Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الكشف الآلي عالي الإنتاجية عن الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

الكشف عن التفاعلات الممرضة البكتيرية المضيفة على أساس الالتزام phenotypic باستخدام عالية الإنتاجية التصوير الوسم الفلوري جنبا إلى جنب مع أساليب التحليل الإحصائي الآلي تمكن التقييم السريع للتفاعلات البكتيرية المحتملة مع الخلايا المضيفة.

Abstract

تحديد مسببات الأمراض البكتيرية الناشئة أمر بالغ الأهمية لصحة الإنسان وأمنه. يعد الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة خطوة أساسية في العدوى البكتيرية ويشكل سمة مميزة للتهديد المحتمل. لذلك ، يمكن استخدام فحص التزام البكتيريا بالخلايا المضيفة كعنصر من عناصر تقييم التهديد البكتيري. وهناك طريقة قياسية لتعداد الالتزام البكتيري للخلايا المضيفة هو المشاركة في احتضان البكتيريا مع الخلايا المضيفة، وحصاد البكتيريا الملتصقة، ولوحة الخلايا المحصودة على وسائل الإعلام الصلبة، ومن ثم عد وحدات تشكيل مستعمرة الناتجة (CFU). بدلا من ذلك، يمكن تقييم الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة باستخدام النهج القائمة على المجهر المناعي. بيد أن الاستراتيجيات التقليدية لتنفيذ هذه النهج تستغرق وقتا طويلا ولا تتسم بالكفاءة. هنا، يتم وصف طريقة التصوير الآلي المضروبة القائمة على الفلورسينس التي تم تطويرها مؤخرا. عند دمجها مع معالجة الصور عالية الإنتاجية والتحليل الإحصائي ، تمكن الطريقة من التحديد الكمي السريع للبكتيريا التي تلتزم بالخلايا المضيفة. تم اختبار نوعين بكتيريين ، السودوموناس aeruginosa سلبية الغرام والليستيريا monocytogenes إيجابية الغرام والضوابط السلبية المقابلة ، لإثبات البروتوكول. وتبين النتائج أن هذا النهج يعدد بسرعة ودقة البكتيريا الملتصقة ويقلل بشكل كبير من أعباء العمل التجريبية والجداول الزمنية.

Introduction

الالتصاق البكتيري هو عملية حيث ترتبط البكتيريا بالخلايا أو الأسطح الأخرى. النجاح في إنشاء العدوى من قبل مسببات الأمراض البكتيرية يتطلب التصاق الخلايا المضيفة، والاستعمار من الأنسجة، وفي بعض الحالات، غزو الخلايا المضيفة1،2،3. تشكل الأمراض المعدية الناشئة تهديدات رئيسية للصحة العامة، كما يتضح من جائحة COVID-19 الأخيرة4و5و6. والأهم من ذلك، قد لا يمكن تمييز مسببات الأمراض الجديدة أو الناشئة بسهولة باستخدام النهج القائمة على الجينوم، لا سيما في الحالات التي تم فيها تصميم العامل الممرض للتهرب من الكشف أو لا يحتوي على توقيعات جينومية تحدده على أنه مسبب للأمراض. لذلك ، فإن تحديد مسببات الأمراض المحتملة باستخدام الطرق التي تقيم مباشرة السمات المميزة للتسبب في المرض ، مثل الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة ، يمكن أن يلعب دورا حاسما في تحديد مسببات الأمراض.

وقد استخدم الالتزام البكتيري للخلايا المضيفة لتقييم آليات الإمراض البكتيري لعقود1،7. التصوير المجهري8،9 وعدد وحدة تشكيل المستعمرة البكتيرية (CFU)10،11،12،13 عن طريق طلاء ما بعد العدوى هما طريقتان مختبريتان متطورتان لاختبار الالتزام الميكروبي و / أو عدوى الخلايا المضيفة14. بالنظر إلى حجم مقياس ميكرومتر للخلايا البكتيرية ، فإن تعداد الخلايا البكتيرية الملتصقة يتطلب بشكل عام استخدام تقنيات المجهر المتقدمة عالية التكبير ، وكذلك نهج التصوير عالي الدقة ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني ، والتنظير المجهري التوسعي (ExM)15،16، والتصوير ثلاثي الأبعاد17 . بدلا من ذلك ، يمكن إجراء تعداد البكتيريا المرتبطة أو المستوعبة داخل الخلايا المضيفة عن طريق طلاء سلسلة التخفيف من البكتيريا المحصودة على أجار صلب وحساب CFUsالناتجة 10،12،13. هذه الطريقة شاقة وتتضمن العديد من الخطوات اليدوية ، والتي تقدم صعوبات في إنشاء إجراء موحد أو آلي مطلوب للتحليلات عالية الإنتاجية18،19. ولذلك، فإن تطوير أساليب جديدة لتقييم مرفق الخلية المضيفة سيعالج القيود الحالية في الحقل.

ويرد وصف إحدى هذه الطرق هنا التي تستخدم المجهر الآلي عالية الإنتاجية، جنبا إلى جنب مع معالجة الصور ذات الإنتاجية العالية والتحليل الإحصائي. لإثبات هذا النهج ، تم إجراء تجارب مع العديد من مسببات الأمراض البكتيرية ، بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa، وهو ممرض بكتيري انتهازي سلبي الغرام من البشر والحيوانات والنباتات14،20، والذي غالبا ما يتم العثور عليه لاستعمار الجهاز التنفسي للمرضى الذين يعانون من ضعف وظائف الدفاع المضيف. هذا النهج الأمثل لعملية التصوير المجهرية الموصوفة في الدراسات السابقة14،20. تم تبسيط الكشف عن التصوير من خلال الخلايا المضيفة والبكتيريا ذات العلامات الفلورية لتتبع قربها بسرعة ، مما قلل بشكل كبير من عبء عمل المجهر للحصول على صور عالية الدقة لتمييز البكتيريا. بالإضافة إلى ذلك ، حل التحليل الإحصائي الآلي للصور في عد الخلايا المضيفة والبكتيريا محل التجربة اليدوية للطلاء البكتيري CFU لتقدير نسبة العد البكتيري الملتصق لكل خلية مضيفة. لتأكيد توافق هذه الطريقة ، تم اختبار العديد من السلالات البكتيرية وأنواع الخلايا المضيفة ، مثل الليستيريا أحادية الخلايا، المكورات العنقودية، عصيات cereus ، والالتهاب الرئوي Klebsiella ، وكذلك الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVECs) ، وتدعم النتائج تنوع وفعالية الطريقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة الخلية A549

  1. الحفاظ على خط الخلية A549 في F-12K المتوسطة تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  2. تغيير المتوسط كل 3-4 أيام والمرور في التقاء 85٪-95٪.
  3. باختصار، شطف الخلايا مع 1 × الفوسفات العازلة المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4، ما لم يشر إلى خلاف ذلك) وعلاج مع 1 مل من 0.25٪ تريبسين-0.53 mM حمض الإيثيلينديامينتتراستيك (EDTA) حل (غمر طبقة الخلية) لمدة 2 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  4. إضافة إضافية 6 مل من متوسط النمو الكامل (F-12K المتوسط + 10٪ FBS) لوقف نشاط بروتيز. ثم، لوحة الخلايا في قارورة زراعة الأنسجة البوليسترين T-75 معقمة بنسبة subcultivation من 1:3-1:8. الحجم النهائي للثقافة هو 12 مل.
  5. البذور ما يقرب من 1 ×10 4 A549 الخلايا (تركيز الخلية: ~ 1 ×10 5 خلايا / مل) على كل بئر من لوحة 96 جيدا قبل يوم واحد من المقايسات الالتزام.

2. نمو البكتيريا وتلطيخ

  1. قم بأداء جميع الأعمال البكتيرية في خزانة السلامة الحيوية، مختبر السلامة البيولوجية المستوى 2.
  2. تلقيح جميع الثقافات البكتيرية، بما في ذلك P. aeruginosa (PAO1)، Escherichia. القولونية، L. monocytogenes، وB. subtilis، الخ، من مخزون الجلسرين المجمدة وتنمو لهم في مرق الصويا Tryptic (TSB، 3 مل) في حاضنة تهتز في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها الحفاظ عليها في 250 دورة في الدقيقة.
  3. في اليوم التالي، استخدم تخفيف 1:100 للثقافة بين عشية وضحاها لتطعيم ثقافة فرعية ونمت لهم في TSB (1 مل) لمدة 3 ساعة إلى المرحلة الأسية، وقياس OD في 600 نانومتر (OD600) لتأكيد. تأكد من أن OD600 في نطاق 0.4-0.6.
  4. قبل إجراء اختبار الالتزام بالبكتيريا المضيفة ، تقوم مخففات طبقية متسلسلة للتعليق البكتيري على لوحات TSB-agar ، باحتضانها بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، ثم إنشاء CFUs البكتيرية من عدد المستعمرات. لP. aeruginosa, OD600 من 1.0 يتوافق مع 2 × 108 خلايا بكتيرية قابلة للحياة / مل, وبالنسبة ل. monocytogenes, OD600 من 1.0 يتوافق مع 9 × 108 خلايا بكتيرية قابلة للحياة / مل.
  5. حصاد الثقافات البكتيرية في مرحلة الأسي عن طريق الطرد المركزي في 13000 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT)، ثم غسلها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني 1x (1 مل). Resuspend الكريات البكتيرية في 1 مل من 1x برنامج تلفزيوني وتحديد التركيزات عن طريق قياس OD600 من تعليق البكتيرية. على سبيل المثال، P. aeruginosa مع OD600 من 0.5 يمثل تركيز 1 × 108 الخلايا البكتيرية / مل.
  6. لطخ التعليق البكتيري باستخدام صبغة فلورية خضراء أو حمراء في RT لمدة 30 دقيقة مع دوران لطيف في الظلام. لهذا، إضافة 2 ميكرولتر من 500 أضعاف صباغة تلطيخ الأسهم المركزة في 1 مل من التعليق البكتيري لتخفيف الصبغة 1-أضعاف. لغسل صبغة تلطيخ، الطرد المركزي البكتيريا الملطخة في 13،000 × ز لمدة 2 دقيقة وإعادة إنفاق بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x لمدة ثلاث مرات.
    ملاحظة: إذا تم استخدام البكتيريا الموسومة بالفلورسينس -(GFP-، RFP-، mCherry-، إلخ) في التجربة، ثم تخطي هذه الخطوة تلطيخ البكتيرية. GFP- الموسومة P. aeruginosa والأحمر الفلورسنت صبغ الملون L. monocytogenes استخدمت في هذا البروتوكول.
  7. جمع الخلايا البكتيرية الملطخة أو البكتيريا GFP الموسومة عن طريق الطرد المركزي في 13،000 × ز لمدة 2 دقيقة. Resuspend في جديدة F-12K المتوسطة (1 مل) وقياس OD600 من كل ثقافة. بعد ذلك تمييع الثقافات إلى التركيزات المطلوبة على أساس تعدد العدوى (MOI) وتركيز الخلية المضيفة. الحجم النهائي المستخدم في هذه التجربة هو 500 ميكرولتر.
    ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان تركيز الخلية المضيفة الذي تم عده باستخدام تلطيخ تريبان الأزرق هو 1 × 105 خلايا / مل، فإن التركيز المطلوب للخلايا البكتيرية في MOI من 100 سيكون 1 × 107 خلايا / مل. تركيز P. aeruginosa في 0.5 OD600 هو 1 × 108/ مل. للحصول على التركيز المطلوب، تمييع ثقافة P. aeruginosa 10 أضعاف، إضافة 50 ميكرولتر من الثقافة resuspended إلى 450 ميكروغرام من F-12K المتوسطة الطازجة.

3. الالتزام البكتيري وتلطيخ الخلايا المضيفة

  1. أولا، غسل أحاديات الخلية A549 المصنف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x دافئ. لكل غسل، إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x إلى كل بئر، ماصة بلطف صعودا وهبوطا ثلاث مرات، والتخلص من برنامج تلفزيوني 1x أو الانتظار لمدة 10 ثانية بعد إضافة ثم فراغ لإزالة 1x PBS. لتحديد حركية الارتباط البكتيري ، قم بتراكب الخلايا مع 100 ميكرولتر من التركيزات المرغوبة للتعليق البكتيري مع MOIs مختلفة (0 و 1 و 10 و 100). تدور أسفل البكتيريا في 200 × ز لمدة 10 دقيقة واحتضان الخلايا A549 المصابة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 ل1 ساعة إضافية.
    ملاحظة: في هذه التجربة، كان لكل شرط ثلاثي التقنية.
  2. إزالة البكتيريا غير المنضمة عن طريق غسل monolayers خمس مرات مع برنامج تلفزيوني 1x الحارة على النحو المبين أعلاه. إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ الفورمالديهايد (في برنامج تلفزيوني 1x) في كل بئر من لوحات 96 بئر لإصلاح الخلايا. دع الأطباق تجلس على الجليد لمدة 15 دقيقة ثم تغسل محلول التثبيت باستخدام برنامج تلفزيوني 1x ثلاث مرات.
  3. وصمة عار النوى، إضافة 50 نانوغرام / مل من 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) واحتضانه لمدة 10 دقيقة في RT. بعد الحضانة، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني 1x. قم بتغطية خلايا A549 المصابة ب 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x لتجنب التجفيف. عملية الخطوة التالية أو تخزين لوحة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أيام في الظلام.

4. التصوير الآلي المضان ، والمعالجة ، والتحليل

  1. للحفاظ على سلامة البيانات، اختر عشوائيا ويدويا خمسة مواقع لكل بئر لالتقاط الصور عند تكبير 20x. التقط الصور الفلورية لخلايا وبكتيريا A549 تحت قنوات DAPI وGFP على التوالي. استخدام PE-Cy5 قناة للبكتيريا الملطخة صبغة الفلورسنت الحمراء.
  2. للحصول على دقة أفضل، قم بمعالجة جميع الصور لتسطيح الخلفية وتفكيكها. تعيين المعلمات كما قطر 68 ميكرومتر من الكرة المتداول لصقل والسيارات قياس وظيفة انتشار نقطة (PSF) من deconvolution الصورة على أساس الهدف.
  3. لحساب جميع الخلايا والبكتيريا المؤهلة، قم بقياس كثافة الفلورسينس للخلايا والبكتيريا المضيفة وحدد أضعف كثافة مضانة للخلايا والبكتيريا المضيفة كعتبات لعدد الخلايا. عد جميع البكتيريا القريبة من الخلية المضيفة ضمن مسافة 15 ميكرومتر كبكتيريا معتنقة حيث يبلغ قطر الخلية A549 10.59-14.93 ميكرومتر21.
    ملاحظة: يقوم الإعداد الافتراضي في نظام التصوير بحساب الخلايا المضيفة ذات الأقطار التي تتراوح بين 5-100 ميكرومتر والبكتيريا التي تتراوح مساحتها بين 0.2-5 ميكرومتر (العرض والطول).
  4. استنادا إلى نتائج معالجة الصور اليدوية المذكورة أعلاه ، قم بتطبيق معلمات تنعيم الصور ، وفك الانفكاق ، وأحجام الكائنات ، والمسافة ، وكثافة الفلورسينس على بقية الصور الآلية. بعد التحليل الآلي، فكر في القراءات الحرجة، مثل إجمالي عدد الخلايا المضيفة، وأحجام الخلايا وأشكالها، وإجمالي عدد البكتيريا، ومتوسط عدد البكتيريا لكل خلية مضيفة، والذي كان أهم مؤشر، لتحديد الالتزام البكتيري.
  5. تصدير البيانات والتحليل الإحصائي
    1. تصدير النتائج التي تم تحليلها من جميع الصور إلى جدول بيانات (على سبيل المثال، تنسيق xlsx). النظام الآلي يولد مجموعتين من النتائج: 1) متوسط عدد البكتيريا الملتصقة من كل صورة؛ 1) متوسط عدد البكتيريا الملتصقة من كل صورة؛ (2) معدل عدد البكتيريا الملتصقة من كل صورة؛ (2) معدل عدد البكتيريا الملتصقة من كل صورة؛ (2) معدل عدد البكتيريا الملتصق 2) البيانات المفيدة لكل خلية مضيفة واحدة ، مثل العد البكتيري الملتصق على خلية واحدة ، وحجم المضيف ، ومتوسط كثافة الفلورسينس للخلية المضيفة والبكتيريا ، من الصورة المقابلة.
    2. حساب متوسط عدد الانحراف المعياري للأعداد البكتيرية الملتصقة من جميع الصور لتمثيل مستوى الالتزام البكتيري مقارنة بالضوابط السلبية. في هذه الطريقة، كان الإشريكية القولونية وB. subtilis بمثابة ضوابط سلبية في اختبار الالتزام البكتيري إيجابية الغرام والغرام، على التوالي. إجراء ANOVAs ثنائي الاتجاه لاختبار التباين الكبير بين نقاط البيانات عبر العلاج لثلاث تجارب مستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتطوير مضان التصوير القائم على فحص الالتزام البكتيري، P. aeruginosa سلالة PAO1 ونظيره السلبية الالتزام E. القولونية استخدمت لاختبار فعالية البروتوكول، كما تم الإبلاغ عن التزام هذه البكتيريا إلى خلايا A54914،20،22. أولا، تم احتضان GFP- المسمى P. aeruginosa (PAO1) وGFP المسمى E. coli مع خط الخلية الظهارية الخالد البشري A549 في مختلف MOIs، على التوالي. وأظهرت النتائج أن PAO1 تلتزم A549 الخلايا بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 1A,B); في غضون ذلك، قرب الالتزام فارغة من كولاي E. كما تم التحقق (الشكل 1A،B). تم التقاط 50 صورة وتحليلها في كل وزارة الداخلية. وأجريت انوفاس ثنائية الاتجاه لاختبار الاختلافات الكبيرة من ثلاث تجارب مستقلة.

Figure 1
الشكل 1:الغرام سلبية البكتيرية P. aeruginosa انضمت إلى خلايا A549 في غضون 1 ساعة من الحضانة المشتركة. (أ)الصور المجهرية للحصول على نظرة عامة على الالتزام البكتيري حيث تم التقاط الصور باستخدام التكبير 20x. PAO1 ومكافحة الالتزام السلبي E. القولونية انضمت إلى خلايا A549 في تعدد المشار إليها من العدوى (MOIs). كانت البكتيريا GFP-مضان الموسومة. A549 كانت ملطخة نواة الخلية من قبل DAPI. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر (ب) القياس الكمي للأعداد البكتيرية الملتصقة لكل خلية A549. لكل سلالة بكتيرية مختبرة (PAO1 و E. coli)في كل وزارة الداخلية، تم تطبيق ما مجموعه 50 صورة على التحليل في كل حالة. البيانات هي متوسط الانحراف المعياري ± (SD) من ممثل واحد لثلاث تجارب مستقلة. وقد تم إجراء التحليل الإحصائي ANOVA ثنائي الاتجاه. * ص < 0.05 ، *** ع < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كما لوحظت نتائج مماثلة عندما استخدمت البكتيريا إيجابية الغرام، L. monocytogens23،24 والسيطرة السلبية B. subtilis، (الشكل 2A،B). كان الالتزام بخلايا A549 كبيرا في أحاديات الخلايا L. من B. subtilis (الشكل 2A،B).

Figure 2
الشكل 2:انضمت الخلايا البكتيرية L. monocytogenes إيجابية الغرام إلى خلايا A549 في غضون ساعة واحدة من الحضانة المشتركة. (أ) الصور المجهرية لمحة عامة عن L. monocytogenes، فضلا عن السيطرة السلبية B. subtilis الالتزام A549 الخلايا في MOIs مختلفة. كانت البكتيريا ملطخة باستخدام صبغة حمراء فلورية. A549 كانت ملطخة نواة الخلية مع DAPI. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر (ب) القياس الكمي للعد البكتيري الملتصق لكل خلية A549. لكل سلالة بكتيرية مختبرة(L. monocytogenes و B. subtilis)في كل MOI ، تم تطبيق ما مجموعه 50 صورة على التحليل في كل حالة. البيانات هي متوسط ± SD من ممثل لثلاث تجارب مستقلة. وقد تم إجراء التحليل الإحصائي ANOVA ثنائي الاتجاه. ** ص < 0.01، *** ص < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تظهر صورة تمثيلية لتقسيم P. aeruginosa والتعداد المنضم للمضيف في الشكل 3 (الأقنعة الصفراء: البكتيريا المختارة، المخطط التفصيلي الأحمر: عدد بكتيري واحد). يتم وصف إعدادات أهداف كل من المضيف والبكتيريا في قسم البروتوكول.

Figure 3
الشكل 3: مثال صور للتجزئة البكتيرية والعد في عملية التحليل الآلي. (أ) الصور المجهرية ل P. aeruginosa انضمت إلى A549 في وزارة الداخلية من 100 دون تجزئة البكتيرية والعد. (ب) نفس الصورة بعد التحليل الإحصائي للتجزئة البكتيرية والعد. أقنعة صفراء: البكتيريا المختارة، مخطط أحمر: عدد بكتيري واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وترد في الجدول 1 والجدول 2نتائج التحليلات الآلية، بما في ذلك أحجام الخلايا المضيفة ومناطقها، وعدد الخلايا البكتيرية والمضيفة، فضلا عن متوسط عدد البكتيريا لكل خلية مضيفة، التي تمثل حالة صحة الخلية المضيفة، ومستوى الالتزام بالبكتيريا، والسمية الخلوية البكتيرية. يمثل الجدول 1 العد البكتيري الملتصق بمتوسط المستوى الخلوي من صور مختلفة، في حين يمثل الجدول 2 العد البكتيري الملتصق الذي تم تحليله على صورة واحدة على مستوى خلوي واحد من A549. تم التقاط هذه الصور التمثيلية من خلايا A549 المصابة ب PAO1 في وزارة الداخلية من 100. تم إدراج النتائج التي تم تحليلها للصورة الأولية في الشكل 3 على أنها الصورة 1 في الجدول 1 والجدول 2.

الجدول 1: نتائج التحليل الإحصائي ل 9 صور تمثيلية على المستوى الخلوي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

في كل صورة، يمثل عدد مجموع المضيف وبقع المجموع البكتيري إجمالي عدد النوى المضيفة وإجمالي عدد البكتيريا المعترف بها من قبل النظام استنادا إلى المعلمات الموضحة أعلاه، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، يمثل الحساب الآلي لنسبة البقع البكتيرية متوسط عدد البكتيريا لكل خلية مضيفة ، المستمدة من مجموع البكتيريا البقع / عدد المبلغ المضيف. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا إدراج قراءات إضافية؛ على سبيل المثال ، توضح أعداد المضيفين الملتصقين بالبكتيريا الظاهرة العالمية أو المحددة للالتزام بالبكتيريا المضيفة. عندما يكون عدد المضيفين الملتصقين بالبكتيريا أقل بكثير من عدد المبلغ المضيف ، في المقابل ، فإن متوسط عدد البكتيريا لكل مضيف مرتفع نسبيا ، مما يمثل أن النمط الظاهري لهذا الالتزام له تغاير كبير.

الجدول 2: تحليل إحصائي خلوي واحد لصورة تمثيلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

يوفر تحليل الخلايا المفرد المزيد من التفاصيل حول الخلايا المضيفة والأهداف البكتيرية في كل صورة ، وهو أمر أكثر فائدة عند جمع الميزات البكتيرية الأخرى وتطبيقها على التحليل الحسابي الآلي لتطوير أداة أكثر قوة في تقييم الإمراض البكتيري المحتمل ، مثل نموذج التعلم الآلي الذي يتم دراسته. في هذا البروتوكول، يمثل حجم المضيف ومنطقته أقطار ومناطق كل نواة مضيفة ملطخة، وتمثل كثافة الفلورسينس المضيفة متوسط كثافة النوى الملطخة. يمثل عدد المناطق البكتيرية والمنطقة الأهداف البكتيرية الملتصقة لكل خلية مضيفة وإجمالي مناطقها. تمثل كثافة الفلورسينس البكتيرية متوسط كثافة جميع البكتيريا الملتصقة.

ليس من المستغرب أن بعض البكتيريا الخبيثة لم تلتزم A549 في حين أن بعض البكتيريا ذات المستويات العالية من الالتزام البكتيري لا ترتبط بالضرورة مع الإمراض. تم اختبار نوع خلية مضيف مختلفة، HUVECs، أيضا لتحقيق أقصى قدر من تطبيق هذا الأسلوب. وأظهرت النتائج الكشف الفعال والأنماط الظاهرية المختلفة للالتزام بالبكتيريا(الشكل 4). ويمكن للخلايا المضيفة المختلفة أن تزيد من تقدير مسببات الأمراض البكتيرية المحتملة؛ على سبيل المثال، كانت المسببة للأمراض سيراتيا روبيدأيا وStreptococcus agalactiae ملتزمة HUVEC ولكن ليس لخلايا A549 (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، فإن الإشريكية القولونية (EHEC) المسمية للخلايا كانت غير ملتزمة إما ب A549 أو HUVEC(الشكل 4). لذلك ، من المهم التأكد من أن الطريقة مناسبة لأنواع الخلايا المضيفة المتعددة للاستجابة لخصوصية التفاعلات بين البكتيريا المضيفة. وقد شاركت كل من خلايا A549 وHUVEC مع البكتيريا في وزارة الداخلية من 100 في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.

Figure 4
الشكل 4:خصوصية الالتزام البكتيري لاستضافة خلايا A549 و HUVEC. السلالات البكتيرية، بما في ذلك S. روبيدايا، S. agalactiae، السمية الخلوية Enterohemorrhagic E. القولونية (EHEC)، PAO1، P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP)، E. coli ، S. aureus ، و S. aureus ΔsaeR، تم اختبارها على كل من خلايا A549 و HUVEC في MOI من 100 لمدة ساعة واحدة من الحضانة المشتركة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. كانت البكتيريا ملطخة بصبغة حمراء فلورية. تم قياس عدد البكتيريا الملتصقة من 45 صورة / سلالة بكتيرية في ثلاث تجارب مستقلة. البيانات هي متوسط ± SD من ممثل واحد من ثلاث تجارب مستقلة. * ص < 0.05 ، *** ع < 0.001 ، **** ع <0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف البروتوكول أسلوب تلقائي لتعداد المرفق البكتيري بالخلايا المضيفة. 10- والنهج الموصوف له عدة مزايا جذابة على الأساليب التقليدية. أولا، يمكن هذا النهج من التحديد الكمي الدقيق لعدد الخلايا المسببة للأمراض الميكروبية المرتبطة بالخلايا المضيفة الفردية. الأهم من ذلك، يمكن إجراء هذا القياس الكمي دون الحاجة إلى حصاد البكتيريا شاقة، المخففات التسلسلية، والطلاء على وسائل الإعلام الصلبة، وتحديد CFUs10،11،12. على هذا النحو ، فإن التقنية الموصوفة تقلل من عبء العمل الإجمالي المطلوب لقياس الالتزام البكتيري. وينبغي تقدير أن مزايا النهج المقترح تتضخم عند السعي إلى الكشف عن الأنماط الظاهرية للالتزام في تجارب الفحص الواسعة النطاق، بما في ذلك تحديد الجينات البكتيرية أو المضيفة في مكتبات متحولة أو كريسبر، على التوالي، التي تنظم هذه العملية. ثانيا، يوفر التقييم المباشر للتفاعلات بين الخلايا المضيفة والبكتيرية باستخدام المجهر الفلوري معلومات لتوضيح آليات الإمراض البكتيري، بما في ذلك التعديلات في بقاء الخلية المضيفة أو البكتيرية أو مورفولوجيا أو ديناميكيات. وأخيرا، فإن التحليل الإحصائي الآلي الذي أجري على الصور التي تم جمعها في التحليل لا يوفر فقط القياس الكمي الشامل لمتوسط الارتباط البكتيري مع الخلايا المضيفة، بل يتيح أيضا تقييم التفاعلات الديناميكية أحادية الخلية والمضيفة- الممرضة.

على الرغم من هذه المزايا، فإن الأساليب الموصوفة لها بعض القيود الهامة. أولا، مطلوب تلطيخ مضان من البكتيريا لتعداد تمسكها بالخلايا المضيفة. وهكذا ، فإن صبغة تلطيخ الفلورسنت يجب أن تلطخ البكتيريا بشكل انتقائي من نظيراتها في الخلية المضيفة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب ألا تغير صبغة التلطيخ النمط الظاهري المرفق للبكتيريا التي تحمله. لذلك ، يجب تحديد تحسين تلطيخ الفلورسينس البكتيري (على سبيل المثال ، التركيز ، مدة التلطيخ) قبل إجراء دراسات الالتزام الموصوفة. في هذا البروتوكول، تلطيخ الفلورسنت من السلالات البكتيرية بما في ذلك P. aeruginosa، L. monocytogenes، E. القولونية، وB. subtilis لمدة 30 دقيقة لا يؤثر على التزامها الخلايا المضيفة. ثانيا، نظرا لخصوصية التفاعلات المختلفة بين المضيف والبكتيريا، قد لا يكون نوع الخلية المضيفة الواحد كافيا لتقييم الارتباط البكتيري بالخلايا المضيفة. لذلك، قد تكون هناك حاجة إلى أنواع متعددة من الخلايا المضيفة للحصول على فهم كامل لدرجة أن ميكروب معين يمكن أن تلتزم أسطح الخلايا المضيفة. ثالثا، لم يكن التقسيم البكتيري فعالا تماما عندما تدفع البكتيريا التجميع أثناء الحضانة المشتركة، على سبيل المثال، S. aureus، أو عندما تشكلت البكتيريا كتلا في وزارة الداخلية العليا (>100)، على سبيل المثال، P. aeruginosa. في هذه الحالة ، يجب تطبيق تكبير أعلى لالتقاط الصور ، أو يجب استخدام المزيد من الصور في التحليل لتقليل تأثير التجميع البكتيري.

استخدمت خلايا ظهارية الرئة البشرية (A549) و HUVECs في الدراسات لإثبات لونة النهج فيما يتعلق بنوع الخلية المضيفة ، وكلاهما أظهر مستويات عالية من التعرض للالتزام البكتيري. كما أظهر استخدام نوعين من الخلايا المضيفة أن الطريقة الموصوفة يمكن تطبيقها على نطاق واسع لتوصيف التفاعلات بين المضيف والبكتيريا الملتصقة بسرعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgments

ونحن ممتنون للدكتور كايت زلوتكوفسكي من شركة بيوتيك لدعمهم التقني. وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع بموجب رقم العقد W911NF1920013 إلى PdF ووكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاعية (DARPA) ووزارة الداخلية بموجب العقد رقم 140D6319C0029 إلى PdF. ولا يعكس محتوى المعلومات بالضرورة موقف الحكومة أو سياستها، ولا ينبغي الاستدلال على أي تأييد رسمي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 175،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

الكشف الآلي عالي الإنتاجية عن الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter