Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Vurdering af indsendeokondrial protein lokalisering i spirende gær saccharomyces cerevisiae

Published: July 19, 2021 doi: 10.3791/62853
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo

Summary

På trods af de seneste fremskridt, mange gær mitokondrie proteiner stadig med deres funktioner helt ukendt. Denne protokol giver en enkel og pålidelig metode til at bestemme underkastelsesalisering af proteiner, som har været grundlæggende for udredningen af deres molekylære funktioner.

Abstract

På trods af de seneste fremskridt i karakteriseringen af gær mitokondrie proteom, er indsendelsenokondrial lokalisering af et betydeligt antal proteiner stadig undvigende. Her beskriver vi en robust og effektiv metode til bestemmelse af suborganellar lokalisering af gær mitokondrieproteiner, som betragtes som et grundlæggende skridt under mitokondrieproteinfunktionsudredning. Denne metode indebærer et første skridt, der består i at opnå meget ren intakt mitokondrier. Disse mitokondriepræparater underkastes derefter en subfraktioneringsprotokol bestående af hypotonchok (hævelse) og inkubation med proteinase K (protease). Under hævelse forstyrres den ydre mitokondriemembran selektivt, så proteinase K kan fordøje proteiner i intermembranumrummet. Parallelt, for at få oplysninger om topologien af membranproteiner, bliver mitokondriepræparaterne oprindeligt sonikeret og udsættes derefter for alkalisk ekstraktion med natriumcarbonat. Endelig, efter centrifugering, pellet og supernatant fraktioner fra disse forskellige behandlinger analyseres af SDS-PAGE og vestlige blot. Den submitochondriale lokalisering samt membranen topologi af protein af interesse opnås ved at sammenligne sin vestlige blot profil med kendte standarder.

Introduction

Mitokondrier er essentielle organeller af eukaryote celler, der spiller afgørende roller i bioenergetik, cellulære metabolisme, og signalering veje1. For korrekt at udføre disse opgaver er mitokondrier afhængige af et unikt sæt proteiner og lipider, der er ansvarlige for deres struktur og funktion. Den spirende gær Saccharomyces cerevisiae er blevet meget brugt som et modelsystem til undersøgelser af mitokondrieprocesser samt til andre organeller2. Mitokondriegenomkoderne for kun otte proteiner i gær; langt de fleste mitokondrieproteiner (~99%) er kodet af nukleare gener, som oversættes på cytosoliske ribosomer og efterfølgende importeres til deres korrekte indsendelsesrum af avancerede proteinimportmaskiner3,4,5. Mitokondriebiogenese afhænger således af det koordinerede udtryk for både det nukleare og mitokondriegenomer6,7. Genetiske mutationer forårsager defekter i mitokondrie biogenese er forbundet med menneskelige sygdomme8,9,10.

I de sidste to årtier, high-throughput proteomiske undersøgelser rettet mod stærkt renset mitokondrier resulterede i en omfattende karakterisering af gær mitokondrie proteom, som er blevet anslået til at bestå af mindst 900 proteiner11,12,13,14. Selv om disse undersøgelser gav værdifulde oplysninger, er suborganellar lokalisering af hvert protein i de fire mitokondrie subcompartments, nemlig den ydre membran (OM), intermembrane rum (IMS), indre membran (IM) og matrix, stadig påkrævet. Dette spørgsmål blev delvis behandlet med proteomiske undersøgelser af de to mindre mitokondrieunderkomplekser (OM og IMS)15,16. For nylig tog Vögtle og samarbejdspartnere et stort skridt fremad ved at generere et globalt kort af høj kvalitet over indsendelse af proteiner i gær. Ved hjælp af en integreret tilgang, der kombinerer SILAC-baseret kvantitativ massespektrometri, forskellige submitochondriale fraktioneringsprotokoller og datasættet fra OM- og IMS-proteomerne, tildelte forfatterne 818 proteiner i de fire mitokondrieunderkommandoer13.

På trods af de fremskridt, der er opnået ved disse højgennemsigtede proteomiske undersøgelser, er vores viden om indsendelsesproktørrieproteomsammensætningen langt fra afsluttet. Faktisk, blandt 986 proteiner rapporteret af Vögtle og samarbejdspartnere som værende lokaliseret til gær mitokondrier, 168 kunne ikke tildeles i nogen af de fire submitochondrial rum13. Desuden gav forfatterne ikke oplysninger om membranetopologien af proteiner, der blev forudsagt at være perifert fastgjort til periferien af mitokondriemembraner. For eksempel er det ikke muligt at vide, om et protein, der blev tildelt som perifert fastgjort til den indre membran, vender mod matrixen eller intermembranrummet. Bortset fra disse manglende data fra proteom-dækkende undersøgelser, der er modstridende oplysninger om suborganellar lokalisering af et betydeligt antal mitokondrie proteiner. Et eksempel er protease Prd1, som er blevet tildelt som et intermembrane rumprotein i de fælles databaser som Saccharomyces Genome Database (SGD) og Uniprot. Overraskende nok viste Vögtle og samarbejdspartnere ved hjælp af en underfraktioneringsprotokol svarende til den, der er beskrevet her, klart, at Prd1 er et ægte matrixprotein13. Som nævnt ovenfor skal indsendeokondrial lokalisering af mange mitokondrieproteiner belyses eller revurderes. Her giver vi en enkel og pålidelig protokol til bestemmelse af suborganellar lokalisering af gær mitokondrieproteiner. Denne protokol blev udviklet og optimeret af forskellige forskningsgrupper og er rutinemæssigt blevet brugt til at bestemme underkastelsesplaceringen samt membrantopologien af mange mitokondrieproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vækst af gærceller

  1. Isoler enkelte kolonier af stammen af interesse ved striber en lille del af cellerne fra en -80 ° C glycerol lager på en YPD (1% gær ekstrakt, 2% peptone, 2% glukose) agar plade. Pladen inkuberes ved 30 °C i 2-3 dage.
    BEMÆRK: Den S. cerevisiae stamme, der anvendes i denne protokol er afledt af BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Med undtagelse af de auxotrofiske markørgener indeholder denne stamme ikke noget slettet gen og bærer ikke nogen plasmid. Således kan det med succes dyrkes i et rigt medium, stimulere kraftig cellevækst. Når du arbejder med stammer, der er omdannet med plasmid, skal du bruge det relevante minimale medium til plasmidvalg.
  2. Forbered en starterkultur ved at pode 2-3 individuelle kolonier fra YPD agarplade i 10-20 mL YPGal medium (1% gærekstrakt, 2% peptone, 2% galactose) i en 100 mL Erlenmeyer kolbe. Inkuberes ved 30 °C i 24 timer med kraftig rysten.
    BEMÆRK: Valget af vækstmediet afhænger af gærstammen, der anvendes i protokollen. Både YPD og YPGal indeholder fermenterbare kulstofkilder, som tillader vækst af stammer, der ikke udfører mitokondrie respiration. Men da glukose undertrykker udtrykket af mange mitokondriegener, anbefales det ikke at bruge denne kulstofkilde, da det vil producere lavere mængder mitokondrier. Når du arbejder med respiratoriske kompetente stammer, der kan respirere, er det også muligt at bruge kulstofkilder som glycerol og ethanol i et forsøg på at opnå et højere udbytte af mitokondrier.
  3. Fortynd startkulturen til 1 L frisk YPGal medium til en OD600 mindre end 0,1. Cellerne dyrkes ved 30 °C med kraftig rysten, indtil OD600 når 1-1,5.
    BEMÆRK: Bestem vækstraten (fordoblingstid) for hver gærstamme, før eksperimentet udføres. Dette vil give et nøjagtigt skøn over tidspunktet for inkubation, der er nødvendig for, at kulturen kan nå en OD600 på 1-1,5.

2. Isolering af stærkt renset mitokondrier

BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra17, med mindre ændringer.

  1. Høst cellerne ved centrifugering ved 3.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  2. Vask cellerne med destilleret vand og saml dem ved centrifugering ved 3.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  3. Bestem cellernes våde vægt.
    BEMÆRK: Den nemmeste måde at måle vægten af cellepillen fra trin 2.2 er at bestemme vægten af det tomme centrifugerør lige før samlingen af cellerne. Efter centrifugering kasseres supernatanten og måler vægten af det samme rør med cellerne. Vægten af cellerne er forskellen mellem de to målinger.
  4. Brug cellerne igen i DTT-buffer (2 mL pr. 1 g celler) ved hjælp af en Pasteur-pipette eller P5000-spids. Se tabel 1 for DDT-buffersammensætning.
  5. Inkuber cellerne ved 30 °C i 20 min med skånsom rysten (~70 omdr./min).
  6. Centrifuge ved 3.000 x g i 5 min ved stuetemperatur for at pille cellerne.
  7. Vask cellerne med Zymolyase buffer uden enzymet (ca. 7 mL pr. 1 g celler).
    Se tabel 1 for Zymolyase buffer sammensætning.
  8. Centrifuge ved 3.000 x g i 5 min ved stuetemperatur for at pille cellerne.
  9. Brug cellerne i bufferen igen uden Zymolyase (7 mL pr. 1 g celler).
  10. Celleaffjedringen overføres til en 250 mL Erlenmeyer kolbe og tilsæt Zymolyase-20T (3 mg pr. g vådvægt).
  11. Inkuber cellerne ved 30 °C i 30-40 min med skånsom rysten (~70 omdr./min). Kontroller effektiviteten af denne proces ved at sammenligne turbiditeten af celleaffjedringen før og efter Zymolyase-behandlingen.
    BEMÆRK: I dette trin vil cellerne blive omdannet til spheroplasts på grund af cellevæg fordøjelse af Zymolyase.
    1. Til dette tilsættes 50 μL af hver celleaffjedring til separate glasrør, der indeholder 2 mL vand. Efter kraftig blanding bør uklarheden af celleaffjedringen, der behandles med Zymolyase, hurtigt falde på grund af den osmotiske forstyrrelse af spheroplasts. På den anden side bør uklarheden af den ikke-behandlede cellesuspension forblive uændret.
      BEMÆRK: Virkningerne af uklarhed kan også overvåges ved simpel visuel inspektion eller ved at måle OD600 af begge prøver. I det andet tilfælde skal OD600 for den Zymolyase-behandlede prøve være 10-20 % af den ikke-behandlede prøve. En alternativ metode indebærer at tælle cellerne i begge prøver ved hjælp af lysmikroskopi.
    2. Hvis udbyttet af spheroplasts dannelse er lav, tilsæt mere Zymolyase og inkubere i yderligere 15 min interval.
  12. Høst spheroplasterne ved centrifugering ved 2500 x g i 5 min ved 4 °C.
    BEMÆRK: Alle yderligere trin skal udføres hurtigt og på is eller ved 4 °C for at undgå proteinforringelse af hydrolytiske enzymer.
  13. Spheroplasterne vaskes to gange med iskold homogeniseringsbuffer (ca. 6,5 mL pr. 1 g celler) og pellet ved centrifugering ved 2.500 x g i 5 min ved 4 °C. Se tabel 1 for homogeniseringsbuffersammensætning.
  14. Spheroplasterne genbruges i iskold homogeniseringsbuffer (6,5 mL pr. 1 g celler) og overfør dem til en forkølet glas Dounce homogenisator. Brug en stor glas homogenisator på ca. 30 mL.
  15. Homogeniser spheroplasterne med 15 slag ved hjælp af en støder.
    BEMÆRK: Antallet af slagtilfælde skal justeres afhængigt af støderens montering. For stram støder er 15 slag tilstrækkelige. På den anden side anbefales det at udføre op til 25 slag, hvis du bruger en løs støder.
  16. Overfør homogenatet til et 50 mL centrifugerør og tilsæt 1 volumen iskold homogeniseringsbuffer.
  17. Centrifugere homogenatet ved lav hastighed, 1.500 x g i 5 min ved 4 °C til pelletkerner, cellerester og ubrudte celler.
  18. Overfør supernatanten til et nyt 50 mL centrifugerør ved hjælp af en Pasteur pipette eller P5000-spids, der sørger for at undgå at forstyrre pellet.
  19. Centrifuge ved 4.000 x g i 5 min ved 4 °C.
  20. Supernatanten overføres til et centrifugrør med høj hastighed og centrifuge ved 12.000 x g i 15 min ved 4 °C for at pille den rå mitokondrierfraktion.
  21. Kassér supernatanten, og vask forsigtigt den rå mitokondriepille i 20-30 mL iskold homogeniseringsbuffer ved at skånsom pipetter ved hjælp af en P5000-spids.
  22. Suspensionen overføres til et 50 mL centrifugerør og centrifuge ved 4.000 x g i 5 min ved 4 °C for at pille de resterende cellerester.
  23. Supernatanten overføres til et centrifugrør med høj hastighed og centrifuge ved 12.000 x g i 15 min ved 4 °C for at pille den rå mitokondrierfraktion.
  24. Kassér supernatanten og genbrug forsigtigt den rå mitokondriepille i et lille volumen (typisk 1000 μL) iskold SEM-buffer ved at skånsomt pipetter ved hjælp af en P1000-spids. Se tabel 1 for SEM-buffersammensætning.
    BEMÆRK: Selv om denne rå mitokondrie fraktion kan bruges direkte i nogle applikationer, såsom i organello protein import assays, det indeholder betydelige mængder af andre cellulære komponenter. Disse forureninger kan føre til fejlfortolkninger af resultaterne ved bestemmelse af indsendelse af et protein. Derfor er yderligere rensningstrin nødvendige for at få meget renset mitokondriepræparat, som beskrevet nedenfor.
  25. Forbered saccharoseopløsninger i EM-bufferen i koncentrationer på 60%, 32%, 23% og 15% (w/v). Disse opløsninger er stabile i op til 1 måned ved 4 °C. Se tabel 1 for EM-buffersammensætning.
  26. Forbered en 4-trins saccharosegradient i et ultracentrifugerør som følger: Placer 1,5 mL 60% (w/v) saccharose på bunden af centrifugerøret. Dernæst pipette forsigtigt trinvist: 4 mL af 32%, 1,5 mL på 23% og 1,5 mL af 15% saccharose (w /v). Pas på at undgå at forstyrre faserne.
  27. Læg forsigtigt den rå mitokondriefraktion oven på saccharosegradienten.
  28. Centrifuge i 1 time ved 134.000 x g ved 4 °C i en svingende skovlrotor.
  29. Fortsæt forsigtigt med at fjerne saccharoseopløsningen, indtil den stærkt rensede mitokondrierfraktion er nået, som er repræsenteret af et brunt bånd ved 60%/32% saccharosegrænsefladen.
  30. Gendan det rensede mitokondrier ved hjælp af en P1000-skåret spids og læg den i et forkølet højhastighedscentrifugerør.
  31. Fortynd det genvundne mitokondrier med 5-10 volumener iskold SEM-buffer.
  32. Centrifuge i 30 min ved 12.000 x g ved 4 °C.
  33. Brug den rene mitokondrier igen i 500 μL iskold SEM-buffer ved at skånsom pipetter ved hjælp af en P1000-skåret spids.
  34. Bestem proteinkoncentrationen af det meget rensede mitokondriepræparat ved hjælp af Bradford-proceduren efter producentens anvisninger. Proteinkoncentrationen justeres til 10 mg protein/mL med iskold SEM-buffer.
    BEMÆRK: For den nedenfor beskrevne fraktioneringsprotokol for indsendelse af indsenderokonkation anbefales det at bruge frisklavet mitokondrier. Vögtle og samarbejdspartnere udførte imidlertid en detaljeret kvalitetskontrolanalyse af mitokondrie intaktheden og viste, at frosne organeller også kan bruges i denne protokol13. Til dette skal du lave aliquots på 40 μL og fryse dem i flydende nitrogen. Opbevares ved -80 °C.

3. Submitochondrial fraktionering protokol

BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra reference18 og består af to trin: (1) hypotonisk hævelse i nærvær eller fravær af proteinase K og (2) sonikering efterfulgt af kulbonatudvinding. Udfør alle trinene i både protokollerne på is eller ved 4 °C for at undgå proteinforringelse.

  1. Hypotonisk hævelse i nærværelse af proteinase K
    1. Overfør 40 μL af stærkt renset mitokondrier ved 10 mg/mL (400 μg) til fire 1,5 mL forkølede mærkede mikrocentrifugerør.
    2. Der tilsættes 360 μL SEM-buffer i rør 1 og 2.
    3. Der tilsættes 360 μL EM-buffer i rør 3 og 4.
    4. Der tilsættes 4 μL proteinase K (10 mg/mL) i rør 2 og 4. Brug det pipettereskema, der er angivet i tabel 2 , for at undgå fejl.
      BEMÆRK: Klargør en opløsning på 10 mg/mL af proteinase K i vand umiddelbart før brug. Den endelige koncentration af proteinase K i forsøget skal være ca. 50-100 μg/mL. Yderligere oplysninger finder du i afsnittet Diskussion .
    5. Bland alle rørene forsigtigt og inkuber på is i 30 minutter med lejlighedsvis blanding.
    6. Tilsæt 4 μL på 200 mM PMSF til alle fire rør for at stoppe proteinase K aktivitet.
      FORSIGTIG: PMSF er meget giftig. Brug handsker, når du arbejder med løsninger, der indeholder PMSF.
    7. Centrifuge ved 20.000 x g i 30 min ved 4 °C.
    8. Saml supernatanten, og overfør den til et nyt 1,5 mL forkølet mærket mikrocentrifugerør. Pas på at undgå at forstyrre pellet.
      BEMÆRK: Pellet kan suspenderes direkte i prøvebufferen for yderligere SDS-PAGE og western blot-analyse. Spor af proteinase K kan dog forblive aktive, selv efter PMSF-behandling, og kan til sidst fordøje nogle proteiner, efter at pelleten er blevet opløst i den SDS-holdige prøvebuffer. For at undgå dette problem kan proteinase K være fuldstændig inaktiveret ved behandling af prøverne med trichloreddikesyre (TCA) som beskrevet nedenfor.
      FORSIGTIG: TCA er meget giftig. Brug handsker, når du arbejder med løsninger, der indeholder TCA.
    9. Pillet ved siden af trin 3.1.8 i 400 μL iskold SEM-buffer.
    10. Supernatanten (fra trin 3.1.8) og den ophængte pellet (fra trin 3.1.9) med TCA til en endelig koncentration på 10% (w/v).
    11. Inkuber alle rørene på is i 10 minutter.
    12. Centrifugere de TCA-behandlede prøver i 10 min ved 12.000 x g ved 4 °C.
    13. Supernatanten fjernes, og pilleudtagningen tages i brug igen i 200 μL prøvebuffer.
      BEMÆRK: Det er muligt, at bromophenolblå pH-indikator bliver gul på grund af syrebehandlingen. Hvis dette sker, tilsættes små aliquots (1-5 μL) af 1 M Tris base, indtil den bliver blå.
    14. Der tilsættes 4 μL på 200 mM PMSF til alle rørene.
    15. Opbevar alle prøverne ved -80 °C indtil yderligere analyse af SDS-PAGE og western blot.
  2. Sonikering og kulbonatudvinding
    BEMÆRK: I denne protokol er det ikke nødvendigt at bruge frisklavet mitokondrier, når sonikering forårsager brud på mitokondriemembranerne.
    1. Overfør 200 μL højt renset mitokondrier ved 10 mg/mL (2 mg protein) til et 1,5 mL forkølet mikrocentrifugerør.
    2. Fortynd mitokondrier én gang med iskold SEM buffer.
    3. Soniker mitokondrier for 3 x 30 s på is. Brug en soniker, der er kompatibel til små diskenheder.
    4. Centrifugprøven i 30 min ved 100.000 x g ved 4 °C.
    5. Saml supernatanten, og overfør den til et nyt 1,5 mL forkølet mikrocentrifugerør. Hold den på is. Denne prøve vil blive navngivet opløselig proteinfraktion (S).
    6. Pillet ved siden af trin 3.2.4 i 400 μL iskold SEM-buffer.
    7. 100 μL af den genophængte pille fra trin 3.2.6 og overfør den til et nyt 1,5 mL forkølet mikrocentrifugerør. Hold den på is. Denne prøve vil blive navngivet submitochondrial partikler brøk (SMP).
    8. De resterende 300 μL fortyndes fra trin 3.2.6 én gang med frisklavet 200 mM natriumcarbonat.
    9. Prøven inkuberes fra trin 3.2.8 på is i 30 min.
    10. Centrifugprøven i 30 min ved 100.000 x g ved 4 °C.
    11. Saml supernatanten, og overfør den til et nyt 1,5 mL forkølet mikrocentrifugerør. Hold den på is. Denne prøve vil blive navngivet karbonat supernatant brøk (CS).
    12. Pillet ved siden af trin 3.2.10 i 400 μL iskold SEM-buffer. Denne prøve vil blive navngivet karbonatudfængt brøk (CP).
    13. Udfælde alle prøverne (S, SMP, CS og CP) med TCA til en endelig koncentration på 10% (w/v).
    14. Inkuber alle rørene på is i 10 minutter.
    15. Centrifugere de TCA-behandlede prøver i 10 min ved 12.000 x g ved 4 °C.
    16. Fjern supernatanten, og brug hver pille igen i prøvebufferen. Hvis prøvebufferen bliver gul, tilsættes små aliquots (1-5 μL) af 1 M Tris base, indtil den bliver blå.
    17. Der tilsættes 1 μL på 200 mM PMSF til alle rørene.
    18. Opbevar alle prøverne ved -80 °C indtil yderligere analyse af SDS-PAGE og western blot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Succesen af submitochondrialfraktionering protokol afhænger af at opnå stærkt renset intakt mitokondrier. Til dette er det vigtigt, at under gærcellelyset forbliver organellernes intakthed næsten helt bevaret. Dette opnås ved hjælp af en celle lysis protokol, der kombinerer enzymatisk fordøjelse af cellevæggen efterfulgt af fysisk forstyrrelse af plasmamembranen ved hjælp af en Dounce homogenizer. Mitokondrieindholdet opsamles derefter ved differentialcentrifugering. Denne subcellulære fraktionering giver en beriget mitokondriefraktion, som bekræftet af tilstedeværelsen af høje niveauer af porin (Por1), et mitokondriemarkørprotein (Figur 1, bane 2). Dette er dog en rå mitokondrier fraktion, som indeholder betydelige mængder af andre cellulære rum, herunder endoplasmisk reticulum, vacuole, cytosol, og endosome (Figur 1, lane 2). Disse forureninger kan indføre artefakter i nogle applikationer, såsom submitochondrial protein lokalisering eksperimenter. For at reducere mængden af disse forureninger renses den rå mitokondriefraktion yderligere på saccharosetæthedsgradientcentrifugering. Dette ekstra rensningstrin genererer en meget ren mitokondriefraktion, som det fremgår af en betydelig reduktion i indholdet af proteinmarkørerne for andre cellerum (figur 1, vognbane 3).

For at bestemme underkastelsesplaceringen af proteiner er de stærkt rensede mitokondrier yderligere fraktioneret i deres underkomplekser (figur 2A). Denne protokol indebærer konvertering af mitokondrier til mitoplaster ved hypotonisk osmotisk chok. I denne proces inkuberes intakt mitokondrier i en hypoosmotisk buffer, hvilket resulterer i hævelse af organelle. Under hævelse bristes den ydre mitokondriemembran selektivt af osmotisk ubalance, og indholdet af intermembrane rumprotein frigives til supernatanten. Al denne procedure udføres i nærvær eller fravær af proteinase K. Som følge af den ydre membranforstyrrelse får protease adgang til indhold af intermembrane rumprotein og fremmer nedbrydningen af de tilsvarende proteiner. I modsætning hertil forbliver proteinindholdet i mitokondriematrixen beskyttet mod angreb af protease på grund af integriteten af den indre mitokondriemembran. Efter disse behandlinger, proteinindholdet i de forskellige prøver er evalueret af SDS-PAGE og vestlige blot analyser.

Den effektive konvertering af mitokondrier til mitoplaster ved osmotisk chok (hævelse) kan overvåges på to måder: (1) forsvinden af det opløselige intermembrane rummarkørprotein (f.eks. cytochrom cyt. b2) i pillefraktionen fra mitoplaster med dens samtidige udseende i supernatantfraktionen (figur 2B, sammenlign bane 3 med vognbane 7) (2) selektiv nedbrydning af det indre membranmarkørprotein, der vender ud mod intermembranområdet (f.eks. ScoI) med proteinase K kun i mitoplaster (figur 2B, bane 4). Hertil kommer, at beskyttelsen af markører Cyt. b2 og ScoI mod proteinase K nedbrydning i pelletfraktionen fra mitokondrier anvendes til at bekræfte integriteten af den ydre mitokondriemembran (Figur 2B, bane 2). På den anden side bekræftes integriteten af den indre mitokondriemembran ved beskyttelse af den matrixopløselige proteinmarkør α-KGD mod proteinase K nedbrydning (Figur 2B, bane 4). For at bestemme indsendeokondrial lokalisering af et protein af interesse, skal du blot sammenligne sin vestlige blot profil med profilerne af disse standarder med kendt lokalisering.

For proteinet afbildet i figur 2B (Prx1) er dets vestlige blotprofil tegn på et protein med dobbelt mitokondrie localization: intermembrane rum og matrix. Ved første øjekast svarer dens fraktioneringsprofil til α KGD, hvilket indikerer en matrix lokalisering. Men dens tilstedeværelse i supernatanten af mitoplaster indikerer også en intermembrane rum lokalisering. De fraktionering profiler af protein markører beskrevet ovenfor fjerne de mulige artefakter forbundet med integriteten af mitokondrie forberedelse og bekræfte den dobbelte lokalisering af Prx119.

For at undersøge topologien af proteiner på mitokondriemembraner underkastes mitokondrier to yderligere behandlinger: sonikering og kulbonatudvinding (Figur 3A). Mens sonikering frigiver kun opløselige proteiner i supernatantfraktion13, alkalisk ekstraktion med natriumcarbonat desuden opløses perifert membran-associerede proteiner13,20. I begge behandlinger forbliver integrerede membranproteiner i pelletfraktionen13. Disse antagelser bekræftes af western blot analyse af pellet og supernatant fraktioner fra begge behandlinger (Figur 3B). Et integreret mitokondriemembranprotein (f.eks. porin Por1) forventes at blive fundet helt i pelletfraktionen, selv efter alkalibehandlingen med natriumcarbonat (figur 3B, vognbane 3 og 5). På den anden side forventes et opløseligt matrixprotein (f.eks. α KGD) at være fuldstændig opløseligt i begge behandlinger (figur 3B, vognbane 2 og 4). Den betydelige fastholdelse af α-KGD i pellet fra sonikering (Figur 3B, bane 3, SMP-fraktion) kan skyldes små variationer i sonikeringsparametrene, der kan påvirke dannelsen af de såkaldte submitochondriale partikler, som effektivt sedimenteres af ultracentrifugering. Adfærden af disse proteiner med kendte opløselighed profiler bruges derefter til at bestemme mitokondrie opløselighed af et protein af interesse. I tilfælde af Prx1, dens vestlige blot profil tyder på et protein forbundet med membranen periferien og alkalisk behandling inducerer sin opløselighed (Figur 3B, bane 4).

Figure 1
Figur 1: Isolering af stærkt renset mitokondrier. Western blot analyse af den samlede lysatfraktion (bane 1), en rå mitokondriefraktion (vognbane 2) og stærkt renset mitokondriefraktion (vognbane 3). Fraktionerne blev adskilt af SDS-PAGE på en 12% polyacrylamidgel, overført til nitrocellulose og undersøgt med antistoffer hævet mod markører for forskellige cellulære rum som beskrevet på højre side af gelen. Dette tal er blevet ændret fra reference19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Submitochondrial fractionation protokol ved hypotonisk hævelse i nærværelse af proteinase K. (A) Skematisk repræsentation af submitochondrialfraktionering protokol. Stærkt renset mitokondrier er særskilt udsat for isotoniske eller hypotoniske behandlinger (hævelse) i nærvær (+) eller fravær (-) af proteinase K. Efter behandling hæmmes aktiviteten af proteinase K ved tilsætning af PMSF, og mitokondrier og mitoplaster genvindes ved centrifugering. Proteinindholdet fra de resulterende pellet og supernatant fraktioner er udfældet af TCA, og derefter analyseret af SDS-PAGE og vestlige blot. Farvekuglerne repræsenterer submitochondrialproteinmarkører for: et opløseligt intermembrane rumprotein (grønt), et indre membranprotein, der vender ud mod det mellemmembrane rum (pink) og et opløseligt matrixprotein (lyseblå). (B) Western blot analyse af pellet og supernatant fraktioner fra submitochondrial fraktionering protokol. Fraktionerne blev adskilt af SDS-PAGE på en 12% polyacrylamidgel, overført til nitrocellulose og undersøgt med antistoffer hævet mod markører for forskellige indsendelsesrum som afbildet i A. Se teksten for at få flere oplysninger. Dette tal er blevet ændret fra 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Submitochondrial fractionation protokol ved sonikering og karbonat ekstraktion. (A) Skematisk repræsentation af den protokol, der anvendes til at bestemme opløselighed og membran topologi af mitokondrie proteiner. Mitokondrier er oprindeligt sonikeret og centrifugeret, hvilket resulterer i en opløselig proteinfraktion (S) og det opdelte membranøse produkt, kaldet submitochondrial partikel (SMP). Pellet fra sonikeringstrinnet underkastes efterfølgende en alkalisk behandling med natriumcarbonat (Na2CO3) og centrifugeret, hvilket resulterer i karbonat supernatant (CS) og karbonat-udfældede fraktioner (CP). (B) Western blot analyse af pellet og supernatant fraktioner fra sonikering og karbonat udvinding protokol. Fraktionerne blev adskilt af SDS-PAGE på en 12% polyacrylamidgel, overført til nitrocellulose og undersøgt med antistoffer hævet mod proteinmarkører, der viser forskellige niveauer af opløselighed. Se teksten for at få flere oplysninger. Dette tal er blevet ændret fra 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Opløsning Komponenter Kommentarer
YPD-medie 1% (w/v) gærekstrakt, 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) glukose Opløs 10 g Bacto Gær ekstrakt, 20 g Bacto Peptone og 20 g glukose i 900 m destilleret vand tilsat. Fyld op til 1000 ml og steriliseres ved autoklavering.
YPGal medium 1% (w/v) gær ekstrakt, 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) galactose Opløs 10 g Bacto Gær ekstrakt, 20 g Bacto Peptone og 20 g galactose i 900 m destilleret vand tilsat. Fyld op til 1000 ml og steriliseres ved autoklavering.
DTT-buffer 100 mM Tris-H2SO4 (pH 9,4), 10 mM dithiothreitol (DTT) For at fremstille 15 ml: Bland 1,5 ml 1 M Tris-H2SO4, pH 9,4 med 150 μL 1M DTT forvarmt ved 30 °C.
Volumen til 15 ml med ddH2O
Forbered frisk før brug
Zymolyase buffer 20 mM kaliumphosphat buffer (pH 7,4), 1,2 M sorbitol For at lave 100 ml: Bland 2 ml 1 M kaliumphosphatbuffer (pH 7.4) med 60 ml 2 M sorbitol
Volumen til 15 ml med ddH2O
Pulveret (3 mg pr. gram vådvægt) af Zymolyase-20T opløses fra Arthrobacter luteus (MP Biomedicals, Irvine, CA) i bufferen lige før brug
Homogeniseringsbuffer 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w/v) kvæg serum albumin (BSA), 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) For at fremstille 250 ml: Bland 2,5 ml 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) med 75 ml 2 M sorbitol, 500 μL på 500 mM EDTA og 0,5 g BSA (i det væsentlige fedtsyrefri)
Volumen til 250 ml med ddH2O
Forkøling ved 4 °C
Tilføj PMSF og BSA i bufferen lige før brug
SEM-buffer 10 mM MOPS-KOH (pH 7,2), 250 mM saccharose, 1 mM EDTA For at fremstille 250 ml: Bland 2,5 ml 1 M MOPS-KOH buffer (pH 7.2) med 31,25 ml 2 M saccharose og 500 μL på 500 mM EDTA
Volumen til 250 ml med ddH2O
Forkøl ved 4 °C lige før brug.
EM-buffer 10 mM MOPS-KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA For at lave 250 ml: Bland 2,5 ml 1 M MOPS-KOH buffer (pH 7.2) med 500 μL på 500 mM EDTA
Volumen til 250 ml med ddH2O
Forkøling ved 4 °C lige før brug
eksempelbuffer 2% (w/v) natrium dodecylsulfat (SDS), 50 mM DTT, 10% (v/v) glycerol, 0,02% bromophenol
blå, 60 mM Tris-HCl (pH 6,8),

Tabel 1: Medier, løsninger og buffere.

Reagens 1 2 3 4
Mitokondrier (10 mg/mL) 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL
SEM-buffer 360 μL 360 μL - -
EM-buffer - - 360 μL 360 μL
Proteinase K (10 mg/mL) - 4 μL - 4 μL

Tabel 2: Pipetterordning til at udføre hypotonisk hævelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen, der præsenteres her, er blevet brugt med succes og løbende optimeret i lang tid til at bestemme proteinaaliseringen i indsenderokondrierummene13,14,18,21,22,23. Pålideligheden og reproducerbarheden af denne protokol er stærkt afhængig af renheden og integriteten af mitokondriepræparater18. Begge disse krav opnås ved at tilføje et ekstra rensningstrin (saccharosetæthedsgradientcentrifugering) til rå mitokondriepræparater13,24,25 (figur 1). Udover at eliminere uønskede nonmitochondriale forurenende stoffer eliminerer dette ekstra rensningstrin også brudt mitokondrier og mitoplaster, der kan opstå fra de mange fysiske manipulationer af prøven under protokollen18. På trods af at dette saccharosegradens rensningstrin øger procedurens tid, genererer dette saccharosegradens rensningstrin således stærkt renset intakt mitokondrier, som anses for at være afgørende for, at submitochondrialfraktioneringsprotokollen kan lykkes18,22.

Vögtle og samarbejdspartnere rapporterede, at frosne organeller (ved -80 °C) også med succes kunne anvendes til indsendelse af okondrialfraktionering13; Vi anbefaler dog at bruge frisk mitokondriepræparat. Uafhængigt af valg kan intaktheden af renset mitokondrier bekræftes ved at kontrollere følsomheden af intermembrane rumproteiner mod eksternt tilsat proteinase K. Hvis organellerne er intakte, proteiner i dette rum som Cyt. b2 og Sco1 bør forblive beskyttet mod proteolytisk nedbrydning på grund af den barriere, som den ydre membran giver (Figur 2B, vognbane 2). I modsætning hertil, når organellerne inkuberes i en hypoosmotisk buffer, gør bruddet af den ydre membran på grund af osmotisk chok (hævelse) disse proteiner tilbøjelige til proteaseforringelse (Figur 2B, bane 4). På den anden side bør de proteiner, der er til stede i matrixrummet, såsom α-KGD, forblive beskyttet mod nedbrydning i både mitokondrier og mitoplaster på grund af den indre membrans integritet (figur 2B, vognbane 2 og 4). Således kan profilerne af disse velundersøgte mitokondriemarkørproteiner bruges enten til at vurdere integriteten af mitokondriepræparater eller fraktioneringsprotokollens succes. Desuden opnås den indsendendeokondriale lokalisering af et protein af interesse blot ved sammenligning af dets fraktioneringsprofil med dem fra markørproteinerne18,22 (figur 2B). Det er vigtigt, at hvis mitokondriemarkørproteinerne viser en adfærd, der adskiller sig fra den ovenfor beskrevne, er organellernes integritet sandsynligvis kompromitteret, og dermed bør mitokondriepræparatet ikke anvendes med henblik på denne protokol.

Selvom hypotonisk chok har vist sig at være en pålidelig metode til at skelne mellem intermembrane rumproteiner versus matrix, giver denne metode ikke oplysninger om, hvorvidt et matrixprotein er opløseligt eller fastgjort til mitokondrieens indre membran. Disse oplysninger kan opnås ved at indsende mitokondrier til sonikering efterfulgt af alkalisk ekstraktion med natriumcarbonat (figur 3). Mens opløselige matrix proteiner forventes at blive frigivet i supernatant fraktion ved sonikering, proteiner forbundet med membraner tendens til at være i bundfald13. På den anden side opløser alkalisk ekstraktion med natriumcarbonat effektivt proteiner, der er perifert fastgjort til membraner, men ikke integrerede membranproteiner13,20. Således, hvis et protein er resistent mod protease nedbrydning efter hævelse, men frigives i supernatant ved alkalisk behandling, er det sandsynligvis en perifert fastgjort indre membran protein står over for matrixrummet. Det er vigtigt at huske på, at succesen af proteasefølsomhedsanalysen er slående afhængig af følsomheden af det interesseprotein, der er i forhold til den protease, der anvendes til fordøjelsen. Nogle mitokondrieproteiner synes at være resistente over for proteolytisk nedbrydning ved standardkoncentrationen af proteinase K (0,1 mg/mL), der normalt anvendes i subfraktioneringsprotokoller (figur 2B, vognbane 8)19. Fordobling af proteinase K-koncentrationen (0,2 mg/mL) synes at være tilstrækkelig til at muliggøre en fuldstændig proteolytisk nedbrydning. Men husk på, at højere koncentrationer af protease kan destabilisere den ydre mitokondriemembran og i sidste ende kompromittere effektiviteten af protokollen.

Der er ingen tvivl om, at for at belyse funktionen af mitokondrieproteiner er det vigtigt at bestemme deres underkastelses localisering. I denne henseende repræsenterer denne protokol et kraftfuldt værktøj for forskere, der begynder at studere mitokondrier. På trods af at være rettet mod gær, mange af dens principper kunne være let anvendelige til andre organismer. Med undtagelse af mitokondrierensningstrin ligner resten af protokollen faktisk meget dem, der er rapporteret for andre organismer26,27,28. Et andet vigtigt bidrag i denne protokol er dens anvendelighed i studiet af mutanter af S. cerevisiae, der viser ændret mitokondriebiogenese. Det er blevet almindeligt rapporteret, at gær mutanter for mitokondrie protein import maskiner viser en ændret fordeling af mitokondrie proteiner5,29. Således kan denne protokol rutinemæssigt bruges til at undersøge konsekvenserne på mitokondrieproteinfordeling forårsaget af mutationer, der kan ændre mitokondriebiogenese. Endelig kan protokollen være særlig nyttig til undersøgelse af proteiner, der viser dobbelt mitokondrie lokalisering19,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) for at give antistoffer rejst mod submitochondrial markør proteiner Cyt. b2, αKGD og Sco1. Vi takker også Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) for nyttige diskussion og kommentarer under oprettelsen af denne protokol.

Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (tilskud 2013/07937-8).

Fernando Gomes og Helena Turano støttes også af FAPESP, giver henholdsvis 2017/09443-3 og 2017/23839-7. Angélica Ramos støttes også af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Peptone BD 211677
Bacto Yeast extract BD 212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm Beckman Coulter 344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) Sigma-Aldrich A7030 Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43815 Component of DDT buffer
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
Galactose Sigma-Aldrich G0625
Glucose Sigma-Aldrich G7021
MOPS Sigma-Aldrich M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662
Proteinase K Sigma-Aldrich
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus MP Biomedicals, Irvine, CA 320921 Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
  3. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
  4. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
  5. Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
  6. Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
  7. Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
  8. Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
  9. Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
  10. Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
  11. Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
  12. Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
  13. Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).
  14. Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
  15. Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
  16. Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
  17. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
  18. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
  19. Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
  20. Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
  21. Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
  22. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
  23. Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
  24. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
  25. Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), Clifton, N.J. 33-39 (2006).
  26. Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
  27. Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
  28. Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
  29. Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
  30. Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).

Tags

Biokemi udgave 173 mitokondrier spirende gær Saccharomyces cerevisiae submitochondriale rum submitochondrialfraktionering underkastelses-lokalisering sonikering kulbonatudvinding western blot
Vurdering af indsendeokondrial protein lokalisering i spirende gær <em>saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gomes, F., Turano, H., Ramos, A.,… More

Gomes, F., Turano, H., Ramos, A., Netto, L. E. S. Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (173), e62853, doi:10.3791/62853 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter