Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Автоматизированное, высокопроизводительное обнаружение бактериальной приверженности клеткам-хозяевам

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

Обнаружение взаимодействий патогенов-хозяев и бактерий на основе фенотипической приверженности с использованием высокопроизводительной флуоресцентной маркировки изображений наряду с автоматизированными методами статистического анализа позволяет быстро оценить потенциальные бактериальные взаимодействия с клетками-хозяевами.

Abstract

Идентификация новых бактериальных патогенов имеет решающее значение для здоровья и безопасности человека. Бактериальная приверженность клеткам-хозяевам является важным шагом при бактериальных инфекциях и представляет собой признак потенциальной угрозы. Поэтому изучение приверженности бактерий к клеткам-хозяевам может быть использовано в качестве компонента оценки бактериальной угрозы. Стандартный метод перечисления бактериальной приверженности клеткам-хозяевам заключается в совместной инкубации бактерий с клетками-хозяевами, сборе адгезивных бактерий, нанесении собранных клеток на твердые среды, а затем подсчете результирующих колониеобразующих единиц (КОЕ). Альтернативно, бактериальная приверженность к клеткам-хозяевам может быть оценена с использованием подходов, основанных на иммунофлуоресцентной микроскопии. Однако традиционные стратегии реализации этих подходов отнимают много времени и неэффективны. Здесь описан недавно разработанный автоматизированный метод визуализации на основе флуоресцентной микроскопии. В сочетании с высокопроизводительной обработкой изображений и статистическим анализом метод позволяет быстро количественно оценить бактерии, которые прилипают к клеткам-хозяевам. Два вида бактерий, Gram-отрицательный Pseudomonas aeruginosa и Gram-positive Listeria monocytogenes и соответствующие отрицательные контрольные группы, были протестированы для демонстрации протокола. Результаты показывают, что этот подход быстро и точно перечисляет адгезивные бактерии и значительно снижает экспериментальные нагрузки и сроки.

Introduction

Бактериальная адгезия - это процесс, посредством которого бактерии прикрепляются к другим клеткам или поверхностям. Успешное установление инфекции бактериальными возбудителями требует адгезии к клеткам-хозяевам, колонизации тканей, а в некоторых случаях и инвазии клеток-хозяев1,2,3. Возникающие инфекционные заболевания представляют собой серьезную угрозу общественному здравоохранению, о чем свидетельствует недавняя пандемияCOVID-19 4,5,6. Важно отметить, что новые или возникающие патогены не могут быть легко распознаны с использованием геномных подходов, особенно в тех случаях, когда патоген был спроектирован так, чтобы избежать обнаружения или не содержит геномных сигнатур, которые идентифицируют его как патогенный. Поэтому идентификация потенциальных патогенов с использованием методов, которые непосредственно оценивают признаки патогенности, такие как бактериальная приверженность клеткам-хозяевам, может играть решающую роль в идентификации патогенов.

Бактериальная адгезия к клеткам-хозяевам использовалась для оценки механизмов бактериального патогенеза на протяжениидесятилетий 1,7. Микроскопическая визуализация8,9 и перечисление бактериальной колониеобразующей единицы (КОЕ)10,11,12,13 путем постинфекционного покрытия являются двумя хорошо разработанными лабораторными методами тестирования микробной адгезии и/или инфицирования клеток-хозяев14. Учитывая размер бактериальных клеток в микрометровом масштабе, перечисление адгезивных бактериальных клеток обычно требует использования передовых методов микроскопии с высоким увеличением, а также подходов к визуализации с высоким разрешением, включая электронную микроскопию, расширительную микроскопию (ExM)15,16и трехмерную визуализацию17 . Альтернативно, перечисление бактерий, связанных или интернализованных внутри клеток-хозяев, может быть выполнено путем покрытия серии разбавления собранных бактерий на твердом агаре и подсчета результирующих КОЕ10,12,13. Этот метод трудоемкий и включает в себя множество ручных шагов, что создает трудности в создании стандартизированной или автоматизированной процедуры, необходимой для высокопроизводительных анализов18,19. Таким образом, разработка новых методов оценки прикрепления клеток-хозяев позволит устранить текущие ограничения в этой области.

Здесь описан один из таких методов, который использует автоматизированную высокопроизводительную микроскопию в сочетании с высокопроизводительной обработкой изображений и статистическим анализом. Чтобы продемонстрировать подход, были проведены эксперименты с несколькими бактериальными патогенами, в том числе Pseudomonas aeruginosa,оппортунистическим грамотрицательным бактериальным патогеном человека, животных и растений14,20,который часто обнаруживается для колонизации дыхательных путей пациентов с нарушенными защитными функциями хозяина. Этот подход оптимизировал процесс микроскопической визуализации, описанный в предыдущих исследованиях14,20. Обнаружение изображений было упрощено флуоресцентно-мечеными клетками-хозяевами и бактериями для быстрого отслеживания их близости, что значительно снизило рабочую нагрузку микроскопии для получения изображений с высоким разрешением для различения бактерий. Кроме того, автоматизированный статистический анализ изображений при подсчете клеток-хозяев и бактерий заменил ручной эксперимент по бактериальному покрытию КОЕ для оценки соотношения количества адгезивных бактерий на клетку-хозяина. Чтобы подтвердить совместимость этого метода, также были протестированы множественные бактериальные штаммы и типы клеток-хозяев, такие как Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus и Klebsiella pneumoniae, а также эндотелиальные клетки пупочных вен человека (HUVECs), и результаты подтверждают разнообразие и эффективность метода.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура клеток A549

  1. Поддерживать клеточную линию A549 в среде F-12K, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и инкубировать при 37 °C, 5% CO2.
  2. Менять среду каждые 3-4 дня и проходить при 85%-95% слиянии.
  3. Вкратце промыть клетки 1 х фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS, рН 7,4, если не указано иное) и обработать 1 мл 0,25% трипсина-0,53 мМ раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (погружая клеточный слой) в течение примерно 2 мин при 37 °C.
  4. Добавьте дополнительно 6 мл полной питательной среды (среда F-12K + 10% FBS), чтобы остановить активность протеазы. Затем обложите клетки стерильным полистиролом Т-75 тканевой культуральной колбой с соотношением субкультивации 1:3-1:8. Конечный объем культуры составляет 12 мл.
  5. Посейте приблизительно 1 х10 4 ячейки A549 (концентрация клеток: ~1х 10 5 клеток /мл) на каждую лунку 96-луночной пластины за день до анализа адгезии.

2. Рост и окрашивание бактерий

  1. Выполняйте всю бактериальную работу в кабинете биобезопасности, лаборатории уровня биобезопасности 2.
  2. Инокулируют все бактериальные культуры, включая P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes и B. subtilis и т. д., из замороженного глицеринового бульона и выращивают их в триптическом соевом бульоне (TSB, 3 мл) в встряхивающем инкубаторе при 37 °C в течение ночи, поддерживаемом при 250 оборотах в минуту.
  3. На следующий день используйте разбавление 1:100 ночной культуры для прививки субкультуры и выращивайте их в TSB (1 мл) в течение 3 ч до экспоненциальной фазы, измерьте OD при 600 нм (OD600)для подтверждения. Убедитесь, что OD600 находится в диапазоне 0,4-0,6.
  4. Перед выполнением анализа приверженности бактерий-хозяев пластинчатых последовательных разведений бактериальной суспензии на пластинах TSB-агара, инкубируют их в течение ночи при 37 °C, а затем устанавливают бактериальные КОЕ из числа колоний. Для P. aeruginosaOD600 1,0 соответствует 2 x 108 жизнеспособным бактериальным клеткам/ мл, а для L. monocytogenesOD600 1,0 соответствует 9 x 108 жизнеспособным бактериальным клеткам / мл.
  5. Соберите бактериальные культуры в экспоненциальной фазе путем центрифугирования при 13 000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре (RT), затем промыть их один раз, используя 1x PBS (1 мл). Повторно суспендируют бактериальные гранулы в 1 мл 1x PBS и определяют концентрации путем измерения OD600 бактериальных суспензий. Например, P. aeruginosa с OD600 0,5 представляет собой концентрацию 1 х 108 бактериальных клеток/мл.
  6. Окрашивайте бактериальную суспензию зеленым или красным флуоресцентным красителем при RT в течение 30 мин с мягким вращением в темноте. Для этого добавьте 2 мкл 500-кратного концентрированного красителя для окрашивания в 1 мл бактериальной суспензии, чтобы разбавить краситель в 1 раз. Чтобы смыть окрашивающий краситель, центрифугируйте окрашенные бактерии на 13 000 х г в течение 2 минут и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 1x PBS в течение трех раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в эксперименте используются флуоресцентные (GFP-, RFP-, mCherry- и т.д.) помеченные бактерии, то пропустите этот этап бактериального окрашивания. В этом протоколе использовались GFP-метки P. aeruginosa и окрашенные красным флуоресцентным красителем L. monocytogenes.
  7. Соберите окрашенные бактериальные клетки или помеченные GFP бактерии центрифугированием при 13 000 х г в течение 2 мин. Повторно суспендировать в свежей среде F-12K (1 мл) и измерить OD600 каждой культуры. Впоследствии разбавляют культуры до желаемых концентраций на основе кратности инфекции (MOI) и концентрации клеток хозяина. Конечный объем, используемый в этом эксперименте, составляет 500 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если концентрация клеток-хозяев, подсчитанная с помощью окрашивания Trypan Blue, составляет 1х 10 5 клеток / мл, желаемая концентрация бактериальных клеток при MOI 100 будет составлять 1 х 107 клеток / мл. Концентрация P. aeruginosa при 0,5 OD600 составляет 1 х 108/мл. Для получения нужной концентрации разводят культуру P. aeruginosa в 10 раз, добавляют 50 мкл повторно суспендированной культуры к 450 мкл свежей среды F-12K.

3. Бактериальная адгезия и окрашивание клеток-хозяев

  1. Сначала промыть посеянные монослои ячейки A549 три раза теплым 1x PBS. Для каждой промывки добавьте 100 мкл 1x PBS в каждую лунку, аккуратно пипетку вверх и вниз три раза, утилизируйте 1x PBS или подождите 10 с после добавления, а затем пылесосите, чтобы удалить 1x PBS. Чтобы определить кинетику бактериальной ассоциации, наложите на клетки 100 мкл желаемых концентраций бактериальной суспензии с различными MOI (0, 1, 10 и 100). Раскрутите бактерии при 200 х г в течение 10 мин и инкубируйте инфицированные клетки A549 при 37 °C, 5% CO2 в течение дополнительного 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте каждое условие имело техническую тройку.
  2. Удалите несвязанные бактерии, промыв монослои пять раз теплым 1x PBS, как описано выше. Добавьте 100 мкл 4% формальдегида (в 1x PBS) в каждую лунку 96-луночных пластин, чтобы зафиксировать ячейки. Дайте пластинам постоять на льду в течение 15 минут, а затем смойте раствор для фиксации, используя 1x PBS три раза.
  3. Чтобы окрасить ядра, добавляют 50 нг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и инкубируют его в течение 10 мин при RT. После инкубации промыть колодцы три раза, используя 1x PBS. Покройте инфицированные клетки A549 100 мкл 1x PBS, чтобы избежать высыхания. Обработайте для следующего этапа или храните пластину при 4 °C до 2 дней в темноте.

4. Автоматизированная флуоресцентная визуализация, обработка и анализ

  1. Чтобы сохранить целостность данных, случайным образом и вручную выберите пять мест каждой скважины для захвата изображений с 20-кратным увеличением. Захват флуоресцентных изображений клеток и бактерий A549 по каналам DAPI и GFP соответственно. Используйте канал PE-Cy5 для бактерий, окрашенных красным флуоресцентным красителем.
  2. Чтобы иметь лучшее разрешение, обработайте все изображения для сведения и деконволюции фона. Установите параметры диаметра 68 мкм катящегося шара для сглаживания и автоматического измерения функции точечного спреда (PSF) деконволюции изображения на основе объектива.
  3. Чтобы подсчитать все квалифицированные клетки и бактерии, измерьте интенсивность флуоресценции клеток-хозяев и бактерий и установите самую слабую интенсивность флуоресценции клеток-хозяев и бактерий в качестве пороговых значений для количества клеток. Подсчитайте все бактерии, находящиеся рядом с клеткой-хозяином на расстоянии 15 мкм, поскольку адгезивные бактерии, поскольку диаметр ячейки A549 составляет 10,59-14,93 мкм21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка по умолчанию в системе визуализации выборочно подсчитывает клетки-хозяева диаметром от 5 до 100 мкм и бактерии размером от 0,2-5 мкм (ширина и длина).
  4. Основываясь на вышеупомянутых результатах ручной обработки изображений, примените параметры сглаживания изображения, деконволюции, размеров объектов, расстояния и интенсивности флуоресценции к остальным автоматизированным изображениям. После автоматизированного анализа рассмотрите критические показания, такие как общее количество клеток-хозяев, размеры и формы клеток, общее количество бактерий и среднее количество бактерий на клетку-хозяина, что было наиболее важным показателем для определения бактериальной приверженности.
  5. Экспорт данных и статистический анализ
    1. Экспортируйте проанализированные результаты со всех изображений в электронную таблицу (например, в формат 'xlsx'). Автоматизированная система генерирует два набора результатов: 1) среднее количество бактерий адгезивов с каждого изображения; 2) информативные данные каждой отдельной клетки-хозяина, такие как количество адгезивных бактерий на одной клетке, размер хозяина и средняя интенсивность флуоресценции клетки-хозяина и бактерий, из соответствующего изображения.
    2. Рассчитайте среднее число и стандартное отклонение количества адгезивных бактерий из всех изображений, чтобы представить уровень бактериальной приверженности по сравнению с отрицательными контрольными группами. В этом методе E. coli и B. subtilis служили отрицательным контролем при тестировании грамотрицательной и грамположительной бактериальной приверженности соответственно. Выполняйте двусторонние ANOVA для проверки значительных различий между точками данных в лечении для трех независимых экспериментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для разработки анализа бактериальной приверженности на основе флуоресцентной визуализации штамм P. aeruginosa PAO1 и его аналог с отрицательной адгезией E. coli были использованы для проверки эффективности протокола, поскольку сообщалось о прилипании этих бактерий к клеткам A54914,20,22. Во-первых, GFP-меченый P. aeruginosa (PAO1) и GFP-меченый E. coli были совместно инкубированы с увековеченной человеком эпителиальной клеточной линией A549 на различных MOI, соответственно. Результаты показали, что PAO1 прилипает к клеткам A549 дозозависимым образом(рисунок 1A,B); в то же время было также проверено почти нулевое сцепление E. coli (рисунок 1A,B). В каждом МВД было получено и проанализировано 50 изображений. Были проведены двусторонние ANOVA для проверки значительных вариаций из трех независимых экспериментов.

Figure 1
Рисунок 1:Грамотрицательная бактерия P. aeruginosa прилипает к клеткам А549 в течение 1 ч после совместной инкубации. (A) Микроскопические изображения для обзора бактериальной адгезии, где изображения были сделаны с использованием 20-кратного увеличения. PAO1 и контроль отрицательной адгезии E. coli прилипали к клеткам A549 при указанной множественности инфекций (MOI). Бактерии были помечены GFP-флуоресценцией. Ядра клеток A549 были окрашены DAPI. Шкала составляет 50 мкм. (B) Количественная оценка количества адгезивных бактерий на клетку A549. Для каждого тестируемого бактериального штамма (PAO1 и E. coli)в каждом MOI к анализу было применено в общей сложности 50 изображений при каждом условии. Данные являются средними ± стандартным отклонением (SD) от одного представителя трех независимых экспериментов. Проведен двусторонний статистический анализ ANOVA. * p < 0,05, *** p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Аналогичные результаты наблюдались также при использовании грамположительных бактерий, L. monocytogens23,24 и его отрицательного контрольного B. subtilis (рисунок 2A,B). Приверженность к клеткам A549 была значительной у L. monocytogenes, чем у B. subtilis (рисунок 2A,B).

Figure 2
Рисунок 2:Грамположительные бактериальные L. monocytogenes прилипали к клеткам A549 в течение 1 ч после коинкубации. (A) Микроскопические изображения для обзора L. monocytogenes,а также отрицательного контроля B. subtilis приверженности к клеткам A549 на различных MOI. Бактерии окрашивались с использованием красного флуоресцентного красителя. Ядра клеток A549 окрашивали DAPI. Шкала составляет 50 мкм.(B)Количественная оценка количества адгезивных бактерий на клетку A549. Для каждого тестируемого бактериального штамма(L. monocytogenes и B. subtilis)в каждом MOI к анализу при каждом условии было применено в общей сложности 50 изображений. Данные являются средними ± SD от представителя трех независимых экспериментов. Проведен двусторонний статистический анализ ANOVA. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Репрезентативное изображение сегментации и подсчетов P. aeruginosa, адгезивного хозяина, показано на рисунке 3 (Желтые маски: выделенные бактерии, красный контур: количество одиночных бактерий). Настройки как для мишеней для хозяина, так и для бактерий описаны в разделе Протокол.

Figure 3
Рисунок 3:Пример изображений бактериальной сегментации и подсчета в автоматизированном процессе анализа. (A) Микроскопические изображения P. aeruginosa прилипают к A549 при MOI 100 без бактериальной сегментации и подсчета. (B) То же изображение после статистического анализа бактериальной сегментации и подсчета. Желтые маски: выделенные бактерии, красный контур: количество одиночных бактерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты автоматизированных анализов, включая размеры и площади клеток-хозяев, количество бактериальных и клеток-хозяев, а также среднее количество бактерий на клетку-хозяина, представляющее состояние здоровья клеток-хозяев, уровень приверженности бактерий и бактериальную цитотоксичность, перечислены в Таблицах 1 и 2. Таблица 1 представляет количество адгезивных бактерий на среднем клеточном уровне из различных изображений, в то время как таблица 2 представляет количество адгезивных бактерий, проанализированных на одном изображении на одном клеточном уровне A549. Эти репрезентативные изображения были получены из клеток A549, инфицированных PAO1 при MOI 100. Проанализированные результаты исходного изображения на рисунке 3 были перечислены как Изображение 1 в Таблице 1 и Таблице 2.

Таблица 1: Результаты статистического анализа 9 репрезентативных изображений на клеточном уровне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

На каждом изображении количество сумм хозяина и пятна бактериальной суммы представляют собой общее количество ядер хозяина и общее количество бактерий, распознаваемое системой на основе параметров, описанных выше, соответственно. Кроме того, автоматизированный расчет соотношения бактериальных пятен представляет собой среднее количество бактерий на клетку-хозяина, полученное из количества количества пятен бактерий / суммы хозяина. Кроме того, могут быть включены дополнительные показания; например, количество бактерий-адгезивных хозяев иллюстрирует универсальное или специфическое явление приверженности бактерий-хозяев. Когда количество бактерий-адгезивных хозяев намного меньше, чем количество суммы хозяина, напротив, среднее количество бактерий на одного хозяина относительно велико, что означает, что такой фенотип приверженности имеет значительную гетерогенность.

Таблица 2: Одноклеточный статистический анализ репрезентативного изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Сингулярный клеточный анализ предоставляет более подробную информацию о клетках-хозяевах и бактериальных мишенях на каждом изображении, что более полезно при сборе других бактериальных признаков и применении их к автоматизированному вычислительному анализу для разработки более мощного инструмента оценки потенциальной бактериальной патогенности, такого как модель машинного обучения, которая изучается. В этом протоколе размер и площадь хозяина представляют диаметры и области каждого окрашенного ядра хозяина, а интенсивность флуоресценции хозяина представляет собой среднюю интенсивность окрашенных ядер. Количество и площадь бактериальных пятен представляют собой адгезивные бактериальные мишени для каждой клетки-хозяина и их общие площади. Интенсивность бактериальной флуоресценции представляет собой среднюю интенсивность всех адгезивных бактерий.

Неудивительно, что некоторые вирулентные бактерии не придерживались A549, в то время как некоторые бактерии с высоким уровнем бактериальной приверженности не обязательно коррелируют с патогенностью. Другой тип клетки-хозяина, HUVECs, также был протестирован для максимального применения этого метода. Результаты показали эффективное обнаружение и различные фенотипы адгезии бактерий(рисунок 4). Различные клетки-хозяева могут увеличить оценку потенциальных бактериальных патогенов; например, патогенные Serratia rubidaea и Streptococcus agalactiae были прилипшими к HUVEC, но не к клеткам A549(рисунок 4). Кроме того, цитотоксическая энтерогеморрагическая Кишечная палочка (ЭГКП) не была присоединена ни к A549, ни к HUVEC(рисунок 4). Поэтому крайне важно убедиться, что метод подходит для нескольких типов клеток-хозяев, чтобы реагировать на специфичность взаимодействий между хозяином и бактериями. Клетки A549 и HUVEC совместно инкубировали с бактериями при MOI 100 при 37 °C в течение 1 ч.

Figure 4
Рисунок 4:Специфичность бактериальной адгезии к клеткам хозяина A549 и HUVEC. Бактериальные штаммы, включая S. rubidaea, S. agalactiae, цитотоксические Enterohemorrhagic E. coli (EHEC), PAO1,P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP),E. coli, S. aureus и S. aureus ΔsaeR,были протестированы на клетках A549 и HUVEC при MOI 100 в течение 1 ч коинкубации при 37 °C, 5% CO2. Бактерии были окрашены красным флуоресцентным красителем. Количество адгезивных бактерий было количественно определено по 45 изображениям / бактериальному штамму в трех независимых экспериментах. Данные являются средними ± SD от одного представителя трех независимых экспериментов. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** p<0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол описывает автоматизированный подход к перечислению бактериальной привязанности к клеткам-хозяевам. Описанный подход имеет ряд привлекательных преимуществ перед обычными методами. Во-первых, этот подход позволяет точно количественно оценить количество клеток микробного патогена, которые прикреплены к отдельным клеткам-хозяевам. Важно отметить, что эта количественная оценка может быть выполнена без необходимости трудоемкого сбора бактерий, последовательного разбавления, нанесения покрытий на твердые среды и определенияКОЕ 10,11,12. Таким образом, описанный метод снижает общую рабочую нагрузку, необходимую для количественной оценки бактериальной приверженности. Следует понимать, что преимущества предлагаемого подхода усиливаются при стремлении обнаружить фенотипы адгезии в крупномасштабных скрининговых экспериментах, включая идентификацию бактериальных генов или генов-хозяев в мутантных или CRISPR-библиотеках, соответственно, которые регулируют этот процесс. Во-вторых, прямая оценка взаимодействий между клетками-хозяевами и бактериальными клетками с помощью флуоресцентной микроскопии предоставляет информацию для выяснения механизмов бактериальной патогенности, включая изменения в выживании клетки-хозяина или бактериальной клетки, морфологию или динамику. Наконец, автоматизированный статистический анализ, выполненный на изображениях, собранных в анализе, не только обеспечивает общую количественную оценку средней бактериальной ассоциации с клетками-хозяевами, но также позволяет оценить динамические, одноклеточные взаимодействия хозяин-патоген.

Несмотря на эти преимущества, описанные методы имеют некоторые важные ограничения. Во-первых, флуоресцентное окрашивание бактерий требуется для перечисления их прилипания к клеткам-хозяевам. Таким образом, флуоресцентный окрашивающий краситель должен избирательно окрашивать бактерии, чем их аналоги из клеток-хозяев. Кроме того, окрашивающий краситель не должен изменять фенотип прикрепления бактерий, которые его переносят. Поэтому оптимизация бактериального флуоресцентного окрашивания (например, концентрация, продолжительность окрашивания) должна быть определена до выполнения описанных исследований адгезии. В этом протоколе флуоресцентное окрашивание бактериальных штаммов, включая P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli и B. subtilis в течение 30 мин, не влияет на их приверженность клеткам-хозяевам. Во-вторых, из-за специфичности различных взаимодействий между хозяином и бактерией одного типа клеток-хозяев может быть недостаточно для оценки бактериальной привязанности к клеткам-хозяевам. Таким образом, для получения полного понимания степени, в которой данный микроб может прилипать к поверхностям клеток-хозяев, может потребоваться несколько типов клеток-хозяев. В-третьих, бактериальная сегментация не была полностью эффективной, когда бактерии стимулировали агрегацию во время совместной инкубации, например, S. aureus,или когда бактерии образовывали скопления при более высоком MOI (>100), например, P. aeruginosa. В этом случае для захвата изображений следует применить более высокое увеличение, или при анализе следует использовать больше изображений, чтобы уменьшить эффект бактериальной агрегации.

Эпителиальные клетки легких человека (A549) и HUVEC были использованы в исследованиях, чтобы продемонстрировать пластичность подхода по отношению к типу клеток-хозяев, и оба показали высокий уровень восприимчивости к бактериальной приверженности. Использование двух типов клеток-хозяев также продемонстрировало, что описанный способ может быть широко применен для быстрой характеристики адгезивных взаимодействий между хозяином и бактерией.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У всех авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Мы благодарны доктору Кайте Злотковски из Biotek Inc. за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством обороны по контракту W911NF1920013 с PdF, Агентством перспективных оборонных исследовательских проектов (DARPA) и Министерством внутренних дел по контракту No 140D6319C0029 с PdF. Содержание информации не обязательно отражает позицию или политику правительства, и не следует делать никаких выводов об официальном одобрении.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Автоматизированное, высокопроизводительное обнаружение бактериальной приверженности клеткам-хозяевам
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter