוקול רב-שלבי בן 6 שבועות עם תשומת לב לפרטים, כולל זמן חשיפה לגורמי גדילה ומולקולות קטנות, צפיפות תאית לאחר המעבר ואיכות hiPSCs. לפתרון בעיות, ראה טבלה 2. hiPSCs צריך להיות כ 70%-80% confluent, עם פחות מ 5% בידול ספונטני לפני ניתוק. פרוטוקול זה קורא למדיום "mTeSR plus"; עם זאת, מדיום "mTeSR" רגיל שימש גם עם תוצאות דומות והוא פחות יקר. עבור המטריצה החוץ-תאית, אנו משתמשים במדיום מטריצת הממברנה במרתף GFR. אנו מעבר hiPSCs באמצעות ReLesR (ראה טבלת חומרים) כדי להפחית את הבידול.
במהלך בידול endoderm, תאים צריכים להיות חזותיים מדי יום לפני ואחרי שינויי מדיה. גורמי גדילה מוגדרים / מולקולות קטנות יש להוסיף טרי מדי יום למדיום הבסיס כדי למנוע השפלה מוקדמת. מוות תאי ב אנדודרם מוחלט (DE) הוא נפוץ אבל צריך להיות מוגבל במהלך אנדודרם foregut מראש (AFE) ותא ריאות (LPC) אינדוקציה. אם יש למות גדול ביום השלישי של DE (יום 4), להקטין את הזמן הכולל של DE על ידי 6-12 שעות. ייתכן שיהיה צורך למטב קווי תאים חדשים של iPSC לבידול אנדודרם מוצלח. בצע ציטומטריית זרימה ב- DE עבור CXCR4 כדי לאשר אינדוקציה מוצלחת (>85% CXCR4 + תאים). התאים צריכים להיות יציבים יחסית ב- AFE וישתנו מורפולוגית עם מעט למות.
מעבר ל- LPC הוא תהליך נוסף שיש למטב עבור סוג התא. תגמול תאים בצפיפות נמוכה מדי (<50%) יגרום לבידול לא יעיל. אשר אינדוקציה מוצלחת LPC עם אימונוציטוכימיה עבור NKX2-1 או ציטומטריית זרימה עבור CPM18 או CD26low / CD47high15. אינדוקציה מוצלחת LPC חייב להיות >40% NKX2-1, אחרת organoids יהיה שפע גדול יותר של AFE עמוס. עבור אינדוקציה LPC, יש להוסיף גורמי גדילה למדיית הבסיס עם כל שינוי מדיה. אם המדיה הופכת לצהובה מאוחר יותר לתוך אינדוקציה LPC, שקול להגדיל את נפח המדיה הטרייה, או לשנות את המדיה מדי יום. במהלך אינדוקציה אורגנויד ריאות שלם 3D, מספר ציפוי ושמירה על אשכולות תאים הם המפתח לצמיחה organoid מוצלחת. מדיום מטריצת ממברנה במרתף GFR קשה לטיפול ורגיש מאוד בטמפרטורה, אז תמיד לשמור אותו על קרח. אם מטריצת הממברנה במרתף GFR ג'לים בינוניים מוקדם מדי, אז תאי LPC לא ישתלבו בתוכו. אנו ממליצים להפשיר 1 מ"ל aliquots של מטריצת ממברנה GFR-מרתף בינוני על קרח 30 דקות לפני המעבר. לאחר התאים / האשכולות נספרו ו aliquots מתאים עשה, למקם את גלולה התא על קרח. אנו מציעים להכין צלחות, תיוג, ותוספת של קרום התא מוסיף לפני GFR-מרתף מטריצת ממברנה טיפול בינוני.
השתמש טיפים pipette כדי להוסיף נפח נכון של מטריצת ממברנה נוזלי GFR-מרתף מדיום מיד לכדור התא, שמירה על קרח. פיפטה למעלה ולמטה במהירות אך בעדינות (טיפול ניואנסי) כדי לא להציג בועות, ואז להחזיר את הצינור לקרח. מוסיפים את התא ואת מטריצת הממברנה במרתף GFR לתערובת בינונית לחלק האפאלי של הטרנסוול בלוחות מוכנים. התערובת צריכה להתפשט ולכסות את כל הטרנסוול; הטה בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ציפוי. לאחר gelling באינקובטור במשך 30-60 דקות, צריך להיות אשכולות תאים גלויים במדיום מטריצת הממברנה GFR-מרתף. הוסף מדיה אינדוקציה ריאות מתאימה לתא בזאלי בתוספת 10 μM ROCK מעכב Y-27632 לפקח על צמיחת organoid כל יומיים.
יישומים עתידיים של organoids שנוצר על ידי פרוטוקול זה כוללים לימוד המסלולים המולקולריים השולטים מחויבות שושלת ריאות מוקדמת מפרט גורל התא21,22,23. האינטראקציה בין האפיתל למנשים יכולה להיקבע על ידי שימוש במודלים של נוק-אאוט של גנים24. האורגנוידים יכולים גם להיות בתרבית משותפת עם תאי אנדותל כדי לקבוע את החשיבות של רקמות ספציפיות לדפוס איתות בין אפיתל הריאות, mesenchyme, ואת אנדותל25. התפתחות הריאות מתרחשת במקביל להתפתחות כלי הדם וכי מערכת היחסים עשויה לעורר מנגנונים מולקולריים חשובים הדרושים להתפתחות תקינה של הריאות. הראינו גם כי אלה organoids ריאות אלה פונקציונליים באמצעות בדיקות הפרשת פעילי שטח לאחר GFR-מרתף מטריצת ממברנה מדיום הוסר ואחריו תרבות לטווח קצר בארות חיבור אולטרה נמוך26. אסטרטגיות אחרות כוללות מיון התאים עבור סמני פני השטח של התא כגון NGFR (תאי בזאלי)27 ו- HTII-280 (תאי ATII)28 והחלפתם כאורגנוידים הומוגניים או מונו-שכבתי בתנאי תרבית בין-פאזית נוזלית אווירית. אורגנוידים שלמים, פרוקסימליים ודיסטליים שימשו גם לחקר המטרות התאיות והפתופיזיולוגיה של זיהום נגיפי SARS-CoV-2 על מנת להבין טוב יותר ולמסך תרופות שעשויות להילחם ב- COVID-19.
פרוטוקול זה הוא חזק ושחזור, אבל אתגרים רבים עדיין קיימים. קווים רבים ושונים של iPSC ו- ESC נבדקו (>20 שורות) אך יש למטב את הפרוטוקול עבור כל שורת תא. למרות אינדוקציה חזקה DE ו- AFE, אינדוקציה LPC עשוי להיות קשה להשיג >40% של NKX2-1 + תאים. פרוטוקולים אחרים כוללים שלב מיון עבור סמני פני השטח של תאי NKX2-115,18, אך אלה רק מניבים סוג מצוחם II כמו אורגנוידים ללא מזנכים ועדיין מכילים אוכלוסיות של תאי קיבה וכבד למרות טיהור אוכלוסיית אבות הריאה29. ציינו גם כמות קטנה של תאי קיבה ו בכבד הן LPC והן organoids ריאות שלמות, אולי בשל נוכחות של תאי foregut העורף העורי מזהמים את LPCs. לכן, ההבחנה של organoids ריאות טהור עדיין לא הושג, ומחקר נוסף על התפתחות תאי אבות הריאה ברקמה האנושית חייב להסתיים. יש לבחון במרץ את מבאי ההסתה במורד הזרם עם ביטוי גנים וחלבון מרקמת הריאה האנושית העיקרית. בעוד, עד כה, השימוש הפורה ביותר של organoids ריאות כבר מודל מחלות הקרנה עבור תרופות במבחנה, השתלת organoids ריאות נגזר hiPSC לתוך חולים לרפואה רגנרטיבית כבר נחשב כטיפול עתידי עבור מגוון של תנאים. עם זאת, לפני ששוקל התערבויות כאלה, יש לשכלל מידה רבה של בקרת איכות, כולל זיהוי והסרה של נגזרות hiPSC מזהמות, לא רצויות, שעלולות להיות גידוליות. יתר על כן, בדיקות תפקודיות טובות יותר במבחנה ומודלים בעלי חיים טובים יותר של מחלת ריאות עדיין צריך להיות מפותח.
באופן ספציפי, יש לאשר את הפונקציונליות והבטיחות של תאים שמקורם ב- hiPSC. תאים לא מורחקים צריכים להיות מודרים מכיוון שיש להם את היכולת ליצור טרטומות. שיטה אחת לקביעת תאי גזע לא מומצאים באנדודרם מוחלט היא למיין את התאים באמצעות סמן הפלוריפוטנציה SSEA4. גנים של סמן עבור רכיבי HiPSCs לא מואצים זוהו לאחרונה באמצעות רצף RNA של תא יחיד30. ניתן להשתמש ב- ESRG, CNMD ו- SFRP2 כדי לאמת תאים לא מובחנים בכל שלב בידול. לאחר אישור הטוהר, היתרון של טיפולים אוטולוגיים נגזר iPSC הוא היכולת של התאים המושתלים להימנע מדחייה שכן הם מגיעים מהתאים של המטופל עצמו. החסרונות כוללים את הזמן שלוקח להבדיל לחלוטין בין התאים, לעבור בדיקות כיתה קליניות קפדניות, ולהשתיל את התאים לחולה עם פגיעה חריפה (תסמונת מצוקה נשימתית, אוטם שריר הלב או פגיעה בעמוד השדרה). החלופה היא להשתמש בתאים הנגזרים מ- iPSC האלוגניים הבנקאיים31. אלה עשויים להיות מאוחסנים וזמינים עבור חולים עם נוגדן לויקוציטים אנושיים (HLA) תורמים תואמים והם יעברו בדיקות יסודיות לזיהום. החיסרון הגדול ביותר הוא האפשרות של דחייה חיסונית. דיכוי חיסוני עשוי להיות נחוץ בהשתלת תאים אלוגניים, שהיא המציאות הנוכחית של השתלות רקמות שלמות אלוגניות. אסטרטגיות מתוכננות כדי לאפשר לתאים הנגזרים iPSC allogenic להתחמק התגובה החיסונית להשתיל אותם בבטחה לתוך חולים32.
בסופו של דבר, אורגנוידים שלמים שמקורם ב-iPSC ישמשו לחקר מודלים של מחלות ספציפיות למטופל, להתאים טיפולים ולשפר את המחקר הרפואי המתחדש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A.
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X.
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C.
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
