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Immunology and Infection

होस्ट कोशिकाओं के लिए बैक्टीरियल पालन का स्वचालित, उच्च थ्रूपुट डिटेक्शन

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

स्वचालित सांख्यिकीय विश्लेषण विधियों के साथ-साथ उच्च-थ्रूपुट फ्लोरेसेंस लेबलिंग इमेजिंग का उपयोग करके फेनोटाइपिक पालन के आधार पर मेजबान-बैक्टीरियल रोगजनक इंटरैक्शन का पता लगाना मेजबान कोशिकाओं के साथ संभावित बैक्टीरियल इंटरैक्शन का तेजी से मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है।

Abstract

उभरते जीवाणु रोगजनकों की पहचान मानव स्वास्थ्य और सुरक्षा के लिए महत्वपूर्ण है । मेजबान कोशिकाओं के लिए जीवाणु पालन जीवाणु संक्रमण में एक आवश्यक कदम है और संभावित खतरे की एक बानगी का गठन किया । इसलिए, कोशिकाओं की मेजबानी के लिए बैक्टीरिया के पालन की जांच बैक्टीरिया खतरे के आकलन के एक घटक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । मेजबान कोशिकाओं के लिए जीवाणु पालन की गणना के लिए एक मानक विधि मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया को सह-इनक्यूबेट करना, अनुयायी बैक्टीरिया को फसल करना, ठोस मीडिया पर काटा गया कोशिकाओं को प्लेट करना, और फिर परिणामी कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीआईएफयू) को गिनना है। वैकल्पिक रूप से, मेजबान कोशिकाओं के जीवाणु पालन का मूल्यांकन इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके किया जा सकता है। हालांकि, इन दृष्टिकोणों को लागू करने के लिए पारंपरिक रणनीतियां समय लेने वाली और अक्षम हैं । यहां, हाल ही में विकसित स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित इमेजिंग विधि का वर्णन किया गया है। जब उच्च थ्रूपुट छवि प्रसंस्करण और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ संयुक्त किया जाता है, तो विधि मेजबान कोशिकाओं का पालन करने वाले बैक्टीरिया के तेजी से मात्राकरण को सक्षम बनाती है। प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए दो जीवाणु प्रजातियों, ग्राम-नकारात्मक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और ग्राम-सकारात्मक लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन और इसी नकारात्मक नियंत्रण का परीक्षण किया गया । परिणाम बताते हैं कि यह दृष्टिकोण तेजी से और सही रूप से अनुयायी बैक्टीरिया की गणना करता है और प्रयोगात्मक वर्कलोड और समयसीमा को काफी कम कर देता है।

Introduction

बैक्टीरियल आसंजन एक प्रक्रिया है जिससे बैक्टीरिया अन्य कोशिकाओं या सतहों से जुड़ते हैं। जीवाणु रोगजनकों द्वारा संक्रमण की सफल स्थापना के लिए कोशिकाओं की मेजबानी करने, ऊतकों के उपनिवेशीकरण और कुछ मामलों में, मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण1,2,3की आवश्यकता होती है। उभरते संक्रामक रोग प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरों का गठन करते हैं, जैसा कि हाल ही में COVID-19 महामारी4,5,6से सबूत है। महत्वपूर्ण बात यह है कि जीनोमिक-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके नए या उभरते रोगजनकों को आसानी से नहीं समझा जा सकता है, विशेष रूप से उन मामलों में जहां रोगजनक को पता लगाने से बचने के लिए इंजीनियर किया गया है या इसमें जीनोमिक हस्ताक्षर नहीं होते हैं जो इसे रोगजनक के रूप में पहचानते हैं। इसलिए, संभावित रोगजनकों की पहचान उन तरीकों का उपयोग करके जो सीधे रोगजनकता की पहचान का आकलन करते हैं, जैसे मेजबान कोशिकाओं के बैक्टीरियल पालन, रोगजनक पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं।

1,7दशकों तक जीवाणु रोगजनकता के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए मेजबान कोशिकाओं का जीवाणु पालन कियाजाता रहाहै . माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग8,9 और बैक्टीरियल कॉलोनी बनाने वाली इकाई(सीएफयू) 10, 11,12,13 की गणना पोस्ट-इंफेक्शन प्लेटिंग द्वारा माइक्रोबियल पालन और/या मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण के परीक्षण के लिए दो अच्छी तरह से विकसित प्रयोगशाला विधियां हैं14। बैक्टीरियल कोशिकाओं के माइक्रोमीटर पैमाने के आकार को ध्यान में रखते हुए, अनुयायी बैक्टीरियल कोशिकाओं की गणना के लिए आम तौर पर उन्नत उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है, साथ ही इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, विस्तार माइक्रोस्कोपी (ExM)15,16,और त्रि-आयामी इमेजिंग17 सहित उच्च-संकल्प इमेजिंग दृष्टिकोण . वैकल्पिक रूप से, मेजबान कोशिकाओं के भीतर बंधे या आंतरिक बैक्टीरिया की गणना ठोस आगार पर काटे गए बैक्टीरिया की कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला को चढ़ाना और परिणामीसीएफयू 10 , 12,13की गणना करके किया जा सकता है। यह विधि श्रमसाध्य है और इसमें कई मैनुअल चरण शामिल हैं, जो उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण18, 19के लिए आवश्यक मानकीकृत या स्वचालित प्रक्रियास्थापितकरने में कठिनाइयों का परिचय देते हैं। इसलिए, मेजबान सेल लगाव के मूल्यांकन के लिए नए तरीकों के विकास क्षेत्र में वर्तमान सीमाओं को संबोधित करेंगे ।

ऐसी ही एक विधि यहां वर्णित है जो स्वचालित उच्च थ्रूपुट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करती है, जो उच्च थ्रूपुट छवि प्रसंस्करण और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ संयुक्त है। दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए, कई जीवाणु रोगजनकों के साथ प्रयोग किए गए थे, जिनमें स्यूडोमोनास एरुगिनोसा,मनुष्यों, जानवरों और पौधों के एक अवसरवादी ग्राम-नकारात्मक जीवाणु रोगजनक14,20शामिल थे, जो अक्सर बिगड़ा मेजबान रक्षा कार्यों वाले रोगियों के श्वसन तंत्र को उपनिवेश बनाने के लिए पाया जाता है। इस दृष्टिकोण ने पिछले अध्ययनों में वर्णित सूक्ष्म इमेजिंग प्रक्रिया को अनुकूलित किया14,20. इमेजिंग डिटेक्शन को फ्लोरेसेंस-लेबल वाली मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया द्वारा सरल बनाया गया था ताकि उनकी निकटता को तेजी से ट्रैक किया जा सके, जिसने बैक्टीरिया को भेदने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोपी कार्यभार को नाटकीय रूप से कम कर दिया। इसके अलावा, मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया की गिनती में छवियों के स्वचालित सांख्यिकीय विश्लेषण ने प्रति मेजबान कोशिका के पालनीय बैक्टीरियल काउंट के अनुपात का अनुमान लगाने के लिए बैक्टीरियल सीएलयू प्लेटिंग के हाथ से प्रयोग को बदल दिया। इस विधि की अनुकूलता की पुष्टि करने के लिए, कई बैक्टीरियल उपभेदों और मेजबान सेल प्रकारों का भी परीक्षण किया गया है, जैसे लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन, स्टेफिलोकोकस ऑरियस, बैसिलस सेरियस, और क्लेबसिएला निमोनिया, साथ ही मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVECs) की तरह, और परिणाम विधि की विविधता और प्रभावशीलता का समर्थन करते हैं।

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Protocol

1. A549 सेल संस्कृति

  1. एफ-12K माध्यम में A549 सेल लाइन को बनाए रखें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर इनक्यूबेट।
  2. हर 3-4 दिन में माध्यम बदलें और 85%-95% की मंजूरी पर पारित करें।
  3. संक्षेप में, 1 एक्स फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस, पीएच 7.4, जब तक अन्यथा संकेत न हो) के साथ कोशिकाओं को कुल्लाएं और 1 मिलीलीटर 0.25% ट्राइप्सिन-0.53 एमएम एथिलीनडाइमाएट्राएक्टेटिक एसिड (ईडीटीए) समाधान (सेल लेयर को जलमग्न करने) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 2 मिनट के लिए इलाज करें।
  4. प्रोटीज गतिविधि को रोकने के लिए पूर्ण विकास माध्यम (एफ-12K माध्यम + 10% एफबीएस) के अतिरिक्त 6 एमएल जोड़ें। फिर, 1:3-1:8 के उपकृषण अनुपात में एक बाँझ पॉलीस्टीरिन टी-75 ऊतक संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं को प्लेट करें। संस्कृति की अंतिम मात्रा 12 एमएल है।
  5. बीज लगभग 1 x 104 A549 कोशिकाओं (सेल एकाग्रता: ~ 1 x10 5 कोशिकाओं/

2. बैक्टीरियल विकास और धुंधला

  1. बायोसेफ्टी कैबिनेट, बायोसेफ्टी लेवल 2 प्रयोगशाला में सभी बैक्टीरियल काम करें।
  2. पी एरुगिनोसा (PAO1), एस्चेरिचियासहित सभी जीवाणु संस्कृतियों,टीका, कोलाई, एल मोनोसाइटोजीन, और बी सबटिलिस, आदि, जमे हुए ग्लिसरोल स्टॉक से और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में बढ़ना 250 आरपीएम पर रात भर बनाए रखा।
  3. अगले दिन, एक उपसंस्कृति टीका लगाने के लिए रातोंरात संस्कृति के 1:100 कमजोर पड़ने का उपयोग करें और उन्हें टीएसबी (1 एमसीएल) में 3 घंटे के लिए घातीय चरण में उगाया, पुष्टि करने के लिए 600 एनएम (ओडी600)पर ओडी को मापें। सुनिश्चित करें कि OD600 0.4-0.6 की सीमा मेंहै।
  4. बैक्टीरिया-होस्ट पालन परख करने से पहले, टीएसबी-एगर प्लेटों पर बैक्टीरियल सस्पेंशन के प्लेट सीरियल कमजोर पड़ने, उन्हें रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और फिर कालोनियों की संख्या से बैक्टीरियल सीएफयू स्थापित करें। पी एरुगिनोसाके लिए,1.0 का एक ओडी 600 2 x 108 व्यवहार्य बैक्टीरियल कोशिकाओं/एमएल से मेल खाता है, और एल मोनोसाइटोजीनके लिए,1.0 का एक ओडी 600 9 x 108 व्यवहार्य जीवाणु कोशिकाओं/एमएल से मेल खाता है।
  5. कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा घातीय चरण में जीवाणु संस्कृतियों को फसल करें, फिर 1x पीबीएस (1 एमएल) का उपयोग करके उन्हें धो लें। 1x पीबीएस के 1 मिलीएल में बैक्टीरियल छर्रों को फिर से खर्च करें और बैक्टीरियल निलंबन के ओडी600 को मापकर सांद्रता निर्धारित करें। उदाहरण के लिए,0.5 के ओडी 600 के साथ पी एरुगिनोसा 1 x 108 बैक्टीरियल कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है।
  6. अंधेरे में कोमल रोटेशन के साथ 30 मिनट के लिए आरटी में हरे या लाल फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके बैक्टीरियल सस्पेंशन को दाग दें। इसके लिए, डाई को 1-गुना पतला करने के लिए बैक्टीरियल सस्पेंशन के 1 मिलील में 500 गुना केंद्रित स्टॉक स्टेनिंग डाई के 2 माइक्रोन जोड़ें। धुंधला डाई को धोने के लिए, 2 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर दाग बैक्टीरिया को अपकेंद्री करें और तीन बार 1x पीबीएस के 1 एमएल में गोली को फिर से रखें।
    नोट: यदि फ्लोरेसेंस-(GFP-, RFP-, mCherry-, आदि) टैग बैक्टीरिया प्रयोग में उपयोग किया जाता है, तो इस जीवाणु धुंधला कदम छोड़ दें । जीएफपी-टैग पी एयरोगिनोसा और लाल फ्लोरोसेंट डाई दाग एल मोनोसाइटोजीन इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया ।
  7. दाग बैक्टीरियल कोशिकाओं या GFP टैग बैक्टीरिया 2 मिनट के लिए 13,000 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा ले लीजिए। ताजा एफ-12K माध्यम (1 mL) में resuspend और प्रत्येक संस्कृति के आयुध डिपो600 उपाय। बाद में संक्रमण की बहुलता (एमओआई) और मेजबान सेल एकाग्रता के आधार पर वांछित सांद्रता के लिए संस्कृतियों को कमजोर करें। इस प्रयोग में उपयोग की जाने वाली अंतिम मात्रा 500 माइक्रोन है।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि ट्रिपन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करके गिना जाने वाला मेजबान सेल एकाग्रता 1 x 105 कोशिकाएं/एमएल है, तो 100 के एमओआई पर बैक्टीरियल कोशिकाओं की वांछित एकाग्रता 1 x 107 कोशिकाएं/एमएल होगी। 0.5 ओडी600 पर पी एरुगिनोसा की एकाग्रता 1 x 108/ वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, पी एरुगिनोसा संस्कृति को 10 गुना पतला करें, ताजा एफ-12K माध्यम के 450 माइक्रोन में पुनर्संरित संस्कृति के 50 माइक्रोन जोड़ें।

3. बैक्टीरियल पालन और मेजबान सेल धुंधला

  1. सबसे पहले, वरीयता प्राप्त A549 सेल मोनोलेयर्स को गर्म 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। प्रत्येक धोने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से 1x PBS के 100 माइक्रोन जोड़ें, धीरे-धीरे तीन बार ऊपर और नीचे पिपेट करें, 1x पीबीएस का निपटान करें या इसके अलावा 10 एस की प्रतीक्षा करें और फिर 1x पीबीएस को हटाने के लिए वैक्यूम करें। बैक्टीरियल एसोसिएशन के काइनेटिक्स को निर्धारित करने के लिए, विभिन्न एमओआई (0, 1, 10 और 100) के साथ बैक्टीरियल निलंबन की वांछित सांद्रता के 100 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को ओवरले करें। 10 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर बैक्टीरिया को स्पिन करें और संक्रमित A549 कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर, 5% सीओ2 को अतिरिक्त 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस प्रयोग में, प्रत्येक स्थिति में एक तकनीकी ट्रिपलीकेट था।
  2. ऊपर वर्णित गर्म 1x पीबीएस के साथ पांच बार मोनोलेयर्स को धोकर अनबाउंड बैक्टीरिया को हटा दें। कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 96-अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 4% फॉर्मलडिहाइड (1x पीबीएस में) का 100 माइक्रोन जोड़ें। प्लेटों को 15 मिनट के लिए बर्फ पर बैठने दें और फिर तीन बार 1x पीबीएस का उपयोग करके निर्धारण समाधान को धो लें।
  3. नाभिक को दाग देने के लिए, 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI) के 50 एनजी/एमएल जोड़ें और इसे आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, 1x पीबीएस का उपयोग करके तीन बार कुओं को धोएं। सुखाने से बचने के लिए संक्रमित A549 कोशिकाओं को 1x PBS के 100 माइक्रोन के साथ कवर करें। अगले चरण के लिए प्रक्रिया करें या अंधेरे में 2 दिनों तक प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. स्वचालित फ्लोरेसेंस इमेजिंग, प्रसंस्करण और विश्लेषण

  1. डेटा अखंडता को बनाए रखने के लिए, बेतरतीब ढंग से और मैन्युअल रूप से प्रत्येक कुएं के पांच स्थानों को लेने के लिए 20x आवर्धन पर छवियों पर कब्जा । क्रमशः DAPI और GFP चैनलों के तहत A549 कोशिकाओं और बैक्टीरिया की फ्लोरोसेंट छवियों को कैप्चर करें। लाल फ्लोरोसेंट डाई से दाग बैक्टीरिया के लिए पीई-Cy5 चैनल का उपयोग करें।
  2. एक बेहतर संकल्प के लिए, पृष्ठभूमि सपाट और deconvolution के लिए सभी छवियों को संसाधित करें। उद्देश्य के आधार पर इमेज कॉन्वोल्यूशन के पॉइंट स्प्रेड फंक्शन (पीएसएफ) को चौरसाई और ऑटो-उपाय करने के लिए रोलिंग बॉल के 68 माइक्रोन व्यास के रूप में पैरामीटर सेट करें।
  3. सभी योग्य कोशिकाओं और बैक्टीरिया की गिनती करने के लिए, मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया की फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें और मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया की सबसे कमजोर फ्लोरेसेंस तीव्रता को सेल काउंट के लिए थ्रेसहोल्ड के रूप में सेट करें। A549 सेल के व्यास के रूप में अनुयायी बैक्टीरिया के रूप में 15 माइक्रोन दूरी के भीतर एक मेजबान कोशिका के लिए समीपस्थ सभी बैक्टीरिया गिनती 10.59-14.93 माइक्रोन21है ।
    नोट: इमेजिंग सिस्टम में एक डिफ़ॉल्ट सेटिंग चुनिंदा 5-100 माइक्रोन और आकार में 0.2-5 माइक्रोन (चौड़ाई और लंबाई) से लेकर बैक्टीरिया से लेकर व्यास के साथ मेजबान कोशिकाओं की गिनती ।
  4. उपर्युक्त मैनुअल छवि प्रसंस्करण परिणामों के आधार पर, बाकी स्वचालित छवियों पर छवि चौरसाई, डिकोोल्यूशन, ऑब्जेक्ट्स आकार, दूरी और फ्लोरेसेंस तीव्रता के मापदंडों को लागू करें। स्वचालित विश्लेषण के बाद, बैक्टीरियल पालन निर्धारित करने के लिए, कुल मेजबान सेल काउंट, सेल आकार और आकार, कुल बैक्टीरियल काउंट, और प्रति मेजबान सेल औसत बैक्टीरियल काउंट जैसे महत्वपूर्ण रीडआउट्स पर विचार करें।
  5. डेटा निर्यात और सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. सभी छवियों से विश्लेषण किए गए परिणामों को स्प्रेडशीट (उदाहरण के लिए, 'xlsx' प्रारूप) में निर्यात करें। स्वचालित प्रणाली परिणामों के दो सेट उत्पन्न करती है: 1) प्रत्येक छवि से औसत अनुयायी बैक्टीरियल काउंट; 2) प्रत्येक एकल मेजबान कोशिका का सूचनात्मक डेटा, जैसे कि एक ही कोशिका पर अनुयायी बैक्टीरियल काउंट, होस्ट आकार, और मेजबान सेल और बैक्टीरिया की औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता, इसी छवि से।
    2. नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में बैक्टीरियल पालन स्तर का प्रतिनिधित्व करने के लिए सभी छवियों से अनुयायी बैक्टीरियल काउंट की औसत संख्या और मानक विचलन की गणना करें। इस विधि में, ई कोलाई और बी सबटिलिस ने क्रमशः ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-सकारात्मक जीवाणु पालन के परीक्षण में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए उपचार में डेटा बिंदुओं के बीच महत्वपूर्ण भिन्नता के लिए परीक्षण करने के लिए दो तरह के ANOVAs प्रदर्शन करें ।

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Representative Results

फ्लोरेसेंस इमेजिंग आधारित बैक्टीरियल पालन परख विकसित करने के लिए, पी एरुगिनोसा तनाव PAO1 और उसके नकारात्मक पालन समकक्ष ई. कोलाई का उपयोग प्रोटोकॉल प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए किया गया था, क्योंकि इन बैक्टीरिया के पालन को A549 कोशिकाओं को14,20, 22बताया गया था। सबसे पहले, जीएफपी-लेबल पी एरुगिनोसा (PAO1) और जीएफपी-लेबल ई. कोलाई को क्रमशः विभिन्न एमओआई में मानव अमर एपिथेलियल सेल लाइन A549 के साथ सह-इनक्यूबेटेड किया गया था। परिणामों से पता चला है कि PAO1 ने खुराक-निर्भर फैशन(चित्रा 1A,बी)में A549 कोशिकाओं का पालन किया; इस बीच, ई. कोलाई के निकट नल पालन भी सत्यापित किया गया था(चित्रा 1A,बी)। प्रत्येक एमओआई पर 50 छवियों पर कब्जा कर लिया गया था और उनका विश्लेषण किया गया था। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से महत्वपूर्ण विविधताओं का परीक्षण करने के लिए दो तरह के ANOVAs का प्रदर्शन किया गया।

Figure 1
चित्रा 1:ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरियल पी एरुगिनोसा ने सह-इनक्यूबेशन के 1 घंटे के भीतर A549 कोशिकाओं का पालन किया। (A)बैक्टीरिया के पालन के अवलोकन के लिए सूक्ष्म छवियां जहां छवियों को 20x आवर्धन का उपयोग करके लिया गया था । PAO1 और नकारात्मक पालन नियंत्रण ई. कोलाई संक्रमण की बहुलता (MOIs) पर A549 कोशिकाओं का पालन किया । बैक्टीरिया GFP-फ्लोरेसेंस टैग किए गए थे । A549 सेल नाभिक DAPI द्वारा दाग थे। स्केल बार 50 माइक्रोन है।(B)प्रति A549 सेल अनुयायी बैक्टीरियल काउंट का क्वांटिफिकेशन। प्रत्येक एमओआई में प्रत्येक परीक्षण बैक्टीरियल स्ट्रेन (PAO1 और ई. कोलाई)के लिए, प्रत्येक स्थिति में विश्लेषण के लिए कुल 50 छवियों को लागू किया गया था। डेटा का मतलब तीन स्वतंत्र प्रयोगों ± एक प्रतिनिधि से मानक विचलन (एसडी) है। दो तरह का इनोवा सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया । * पी < 0.05, *** पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इसी तरह के परिणाम तब भी देखे गए जब ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया, एल मोनोसाइटोजन23,24 और इसके नकारात्मक नियंत्रण बी उपटिलि का उपयोग किया गया(चित्र 2 ए,बी)। बी सबटिलिस (चित्र 2 ए,बी)की तुलना में एल मोनोसाइटोजीन में A549 कोशिकाओं का पालन महत्वपूर्णथा।

Figure 2
चित्र 2:ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरियल एल मोनोसाइटोजीन ने सह-इनक्यूबेशन के 1 घंटे के भीतर A549 कोशिकाओं का पालन किया। (ए) एल मोनोसाइटोजीनके अवलोकन के लिए सूक्ष्म छवियां, साथ ही विभिन्न एमओआई पर A549 कोशिकाओं के नकारात्मक नियंत्रण बी सबटिलिस पालन। लाल फ्लोरोसेंट डाई का इस्तेमाल कर बैक्टीरिया दाग रहे थे । A549 सेल नाभिक DAPI के साथ दाग थे। स्केल बार 50 माइक्रोन है।(B)प्रति A549 सेल अनुयायी बैक्टीरियल काउंट का क्वांटिफिकेशन। प्रत्येक एमओआई में प्रत्येक परीक्षण बैक्टीरियल स्ट्रेन(एल मोनोसाइटोजीन और बी सबटिलिस)के लिए, प्रत्येक स्थिति में विश्लेषण के लिए कुल 50 छवियों को लागू किया गया था। डेटा का मतलब तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि से एसडी ± है। दो तरह का इनोवा सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया । ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मेजबान-अनुयायी पी एरुगिनोसा विभाजन और गिनती की एक प्रतिनिधि छवि चित्रा 3 (येलो मास्क: चयनित बैक्टीरिया, लाल रूपरेखा: एकल बैक्टीरियल काउंट) में दिखाई गई है। होस्ट और बैक्टीरिया दोनों लक्ष्यों के लिए सेटिंग्स प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित हैं।

Figure 3
चित्र 3:स्वचालित विश्लेषण प्रक्रिया में बैक्टीरियल विभाजन और गिनती की उदाहरण छवियां। (क) पी एरुगिनोसा की सूक्ष्म छवियों ने जीवाणु विभाजन और गणना के बिना १०० के एमओआई पर A549 का पालन किया । (ख) जीवाणु विभाजन और गणना के सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद एक ही छवि । पीला मास्क: चयनित बैक्टीरिया, लाल रूपरेखा: एकल बैक्टीरियल काउंट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मेजबान सेल आकार और क्षेत्रों, बैक्टीरियल और मेजबान सेल मायने रखता है, साथ ही मेजबान सेल के प्रति औसत जीवाणु मायने रखता है, मेजबान सेल स्वास्थ्य, बैक्टीरिया पालन स्तर, और जीवाणु साइटोटॉक्सिटी की स्थिति का प्रतिनिधित्व सहित स्वचालित विश्लेषण के परिणाम तालिका 1 और तालिका 2में सूचीबद्ध हैं । तालिका 1 विभिन्न छवियों से एक औसत सेलुलर स्तर पर अनुयायी बैक्टीरियल मायने रखता है का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि तालिका 2 एक A549 सेलुलर स्तर पर एक छवि पर विश्लेषण अनुयायी बैक्टीरियल मायने रखता है का प्रतिनिधित्व करता है । इन प्रतिनिधि छवियों को १०० के एक एमओआई पर PAO1 से संक्रमित A549 कोशिकाओं से कब्जा कर लिया गया । चित्रा 3 में प्रारंभिक छवि के विश्लेषण परिणामों को तालिका 1 और तालिका 2में छवि 1 के रूप में सूचीबद्ध किया गया था।

तालिका 1: सेलुलर स्तर पर 9 प्रतिनिधि छवियों के सांख्यिकीय विश्लेषण परिणाम। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रत्येक छवि में, मेजबान योग गिनती और बैक्टीरियल योग स्पॉट क्रमशः ऊपर वर्णित मापदंडों के आधार पर सिस्टम द्वारा मान्यता प्राप्त मेजबान नाभिक और कुल बैक्टीरियल काउंट के कुल मायने रखता है। इसके अलावा, बैक्टीरिया स्पॉट अनुपात की स्वचालित गणना प्रति मेजबान सेल औसत बैक्टीरियल काउंट का प्रतिनिधित्व करता है, जो बैक्टीरिया योग स्पॉट/होस्ट योग गणना से प्राप्त होता है । इसके अलावा, अतिरिक्त रीडिंग भी शामिल की जा सकती है; उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया-अनुयायी मेजबान मायने रखता है मेजबान बैक्टीरिया पालन की सार्वभौमिक या विशिष्ट घटना को दर्शाते हैं। जब बैक्टीरिया-अनुयायी मेजबान मायने रखता है मेजबान राशि मायने रखता है की तुलना में बहुत कम कर रहे हैं, इसके विपरीत, मेजबान प्रति औसत जीवाणु गिनती अपेक्षाकृत अधिक है, जो प्रतिनिधित्व करता है कि इस तरह के पालन फेनोटाइप एक महत्वपूर्ण विषमता है ।

तालिका 2: एक प्रतिनिधि छवि का एकल सेलुलर सांख्यिकीय विश्लेषण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

विलक्षण कोशिका विश्लेषण प्रत्येक छवि में मेजबान कोशिका और जीवाणु लक्ष्यों के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करता है, जो अन्य बैक्टीरियल सुविधाओं को इकट्ठा करते समय अधिक उपयोगी होता है और उन्हें स्वचालित कम्प्यूटेशनल विश्लेषण पर लागू करता है ताकि संभावित बैक्टीरियल रोगजनकता का मूल्यांकन करने में अधिक शक्तिशाली उपकरण विकसित किया जा सके, जैसे मशीन लर्निंग मॉडल जिसका अध्ययन किया जा रहा है। इस प्रोटोकॉल में, मेजबान आकार और क्षेत्र प्रत्येक दाग मेजबान नाभिक के व्यास और क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और मेजबान फ्लोरेसेंस तीव्रता दाग नाभिक की औसत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करती है। बैक्टीरियल स्पॉट काउंट और क्षेत्र प्रत्येक मेजबान कोशिका और उनके कुल क्षेत्रों के लिए अनुयायी बैक्टीरियल लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। बैक्टीरियल फ्लोरेसेंस तीव्रता सभी अनुयायी बैक्टीरिया की औसत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है।

यह आश्चर्य की बात नहीं है कि कुछ उग्र बैक्टीरिया A549 का पालन नहीं किया, जबकि जीवाणु पालन के उच्च स्तर के साथ कुछ बैक्टीरिया जरूरी रोगजनकता के साथ सहसंबंधित नहीं है । इस विधि के आवेदन को अधिकतम करने के लिए एक अलग मेजबान सेल प्रकार, एचयूवीसी का भी परीक्षण किया गया था। परिणामों में प्रभावी पहचान और बैक्टीरिया के विभिन्न पालन फेनोटाइप(चित्र 4)को दिखाया गया । विभिन्न मेजबान कोशिकाएं संभावित जीवाणु रोगजनकों के अनुमान को बढ़ा सकती हैं; उदाहरण के लिए, रोगजनक सेराटिया रूबिडएईए और स्ट्रेप्टोकोकस एगलेक्टिया एचयूवीईसी के अनुयायी थे लेकिन A549 कोशिकाओं(चित्रा 4)के लिए नहीं। इसके अलावा, साइटोटॉक्सिक एंटोहेमेमोरेगैजिक ई कोलाई (ईएचईसी) या तो A549 या HUVEC(चित्रा 4)के लिए गैर-अनुयायी था। इसलिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि विधि मेजबान-बैक्टीरिया इंटरैक्शन की विशिष्टता का जवाब देने के लिए कई मेजबान सेल प्रकारों के लिए उपयुक्त है। A549 और HUVEC कोशिकाओं दोनों को 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर १०० के एमओआई पर बैक्टीरिया के साथ सह-इनक्यूबेटेड किया गया था ।

Figure 4
चित्रा 4:होस्ट A549 और HUVEC कोशिकाओं के लिए बैक्टीरियल पालन की विशिष्टता। एस रुबिडिया, एस एगलेक्टिया, साइटोटॉक्सिक एंटोहेमेमोरेगिक ई सहित बैक्टीरियल उपभेद। कोलाई (EHEC), PAO1,पी एरुगिनोसा पीटिल (पाओ-एनपी), ई. कोलाई, एस ऑरियस, और एस ऑरियस, और एस ऑरियस एसएईआर,37 डिग्री सेल्सियस पर सह-इनक्यूबेशन के 1 घंटे के लिए 100 के एमओआई पर दोनों A549 और HUVEC कोशिकाओं पर परीक्षण कियागया। बैक्टीरिया एक लाल फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग रहे थे । तीन स्वतंत्र प्रयोगों में ४५ छवियों/बैक्टीरियल स्ट्रेन से अनुयायी बैक्टीरियल काउंट की मात्रा निर्धारित की गई थी । डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एक प्रतिनिधि से एसडी ± मतलब है । * पी < 0.05, *** पी < 0.001, **** पी<0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रोटोकॉल मेजबान कोशिकाओं के लिए जीवाणु लगाव की गणना के लिए एक स्वचालित दृष्टिकोण का वर्णन करता है । वर्णित दृष्टिकोण पारंपरिक तरीकों पर कई आकर्षक लाभ है। सबसे पहले, यह दृष्टिकोण माइक्रोबियल रोगजनक कोशिकाओं की संख्या का सटीक मात्राकरण सक्षम बनाता है जो व्यक्तिगत मेजबान कोशिकाओं से जुड़े होते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह मात्रा श्रमसाध्य जीवाणु संचयन, धारावाहिक कमजोर पड़ने, ठोस मीडिया पर चढ़ाना, औरCFUs 10, 11, 12के दृढ़ संकल्प की आवश्यकता के बिना किया जासकताहै । इस प्रकार, वर्णित तकनीक बैक्टीरियल पालन की मात्रा निर्धारित करने के लिए आवश्यक समग्र कार्यभार को कम कर देती है। इस बात की सराहना की जानी चाहिए कि प्रस्तावित दृष्टिकोण के लाभों को बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग प्रयोगों में पालन फेनोटाइप का पता लगाने की मांग करते समय परिलक्षित किया जाता है, जिसमें उत्परिवर्ती या CRISPR पुस्तकालयों में बैक्टीरियल या मेजबान जीन की पहचान शामिल है, जो इस प्रक्रिया को विनियमित करते हैं । दूसरा, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मेजबान और बैक्टीरियल कोशिकाओं के बीच बातचीत का प्रत्यक्ष मूल्यांकन जीवाणु रोगजनकता के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए जानकारी प्रदान करता है, जिसमें मेजबान या बैक्टीरियल सेल अस्तित्व, आकृति विज्ञान या गतिशीलता में परिवर्तन शामिल हैं। अंत में, विश्लेषण में एकत्र की गई छवियों पर किए गए स्वचालित सांख्यिकीय विश्लेषण न केवल मेजबान कोशिकाओं के साथ औसत बैक्टीरियल एसोसिएशन का समग्र मात्रा प्रदान करता है बल्कि गतिशील, एकल-कोशिका, मेजबान-रोगजनक इंटरैक्शन के मूल्यांकन को भी सक्षम बनाता है।

इन फायदों के बावजूद, वर्णित तरीकों की कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। सबसे पहले, बैक्टीरिया के फ्लोरेसेंस धुंधला मेजबान कोशिकाओं के लिए उनके पालन की गणना करने के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, फ्लोरोसेंट धुंधला डाई को अपने मेजबान सेल समकक्षों की तुलना में चुनिंदा बैक्टीरिया को दागना पड़ता है। इसके अलावा, धुंधला डाई बैक्टीरिया है कि इसे ले जाने के लगाव फेनोटाइप में परिवर्तन नहीं करना चाहिए । इसलिए, वर्णित पालन अध्ययन करने से पहले बैक्टीरियल फ्लोरेसेंस धुंधला (जैसे, एकाग्रता, धुंधला अवधि) का अनुकूलन निर्धारित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, पी एरुगिनोसा, एल मोनोसाइटोजीन, ई कोलाई और बी सबटिलिस सहित बैक्टीरियल उपभेदों का फ्लोरोसेंट धुंधला मेजबान कोशिकाओं के पालन को प्रभावित नहीं करता है। दूसरा, विभिन्न मेजबान-जीवाणु इंटरैक्शन की विशिष्टता के कारण, एक मेजबान सेल प्रकार होस्ट कोशिकाओं के लिए बैक्टीरियल अटैचमेंट का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। इसलिए, एक दिए गए माइक्रोब मेजबान सेल सतहों का पालन कर सकते हैं, इस डिग्री की पूरी समझ हासिल करने के लिए कई मेजबान सेल प्रकार की आवश्यकता हो सकती है। तीसरा, बैक्टीरिया विभाजन पूरी तरह से कुशल नहीं था जब बैक्टीरिया सह-इनक्यूबेशन, उदाहरण के लिए, एस ऑरियस के दौरान एकत्रीकरण को प्रेरित करते हैं,या जब बैक्टीरिया एक उच्च एमओआई (>100) पर झुरमुट का गठन करते हैं, जैसे, पी एरुगिनोसा। इस मामले में, छवियों को कैप्चर करने के लिए एक उच्च आवर्धन लागू किया जाना चाहिए, या बैक्टीरियल एकत्रीकरण के प्रभाव को कम करने के लिए विश्लेषण में अधिक छवियों का उपयोग किया जाना चाहिए।

मानव फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं (A549) और HUVECs को अध्ययन में नियोजित किया गया था ताकि कोशिका प्रकार की मेजबानी के संबंध में दृष्टिकोण की प्लास्टिसिटी प्रदर्शित की जा सके, और दोनों ने बैक्टीरियल पालन के लिए संवेदनशीलता के उच्च स्तर को प्रदर्शित किया। दो मेजबान सेल प्रकारों के उपयोग ने यह भी दर्शाया कि वर्णित विधि को अनुयायी मेजबान-जीवाणु बातचीत को तेजी से चित्रित करने के लिए व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

सभी लेखकों का खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम बायोटेक इंक के डॉ काइट Zlotkowski उनके तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं । इस काम को रक्षा विभाग द्वारा अनुबंध संख्या W911NF1920013 के तहत पीडीएफ, डिफेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी (DARPA) और अनुबंध संख्या 140D6319C029 के तहत आंतरिक विभाग द्वारा पीडीएफ को समर्थन दिया गया था। सूचना की विषयवस्तु सरकार की स्थिति या नीति को आवश्यक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करती है और किसी आधिकारिक समर्थन का अनुमान नहीं लगाया जाना चाहिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

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References

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Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

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Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

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