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Summary
使用高通量荧光标记成像以及自动统计分析方法，基于表型粘附性检测宿主 - 细菌病原体相互作用，可以快速评估细菌与宿主细胞的潜在相互作用。
Abstract
识别新出现的细菌病原体对人类健康和安全至关重要。细菌对宿主细胞的粘附是细菌感染的重要步骤，并构成潜在威胁的标志。因此，检查细菌对宿主细胞的粘附性可以用作细菌威胁评估的一个组成部分。枚举细菌对宿主细胞的粘附的标准方法是将细菌与宿主细胞共同孵育，收获贴壁细菌，将收获的细胞接种在固体培养基上，然后计算所得的菌落形成单位（CFU）。或者，可以使用基于免疫荧光显微镜的方法评估细菌对宿主细胞的依从性。然而，实施这些方法的传统策略既耗时又低效。在这里，描述了最近开发的基于自动荧光显微镜的成像方法。当与高通量图像处理和统计分析相结合时，该方法可以快速定量粘附在宿主细胞上的细菌。测试了两种细菌物种，铜绿革兰氏阴 性假单胞菌 和革兰氏阳性 单核细胞增多性李斯特菌 以及相应的阴性对照，以证明方案。结果表明，这种方法可以快速准确地枚举贴附细菌，并显着减少实验工作量和时间表。
Introduction
细菌粘附是细菌附着在其他细胞或表面上的过程。细菌病原体感染的成功建立需要粘附于宿主细胞，定植组织，并且在某些情况下，侵入宿主细胞1，2，3。新出现的传染病构成重大的公共卫生威胁，最近的COVID-19大流行4，5，6证明了这一点。重要的是，使用基于基因组的方法可能无法轻易识别新的或正在出现的病原体，特别是在病原体被设计为逃避检测或不包含将其识别为致病性的基因组特征的情况下。因此，使用直接评估致病性特征的方法（如细菌对宿主细胞的粘附性）鉴定潜在病原体可以在病原体鉴定中起关键作用。
细菌对宿主细胞的粘附性已被用于评估细菌发病机制数十年1，7。显微成像8、9和通过感染后电镀枚举细菌集落形成单元（CFU）10、11、12、13是两种成熟的实验室方法，用于测试微生物的粘附和/或宿主细胞的感染14。考虑到细菌细胞的微米级大小，贴壁细菌细胞的枚举通常需要使用先进的高倍率显微镜技术，以及高分辨率成像方法，包括电子显微镜，膨胀显微镜（ExM）15，16和三维成像17.或者，可以通过在固体琼脂上接种收获的细菌的稀释系列并计数所得的CFU10，12，13来计数与宿主细胞结合或内化在宿主细胞内的细菌的枚举。这种方法费力，包括许多手动步骤，这给建立高通量分析所需的标准化或自动化程序带来了困难18，19。因此，开发用于评估宿主细胞附着的新方法将解决该领域当前的局限性。
这里描述了一种这样的方法，它使用自动化高通量显微镜，结合高通量图像处理和统计分析。为了证明这种方法，对几种细菌病原体进行了实验，包括铜绿假单胞菌，一种人类，动物和植物的机会性革兰氏阴性细菌病原体14，20，它经常被发现定植于宿主防御功能受损患者的呼吸道。这种方法优化了先前研究14，20中描述的显微成像过程。通过荧光标记的宿主细胞和细菌简化了成像检测，以快速跟踪它们的接近程度，这大大减少了显微镜工作量，以获得用于区分细菌的高分辨率图像。此外，对计数宿主细胞和细菌中的图像进行自动统计分析取代了细菌CFU接种的动手实验，以估计每个宿主细胞的贴壁细菌计数的比率。为了证实该方法的相容性，还测试了多种细菌菌株和宿主细胞类型，如单核细胞增多性李斯特菌，金黄色葡萄球菌，蜡样芽孢杆菌和肺炎克雷伯菌，以及人脐静脉内皮细胞（HUVECs），结果支持该方法的多样性和有效性。
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Protocol
1. A549细胞培养
- 将A549细胞系维持在补充有10%胎牛血清（FBS）的F-12K培养基中，并在37°C，5%CO2下孵育。
- 每3-4天更换一次培养基，以85%-95%的汇合度通过。
- 简而言之，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4，除非另有说明）冲洗细胞，并在37°C下用1ml 0.25%胰蛋白酶-0.53mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（浸没细胞层）处理约2分钟。
- 加入额外的6mL完全生长培养基（F-12K培养基+ 10%FBS）以停止蛋白酶活性。然后，将细胞以1：3-1：8的沉降比接种在无菌聚苯乙烯T-75组织培养瓶中。最终培养体积为12mL。
- 在粘附测定前一天将约1 x 104 个A549细胞（细胞浓度：~1×105 个细胞/ mL）接种到96孔板的每个孔上。
2. 细菌生长和染色
- 在生物安全柜，生物安全2级实验室中执行所有细菌工作。
- 从冷冻甘油储备中接种所有细菌培养物，包括铜绿假单胞菌（PAO1），大肠杆菌，单核细胞增多性李斯特菌和枯草芽孢杆菌等，并在37°C的振荡培养箱中在37°C下在250rpm下振荡培养的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB，3mL）中生长它们。
- 第二天，使用1：100稀释的过夜培养物接种传代培养物，并在TSB（1mL）中生长3小时至指数相，测量600nm处的OD（OD600）以确认。确保 OD600 在 0.4-0.6 的范围内。
- 在进行细菌 - 宿主依从性测定之前，将板连续稀释细菌悬浮液到TSB-琼脂平板上，在37°C下孵育过夜，然后从菌落数量中建立细菌CFU。对于 铜绿假单胞菌，OD600 为1.0对应于2 x 108 活细菌细胞/mL，而对于 单核细胞增多性李斯特菌，OD600 为1.0对应于9 x 108 活细菌细胞/mL。
- 通过在室温（RT）下以13，000×g离心2分钟，在指数相上收获细菌培养物，然后使用1x PBS（1mL）洗涤一次。将细菌沉淀重悬于1mL 1x PBS中，并通过测量OD600细菌悬浮液来确定浓度。例如，OD600为0.5的铜绿假单胞菌代表1×108个细菌细胞/ mL的浓度。
- 在室温下使用绿色或红色荧光染料染色细菌悬浮液30分钟，在黑暗中轻轻旋转。为此，将2μL500倍浓缩的储备染色染料加入1mL细菌悬浮液中以稀释染料1倍。为了洗掉染色染料，将染色的细菌以13，000×g离心2分钟，并将沉淀重悬于1mL的1x PBS中三次。
注意：如果在实验中使用荧光（GFP-，RFP-，mCherry-等）标记的细菌，则跳过此细菌染色步骤。GFP-标记 的铜绿假单胞 菌和红色荧光染料染色 的单核细胞增多性李斯特菌 用于该方案。 - 通过以13，000×g离心2分钟收集染色的细菌细胞或GFP标记的细菌。 重悬于新鲜的F-12K培养基（1 mL）中，并测量每种培养物的OD600。 随后根据感染（MOI）的多样性和宿主细胞浓度将培养物稀释至所需浓度。本实验中使用的最终体积为500μL。
注意：例如，如果使用台盼蓝染色计数的宿主细胞浓度为1 x 105 个细胞/ mL，则MOI为100的细菌细胞的所需浓度将为1 x 107 个细胞/ mL。铜绿假单胞菌 在0.5 OD600 下的浓度为1×108/mL。为了获得所需的浓度，将 铜绿假单胞菌 培养物稀释10倍，将50μL重悬培养物加入450μL新鲜F-12K培养基中。
3. 细菌粘附和宿主细胞染色
- 首先，用温热的1x PBS洗涤接种的A549细胞单层三次。对于每次洗涤，向每个孔中加入100μL1x PBS，轻轻地上下移液三次，处理1x PBS或在添加后等待10秒，然后真空除去1x PBS。为了确定细菌关联的动力学，用100μL所需浓度的细菌悬浮液覆盖细胞，并具有不同的MOI（0，1，10和100）。将细菌以200×g旋转10分钟，并将受感染的A549细胞在37°C，5%CO2下再孵育1小时。
注意：在此实验中，每个条件都有一个技术上的一式三份。 - 如上所述，通过用温热的1x PBS洗涤单层五次来去除未结合的细菌。将100μL4%甲醛（在1x PBS中）加入96孔板的每个孔中以固定细胞。让盘子在冰上静置15分钟，然后用1x PBS洗掉固定溶液三次。
- 要染色细胞核，加入50 ng / mL的4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），并在室温下孵育10分钟。孵育后，使用1x PBS洗涤孔三次。用100μL的1x PBS覆盖受感染的A549细胞以避免干燥。处理下一步或在黑暗中将板在4°C下储存长达2天。
4. 自动荧光成像、处理和分析
- 为了保持数据的完整性，随机和手动选择每个孔的五个位置，以20倍放大倍率捕获图像。分别在DAPI和GFP通道下捕获A549细胞和细菌的荧光图像。使用PE-Cy5通道对红色荧光染料染色的细菌。
- 要获得更好的分辨率，请处理所有图像以进行背景拼合和解卷积。将参数设置为滚动球直径为68 μm，用于平滑和自动测量基于物镜的图像反卷积的点扩散函数（PSF）。
- 要对所有合格的细胞和细菌进行计数，测量宿主细胞和细菌的荧光强度，并将宿主细胞和细菌的最弱荧光强度设置为细胞计数的阈值。计数15μm距离内靠近宿主细胞的所有细菌，因为贴壁细菌为A549细胞的直径为10.59-14.93μm21。
注意：成像系统中的默认设置选择性地计数直径范围为5-100μm的宿主细胞和大小为0.2-5μm（宽度和长度）的细菌。 - 根据上述手动图像处理结果，将图像平滑、反卷积、物体大小、距离和荧光强度等参数应用于其余的自动图像。自动分析后，考虑关键读数，例如宿主细胞总计数，细胞大小和形状，总细菌计数以及每个宿主细胞的平均细菌计数，这是最重要的指标，以确定细菌粘附性。
- 数据导出和统计分析
- 将所有图像的分析结果导出到电子表格（例如，"xlsx"格式）。自动化系统生成两组结果：1）每个图像的平均粘附细菌计数;2）每个单宿主细胞的信息性数据，如单个细胞上的贴壁细菌计数、宿主大小、宿主细胞和细菌的平均荧光强度等，来自相应的图像。
- 计算所有图像中粘附细菌计数的平均数和标准差，以表示与阴性对照相比的细菌粘附水平。在这种方法中， 大肠杆菌 和 枯草芽孢杆菌 分别作为检测革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌依从性的阴性对照。执行双向ANOVA以测试三个独立实验中治疗中数据点之间的显着差异。
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Representative Results
为了开发基于荧光成像的细菌粘附测定法，使用铜绿假单胞菌菌株PAO1及其阴性粘附对应物大肠杆菌来测试方案有效性，因为这些细菌对A549细胞的粘附已有报道14，20，22。首先，分别在各种MOI下将GFP标记的铜绿假单胞菌（PAO1）和GFP标记的大肠杆菌与人类永生化上皮细胞系A549共同孵育。结果表明，PAO1以剂量依赖性方式粘附在A549细胞上（图1A，B）;同时，还验证了大肠杆菌的近乎零的依从性（图1A，B）。每个MOI捕获并分析了50张图像。进行双向ANOVA以测试三个独立实验的显着变化。
图1：革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌在共孵育1小时内粘附在A549细胞上。（A） 显微图像，用于概述细菌粘附，其中图像是使用20倍放大倍率拍摄的。PAO1和阴依从性对照大肠杆菌在指示的感染多重性（MOIs）下粘附在A549细胞上。细菌被GFP荧光标记。用DAPI对A549细胞核进行染色。比例尺为50μm.（B）定量每个A549细胞的贴壁细菌计数。对于每个MOI中每个测试的细菌菌株（PAO1和大肠杆菌），在每种条件下总共应用了50张图像进行分析。数据是来自三个独立实验中一个代表的均值±标准偏差（SD）。进行了双向方差分析统计分析。* p < 0.05， *** p < 0.001。请点击此处查看此图的放大版本。
当使用革兰氏阳性细菌，单核细胞增多原L.23，24及其阴性对照枯草芽孢杆菌时，也观察到类似的结果（图2A，B）。在单核细胞增多性李斯特菌中，对A549细胞的粘附比枯草芽孢杆菌显著（图2A、B）。
图2：革兰氏阳性细菌单核细胞增多性李斯特菌在共孵育1小时内粘附在A549细胞上。（A） 显微镜图像，用于概述单核细胞增多性李斯特菌，以及阴性对照枯草芽孢杆菌在不同MOI下对A549细胞的依从性。使用红色荧光染料对细菌进行染色。用DAPI染色A549细胞核。比例尺为50μm.（B）定量每个A549细胞的贴壁细菌计数。对于每个MOI中每个测试的细菌菌株（单核细胞增多性李斯特菌和枯草芽孢杆菌），在每种条件下总共应用了50张图像进行分析。数据是来自三个独立实验代表的SD平均值±。进行了双向方差分析统计分析。** p < 0.01， *** p < 0.001。请点击此处查看此图的放大版本。
宿主贴壁 铜绿 假单胞菌分割和计数的代表性图像如图 3 所示（黄色口罩：选定的细菌，红色轮廓：单个细菌计数）。宿主和细菌靶标的设置在"实验方案"部分进行了介绍。
图3：自动分析过程中细菌分割和计数的示例图像。（A）铜绿假单胞菌的显微图像在MOI为100时粘附在A549上，没有细菌分割和计数。（二）同一图像经统计分析后对细菌进行分割和计数。黄色口罩：选定的细菌，红色轮廓：单个细菌计数。请点击此处查看此图的放大版本。
自动分析的结果，包括宿主细胞大小和面积，细菌和宿主细胞计数，以及每个宿主细胞的平均细菌计数，代表宿主细胞健康状态，细菌粘附水平和细菌细胞毒性，列于表1和表2中。表1表示来自不同图像的平均细胞水平上的贴附细菌计数，而表2表示在单个A549细胞水平上分析的一张图像上的贴附细菌计数。这些代表性图像是从被PAO1感染的A549细胞中以100的MOI捕获的。图3中初始图像的分析结果在表1和表2中列为图像1。
表1：9张代表性图像在细胞水平上的统计分析结果。请点击此处下载此表格。
在每个图像中，宿主总和计数和细菌总和点分别表示系统根据上述参数识别的宿主核和细菌总数。此外，细菌斑点比的自动计算代表了每个宿主细胞的平均细菌计数，该计数来自细菌总斑点/宿主总和计数。此外，还可以包括其他读数;例如，细菌粘附宿主计数说明了宿主细菌粘附的普遍或特定现象。当细菌粘附宿主计数远小于宿主总计数时，相反，每个宿主的平均细菌计数相对较高，这表示这种粘附表型具有显着的异质性。
表2：代表性图像的单细胞统计分析。请点击此处下载此表格。
奇异细胞分析提供了有关每个图像中宿主细胞和细菌靶标的更多详细信息，这在收集其他细菌特征并将其应用于自动计算分析以开发更强大的工具以评估潜在的细菌致病性时更有用，例如正在研究的机器学习模型。在该协议中，宿主大小和面积代表每个染色宿主核的直径和面积，宿主荧光强度表示染色核的平均强度。细菌斑点计数和面积表示每个宿主细胞的贴附细菌靶标及其总面积。细菌荧光强度代表所有贴附细菌的平均强度。
毫不奇怪，一些有毒细菌不粘附于A549，而一些具有高水平细菌粘附性的细菌不一定与致病性相关。还测试了另一种宿主细胞类型HUVECs，以最大限度地利用该方法。结果显示细菌的有效检测和不同的粘附表型（图4）。不同的宿主细胞可以增加对潜在细菌病原体的估计;例如，致病性 红沙雷氏菌和 无乳链球菌 粘附于HUVEC，但不粘附于A549细胞（图4）。此外，细胞毒性肠出血性 大肠杆菌 （EHEC）对A549或HUVEC不粘附（图4）。因此，确保该方法适用于多种宿主细胞类型以响应宿主 - 细菌相互作用的特异性至关重要。将A549和HUVEC细胞与细菌在37°C下以100的MOI共培养1小时。
图4：细菌对宿主A549和HUVEC细胞的粘附特异性。在A549和HUVEC细胞上对包括红葡萄球菌，无乳链球菌，细胞毒性肠出血性大肠杆菌（EHEC），PAO1，铜绿假单胞菌ΔpilA（PAO-NP），大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌ΔsaeR在内的细菌菌株在A549和HUVEC细胞上进行了测试，MOI为100，在37°C，5%CO2下共孵育1小时。用红色荧光染料染色细菌。在三个独立实验中，从45张图像/细菌菌株中量化了贴壁细菌计数。数据是来自三个独立实验中一个代表的SD平均值±。* p < 0.05， *** p < 0.001， **** p<0.0001。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
该协议描述了一种用于枚举细菌附着在宿主细胞上的自动化方法。与传统方法相比，所描述的方法具有几个有吸引力的优点。首先，这种方法能够精确定量附着在单个宿主细胞上的微生物病原体细胞的数量。重要的是，这种定量可以在不需要费力的细菌收获，连续稀释，在固体培养基上电镀以及CFU10，11，12的测定的情况下进行。因此，所描述的技术减少了量化细菌粘附性所需的总体工作量。应当理解，在大规模筛选实验中寻求检测依从性表型时，所提出方法的优点被放大，包括分别鉴定突变体或CRISPR文库中调节这一过程的细菌或宿主基因。其次，使用荧光显微镜直接评估宿主和细菌细胞之间的相互作用，为阐明细菌致病机制提供了信息，包括宿主或细菌细胞存活，形态或动力学的改变。最后，对分析中收集的图像进行的自动统计分析不仅可以全面量化细菌与宿主细胞的平均关联，还可以评估动态，单细胞，宿主 - 病原体相互作用。
尽管有这些优点，但所描述的方法具有一些重要的局限性。首先，需要对细菌进行荧光染色以列举它们对宿主细胞的粘附。因此，荧光染色染料必须比宿主细胞对应物选择性地染色细菌。此外，染色染料不得改变携带它的细菌的附着表型。因此，细菌荧光染色的优化（例如，浓度，染色持续时间）必须在执行所述依从性研究之前确定。在该协议中，对包括 铜绿假单胞菌，单核细胞增多性李斯特朗，大肠杆菌 和 枯草 芽孢杆菌在内的细菌菌株进行荧光染色30分钟不会影响它们对宿主细胞的粘附。其次，由于不同宿主 - 细菌相互作用的特异性，单个宿主细胞类型可能不足以评估细菌与宿主细胞的附着。因此，可能需要多种宿主细胞类型才能完全了解给定微生物可以粘附在宿主细胞表面的程度。第三，当细菌在共孵育期间推动聚集时，例如 金黄色葡萄球菌，或者当细菌在较高的MOI（>100）处形成团块时，细菌分割不完全有效，例如 铜绿假单胞菌。在这种情况下，应应用更高的放大倍率来捕获图像，或者在分析中应使用更多图像以减少细菌聚集的影响。
在研究中采用了人肺上皮细胞（A549）和HUVECs来证明该方法相对于宿主细胞类型的可塑性，并且两者都对细菌粘附表现出高水平的易感性。两种宿主细胞类型的使用也表明，所述方法可以广泛用于快速表征贴壁宿主 - 细菌相互作用。
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Disclosures
所有作者均无需披露任何利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Biotek Inc.的Kaite Zlotkowski博士的技术支持。这项工作得到了国防部的支持，合同号为W911NF1920013到PdF，国防高级研究计划局（DARPA）和内政部根据合同号140D6319C0029到PdF。资料的内容不一定反映政府的立场或政策，不应推断官方认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
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Tags
免疫学和感染，第175期，Erratum
Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022.
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An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine
