Summary
Ondanks recente vooruitgang blijven veel mitochondriale gisteiwitten nog steeds met hun functies volledig onbekend. Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de submitchondriale lokalisatie van eiwitten te bepalen, wat fundamenteel is geweest voor de opheldering van hun moleculaire functies.
Abstract
Ondanks recente vooruitgang in de karakterisering van gist mitochondriaal proteoom, blijft de submitochondrial lokalisatie van een aanzienlijk aantal eiwitten ongrijpbaar. Hier beschrijven we een robuuste en effectieve methode voor het bepalen van de suborganellaire lokalisatie van gist mitochondriale eiwitten, die wordt beschouwd als een fundamentele stap tijdens mitochondriale eiwitfunctie-opheldering. Deze methode omvat een eerste stap die bestaat uit het verkrijgen van zeer zuivere intacte mitochondriën. Deze mitochondriale preparaten worden vervolgens onderworpen aan een subfractionatieprotocol bestaande uit hypotone shock (zwelling) en incubatie met proteïnase K (protease). Tijdens zwelling wordt het buitenste mitochondriale membraan selectief verstoord, waardoor het proteïnase K eiwitten van het intermembraanruimtecompartiment kan verteren. Tegelijkertijd, om informatie te verkrijgen over de topologie van membraaneiwitten, worden de mitochondriale preparaten in eerste instantie gesoniseerd en vervolgens onderworpen aan alkalische extractie met natriumcarbonaat. Ten slotte worden na centrifugeren de pellet- en supernatantfracties van deze verschillende behandelingen geanalyseerd door SDS-PAGE en western blot. De submitchondriale lokalisatie en de membraantopologie van het eiwit van belang wordt verkregen door het western blot-profiel te vergelijken met bekende standaarden.
Introduction
Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryote cellen die een cruciale rol spelen in bio-energetica, cellulair metabolisme en signaalroutes1. Om deze taken goed uit te voeren, vertrouwen mitochondriën op een unieke set eiwitten en lipiden die verantwoordelijk zijn voor hun structuur en functie. De ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae is veel gebruikt als modelsysteem voor onderzoek naar mitochondriale processen, evenals voor andere organellen2. Het mitochondriale genoom codeert voor slechts acht eiwitten in gist; de overgrote meerderheid van mitochondriale eiwitten (~99%) wordt gecodeerd door nucleaire genen, die worden vertaald op cytosolische ribosomen, en vervolgens geïmporteerd in hun juiste submitochondriale compartimenten door geavanceerde eiwitimportmachines3,4,5. Mitochondriale biogenese hangt dus af van de gecoördineerde expressie van zowel het nucleaire als het mitochondriale genoom6,7. Genetische mutaties die defecten in mitochondriale biogenese veroorzaken, zijn geassocieerd met ziekten bij de mens8,9,10.
In de afgelopen twee decennia resulteerden proteomische studies met hoge doorvoer gericht op sterk gezuiverde mitochondriën in een uitgebreide karakterisering van gist mitochondriaal proteoom, dat naar schatting bestaat uit ten minste 900 eiwitten11,12,13,14. Hoewel deze studies waardevolle informatie opleverden, is de suborganellaire lokalisatie van elk eiwit in de vier mitochondriale subsecties, namelijk het buitenmembraan (OM), de intermembraanruimte (IMS), het binnenmembraan (IM) en de matrix, nog steeds vereist. Deze vraag werd gedeeltelijk beantwoord met proteomische studies van de twee kleinere mitochondriale subcompartementen (OM en IMS)15,16. Meer recent hebben Vögtle en medewerkers een grote stap voorwaarts gezet door een hoogwaardige wereldwijde kaart van de distributie van submitochondriale eiwitten in gist te genereren. Met behulp van een geïntegreerde aanpak die SILAC-gebaseerde kwantitatieve massaspectrometrie, verschillende submitchondriële fractioneringsprotocollen en de dataset van de OM- en IMS-proteomen combineert, hebben de auteurs 818 eiwitten toegewezen aan de vier mitochondriale subcompartmenten13.
Ondanks de vooruitgang die deze high-throughput proteomische studies hebben geboekt, is onze kennis over de samenstelling van het submitochondriale proteoom verre van compleet. Inderdaad, van de 986 eiwitten die door Vögtle en medewerkers werden gerapporteerd als gelokaliseerd in gist mitochondriën, konden er 168 niet worden toegewezen in een van de vier submitchondriële compartimenten13. Bovendien gaven de auteurs geen informatie over de membraantopologie van eiwitten waarvan werd voorspeld dat ze perifeer aan de periferie van mitochondriale membranen waren bevestigd. Het is bijvoorbeeld niet mogelijk om te weten of een eiwit dat is toegewezen als perifeer bevestigd aan het binnenmembraan zich naar de matrix of de intermembraanruimte bevindt. Afgezien van deze ontbrekende gegevens uit de proteoombrede studies, is er tegenstrijdige informatie over de suborganellaire lokalisatie van een aanzienlijk aantal mitochondriale eiwitten. Een voorbeeld is het protease Prd1, dat is toegewezen als een intermembraan ruimte-eiwit in de gemeenschappelijke databases zoals Saccharomyces Genome Database (SGD) en Uniprot. Verrassend genoeg toonden Vögtle en medewerkers met behulp van een subfractionatieprotocol vergelijkbaar met het hier beschreven protocol duidelijk aan dat Prd1 een echt matrixeiwit13 is. Zoals hierboven vermeld, moet de submitchondrial lokalisatie van veel mitochondriale eiwitten worden opgehelderd of opnieuw geëvalueerd. Hier bieden we een eenvoudig en betrouwbaar protocol om de suborganellaire lokalisatie van gist mitochondriale eiwitten te bepalen. Dit protocol is ontwikkeld en geoptimaliseerd door verschillende onderzoeksgroepen en is routinematig gebruikt om de submitchondrial lokalisatie te bepalen, evenals de membraantopologie van veel mitochondriale eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Groei van gistcellen
- Isoleer enkele kolonies van de stam van belang door een klein deel van de cellen van een -80 °C glycerolvoorraad op een YPD (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose) agarplaat te strepen. Incubeer de plaat bij 30 °C gedurende 2-3 dagen.
OPMERKING: De S. cerevisiae-stam die in dit protocol wordt gebruikt, is afgeleid van BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Met uitzondering van de auxotrofe markergenen bevat deze stam geen verwijderd gen en draagt geen plasmide. Het kan dus met succes worden gekweekt in een rijk medium, waardoor krachtige celgroei wordt gestimuleerd. Gebruik bij het werken met stammen die zijn getransformeerd met plasmiden het juiste minimale medium voor plasmideselectie. - Bereid een startcultuur door 2-3 individuele kolonies van YPD-agarplaat in te enten in 10-20 ml YPGal-medium (1% gistextract, 2% pepton, 2% galactose) in een Erlenmeyer van 100 ml. Incubeer bij 30 °C gedurende 24 uur met krachtig schudden.
OPMERKING: De keuze van het groeimedium hangt af van de giststam die in het protocol wordt gebruikt. Zowel YPD als YPGal bevatten fermenteerbare koolstofbronnen, die de groei van stammen mogelijk maken die geen mitochondriale ademhaling uitvoeren. Omdat glucose echter de expressie van veel mitochondriale genen onderdrukt, wordt het niet aanbevolen om deze koolstofbron te gebruiken, omdat deze lagere hoeveelheden mitochondriën zal produceren. Bij het werken met respiratoire competente stammen die kunnen ademen, is het ook mogelijk om koolstofbronnen zoals glycerol en ethanol te gebruiken in een poging om een hogere opbrengst van mitochondriën te verkrijgen. - Verdun de startercultuur tot 1 L vers YPGal-medium tot een OD600 van minder dan 0,1. Kweek de cellen bij 30 °C met krachtig schudden tot od600 1-1,5 bereikt.
OPMERKING: Bepaal de groeisnelheid (verdubbelingstijd) voor elke giststam voordat u het experiment uitvoert. Dit geeft een nauwkeurige schatting van de incubatietijd die nodig is om de cultuur een OD600 van 1-1,5 te laten bereiken.
2. Isolatie van sterk gezuiverde mitochondriën
OPMERKING: Dit protocol is aangepast van17, met kleine wijzigingen.
- Oogst de cellen door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen met gedestilleerd water en verzamel ze door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Bepaal het natte gewicht van de cellen.
OPMERKING: De eenvoudigste manier om het gewicht van de celkorrel uit stap 2.2 te meten, is door het gewicht van de lege centrifugebuis vlak voor het verzamelen van de cellen te bepalen. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en meet het gewicht van dezelfde buis met de cellen. Het gewicht van de cellen is het verschil tussen de twee metingen. - Resuspend de cellen in DTT-buffer (2 ml per 1 g cellen) met behulp van een Pasteur pipet of P5000-tip. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de DDT-buffer.
- Incubeer de cellen bij 30 °C gedurende 20 minuten met zacht schudden (~ 70 rpm).
- Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
- Was de cellen met Zymolyase buffer zonder het enzym (ongeveer 7 ml per 1 g cellen).
Zie tabel 1 voor de samenstelling van de Zymolyasebuffer. - Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
- Resuspend de cellen in de buffer zonder Zymolyase (7 ml per 1 g cellen).
- Breng de celsuspensie over in een Erlenmeyer van 250 ml en voeg Zymolyase-20T (3 mg per g nat gewicht) toe.
- Incubeer de cellen bij 30 °C gedurende 30-40 minuten met zacht schudden (~ 70 rpm). Controleer de efficiëntie van dit proces door de troebelheid van de celsuspensie voor en na de behandeling met Zymolyase te vergelijken.
OPMERKING: In deze stap worden de cellen omgezet in sferoplasten als gevolg van celwandvertering door Zymolyase.- Voeg hiervoor 50 μL van elke celsuspensie toe aan afzonderlijke glazen buizen met 2 ml water. Na krachtig mengen zou de troebelheid van de met Zymolyase behandelde celsuspensie snel moeten afnemen als gevolg van de osmotische verstoring van sferoplasten. Aan de andere kant moet de troebelheid van de niet-behandelde celsuspensie ongewijzigd blijven.
OPMERKING: De effecten van troebelheid kunnen ook worden gecontroleerd door eenvoudige visuele inspectie of door het meten van de OD600 van beide monsters. In het tweede geval moet de OD600 van het met Zymolyase behandelde monster 10%-20% van het niet-behandelde monster zijn. Een alternatieve methode omvat het tellen van de cellen in beide monsters met behulp van lichtmicroscopie. - Als de opbrengst van de vorming van sferoplasten laag is, voeg dan meer Zymolyase toe en incubeer gedurende nog een interval van 15 minuten.
- Voeg hiervoor 50 μL van elke celsuspensie toe aan afzonderlijke glazen buizen met 2 ml water. Na krachtig mengen zou de troebelheid van de met Zymolyase behandelde celsuspensie snel moeten afnemen als gevolg van de osmotische verstoring van sferoplasten. Aan de andere kant moet de troebelheid van de niet-behandelde celsuspensie ongewijzigd blijven.
- Oogst de sferoplasten door centrifugeren bij 2500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Alle verdere stappen moeten snel en op ijs of bij 4 °C worden uitgevoerd om eiwitafbraak door hydrolytische enzymen te voorkomen. - Was de sferoplasten tweemaal met ijskoude homogenisatiebuffer (ongeveer 6,5 ml per 1 g cellen) en pellet door 5 minuten bij 4 °C bij 2.500 x g te centrifugeren. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de homogenisatiebuffer.
- Resuspend de sferoplasten in ijskoude homogenisatiebuffer (6,5 ml per 1 g cellen) en breng deze over in een voorgekoelde glazen Dounce-homogenisator. Gebruik een grote glazen homogenisator van ongeveer 30 ml.
- Homogeniseer de sferoplasten met 15 slagen met behulp van een stamper.
OPMERKING: Het aantal slagen moet worden aangepast afhankelijk van de stamperfitting. Voor strakke stamper zijn 15 slagen voldoende. Aan de andere kant, als u een losse stamper gebruikt, wordt het aanbevolen om maximaal 25 slagen uit te voeren. - Breng het homogenaat over in een centrifugebuis van 50 ml en voeg 1 volume ijskoude homogenisatiebuffer toe.
- Centrifugeer het homogenaat bij lage snelheid, 1.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om kernen, celresten en ongebroken cellen te pelleteren.
- Breng het supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis van 50 ml met behulp van een Pasteur-pipet of P5000-tip om ervoor te zorgen dat de pellet niet wordt verstoord.
- Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Breng het supernatant over in een snelle centrifugebuis en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om de ruwe mitochondriale fractie te pelleteren.
- Gooi het supernatant weg en was de ruwe mitochondriale pellet voorzichtig in 20-30 ml ijskoude homogenisatiebuffer door zachtjes te pipetteren met een P5000-tip.
- Breng de suspensie over in een centrifugebuis van 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 4.000 x g om het resterende celafval te pelleteren.
- Breng het supernatant over in een snelle centrifugebuis en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om de ruwe mitochondriale fractie te pelleteren.
- Gooi het supernatant weg en resuspend de ruwe mitochondriale pellet voorzichtig in een klein volume (meestal 1000 μL) ijskoude SEM-buffer door zachtjes te pipetteren met een P1000-tip. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de SEM-buffer.
OPMERKING: Hoewel deze ruwe mitochondriale fractie direct kan worden gebruikt in sommige toepassingen, zoals in organello-eiwitimporttests , bevat het aanzienlijke hoeveelheden andere cellulaire componenten. Deze verontreinigingen kunnen leiden tot verkeerde interpretaties van de resultaten bij het bepalen van de submitchondriële lokalisatie van een eiwit. Daarom zijn verdere zuiveringsstappen vereist om een sterk gezuiverd mitochondriaal preparaat te krijgen, zoals hieronder beschreven. - Bereid sucrose-oplossingen in de EM-buffer bij concentraties van 60%, 32%, 23% en 15% (w/v). Deze oplossingen zijn tot 1 maand stabiel bij 4 °C. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de EM-buffer.
- Bereid als volgt een 4-staps sucrosegradiënt in een ultracentrifugebuis: Plaats 1,5 ml 60% (w/v) sucrose op de bodem van de centrifugebuis. Pipetteer vervolgens voorzichtig stapsgewijs: 4 ml van 32%, 1,5 ml van 23% en 1,5 ml van 15% sucrose (w / v). Zorg ervoor dat de fasen niet worden verstoord.
- Laad de ruwe mitochondriale fractie voorzichtig bovenop de sucrosegradiënt.
- Centrifugeer gedurende 1 uur bij 134.000 x g bij 4 °C in een zwenkbakrotor.
- Blijf voorzichtig de sucrose-oplossing verwijderen totdat de sterk gezuiverde mitochondriale fractie is bereikt, die wordt vertegenwoordigd door een bruine band op het 60% / 32% sucrose-grensvlak.
- Herstel de gezuiverde mitochondriën met behulp van een P1000-gesneden punt en plaats deze in een voorgekoelde snelle centrifugebuis.
- Verdun de teruggewonnen mitochondriën met 5-10 volumes ijskoude SEM-buffer.
- Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C.
- Resuspend de zuivere mitochondriën in 500 μL ijskoude SEM-buffer door zachtjes te pipetteren met behulp van een P1000-snijpunt.
- Bepaal de eiwitconcentratie van het sterk gezuiverde mitochondriale preparaat met behulp van de Bradford-procedure volgens de instructies van de fabrikant. Stel de eiwitconcentratie in op 10 mg eiwit/ml met ijskoude SEM-buffer.
OPMERKING: Voor het hieronder beschreven submitchondriële fractioneringsprotocol wordt aanbevolen om vers bereide mitochondriën te gebruiken. Vögtle en medewerkers voerden echter een gedetailleerde kwaliteitscontroleanalyse uit van de mitochondriale intactheid en toonden aan dat bevroren organellen ook in dit protocol kunnen worden gebruikt13. Maak hiervoor aliquots van 40 μL en vries ze in vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 °C.
3. Submitochondrial fractioneringsprotocol
OPMERKING: Dit protocol is aangepast van referentie18 en bestaat uit twee stappen: (1) hypotone zwelling in de aan- of afwezigheid van proteïnase K, en (2) ultrasoonapparaat gevolgd door carbonaatextractie. Voer alle stappen van beide protocollen uit op ijs of bij 4 °C om eiwitafbraak te voorkomen.
- Hypotone zwelling in aanwezigheid van proteïnase K
- Breng 40 μL sterk gezuiverde mitochondriën over bij 10 mg/ml (400 μg) in vier voorgekoelde gelabelde microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
- Voeg 360 μL SEM-buffer toe in buis 1 en 2.
- Voeg 360 μL EM-buffer toe in buis 3 en 4.
- Voeg 4 μL proteïnase K (10 mg/ml) toe in de buis 2 en 4. Gebruik het pipetteerschema in tabel 2 om fouten te voorkomen.
OPMERKING: Bereid vlak voor gebruik een 10 mg/ml oplossing van proteïnase K in water. De uiteindelijke concentratie van proteïnase K in het experiment moet ongeveer 50-100 μg/ml zijn. Zie het gedeelte Discussie voor meer informatie. - Meng alle tubes voorzichtig en incubeer op ijs gedurende 30 minuten met af en toe mengen.
- Voeg 4 μL van 200 mM PMSF toe aan alle vier de buizen om de proteïnase K-activiteit te stoppen.
LET OP: PMSF is zeer giftig. Draag handschoenen bij het werken met oplossingen die PMSF bevatten. - Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Verzamel het supernatant en breng het over naar een nieuwe 1,5 ml voorgekoelde gelabelde microcentrifugebuis. Zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord.
OPMERKING: De pellet kan direct worden geresuspendeerd in de monsterbuffer voor verdere SDS-PAGE en western blot analyse. Sporen van proteïnase K kunnen echter ook na PMSF-behandeling actief blijven en kunnen uiteindelijk sommige eiwitten verteren nadat de pellet is opgelost in de SDS-bevattende monsterbuffer. Om dit probleem te voorkomen, kan proteïnase K volledig worden geïnactiveerd door behandeling van de monsters met trichloorazijnzuur (TCA) zoals hieronder beschreven.
LET OP: TCA is zeer giftig. Draag handschoenen bij het werken met oplossingen die TCA bevatten. - Resuspend de pellet uit stap 3.1.8 in 400 μL ijskoude SEM-buffer.
- Precipiteer het supernatant (vanaf stap 3.1.8) en de geresuspendeerde pellet (vanaf stap 3.1.9) met TCA tot een eindconcentratie van 10% (w/v).
- Incubeer alle buizen op ijs gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer de met TCA behandelde monsters gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en suspend de pellet in 200 μL monsterbuffer.
OPMERKING: Het is mogelijk dat de broomfenolblauwe pH-indicator geel wordt vanwege de zuurbehandeling. Als dit gebeurt, voeg dan kleine aliquots (1-5 μL) van 1 M Tris base toe totdat het blauw wordt. - Voeg 4 μL van 200 mM PMSF toe aan alle buizen.
- Bewaar alle monsters bij -80 °C tot verdere analyse door SDS-PAGE en western blot.
- Sonicatie en carbonaatextractie
OPMERKING: In dit protocol is het niet nodig om vers bereide mitochondriën te gebruiken zodra de ultrasoonapparaat de breuk van de mitochondriale membranen veroorzaakt.- Breng 200 μL sterk gezuiverde mitochondriën over bij 10 mg /ml (2 mg eiwit) in een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Verdun mitochondriën eenvoudig met ijskoude SEM-buffer.
- Sonicate mitochondriën voor 3 x 30 s op ijs. Gebruik een sonicator die compatibel is met kleine volumes.
- Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij 100.000 x g bij 4 °C.
- Verzamel het supernatant en breng het over naar een nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Houd het op ijs. Dit monster krijgt de naam oplosbare eiwitfractie (S).
- Resuspend de pellet uit stap 3.2.4 in 400 μL ijskoude SEM-buffer.
- Neem 100 μL van de geresuspendeerde pellet uit stap 3.2.6 en breng deze over in een nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Houd het op ijs. Dit monster krijgt de naam submitochondrial particles fraction (SMP).
- Verdun de resterende 300 μL uit stap 3.2.6 eenvoudig met vers bereid 200 mM natriumcarbonaat.
- Incubeer het monster uit stap 3.2.8 gedurende 30 minuten op ijs.
- Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij 100.000 x g bij 4 °C.
- Verzamel het supernatant en breng het over naar een nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Houd het op ijs. Dit monster krijgt de naam carbonate supernatant fraction (CS).
- Resuspend de pellet uit stap 3.2.10 in 400 μL ijskoude SEM-buffer. Dit monster krijgt de naam carbonate precipitated fraction (CP).
- Precipiteer alle monsters (S, SMP, CS en CP) met TCA tot een eindconcentratie van 10% (w/v).
- Incubeer alle buizen op ijs gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer de met TCA behandelde monsters gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en resuspend elke pellet in de monsterbuffer. Als de monsterbuffer geel wordt, voegt u kleine aliquots (1-5 μL) van 1 M Tris-basis toe totdat deze blauw wordt.
- Voeg 1 μL van 200 mM PMSF toe aan alle buizen.
- Bewaar alle monsters bij -80 °C tot verdere analyse door SDS-PAGE en western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het succes van het submitchondrial fractioneringsprotocol hangt af van het verkrijgen van sterk gezuiverde intacte mitochondriën. Hiervoor is het essentieel dat tijdens de gistcellysis de intactheid van de organellen bijna volledig bewaard blijft. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een cellysisprotocol dat de enzymatische vertering van de celwand combineert, gevolgd door fysieke verstoring van het plasmamembraan door een Dounce-homogenisator te gebruiken. De mitochondriale inhoud wordt vervolgens verzameld door differentiële centrifugatie. Deze subcellulaire fractionering levert een verrijkte mitochondriale fractie op, zoals bevestigd door de aanwezigheid van hoge niveaus van porine (Por1), een mitochondriaal markereiwit (figuur 1, baan 2). Dit is echter een ruwe mitochondriale fractie, die aanzienlijke hoeveelheden andere cellulaire compartimenten bevat, waaronder endoplasmatisch reticulum, vacuole, cytosol en endosoom (figuur 1, baan 2). Deze verontreinigingen kunnen artefacten introduceren in sommige toepassingen, zoals submitochondrial eiwitlokalisatie-experimenten. Om de hoeveelheid van deze verontreinigingen te verminderen, wordt de ruwe mitochondriale fractie verder gezuiverd op sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze extra zuiveringsstap genereert een zeer zuivere mitochondriale fractie, zoals blijkt uit een significante vermindering van de inhoud van de eiwitmarkers voor andere cellulaire compartimenten (figuur 1, baan 3).
Om de submitchondriële lokalisatie van eiwitten te bepalen, worden de sterk gezuiverde mitochondriën verder gefractioneerd in hun subsecties (figuur 2A). Dit protocol omvat de omzetting van mitochondriën in mitoplasten door hypotone osmotische shock. In dit proces worden intacte mitochondriën geïncubeerd in een hypoosmotische buffer, wat resulteert in zwelling van het organel. Tijdens de zwelling wordt het buitenste mitochondriale membraan selectief gescheurd door osmotische onbalans en wordt het intermembrane ruimte-eiwitgehalte vrijgegeven in het supernatant. Al deze procedure wordt uitgevoerd in de aan- of afwezigheid van proteïnase K. Als gevolg van de verstoring van het buitenmembraan krijgt het protease toegang tot het intermembraanruimte-eiwitgehalte en bevordert het de afbraak van de overeenkomstige eiwitten. Daarentegen blijft het eiwitgehalte van de mitochondriale matrix beschermd tegen aantasting van het protease vanwege de integriteit van het binnenste mitochondriale membraan. Na deze behandelingen wordt het eiwitgehalte van de verschillende monsters geëvalueerd door SDS-PAGE en western blot analyses.
De efficiënte omzetting van mitochondriën in mitoplasten door osmotische shock (zwelling) kan op twee manieren worden gevolgd: (1) het verdwijnen van het oplosbare intermembraanruimtemarkereiwit (bijv. Cytochroom Cyt. b2) in de pelletfractie van mitoplasten met het gelijktijdige uiterlijk in de supernatantfractie (figuur 2B, vergelijk rijstrook 3 met baan 7); (2) selectieve afbraak van het binnenmembraanmarkereiwit dat zich naar de intermembraanruimte bevindt (bv. ScoI) door proteïnase K alleen in mitoplasten (figuur 2B, baan 4). Daarnaast is de bescherming van de markers Cyt. b2 en ScoI tegen de afbraak van proteïnase K in de pelletfractie van mitochondriën worden gebruikt om de integriteit van het buitenste mitochondriale membraan te bevestigen (figuur 2B, baan 2). Aan de andere kant wordt de integriteit van het binnenste mitochondriale membraan bevestigd door de bescherming van de matrixoplosbare eiwitmarker α-KGD tegen de afbraak van proteïnase K (figuur 2B, baan 4). Om de submitchondrial lokalisatie van een eiwit van belang te bepalen, vergelijkt u eenvoudig het western blot-profiel met de profielen van deze standaarden met bekende lokalisatie.
In het geval van het eiwit afgebeeld in figuur 2B (Prx1), is het western blot-profiel indicatief voor een eiwit met dubbele mitochondriale lokalisatie: intermembraanruimte en matrix. Op het eerste gezicht is het fractioneringsprofiel vergelijkbaar met α-KGD, wat wijst op een matrixlokalisatie. De aanwezigheid ervan in het supernatant van mitoplasten duidt echter ook op een intermembraanruimtelokalisatie. De hierboven beschreven fractioneringsprofielen van eiwitmarkers elimineren de mogelijke artefacten die verband houden met de integriteit van het mitochondriale preparaat en bevestigen de dubbele lokalisatie van Prx119.
Om de topologie van eiwitten op mitochondriale membranen te onderzoeken, worden mitochondriën onderworpen aan twee aanvullende behandelingen: ultrasoonapparaat en carbonaatextractie (figuur 3A). Terwijl ultrasoonapparaat alleen oplosbare eiwitten vrijgeeft in de bovennatuurlijke fractie13, lost alkalische extractie met natriumcarbonaat bovendien perifeer membraangeassocieerde eiwitten op13,20. Bij beide behandelingen blijven integrale membraaneiwitten achter in de pelletfractie13. Deze aannames worden bevestigd door western blot-analyse van de pellet- en supernatantfracties van beide behandelingen (figuur 3B). Een integraal mitochondriaal membraaneiwit (bijv. porine Por1) zal naar verwachting volledig in de pelletfractie worden aangetroffen, zelfs na de alkalibehandeling met natriumcarbonaat (figuur 3B, rijstroken 3 en 5). Aan de andere kant wordt verwacht dat een oplosbaar matrixeiwit (bijvoorbeeld α-KGD) volledig zal worden opgelost in beide behandelingen (figuur 3B, rijstroken 2 en 4). De significante retentie van α-KGD in de pellet van ultrasoonapparaat (figuur 3B, baan 3, SMP-fractie) kan te wijten zijn aan kleine variaties in de ultrasoonapparaatparameters die de vorming van de zogenaamde submitorchondriale deeltjes kunnen beïnvloeden, die efficiënt worden bezinkt door ultracentrifugatie. Het gedrag van deze eiwitten met bekende oplosbaarheidsprofielen wordt vervolgens gebruikt om de mitochondriale oplosbaarheid van een interessant eiwit te bepalen. In het geval van Prx1 is het western blot-profiel suggestief voor een eiwit geassocieerd met de membraanrand en alkalische behandeling induceert de oplosbaarheid ervan (figuur 3B, baan 4).
Figuur 1: Isolatie van sterk gezuiverde mitochondriën. Western blot analyse van totale lysaatfractie (baan 1), een ruwe mitochondriale fractie (baan 2) en sterk gezuiverde mitochondriale fractie (baan 3). De fracties werden gescheiden door SDS-PAGE op een 12% polyacrylamidegel, overgebracht naar nitrocellulose en onderzocht met antilichamen tegen markers voor verschillende cellulaire compartimenten zoals beschreven aan de rechterkant van de gel. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Submitochondriaal fractioneringsprotocol door hypotone zwelling in aanwezigheid van proteïnase K. (A) Schematische weergave van het submitchondriële fractioneringsprotocol. Sterk gezuiverde mitochondriën worden afzonderlijk onderworpen aan isotone of hypotone behandelingen (zwelling) in aanwezigheid (+) of afwezigheid (-) van proteïnase K. Na de behandeling wordt de activiteit van proteïnase K geremd door de toevoeging van PMSF en worden mitochondriën en mitoplasten hersteld door centrifugatie. Het eiwitgehalte van de resulterende pellet- en supernatantfracties wordt neergeslagen door TCA en vervolgens geanalyseerd door SDS-PAGE en western blot. De kleurbollen vertegenwoordigen submitchondrial protein markers voor: een oplosbaar intermembrane ruimte-eiwit (groen), een binnenmembraaneiwit dat naar de intermembraanruimte kijkt (roze) en een oplosbaar matrixeiwit (lichtblauw). (B) Western blot analyse van pellet- en supernatantfracties uit het submitochondrial fractioneringsprotocol. De fracties werden gescheiden door SDS-PAGE op een 12% polyacrylamidegel, overgebracht naar nitrocellulose en onderzocht met antilichamen tegen markers voor verschillende submitchondriële compartimenten zoals afgebeeld in A. Zie tekst voor meer details. Dit cijfer is gewijzigd van19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Submitochondrial fractionation protocol by sonication and carbonate extraction. (A) Schematische weergave van het protocol dat wordt gebruikt om de oplosbaarheid en membraantopologie van mitochondriale eiwitten te bepalen. Mitochondriën worden in eerste instantie gesoniseerd en gecentrifugeerd, wat resulteert in een oplosbare eiwitfractie (S) en het gecompartimenteerde vliezige product, submitochondriaal deeltje (SMP) genoemd. De pellet uit de ultrasoonapparaatstap wordt vervolgens onderworpen aan een alkalische behandeling met natriumcarbonaat (Na2CO3) en gecentrifugeerd, wat resulteert in carbonaatsupernatant (CS) en carbonaat-neergeslagen fracties (CP). (B) Western blot analyse van pellet- en supernatantfracties uit ultrasoonapparaat en carbonaatextractieprotocol. De fracties werden gescheiden door SDS-PAGE op een 12% polyacrylamidegel, overgebracht naar nitrocellulose en onderzocht met antilichamen tegen eiwitmarkers die verschillende niveaus van oplosbaarheid vertoonden. Zie tekst voor meer details. Dit cijfer is gewijzigd van19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Onderdelen | Opmerkingen | |
| YPD medium | 1% (w/v) gistextract, 2% (w/v) pepton, 2% (w/v) glucose | Los 10 g Bacto Gist extract, 20 g Bacto Peptone en 20 g glucose op in 900 m gedestilleerd water toegevoegd. Vul tot 1000 ml en steriliseer door autoclaveren. | |
| YPGal-medium | 1% (w/v) gistextract, 2% (m/v) pepton, 2% (m/v) galactose | Los 10 g Bacto Gist extract, 20 g Bacto Peptone en 20 g galactose op in 900 m gedestilleerd water toegevoegd. Vul tot 1000 ml en steriliseer door autoclaveren. | |
| DTT-buffer | 100 mM Tris-H2SO4 (pH 9,4), 10 mM dithiothreitol (DTT) | Om 15 ml te maken: meng 1,5 ml 1 M Tris-H2SO4, pH 9,4 met 150 μL 1M DTT voorgewarmd bij 30 °C. Volume tot 15 ml met ddH2O Vers bereiden voor gebruik |
|
| Zymolyase buffer | 20 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,4), 1,2 M sorbitol | Om 100 ml te maken: meng 2 ml 1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7,4) met 60 ml 2 M sorbitol Volume tot 15 ml met ddH2O Los het poeder (3 mg per gram nat gewicht) van Zymolyase-20T uit Arthrobacter luteus (MP Biomedicals, Irvine, CA) vlak voor gebruik op in de buffer |
|
| Homogenisatiebuffer | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w/v) runderserumalbumine (BSA), 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Om 250 ml te maken: meng 2,5 ml 1 M Tris-HCl buffer (pH 7,4) met 75 ml 2 M sorbitol, 500 μL 500 mM EDTA en 0,5 g BSA (in wezen vetzuurvrij) Volume tot 250 ml met ddH2O Voorkoelen bij 4°C Voeg PMSF en BSA toe aan de buffer vlak voor gebruik |
|
| SEM-buffer | 10 mM MOPS-KOH (pH 7,2), 250 mM sucrose, 1 mM EDTA | Om 250 ml te maken: meng 2,5 ml 1 M MOPS-KOH buffer (pH 7,2) met 31,25 ml 2 M sucrose en 500 μL van 500 mM EDTA Volume tot 250 ml met ddH2O Voorkoelen bij 4°C vlak voor gebruik. |
|
| EM-buffer | 10 mM MOPS-KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA | Om 250 ml te maken: meng 2,5 ml 1 M MOPS-KOH-buffer (pH 7,2) met 500 μL van 500 mM EDTA Volume tot 250 ml met ddH2O Voorkoelen bij 4°C vlak voor gebruik |
|
| monsterbuffer | 2% (w/v) natriumdodecylsulfaat (SDS), 50 mM DTT, 10% (v/v) glycerol, 0,02% broomfenol blauw, 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), |
||
Tabel 1: Media, oplossingen en buffers.
| Reagens | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Mitochondriën (10 mg/ml) | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | |
| SEM-buffer | 360 μl | 360 μl | - | - | |
| EM-buffer | - | - | 360 μl | 360 μl | |
| Proteïnase K (10 mg/ml) | - | 4 μl | - | 4 μl | |
Tabel 2: Pipetteerschema om hypotone zwelling uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol is met succes gebruikt en continu geoptimaliseerd voor een lange tijd om de eiwitlokalisatie in de submitochondrial compartimenten13,14,18,21,22,23 te bepalen. De betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van dit protocol zijn sterk afhankelijk van de zuiverheid en integriteit van mitochondriale preparaten18. Beide vereisten worden bereikt door een extra zuiveringsstap (sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie) toe te voegen aan ruwe mitochondriale preparaten13,24,25 (figuur 1). Naast het elimineren van ongewenste niet-tochondriële verontreinigingen, elimineert deze extra zuiveringsstap ook gebroken mitochondriën en mitoplasten die kunnen ontstaan door de vele fysieke manipulaties van het monster tijdens het protocol18. Dus, ondanks het verlengen van de tijd van de procedure, genereert deze sucrose gradiëntzuiveringsstap sterk gezuiverde intacte mitochondriën, wat als essentieel wordt beschouwd voor het succes van het submitchondriële fractioneringsprotocol18,22.
Vögtle en medewerkers meldden dat bevroren organellen (bij -80 °C) ook met succes konden worden gebruikt voor submitchondriële fractionering13; we raden echter aan om verse mitochondriale bereiding te gebruiken. Onafhankelijk van keuze kan de intactheid van gezuiverde mitochondriën worden bevestigd door de gevoeligheid van intermembrane ruimte-eiwitten te controleren tegen extern toegevoegd proteïnase K. Als de organellen intact zijn, eiwitten van dit compartiment zoals Cyt. b2 en Sco1 moeten beschermd blijven tegen proteolytische afbraak als gevolg van de barrière die door het buitenmembraan wordt geboden (figuur 2B, baan 2). Wanneer de organellen daarentegen in een hypoosmotische buffer worden geïncubeerd, maakt de breuk van het buitenmembraan als gevolg van osmotische shock (zwelling) deze eiwitten vatbaar voor proteaseafbraak (figuur 2B, baan 4). Aan de andere kant moeten de eiwitten die aanwezig zijn in het matrixcompartiment, zoals α-KGD, beschermd blijven tegen afbraak in zowel mitochondriën als mitoplasten vanwege de integriteit van het binnenmembraan (figuur 2B, rijstroken 2 en 4). De profielen van deze goed bestudeerde mitochondriale markereiwitten kunnen dus worden gebruikt om de integriteit van mitochondriale preparaten of het succes van het fractioneringsprotocol te beoordelen. Bovendien wordt de submitchondriële lokalisatie van een interessant eiwit eenvoudig verkregen door vergelijking van het fractioneringsprofiel met dat van de merkereiwitten18,22 (figuur 2B). Belangrijk is dat als de mitochondriale markereiwitten een gedrag vertonen dat verschilt van het hierboven beschreven gedrag, de integriteit van de organellen waarschijnlijk wordt aangetast en daarom mag het mitochondriale preparaat niet worden gebruikt voor het doel van dit protocol.
Hoewel hypotone shock een betrouwbare methode is gebleken om onderscheid te maken tussen intermembrane ruimte-eiwitten versus matrix, geeft deze methode geen informatie of een matrixeiwit oplosbaar is of vastzit in het mitochondriale binnenmembraan. Deze informatie kan worden bereikt door mitochondriën te onderwerpen aan ultrasoonapparaat gevolgd door alkalische extractie met natriumcarbonaat (figuur 3). Terwijl oplosbare matrixeiwitten naar verwachting vrijkomen in de bovennatuurlijke fractie bij ultrasoonapparaat, hebben eiwitten geassocieerd met membranen de neiging zich in het neerslag te bevinden13. Aan de andere kant lost alkalische extractie met natriumcarbonaat efficiënt eiwitten op die perifeer aan membranen zijn bevestigd, maar niet integrale membraaneiwitten13,20. Dus als een eiwit resistent is tegen proteaseafbraak na zwelling, maar wordt vrijgegeven in het supernatant door alkalibehandeling, is het waarschijnlijk een perifeer bevestigd binnenmembraaneiwit tegenover het matrixcompartiment. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat het succes van protease-gevoeligheidstest opvallend afhankelijk is van de gevoeligheid van het eiwit van belang tegen het protease dat wordt gebruikt voor de spijsvertering. Sommige mitochondriale eiwitten lijken resistent te zijn tegen proteolytische afbraak bij de standaard proteïnase K-concentratie (0,1 mg / ml) die gewoonlijk wordt gebruikt in subfractionatieprotocollen (figuur 2B, rijstrook 8) 19. Een verdubbeling van de proteïnase K-concentratie (0,2 mg/ml) lijkt voldoende om een volledige proteolytische afbraak mogelijk te maken. Houd er echter rekening mee dat hogere concentraties protease het buitenste mitochondriale membraan kunnen destabiliseren en uiteindelijk de effectiviteit van het protocol in gevaar kunnen brengen.
Het lijdt geen twijfel dat om de functie van mitochondriale eiwitten op te helderen, het essentieel is om hun submitochondriële lokalisatie te bepalen. In dit opzicht vertegenwoordigt dit protocol een krachtig hulpmiddel voor onderzoekers die mitochondriën beginnen te bestuderen. Ondanks dat het gericht is op gist, kunnen veel van zijn principes gemakkelijk toepasbaar zijn op andere organismen. Inderdaad, met uitzondering van mitochondriale zuiveringsstappen, lijkt de rest van het protocol sterk op die gerapporteerd voor andere organismen26,27,28. Een andere belangrijke bijdrage van dit protocol is de toepasbaarheid ervan in de studie van mutanten van S. cerevisiae die veranderde mitochondriale biogenese vertonen. Er is op grote schaal gemeld dat gistmutanten voor mitochondriale eiwitimportmachines een veranderde verdeling van mitochondriale eiwitten vertonen5,29. Dit protocol kan dus routinematig worden gebruikt om de gevolgen voor de mitochondriale eiwitverdeling te onderzoeken die worden veroorzaakt door mutaties die mitochondriale biogenese kunnen veranderen. Ten slotte kan het protocol bijzonder nuttig zijn voor het onderzoeken van eiwitten die dubbele mitochondriale lokalisatie vertonen19,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
We danken Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) voor het leveren van antilichamen tegen submitochondrial marker eiwitten Cyt. b2, αKGD en Sco1. We bedanken ook Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) voor de nuttige discussie en opmerkingen tijdens de oprichting van dit protocol.
Dit werk werd ondersteund door onderzoekssubsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (subsidie 2013/07937-8).
Fernando Gomes en Helena Turano worden ook ondersteund door FAPESP, subsidies 2017/09443-3 en 2017/23839-7, respectievelijk. Angélica Ramos wordt ook ondersteund door Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
- Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
- Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
- Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
- Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
- Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
- Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
- Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
- Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
- Vögtle, F. N., et al.
- Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
- Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
- Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
- Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
- Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
- Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
- Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
- Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N.
- Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
- Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
- Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
- Neupert, W., Herrmann, J. M.
- Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).
