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Immunology and Infection

Détection automatisée et à haut débit de l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

La détection des interactions pathogènes hôte-bactérien basée sur l’adhérence phénotypique à l’aide de l’imagerie de marquage par fluorescence à haut débit ainsi que de méthodes d’analyse statistique automatisées permet une évaluation rapide des interactions bactériennes potentielles avec les cellules hôtes.

Abstract

L’identification des agents pathogènes bactériens émergents est essentielle à la santé et à la sécurité humaines. L’adhésion bactérienne aux cellules hôtes est une étape essentielle dans les infections bactériennes et constitue une marque de menace potentielle. Par conséquent, l’examen de l’adhérence des bactéries aux cellules hôtes peut être utilisé comme composante de l’évaluation de la menace bactérienne. Une méthode standard pour dénombrer l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes consiste à co-incuber les bactéries avec les cellules hôtes, à récolter les bactéries adhérentes, à plaquer les cellules récoltées sur des milieux solides, puis à compter les unités formant des colonies (UFC) résultantes. Alternativement, l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes peut être évaluée à l’aide d’approches basées sur la microscopie à immunofluorescence. Cependant, les stratégies conventionnelles de mise en œuvre de ces approches prennent beaucoup de temps et sont inefficaces. Ici, une méthode d’imagerie automatisée basée sur la microscopie à fluorescence récemment développée est décrite. Lorsqu’elle est combinée avec un traitement d’image à haut débit et une analyse statistique, la méthode permet une quantification rapide des bactéries qui adhèrent aux cellules hôtes. Deux espèces bactériennes, Pseudomonas aeruginosa à Gram négatif et Listeria monocytogenes à Gram positif et les témoins négatifs correspondants, ont été testées pour démontrer le protocole. Les résultats montrent que cette approche dénombre rapidement et avec précision les bactéries adhérentes et réduit considérablement les charges de travail et les délais expérimentaux.

Introduction

L’adhésion bactérienne est un processus par lequel les bactéries se fixent à d’autres cellules ou surfaces. L’établissement réussi de l’infection par des agents pathogènes bactériens nécessite l’adhésion aux cellules hôtes, la colonisation des tissus et, dans certains cas, l’invasion des cellules hôtes1,2,3. Les maladies infectieuses émergentes constituent des menaces majeures pour la santé publique, comme en témoigne la récente pandémie deCOVID-19 4,5,6. Il est important de noter que les agents pathogènes nouveaux ou émergents peuvent ne pas être facilement discernés à l’aide d’approches génomiques, en particulier dans les cas où l’agent pathogène a été conçu pour échapper à la détection ou ne contient pas de signatures génomiques qui l’identifient comme pathogène. Par conséquent, l’identification d’agents pathogènes potentiels à l’aide de méthodes qui évaluent directement les caractéristiques de la pathogénicité, comme l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes, peut jouer un rôle essentiel dans l’identification des agents pathogènes.

L’adhérence bactérienne aux cellules hôtes a été utilisée pour évaluer les mécanismes de pathogenèse bactérienne pendant les décennies1,7. L’imagerie microscopique8,9 et le dénombrement de l’unité de formation de colonies bactériennes (UFC)10,11,12,13 par placage post-infection sont deux méthodes de laboratoire bien développées pour tester l’adhérence microbienne et / ou l’infection des cellules hôtes14. Compte tenu de la taille micrométrique des cellules bactériennes, le dénombrement des cellules bactériennes adhérentes nécessite généralement l’utilisation de techniques avancées de microscopie à fort grossissement, ainsi que d’approches d’imagerie à haute résolution, y compris la microscopie électronique, la microscopie à expansion (ExM)15,16et l’imagerie tridimensionnelle17 . Alternativement, le dénombrement des bactéries liées ou internalisées dans les cellules hôtes peut être effectué en plaquant la série de dilution des bactéries récoltées sur une gélose solide et en comptant les UFC résultantes10,12,13. Cette méthode est laborieuse et comprend de nombreuses étapes manuelles, ce qui introduit des difficultés dans l’établissement d’une procédure standardisée ou automatisée requise pour les analyses à haut débit18,19. Par conséquent, l’élaboration de nouvelles méthodes d’évaluation de l’attachement des cellules hôtes permettrait de remédier aux limites actuelles dans le domaine.

Une telle méthode est décrite ici qui utilise la microscopie automatisée à haut débit, combinée au traitement d’images à haut débit et à l’analyse statistique. Pour démontrer l’approche, des expériences avec plusieurs agents pathogènes bactériens ont été effectuées, y compris Pseudomonas aeruginosa, un pathogène bactérien opportuniste à Gram négatif des humains, des animaux et des plantes14,20, qui colonise fréquemment les voies respiratoires de patients présentant des fonctions de défense de l’hôte altérées. Cette approche a optimisé le processus d’imagerie microscopique décrit dans les études précédentes14,20. La détection par imagerie a été simplifiée par des cellules hôtes et des bactéries marquées par fluorescence pour suivre rapidement leur proximité, ce qui a considérablement réduit la charge de travail de microscopie pour obtenir des images haute résolution permettant de distinguer les bactéries. En outre, l’analyse statistique automatisée des images dans le comptage des cellules hôtes et des bactéries a remplacé l’expérience pratique du placage bactérien CFU pour estimer le rapport du nombre de bactéries adhérentes par cellule hôte. Pour confirmer la compatibilité de cette méthode, plusieurs souches bactériennes et types de cellules hôtes ont également été testés, comme Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus et Klebsiella pneumoniae, ainsi que des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et les résultats soutiennent la diversité et l’efficacité de la méthode.

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Protocol

1. Culture cellulaire A549

  1. Maintenir la lignée cellulaire A549 en milieu F-12K complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et incuber à 37 °C, 5% de CO2.
  2. Changez le milieu tous les 3-4 jours et passez à 85% -95% de confluence.
  3. Rincez brièvement les cellules avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4, sauf indication contraire) et traiter avec 1 ml de solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % de trypsine-0,53 mM (EDTA) (immersion de la couche cellulaire) pendant environ 2 min à 37 °C.
  4. Ajouter 6 mL supplémentaires de milieu de croissance complet (milieu F-12K + 10% FBS) pour arrêter l’activité de la protéase. Ensuite, plaquez les cellules dans une fiole de culture tissulaire stérile en polystyrène T-75 à un rapport de sous-culture de 1:3-1:8. Le volume final de la culture est de 12 mL.
  5. Ensemencez environ 1 x10 4 cellules A549 (concentration cellulaire : ~1 x 105 cellules/mL) sur chaque puits d’une plaque de 96 puits un jour avant les essais d’observance.

2. Croissance bactérienne et coloration

  1. Effectuer tous les travaux bactériens dans une armoire de biosécurité, laboratoire de niveau de biosécurité 2.
  2. Inoculer toutes les cultures bactériennes, y compris P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli , L. monocytogenes et B. subtilis, etc., à partir du bouillon de glycérol congelé et les cultiver dans un bouillon de soja tryptique (TSB, 3 mL) dans un incubateur à agitation à 37 ° C pendant la nuit maintenu à 250 tr / min.
  3. Le lendemain, utilisez une dilution de 1:100 de la culture de nuit pour inoculer une sous-culture et cultivez-les dans le BST (1 mL) pendant 3 h jusqu’à la phase exponentielle, mesurez la DO à 600 nm (OD600)pour confirmer. Assurez-vous que l’OD600 se situe entre 0,4 et 0,6.
  4. Avant d’effectuer le test d’adhérence bactérie-hôte, les dilutions en série sur plaque de suspension bactérienne sur des plaques de gélose TSB, les incubent pendant la nuit à 37 ° C, puis établissent les UFC bactériens à partir du nombre de colonies. Pour P. aeruginosa, une OD600 de 1,0 correspond à 2 x 108 cellules bactériennes viables/mL, et pour L. monocytogenes, une OD600 de 1,0 correspond à 9 x 108 cellules bactériennes viables/mL.
  5. Récolter les cultures bactériennes en phase exponentielle par centrifugation à 13 000 x g pendant 2 min à température ambiante (RT), puis les laver une fois à l’aide de 1x PBS (1 mL). Remettre en suspension les granulés bactériens dans 1 mL de 1x PBS et déterminer les concentrations en mesurant l’OD600 des suspensions bactériennes. Par exemple, P. aeruginosa avec OD600 de 0,5 représente une concentration de 1 x 108 cellules bactériennes/mL.
  6. Tacher la suspension bactérienne à l’aide d’un colorant fluorescent vert ou rouge à RT pendant 30 min avec une rotation douce dans l’obscurité. Pour cela, ajoutez 2 μL du colorant de coloration concentré 500 fois dans 1 mL de suspension bactérienne pour diluer le colorant 1 fois. Pour éliminer le colorant de coloration, centrifugez les bactéries colorées à 13 000 x g pendant 2 min et remettez la pastille dans 1 mL de 1x PBS pendant trois fois.
    REMARQUE: Si des bactéries marquées par fluorescence (GFP-, RFP-, mCherry-, etc.) sont utilisées dans l’expérience, sautez cette étape de coloration bactérienne. P. aeruginosa marqué gFP et L. monocytogenes colorés par colorant fluorescent rouge ont été utilisés dans ce protocole.
  7. Prélever les cellules bactériennes colorées ou les bactéries marquées GFP par centrifugation à 13 000 x g pendant 2 min. Remettre en suspension dans un milieu F-12K frais (1 mL) et mesurer l’OD600 de chaque culture. Diluer ultérieurement les cultures aux concentrations souhaitées en fonction de la multiplicité de l’infection (MOI) et de la concentration sur les cellules hôtes. Le volume final utilisé dans cette expérience est de 500 μL.
    REMARQUE: Par exemple, si la concentration de cellules hôtes comptée à l’aide de la coloration Trypan Blue est de 1 x10 5 cellules / mL, la concentration souhaitée de cellules bactériennes à un MOI de 100 sera de 1 x 107 cellules / mL. La concentration de P. aeruginosa à 0,5 OD600 est de 1 x 108/mL. Pour obtenir la concentration souhaitée, diluer la culture de P. aeruginosa 10 fois, ajouter 50 μL de culture remise en suspension à 450 μL de milieu F-12K frais.

3. Adhérence bactérienne et coloration des cellules hôtes

  1. Tout d’abord, lavez les monocouches cellulaires A549 ensemencées trois fois avec 1x PBS chaud. Pour chaque lavage, ajoutez 100 μL de 1x PBS à chaque puits, pipetez doucement de haut en bas trois fois, jetez 1x PBS ou attendez 10 s après l’ajout, puis passez l’aspirateur pour retirer 1x PBS. Pour déterminer la cinétique de l’association bactérienne, superposez les cellules avec 100 μL de concentrations souhaitées de suspension bactérienne avec différents ME (0, 1, 10 et 100). Faire tourner les bactéries à 200 x g pendant 10 min et incuber les cellules A549 infectées à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 1 h supplémentaire.
    REMARQUE: Dans cette expérience, chaque condition avait un triple technique.
  2. Éliminez les bactéries non liées en lavant les monocouches cinq fois avec du PBS chaud 1x comme décrit ci-dessus. Ajouter 100 μL de formaldéhyde à 4 % (dans 1x PBS) dans chaque puits des plaques de 96 puits pour fixer les cellules. Laissez les plaques reposer sur de la glace pendant 15 minutes, puis lavez la solution de fixation à l’aide de 1x PBS trois fois.
  3. Pour colorer les noyaux, ajouter 50 ng/mL de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et l’incuber pendant 10 min à TA. Après l’incubation, lavez les puits trois fois à l’aide de 1x PBS. Couvrez les cellules A549 infectées avec 100 μL de 1x PBS pour éviter le dessèchement. Traitez pour l’étape suivante ou conservez la plaque à 4 °C jusqu’à 2 jours dans l’obscurité.

4. Imagerie, traitement et analyse automatisés par fluorescence

  1. Pour maintenir l’intégrité des données, choisissez aléatoirement et manuellement cinq emplacements de chaque puits pour capturer les images à un grossissement de 20x. Capturez les images fluorescentes des cellules A549 et des bactéries sous les canaux DAPI et GFP, respectivement. Utilisez le canal PE-Cy5 pour les bactéries colorées par le colorant fluorescent rouge.
  2. Pour avoir une meilleure résolution, traitez toutes les images pour l’aplatissement et la déconvolution de l’arrière-plan. Définissez les paramètres comme 68 μm de diamètre de la bille roulante pour le lissage et mesurez automatiquement la fonction d’étalement de points (PSF) de la déconvolution de l’image en fonction de l’objectif.
  3. Pour compter toutes les cellules et bactéries qualifiées, mesurez l’intensité de fluorescence des cellules hôtes et des bactéries et définissez l’intensité de fluorescence la plus faible des cellules hôtes et des bactéries comme seuils pour le nombre de cellules. Comptez toutes les bactéries proches d’une cellule hôte à une distance de 15 μm, car les bactéries adhérentes ont un diamètre de la cellule A549 de 10,59 à 14,93 μm21.
    REMARQUE: Un paramètre par défaut dans le système d’imagerie compte sélectivement les cellules hôtes avec des diamètres allant de 5-100 μm et les bactéries allant de 0,2-5 μm en taille (largeur et longueur).
  4. Sur la base des résultats de traitement manuel d’image mentionnés ci-dessus, appliquez les paramètres de lissage de l’image, de déconvolution, de taille des objets, de distance et d’intensité de fluorescence au reste des images automatisées. Après l’analyse automatisée, considérez les lectures critiques, telles que le nombre total de cellules hôtes, la taille et la forme des cellules, le nombre total de bactéries et le nombre moyen de bactéries par cellule hôte, qui était l’indicateur le plus important, pour déterminer l’adhérence bactérienne.
  5. Exportation de données et analyse statistique
    1. Exportez les résultats analysés de toutes les images vers une feuille de calcul (par exemple, au format « xlsx »). Le système automatisé génère deux ensembles de résultats : 1) le nombre moyen de bactéries adhérentes à partir de chaque image ; 2) les données informatives de chaque cellule hôte, telles que le nombre de bactéries adhérentes sur une seule cellule, la taille de l’hôte et l’intensité moyenne de fluorescence de la cellule hôte et des bactéries, à partir de l’image correspondante.
    2. Calculer le nombre moyen et l’écart-type du nombre de bactéries adhérentes à partir de toutes les images pour représenter le niveau d’adhérence bactérienne par rapport aux témoins négatifs. Dans cette méthode, E. coli et B. subtilis ont servi de témoins négatifs pour tester l’observance bactérienne Gram négatif et Gram positif, respectivement. Effectuer des ANOVA bidirectionnels pour tester la variation significative entre les points de données à travers le traitement pour trois expériences indépendantes.

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Representative Results

Pour développer le test d’adhérence bactérienne basé sur l’imagerie par fluorescence, la souche PAO1 de P. aeruginosa et son homologue à adhérence négative E. coli ont été utilisés pour tester l’efficacité du protocole, car l’adhérence de ces bactéries aux cellules A549 avait été rapportée14,20,22. Tout d’abord, P. aeruginosa (PAO1) et E. coli marqué GFP ont été co-incubés avec une lignée cellulaire épithéliale A549 immortalisée par l’homme à divers MOO, respectivement. Les résultats ont montré que PAO1 adhérait aux cellules A549 de manière dose-dépendante(Figure 1A,B); entre-temps, une adhérence quasi nulle d’E. coli a également été vérifiée (Figure 1A,B). Il y avait 50 images capturées et analysées à chaque MOI. Des ANOVA bidirectionnels ont été réalisés pour tester les variations significatives de trois expériences indépendantes.

Figure 1
Figure 1: P. aeruginosa bactérien à Gram négatif a adhéré aux cellules A549 dans les 1 h suivant la co-incubation. (A) Images microscopiques pour un aperçu de l’adhérence bactérienne où les images ont été prises en utilisant un grossissement de 20x. PAO1 et le témoin à adhérence négative E. coli ont adhéré aux cellules A549 à la multiplicité indiquée d’infections (ME). Les bactéries ont été marquées par fluorescence GFP. Les noyaux des cellules A549 ont été colorés par DAPI. La barre d’échelle est de 50 μm. (B) Quantification du nombre de bactéries adhérentes par cellule A549. Pour chaque souche bactérienne testée (PAO1 et E. coli)dans chaque MOI, un total de 50 images ont été appliquées à l’analyse à chaque condition. Les données sont moyennes ± écart-type (ET) d’un représentant de trois expériences indépendantes. L’analyse statistique bidirectionnelle de l’ANOVA a été effectuée. * p < 0,05, *** p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Des résultats similaires ont également été observés lorsque des bactéries à Gram positif, L. monocytogens23,24 et son témoin négatif B. subtilis, ont été utilisées ( Figure2A,B). L’adhérence aux cellules A549 était significative chez L. monocytogenes que chez B. subtilis (Figure 2A,B).

Figure 2
Figure 2: L. monocytogenes bactérien à Gram positif a adhéré aux cellules A549 dans les 1 h suivant la co-incubation. (A) Images microscopiques pour un aperçu de L. monocytogenes, ainsi que de l’adhérence négative de B. subtilis au contrôle négatif des cellules A549 à différents MOO. Les bactéries ont été colorées à l’aide d’un colorant fluorescent rouge. Les noyaux des cellules A549 ont été colorés avec DAPI. La barre d’échelle est de 50 μm. (B) Quantification du nombre de bactéries adhérentes par cellule A549. Pour chaque souche bactérienne testée(L. monocytogenes et B. subtilis)dans chaque MOI, un total de 50 images ont été appliquées à l’analyse à chaque condition. Les données sont moyennes ± SD d’un représentant de trois expériences indépendantes. L’analyse statistique bidirectionnelle de l’ANOVA a été effectuée. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Une image représentative de la segmentation et du nombre de P. aeruginosa adhérents à l’hôte est illustrée à la figure 3 (Masques jaunes : bactéries sélectionnées, contour rouge : nombre de bactéries uniques). Les paramètres des cibles de l’hôte et des bactéries sont décrits dans la section Protocole.

Figure 3
Figure 3: Exemples d’images de segmentation et de comptage bactériens dans le processus d’analyse automatisé. (A) Des images microscopiques de P. aeruginosa ont adhéré à A549 à un MOI de 100 sans segmentation bactérienne ni comptage. (B) La même image après l’analyse statistique de la segmentation et du comptage bactériens. Masques jaunes: bactéries sélectionnées, contour rouge: nombre unique de bactéries. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les résultats des analyses automatisées, y compris la taille et les zones des cellules hôtes, le nombre de bactéries et de cellules hôtes, ainsi que le nombre moyen de bactéries par cellule hôte, représentant l’état de santé des cellules hôtes, le niveau d’adhérence des bactéries et la cytotoxicité bactérienne, sont énumérés dans les tableaux 1 et 2. Le tableau 1 représente le nombre de bactéries adhérentes à un niveau cellulaire moyen à partir de différentes images, tandis que le tableau 2 représente le nombre de bactéries adhérentes analysées sur une image à un seul niveau cellulaire A549. Ces images représentatives ont été capturées à partir de cellules A549 infectées par PAO1 à un MOI de 100. Les résultats analysés de l’image initiale de la figure 3 ont été répertoriés sous la forme de l’image 1 dans les tableaux 1 et 2.

Tableau 1 : Résultats d’analyse statistique de 9 images représentatives au niveau cellulaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Dans chaque image, le nombre de sommes d’hôtes et les points de somme bactérienne représentent respectivement le nombre total de noyaux d’hôtes et le nombre total de bactéries reconnus par le système en fonction des paramètres décrits ci-dessus. De plus, le calcul automatisé du rapport des taches bactériennes représente le nombre moyen de bactéries par cellule hôte, dérivé du nombre de points de somme des bactéries/somme hôte. En outre, des lectures supplémentaires peuvent également être incluses; par exemple, le nombre d’hôtes adhérents aux bactéries illustre le phénomène universel ou spécifique d’adhérence hôte-bactérie. Lorsque le nombre d’hôtes adhérents aux bactéries est beaucoup moins élevé que le nombre d’hôtes, en revanche, le nombre moyen de bactéries par hôte est relativement élevé, ce qui signifie qu’un tel phénotype d’adhérence a une hétérogénéité significative.

Tableau 2 : Analyse statistique unicellulaire d’une image représentative. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

L’analyse cellulaire singulière fournit plus de détails sur les cellules hôtes et les cibles bactériennes dans chaque image, ce qui est plus utile pour recueillir d’autres caractéristiques bactériennes et les appliquer à l’analyse informatique automatisée afin de développer un outil plus puissant pour évaluer la pathogénicité bactérienne potentielle, comme un modèle d’apprentissage automatique qui est à l’étude. Dans ce protocole, la taille et la surface de l’hôte représentent les diamètres et les zones de chaque noyau d’hôte coloré, et l’intensité de fluorescence de l’hôte représente l’intensité moyenne des noyaux colorés. Le nombre de taches bactériennes et la superficie représentent les cibles bactériennes adhérentes à chaque cellule hôte et leurs zones totales. L’intensité de fluorescence bactérienne représente l’intensité moyenne de toutes les bactéries adhérentes.

Il n’est pas surprenant que certaines bactéries virulentes n’aient pas adhéré à l’A549 alors que certaines bactéries ayant des niveaux élevés d’adhérence bactérienne ne sont pas nécessairement corrélées avec la pathogénicité. Un autre type de cellule hôte, huVEC, a également été testé pour maximiser l’application de cette méthode. Les résultats ont montré la détection efficace et les différents phénotypes d’adhérence des bactéries (Figure 4). Différentes cellules hôtes pourraient augmenter l’estimation des agents pathogènes bactériens potentiels; par exemple, les pathogènes Serratia rubid aeaet Streptococcus agalactiae adhéraient aux cellules HUVEC mais pas aux cellules A549(figure 4). De plus, l’E. coli entérohémorragique cytotoxique (EHEC) n’adhérait ni à l’A549 ni au HUVEC(Figure 4). Par conséquent, il est essentiel de s’assurer que la méthode est adaptée à plusieurs types de cellules hôtes pour répondre à la spécificité des interactions hôte-bactérie. Les cellules A549 et HUVEC ont été co-incubées avec des bactéries à un MOI de 100 à 37 °C pendant 1 h.

Figure 4
Figure 4: Spécificité de l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes A549 et HUVEC. Les souches bactériennes, dont S. rubidaea, S. agalactiae, E. coli entérohémorragique cytotoxique (EHEC), PAO1,P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP),E. coli, S. aureus et S. aureus ΔsaeR,ont été testées sur des cellules A549 et HUVEC à un MOI de 100 pendant 1 h de co-incubation à 37 °C, 5% DE CO2. Les bactéries ont été colorées avec un colorant fluorescent rouge. Le nombre de bactéries adhérentes a été quantifié à partir de 45 images/souche bactérienne dans trois expériences indépendantes. Les données sont moyennes ± SD d’un représentant de trois expériences indépendantes. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** p<0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le protocole décrit une approche automatisée pour dénombrer l’attachement bactérien aux cellules hôtes. L’approche décrite présente plusieurs avantages intéressants par rapport aux méthodes conventionnelles. Tout d’abord, cette approche permet de quantifier avec précision le nombre de cellules pathogènes microbiennes attachées à des cellules hôtes individuelles. Il est important de noter que cette quantification peut être effectuée sans avoir besoin d’une récolte bactérienne laborieuse, de dilutions en série, d’un placage sur des milieux solides et de la détermination des UFC10,11,12. En tant que telle, la technique décrite réduit la charge de travail globale nécessaire pour quantifier l’adhérence bactérienne. Il convient de noter que les avantages de l’approche proposée sont amplifiés lorsqu’il s’agit de détecter des phénotypes d’adhérence dans des expériences de dépistage à grande échelle, y compris l’identification de gènes bactériens ou hôtes dans des bibliothèques mutantes ou CRISPR, respectivement, qui régulent ce processus. Deuxièmement, l’évaluation directe des interactions entre les cellules hôtes et bactériennes à l’aide de la microscopie à fluorescence fournit des informations pour élucider les mécanismes de pathogénicité bactérienne, y compris les altérations de la survie, de la morphologie ou de la dynamique d’une cellule hôte ou bactérienne. Enfin, l’analyse statistique automatisée effectuée sur les images collectées dans l’analyse fournit non seulement une quantification globale de l’association bactérienne moyenne avec les cellules hôtes, mais permet également d’évaluer les interactions dynamiques, unicellulaires, hôte-pathogène.

Malgré ces avantages, les méthodes décrites présentent des limites importantes. Tout d’abord, la coloration par fluorescence des bactéries est nécessaire pour dénombrer leur adhérence aux cellules hôtes. Ainsi, le colorant fluorescent doit colorer sélectivement les bactéries que leurs homologues de la cellule hôte. De plus, le colorant colorant ne doit pas altérer le phénotype d’attachement des bactéries qui le portent. Par conséquent, l’optimisation de la coloration par fluorescence bactérienne (p. ex., concentration, durée de coloration) doit être déterminée avant d’effectuer les études d’observance décrites. Dans ce protocole, la coloration fluorescente des souches bactériennes, y compris P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli et B. subtilis pendant 30 minutes, n’affecte pas leur adhérence aux cellules hôtes. Deuxièmement, en raison de la spécificité des différentes interactions hôte-bactérie, un seul type de cellule hôte peut ne pas être suffisant pour évaluer l’attachement bactérien aux cellules hôtes. Par conséquent, plusieurs types de cellules hôtes peuvent être nécessaires pour acquérir une compréhension complète de la mesure dans laquelle un microbe donné peut adhérer à la surface des cellules hôtes. Troisièmement, la segmentation bactérienne n’était pas pleinement efficace lorsque les bactéries propulsaient l’agrégation pendant la co-incubation, par exemple S. aureus, ou lorsque les bactéries formaient des amas à un MOI plus élevé (>100), par exemple, P. aeruginosa. Dans ce cas, un grossissement plus élevé doit être appliqué pour capturer les images, ou plus d’images doivent être utilisées dans l’analyse pour réduire l’effet de l’agrégation bactérienne.

Les cellules épithéliales pulmonaires humaines (A549) et les HUVEC ont été utilisés dans les études pour démontrer la plasticité de l’approche par rapport au type de cellule hôte, et les deux ont montré des niveaux élevés de susceptibilité à l’adhérence bactérienne. L’utilisation de deux types de cellules hôtes a également démontré que la méthode décrite pouvait être largement appliquée pour caractériser rapidement les interactions hôte-bactérie adhérentes.

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Disclosures

Tous les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants au Dr Kaite Zlotkowski de Biotek Inc. pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense sous le numéro de contrat W911NF1920013 à PdF, la Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) et le ministère de l’Intérieur sous le numéro de contrat 140D6319C0029 à PdF. Le contenu de l’information ne reflète pas nécessairement la position ou la politique du gouvernement, et aucune approbation officielle ne devrait être déduite.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie et infection numéro 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

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The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Détection automatisée et à haut débit de l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes
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Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

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