Summary
Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.
Abstract
Maya mitokondriyal proteomunun karakterizasyonundaki son gelişmelere rağmen, önemli sayıda proteinin boyunkondriyal lokalizasyonu zor olmaya devam etmektedir. Burada, mitokondriyal protein fonksiyonu elucidation sırasında temel bir adım olarak kabul edilen maya mitokondriyal proteinlerin suborganeller lokalizasyonunu belirlemek için sağlam ve etkili bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, son derece saf bozulmamış mitokondri elde etmekten oluşan bir ilk adımı içerir. Bu mitokondriyal preparatlar daha sonra hipotonik şok (şişlik) ve proteinaz K (proteaz) ile inkübasyondan oluşan bir subfraksiyon protokolüne tabi tutulur. Şişlik sırasında, dış mitokondriyal membran seçici olarak bozulur ve proteinaz K'nin intermembran uzay bölmesinin proteinlerini sindirmesine izin verir. Buna paralel olarak, membran proteinlerinin topolojisi hakkında bilgi edinmek için, mitokondriyal preparatlar başlangıçta sonikasyona tabi tutulur ve daha sonra sodyum karbonat ile alkali ekstraksiyona tabi tutulur. Son olarak, santrifüjlemeden sonra, bu farklı tedavilerden elde edilen pelet ve süpernatant fraksiyonları SDS-PAGE ve batı lekesi tarafından analiz edilir. Submitochondrial lokalizasyon ve ilgi proteininin membran topolojisi, batı leke profili bilinen standartlarla karşılaştırılarak elde edilir.
Introduction
Mitokondriler, biyoenergetik, hücresel metabolizma ve sinyal yollarında önemli roller oynayan ökaryotik hücrelerin temel organelleridir1. Bu görevleri düzgün bir şekilde yürütmek için mitokondri, yapılarından ve işlevlerinden sorumlu benzersiz bir protein ve lipit kümesine güvenir. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae, mitokondriyal süreçler üzerindeki araştırmalar ve diğer organeller için bir model sistemi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır2. Mayadaki sadece sekiz protein için mitokondriyal genom kodları; mitokondriyal proteinlerin büyük çoğunluğu (~%99), sitosolik ribozomlar üzerine çevrilen nükleer genler tarafından kodlanır ve daha sonra sofistike protein ithalat makineleri tarafından doğru boyunkopondriyal bölmelerine ithal edilir3,4,5. Bu nedenle, mitokondriyal biyogenez hem nükleer hem de mitokondriyal genomların koordineli ifadesine bağlıdır6,7. Mitokondriyal biyogenezde kusurlara neden olan genetik mutasyonlar insan hastalıkları ile ilişkilidir8,9,10.
Son yirmi yılda, yüksek saflaştırılmış mitokondrileri hedefleyen yüksek verimli proteomik çalışmalar, en az 900 proteinden oluştuğu tahmin edilen maya mitokondriyal proteomunun kapsamlı bir şekilde nitelendirilmesiyle sonuçlandı11,12,13,14. Bu çalışmalar değerli bilgiler sağlasa da, dört mitokondriyal alt şirketteki her proteinin, yani dış zarın (OM), intermembran alanının (IMS), iç zarın (IM) ve matrisin suborganeller lokalizasyonu hala gereklidir. Bu soru, iki küçük mitokondriyal alt bileşenin (OM ve IMS)15,16'nın proteomik geniş çalışmaları ile kısmen ele alındı. Daha yakın zamanda, Vögtle ve işbirlikçileri mayada yüksek kaliteli bir küresel sekonondriyal protein dağılımı haritası oluşturarak ileriye doğru büyük bir adım attı. SILAC tabanlı nicel kütle spektrometresi, farklı boyunkondriyal fraksiyon protokolleri ve OM ve IMS proteomlarından elde edilen verileri birleştiren entegre bir yaklaşım kullanan yazarlar, dört mitokondriyal alt bölüme 818 protein atadı13.
Bu yüksek verimli proteomik çalışmaların elde ettiği gelişmelere rağmen, submitochondrial proteome bileşimi hakkındaki bilgimiz tamamlanmaktan çok uzaktır. Gerçekten de, Vögtle ve işbirlikçileri tarafından maya mitokondrilerine lokalize olduğu bildirilen 986 protein arasında, dört boyunluk bölmeden hiçbirine 168 atanamadı13. Ayrıca, yazarlar mitokondriyal membranların çevresine periferik olarak bağlı olduğu tahmin edilen proteinlerin membran topolojisi hakkında bilgi vermediler. Örneğin, iç zara periferik olarak atanan bir proteinin matrise mi yoksa intermembran uzaya mı dönük olduğunu bilmek mümkün değildir. Proteome çapındaki çalışmalardan elde edilen bu eksik verilerin yanı sıra, önemli sayıda mitokondriyal proteinin suborganeller lokalizasyonu hakkında çelişkili bilgiler vardır. Saccharomyces Genom Veritabanı (SGD) ve Uniprot gibi ortak veritabanlarında intermembran uzay proteini olarak atanan proteaz Prd1 buna bir örnektir. Şaşırtıcı bir şekilde, burada açıklanana benzer bir alt ihlal protokolü kullanarak, Vögtle ve işbirlikçileri Prd1'in gerçek bir matris proteini olduğunu açıkça gösterdi13. Yukarıda belirtildiği gibi, birçok mitokondriyal proteinin submitochondrial lokalizasyonunun aydınlatılması veya yeniden değerlendirilmesi gerekir. Burada, maya mitokondriyal proteinlerin suborganeller lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir protokol sunuyoruz. Bu protokol çeşitli araştırma grupları tarafından geliştirilmiş ve optimize edilmiştir ve birçok mitokondriyal proteinin membran topolojisinin yanı sıra boyunkondriyal lokalizasyonu belirlemek için rutin olarak kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Maya hücrelerinin büyümesi
- Hücrelerin küçük bir kısmını -80 °C gliserol stoğundan bir YPD (%1 maya özü, %2 pepton, %2 glikoz) agar plakasına seri yaparak ilgi suşunun tek kolonilerini izole edin. Plakayı 2-3 gün boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu protokolde kullanılan S. cerevisiae suşu BY4741'den türetilmiştir (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Auxotrophic marker genleri hariç, bu suş silinmiş bir gen içermez ve herhangi bir plazmid taşımaz. Böylece, güçlü hücre büyümesini teşvik eden zengin bir ortamda başarıyla yetiştirilebilir. Plazmidlerle dönüştürülmüş suşlarla çalışırken, plazmid seçimi için uygun minimum ortamı kullanın. - 100 mL Errlenmeyer şişesinde 10-20 mL YPGal ortamında (%1 maya özü, %2 pepton, %2 galaktoz) YPD agar plakasından 2-3 ayrı koloni aşılayarak bir başlangıç kültürü hazırlayın. Kuvvetli sallama ile 24 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Büyüme ortamının seçimi protokolde kullanılan maya suşlarına bağlıdır. Hem YPD hem de YPGal, mitokondriyal solunum yapmayan suşların büyümesine izin veren fermente edilebilir karbon kaynakları içerir. Bununla birlikte, glikoz birçok mitokondriyal genin ekspresyonunun ifadesini bastırdığı için, daha düşük miktarlarda mitokondri üreteceğinden bu karbon kaynağının kullanılması önerilmez. Solunuma yetkin suşlarla çalışırken, daha yüksek bir mitokondri verimi elde etmek için gliserol ve etanol gibi karbon kaynaklarını kullanmak da mümkündür. - Başlangıç kültürünü 1 L taze YPGal ortamına 0,1'den daha az bir OD600'e seyreltin. OD600 1-1.5'e ulaşana kadar hücreleri 30 °C'de kuvvetli sallayarak yetiştirin.
NOT: Denemeyi yapmadan önce her maya suşunun büyüme hızını (iki katına çıkma süresi) belirleyin. Bu, kültürün 1-1,5 OD600'e ulaşması için gereken kuluçka süresinin doğru bir tahminini sağlayacaktır.
2. Son derece saflaştırılmış mitokondrilerin izolasyonu
NOT: Bu protokol, küçük değişikliklerle 17'den uyarlanmıştır.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.
- Hücreleri damıtılmış suyla yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
- Hücrelerin ıslak ağırlığını belirleyin.
NOT: Hücre peletinin ağırlığını adım 2.2'den ölçmenin en kolay yolu, hücrelerin toplanmasından hemen önce boş santrifüj tüpünün ağırlığını belirlemektir. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücrelerle aynı tüpün ağırlığını ölçün. Hücrelerin ağırlığı iki ölçüm arasındaki farktır. - Pasteur pipet veya P5000 ucu kullanarak DTT arabelleğindeki hücreleri (1 g hücre başına 2 mL) yeniden biriktirin. DDT arabellek bileşimi için Tablo 1'e bakın.
- Hücreleri 30 °C'de hafif sallanarak 20 dakika kuluçkaya yaslanın (~70 rpm).
- Hücreleri peletmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj.
- Hücreleri enzim olmadan Zymolyase tamponu ile yıkayın (1 g hücre başına yaklaşık 7 mL).
Zymolyase tampon bileşimi için Tablo 1'e bakın. - Hücreleri peletmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj.
- Tampondaki hücreleri Zymolyase olmadan yeniden biriktirin (1 g hücre başına 7 mL).
- Hücre süspansiyonu 250 mL Erlenmeyer şişesine aktarın ve Zymolyase-20T (g ıslak ağırlık başına 3 mg) ekleyin.
- Hücreleri 30 °C'de 30-40 dakika boyunca hafifçe sallayarak kuluçkaya yatırın (~70 rpm). Zymolyase tedavisinden önce ve sonra hücre süspansiyonunun bulanıklığını karşılaştırarak bu işlemin verimliliğini kontrol edin.
NOT: Bu adımda, hücreler Zymolyase tarafından hücre duvarı sindirimi nedeniyle sferoplastlara dönüştürülecektir.- Bunun için, 2 mL su içeren ayrı cam tüplere her hücre süspansiyonunun 50 μL'sini ekleyin. Kuvvetli bir şekilde karıştırılduktan sonra, sferoplastların ozmotik bozulması nedeniyle Zymolyase ile tedavi edilen hücre süspansiyonunun bulanıklığı hızla azalmalıdır. Öte yandan, tedavi edilmeyen hücre süspansiyonunun bulanıklığı değişmeden kalmalıdır.
NOT: Bulanıklığın etkileri basit görsel muayene veya her iki numunenin OD600'ünin ölçülmesi ile de izlenebilir. İkinci durumda, Zymolyase tedavi edilen numunenin OD600'ü tedavi edilmeyen numunenin% 10-20'si olmalıdır. Alternatif bir yöntem, ışık mikroskopisi kullanarak her iki örnekteki hücreleri saymayı içerir. - Sferoplast oluşumunun verimi düşükse, daha fazla Zymolyase ekleyin ve 15 dakika daha kuluçkaya yatırın.
- Bunun için, 2 mL su içeren ayrı cam tüplere her hücre süspansiyonunun 50 μL'sini ekleyin. Kuvvetli bir şekilde karıştırılduktan sonra, sferoplastların ozmotik bozulması nedeniyle Zymolyase ile tedavi edilen hücre süspansiyonunun bulanıklığı hızla azalmalıdır. Öte yandan, tedavi edilmeyen hücre süspansiyonunun bulanıklığı değişmeden kalmalıdır.
- Sferoplastları 4 °C'de 5 dakika boyunca 2500 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.
NOT: Hidrolitik enzimler tarafından protein bozulmasını önlemek için diğer tüm adımlar hızlı ve buz üzerinde veya 4 °C'de yapılmalıdır. - Sferoplastları buz gibi homojenizasyon tamponu (1 g hücre başına yaklaşık 6,5 mL) ve pelet ile 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüjleme ile iki kez yıkayın. Homojenizasyon arabelleği bileşimi için Tablo 1'e bakın.
- Sferoplastları buz gibi homojenizasyon tamponunda (1 g hücre başına 6,5 mL) yeniden uygulayın ve önceden soğutulmuş bir cam Dounce homojenizatöre aktarın. Yaklaşık 30 mL'lik büyük bir cam homojenizatör kullanın.
- Bir pestle kullanarak 15 vuruşla sferoplastları homojenize edin.
NOT: Strok sayısı pestil takılmasına bağlı olarak ayarlanmalıdır. Sıkı pestle için 15 vuruş yeterlidir. Öte yandan, gevşek bir haşere kullanıyorsanız, 25 darbeye kadar yapılması önerilir. - Homojenatı 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 1 hacim buz gibi homojenizasyon tamponu ekleyin.
- Homojenatı düşük hızda santrifüj, pelet çekirdeğine, hücre kalıntılarına ve kırılmamış hücrelere 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.500 x g .
- Peletin bozulmasını önlemek için bir Pasteur pipet veya P5000 ucu kullanarak süpernatantı yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüj.
- Süpernatantı yüksek hızlı bir santrifüj tüpüne aktarın ve ham mitokondri fraksiyonunu peletmek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj.
- Süpernatantı atın ve P5000 ucu kullanarak hafifçe pipetleme yaparak ham mitokondriyal peleti 20-30 mL buz gibi homojenizasyon tamponunda hafifçe yıkayın.
- Süspansiyonu 50 mL santrifüj tüpüne ve santrifüjü 4.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca aktararak kalan hücre kalıntılarını saçmaya devam edin.
- Süpernatantı yüksek hızlı bir santrifüj tüpüne aktarın ve ham mitokondri fraksiyonunu peletmek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj.
- Üstnatantı atın ve P1000 ucu kullanarak hafifçe pipetleme yaparak ham mitokondriyal peleti küçük bir hacimde (tipik olarak 1000 μL) buz gibi SEM tamponunda hafifçe yeniden depolayın. SEM arabellek bileşimi için Tablo 1'e bakın.
NOT: Bu ham mitokondriyal fraksiyon doğrudan organello protein ithalatı tahlilleri gibi bazı uygulamalarda kullanılabilse de, önemli miktarda başka hücresel bileşen içerir. Bu kontaminasyonlar, bir proteinin sekonondriyal lokalizasyonunu belirlerken sonuçların yanlış yorumlanmasına neden olabilir. Bu nedenle, aşağıda açıklandığı gibi, yüksek oranda saflaştırılmış mitokondriyal preparat elde etmek için daha fazla arınma adımı gereklidir. - EM tamponunda %60, %32, %23 ve %15 (w/v) konsantrasyonlarda sakkaroz çözeltileri hazırlayın. Bu çözeltiler 4 °C'de 1 aya kadar stabildir. EM arabellek bileşimi için Tablo 1'e bakın.
- Ultrasantrifüj tüpüne 4 adımlı bir sakkaroz gradyanı aşağıdaki gibi hazırlayın: Santrifüj tüpünün altına% 60 (w/ v) sakkarozun 1,5 mL'sini yerleştirin. Daha sonra, pipet dikkatlice adım adım: % 32'nin 4 mL'si, % 23'ün 1.5 mL'si ve% 15 sakkarozun 1.5 mL'si (w / v). Aşamaları bozmamaya dikkat edin.
- Ham mitokondriyal fraksiyonu sakkaroz gradyanının üzerine dikkatlice yükleyin.
- Sallanan kova rotorunda 4 °C'de 134.000 x g'da 1 saat santrifüj.
- %60/32 sakkaroz arayüzünde kahverengi bir bantla temsil edilen son derece saflaştırılmış mitokondri fraksiyonu ulaşılana kadar sakkaroz çözeltisini dikkatlice çıkarmaya devam edin.
- P1000 kesim ucu kullanarak saflaştırılmış mitokondrileri kurtarın ve önceden soğutulmuş yüksek hızlı bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Geri kazanılan mitokondrileri 5-10 hacim buz gibi SEM tamponu ile seyreltin.
- 4 °C'de 12.000 x g'da 30 dakika santrifüj.
- P1000 kesme ucu kullanarak hafif pipetleme ile saf mitokondriyi 500 μL buz gibi SEM tamponunda yeniden depolayın.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek Bradford prosedürünü kullanarak yüksek oranda saflaştırılmış mitokondriyal preparatın protein konsantrasyonunun belirlenmesi. Buz gibi SEM tamponu ile protein konsantrasyonu 10 mg protein/mL olarak ayarlayın.
NOT: Aşağıda açıklanan submitochondrial fraksiyonasyon protokolü için, taze hazırlanmış mitokondri kullanılması önerilir. Bununla birlikte, Vögtle ve işbirlikçileri mitokondriyal sağlamlığın ayrıntılı bir kalite kontrol analizini yaptı ve donmuş organellerin de bu protokolde kullanılabileceğini gösterdi13. Bunun için 40 μL'lik aliquots yapın ve sıvı nitrojende dondurun. -80 °C'de saklayın.
3. Submitochondrial fraksiyonasyon protokolü
NOT: Bu protokol referans18'den uyarlanmıştır ve iki adımdan oluşur: (1) proteinaz K'nin varlığında veya yokluğunda hipotonik şişlik ve (2) sonikasyon ve ardından karbonat ekstraksiyonu. Protein bozulmasını önlemek için her iki protokolün tüm adımlarını buz üzerinde veya 4 °C'de gerçekleştirin.
- Proteinaz K varlığında hipotonik şişlik
- 10 mg/mL'de (400 μg) 40 μL yüksek saflaştırılmış mitokondriyi dört 1,5 mL önceden soğutulmuş etiketli mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 1 ve 2 numaralı tüplere 360 μL SEM tampon ekleyin.
- 3 ve 4 numaralı tüplere 360 μL EM tampon ekleyin.
- 2 ve 4 numaralı tüplere 4 μL proteinaz K (10 mg/mL) ekleyin. Hataları önlemek için Tablo 2'de listelenen pipetleme düzenini kullanın.
NOT: Kullanmadan hemen önce suda 10 mg/mL proteinaz K çözeltisi hazırlayın. Deneydeki son proteinaz K konsantrasyonu 50-100 μg / mL civarında olmalıdır. Daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma bölümüne bakın. - Tüm tüpleri hafifçe karıştırın ve ara sıra karıştırarak 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
- Proteinaz K aktivitesini durdurmak için dört tüpe de 4 μL 200 mM PMSF ekleyin.
DİkKAT: PMSF oldukça zehirlidir. PMSF içeren çözümlerle çalışırken eldiven giyin. - 4 °C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüj.
- Süpernatantı toplayın ve yeni bir 1,5 mL önceden soğutulmuş etiketli mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Peletin bozulmasını önlemeye dikkat edin.
NOT: Pelet, daha fazla SDS-PAGE ve batı blot analizi için doğrudan numune arabelleğine yeniden kullanılabilir. Bununla birlikte, PROTEINAZ K izleri PMSF tedavisinden sonra bile aktif kalabilir ve sonunda pelet SDS içeren numune tamponunda çözüldükten sonra bazı proteinleri sindirebilir. Bu sorunu önlemek için, proteinaz K, aşağıda açıklandığı gibi trikloroasetik asit (TCA) ile örneklerin tedavisi ile tamamen inaktive edilebilir.
DİkKAT: TCA oldukça zehirlidir. TCA içeren çözümlerle çalışırken eldiven giyin. - Peletin 400 μL buz gibi SEM tamponunda 3.1.8 adımından yeniden depolanın.
- TCA ile süpernatantı (adım 3.1.8'den) ve yeniden dürtülmüş peletin (adım 3.1.9'dan) %10'luk (w/v) son konsantrasyona kadar çökeltin.
- Buzdaki tüm tüpleri 10 dakika kuluçkaya yatır.
- TCA ile işlenmiş numuneleri 4 °C'de 12.000 x g'da 10 dakika santrifüj edin.
- Üstnatant çıkarın ve peletin 200 μL numune tamponunda yeniden süzülür.
NOT: Bromofenol mavi pH göstergesinin asit tedavisi nedeniyle sararması mümkündür. Bu durumda, maviye dönene kadar 1 M Tris tabanının küçük aliquotlarını (1-5 μL) ekleyin. - Tüm tüplere 4 μL 200 mM PMSF ekleyin.
- SDS-PAGE ve western blot tarafından daha fazla analiz edilene kadar tüm numuneleri -80 °C'de saklayın.
- Sonication ve karbonat ekstraksiyonu
NOT: Bu protokolde, sonication mitokondriyal membranların yırtılmasına neden olduktan sonra taze hazırlanmış mitokondrilerin kullanılması gerekli değildir.- 10 mg/mL'de (2 mg protein) 200 μL yüksek saflaştırılmış mitokondriyi 1,5 mL önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Mitokondrileri buz gibi SEM tamponu ile bir kat seyreltin.
- Buz üzerinde 3 x 30 s için sonicate mitokondri. Küçük birimler için uyumlu bir sonicator kullanın.
- Numuneyi 4 °C'de 100.000 x g'da 30 dakika santrifüj edin.
- Süpernatantı toplayın ve yeni bir 1,5 mL önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Buzda tut. Bu örnek çözünür protein fraksiyonu (S) olarak adlandırılacaktır.
- Peletin 400 μL buz gibi SEM tamponunda 3.2.4 adımından yeniden depolanın.
- 3.2.6 adımından 100 μL resüspended pelet alın ve yeni bir 1.5 mL önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Buzda tut. Bu örnek submitochondrial parçacık fraksiyonu (SMP) olarak adlandırılacaktır.
- Kalan 300 μL'yi 3.2.6 adımdan tek kat taze hazırlanmış 200 mM sodyum karbonatla seyreltin.
- Numuneyi 3.2.8 adımından buz üzerinde 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- Numuneyi 4 °C'de 100.000 x g'da 30 dakika santrifüj edin.
- Süpernatantı toplayın ve yeni bir 1,5 mL önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Buzda tut. Bu örnek karbonat süpernatant fraksiyonu (CS) olarak adlandırılacaktır.
- Peletin 400 μL buz gibi SEM tamponunda 3.2.10 adımından yeniden depolanın. Bu örnek karbonat çökelmiş fraksiyon (CP) olarak adlandırılacaktır.
- TCA ile tüm örnekleri (S, SMP, CS ve CP) %10'luk (w/v) son konsantrasyona çökeltin.
- Buzdaki tüm tüpleri 10 dakika kuluçkaya yatır.
- TCA ile işlenmiş numuneleri 4 °C'de 12.000 x g'da 10 dakika santrifüj edin.
- Üstnatant çıkarın ve örnek arabellek her pelet resuspend. Örnek tampon sarı olursa, maviye dönene kadar 1 M Tris tabanının küçük aliquotlarını (1-5 μL) ekleyin.
- Tüm tüplere 1 μL 200 mM PMSF ekleyin.
- SDS-PAGE ve western blot tarafından daha fazla analiz edilene kadar tüm numuneleri -80 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Submitochondrial fraksiyonasyon protokolünün başarısı, son derece saflaştırılmış bozulmamış mitokondri elde edilmesine bağlıdır. Bunun için, maya hücresi lizisi sırasında, organellerin sağlamlığının neredeyse tamamen korunması esastır. Bu, hücre duvarının enzimatik sindirimini birleştiren bir hücre liziz protokolü ve ardından bir Dounce homojenizatör kullanarak plazma zarının fiziksel bozulması ile elde edilir. Mitokondriyal içerikler daha sonra diferansiyel santrifüjleme ile toplanır. Bu subselüler fraksiyon, bir mitokondriyal belirteç proteini olan yüksek düzeyde porin (Por1) varlığı ile doğrulanan zenginleştirilmiş bir mitokondriyal fraksiyon verir (Şekil 1, şerit 2). Bununla birlikte, bu, endoplazmik reticulum, vakuol, sitozol ve endozom dahil olmak üzere önemli miktarda diğer hücresel bölmeleri içeren ham bir mitokondri fraksiyonudur (Şekil 1, şerit 2). Bu kontaminasyonlar, submitochondrial protein lokalizasyon deneyleri gibi bazı uygulamalarda eserlere neden olabilir. Bu kontaminasyonların miktarını azaltmak için, ham mitokondriyal fraksiyon sakkaroz yoğunluğu gradyan santrifüjleme üzerinde daha da saflaştırılır. Bu ek saflaştırma adımı, diğer hücresel bölmeler için protein belirteçlerinin içeriğinde önemli bir azalma ile kanıtlandıkça, son derece saf bir mitokondriyal fraksiyon oluşturur (Şekil 1, şerit 3).
Proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için, yüksek oranda saflaştırılmış mitokondriler alt bölümlerine daha da kesirlenir (Şekil 2A). Bu protokol, mitokondrilerin hipotonik ozmotik şok ile mitoplastlara dönüştürülmesini içerir. Bu süreçte, sağlam mitokondriler, organel şişmesi ile sonuçlanan hiposmotik bir tamponda inkübe edilir. Şişlik sırasında, dış mitokondriyal membran seçici olarak ozmotik dengesizlik ile yırtılır ve intermembran uzay proteini içeriği süpernatant içine salınır. Tüm bu prosedür proteinaz K varlığında veya yokluğunda gerçekleştirilir. Dış zar bozulmasının bir sonucu olarak, proteaz intermembran uzay proteini içeriğine erişim kazanır ve ilgili proteinlerin bozulmasını teşvik eder. Buna karşılık, mitokondriyal matrisin protein içeriği, iç mitokondriyal zarın bütünlüğü nedeniyle proteazın saldırısından korunmaya devam eder. Bu tedavilerden sonra farklı örneklerin protein içeriği SDS-PAGE ve western blot analizleri ile değerlendirilir.
Mitokondrilerin ozmotik şok (şişlik) ile mitoplastlara verimli dönüşümü iki şekilde izlenebilir: (1) çözünür intermembran uzay belirteci proteininin kaybolması (örneğin, sitokrom Cyt. b2) mitoplastlardan gelen pelet fraksiyonunda, süpernatan fraksiyondaki eşlik eden görünümüyle (Şekil 2B, şerit 3 ile şerit 7'yi karşılaştırın); (2) intermembran uzaya bakan iç zar işaretleyici proteinin (örneğin, ScoI) sadece mitoplastlarda proteinaz K tarafından seçici olarak bozulması (Şekil 2B, şerit 4). Ek olarak, işaretleyicilerin korunması Cyt. b2 ve ScoI, mitokondriden gelen pelet fraksiyonunda proteinaz K bozulmasına karşı dış mitokondriyal zarın bütünlüğünü doğrulamak için kullanılır (Şekil 2B, şerit 2). Öte yandan, iç mitokondriyal membran bütünlüğü, matris çözünür protein işaretleyici α-KGD'nin proteinaz K bozulmasına karşı korunması ile doğrulanır (Şekil 2B, şerit 4). İlgi çekici bir proteinin submitochondrial lokalizasyonunu belirlemek için, batı leke profilini bu standartların profilleriyle bilinen yerelleştirme ile karşılaştırmanız yeterlidir.
Şekil 2B'de (Prx1) tasvir edilen protein durumunda, batı leke profili çift mitokondriyal lokalizasyona sahip bir proteinin göstergesidir: intermembran uzayı ve matris. İlk bakışta, kesir profili α-KGD'ye benzer ve matris lokalizasyonunu gösterir. Bununla birlikte, mitoplastların süpernatantındaki varlığı da intermembran uzay lokalizasyonunu gösterir. Yukarıda açıklanan protein belirteçlerinin fraksiyonasyon profilleri, mitokondriyal preparatın bütünlüğü ile ilişkili olası eserleri ortadan kaldırır ve Prx119'un çift lokalizasyonunu doğrular.
Mitokondriyal membranlar üzerindeki proteinlerin topolojisini araştırmak için mitokondri iki ek tedaviye sunulur: sonikasyon ve karbonat ekstraksiyonu (Şekil 3A). Sonication süpernatant fraksiyon13 içine sadece çözünür proteinler serbest bırakırken, sodyum karbonat ile alkali ekstraksiyon ek olarak periferik membran ilişkili proteinleri çözünür13,20. Her iki tedavide de, integral membran proteinleri pelet fraksiyonunda kalır13. Bu varsayımlar, her iki tedaviden pelet ve süpernatant fraksiyonlarının batı leke analizi ile doğrulanmaktadır (Şekil 3B). Entegre bir mitokondriyal membran proteininin (örneğin porin Por1), sodyum karbonat ile alkali işlemden sonra bile tamamen pelet fraksiyonunda bulunması beklenir (Şekil 3B, şerit 3 ve 5). Öte yandan, çözünür bir matris proteininin (örneğin, α-KGD) her iki tedavide de tamamen çözünmesi beklenir (Şekil 3B, şerit 2 ve 4). α-KGD'nin sonikasyondan kaynaklanan peletteki önemli tutulması (Şekil 3B, şerit 3, SMP fraksiyonu), sonication parametrelerinde ultrasantrifüjleme ile verimli bir şekilde çökeltilen boyunokondriyal parçacıkların oluşumunu etkileyebilecek hafif değişikliklerden kaynaklanabilir. Bu proteinlerin bilinen çözünürlük profillerine sahip davranışları daha sonra ilgi çekici bir proteinin mitokondriyal çözünürlüğü belirlemek için kullanılır. Prx1 durumunda, batı leke profili membran çevresi ile ilişkili bir proteini düşündürücüdür ve alkali tedavisi çözünürlüğünü indükler (Şekil 3B, şerit 4).
Şekil 1: Yüksek oranda saflaştırılmış mitokondri izolasyonu. Toplam lisat fraksiyonunun Batı blot analizi (şerit 1), kaba bir mitokondriyal fraksiyon (şerit 2) ve son derece saflaştırılmış mitokondriyal fraksiyon (şerit 3). Fraksiyonlar SDS-PAGE ile %12 poliakrilamid jel üzerinde ayrıldı, nitroselüloza aktarıldı ve jelin sağ tarafında açıklandığı gibi farklı hücresel bölmeler için işaretleyicilere karşı yükseltilen antikorlarla araştırıldı. Bu rakam reference19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Proteinaz K. (A) Boyunkokondriyal fraksiyonasyon protokolünün şematik gösteriminde hipotonik şişme ile sekonondriyal fraksiyonasyon protokolü. Yüksek oranda saflaştırılmış mitokondriler, proteinaz K'nin varlığında (+) veya yokluğunda (-) izotonik veya hipotonik tedavilere (şişme) ayrı ayrı tabi tutulur. Tedaviden sonra, PMSF ilavesi ile proteinaz K aktivitesi inhibe edilir ve mitokondri ve mitoplastlar santrifüjleme ile geri kazanilir. Elde edilen pelet ve süpernatant fraksiyonlarından elde edilen protein içeriği TCA tarafından çökeltilir ve daha sonra SDS-PAGE ve batı blot tarafından analiz edilir. Renk küreleri submitochondrial protein belirteçlerini temsil eder: çözünür bir intermembran uzay proteini (yeşil), intermembran uzaya (pembe) bakan bir iç membran proteini ve çözünür matris proteini (açık mavi). (B) Geri göndermeochondrial fraksiyon protokolünden pelet ve süpernatant fraksiyonlarının Batı blot analizi. Kesirler SDS-PAGE ile %12 poliakrilamid jel üzerinde ayrılmış, nitroselüloza aktarılmış ve A'da gösterildiği gibi farklı boyunokondriyal bölmeler için belirteçlere karşı yükseltilen antikorlarla araştırılmıştır. Daha fazla ayrıntı için metne bakın. Bu rakam 19'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sonikasyon ve karbonat ekstraksiyonu ile sekonondriyal fraksiyonasyon protokolü. (A) Mitokondriyal proteinlerin çözünürlük ve membran topolojisini belirlemek için kullanılan protokolün şematik gösterimi. Mitokondri başlangıçta sonicated ve santrifüjlü, çözünür protein fraksiyonu (S) ve bölümlere ayrılmış membranöz ürün, sentochondrial parçacık (SMP) denir. Sonication adımından gelen pelet daha sonra sodyum karbonat (Na2CO3) ve santrifüjlü alkali bir tedaviye gönderilir ve karbonat süpernatantı (CS) ve karbonat çökeltili fraksiyonlarla (CP) sonuçlanır. (B) Sonikasyon ve karbonat ekstraksiyon protokolünden pelet ve süpernatant fraksiyonlarının Batı blot analizi. Fraksiyonlar SDS-PAGE ile %12 poliakrilamid jel üzerinde ayrıldı, nitroselüloza aktarıldı ve farklı çözünürlük seviyeleri gösteren protein belirteçlerine karşı yükseltilen antikorlarla araştırıldı. Daha fazla ayrıntı için metne bakın. Bu rakam 19'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm | Bileşen | Yorum | |
| YPD ortamı | %1 (w/v) maya özü, %2 (w/v) pepton, %2 (w/v) glikoz | Eklenen 900 m damıtılmış suda 10 g Bacto Maya özü, 20 g Bacto Peptone ve 20 g glikoz çözün. 1000 ml'ye kadar doldurun ve otomatik olarak sterilize edin. | |
| YPGal ortamı | %1 (w/v) maya özü, %2 (w/v) pepton, %2 (w/v) galaktoz | Eklenen 900 m damıtılmış suda 10 g Bacto Maya özü, 20 g Bacto Peptone ve 20 g galaktoz çözün. 1000 ml'ye kadar doldurun ve otomatik olarak sterilize edin. | |
| DTT arabelleği | 100 mM Tris-H2SO4 (pH 9.4), 10 mM dithiothreitol (DTT) | 15 ml yapmak için: 1,5 ml 1 M Tris-H2SO4, pH 9,4'ü 30 °C'de önceden ısıtılmış 1M DTT'nin 150 μL'si ile karıştırın. ddH2O ile 15 ml'ye kadar hacim Kullanmadan önce yeni hazırlanın |
|
| Zymolyase tamponu | 20 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.4), 1.2 M sorbitol | 100 ml yapmak için: 2 ml 1 M potasyum fosfat tamponunu (pH 7.4) 60 ml 2 M sorbitol ile karıştırın ddH2O ile 15 ml'ye kadar hacim Zymolyase-20T'nin tozlarını (gram ıslak ağırlık başına 3 mg) arthrobacter luteus'tan (MP Biomedicals, Irvine, CA) kullanımdan hemen önce tamponda çözün |
|
| Homojenizasyon arabelleği | 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.6 M sorbitol, 1 mM EDTA, %0.2 (w/v) sığır serum albümin (BSA), 1 mM fenilmetilsfonil florür (PMSF) | 250 ml yapmak için: 2,5 ml 1 M Tris-HCl tamponu (pH 7,4) 75 ml 2 M sorbitol, 500 μL 500 mM EDTA ve 0,5 g BSA (esasen yağ asidi içermeyen) ile karıştırın ddH2O ile 250 ml'ye kadar hacim 4°C'de ön soğutma Kullanmadan hemen önce arabelleğe PMSF ve BSA ekleme |
|
| SEM arabelleği | 10 mM MOPS-KOH (pH 7.2), 250 mM sakkaroz, 1 mM EDTA | 250 ml yapmak için: 2,5 ml 1 M MOPS-KOH tamponu (pH 7,2) 31,25 ml 2 Sakkaroz ve 500 μL 500 mM EDTA ile karıştırın ddH2O ile 250 ml'ye kadar hacim Kullanmadan hemen önce 4°C'de ön soğutma. |
|
| EM arabelleği | 10 mM MOPS-KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA | 250 ml yapmak için: 2,5 ml 1 M MOPS-KOH tamponu (pH 7,2) 500 μL 500 mM EDTA ile karıştırın ddH2O ile 250 ml'ye kadar hacim Kullanımdan hemen önce 4°C'de ön soğutma |
|
| örnek arabellek | %2 (w/v) sodyum dodecylsulfate (SDS), 50 mM DTT, %10 (v/v) gliserol, %0,02 bromofenol mavi, 60 mM Tris-HCl (pH 6.8), |
||
Tablo 1: Ortam, çözümler ve arabellekler.
| Reaktif | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Mitokondri (10 mg/mL) | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | |
| SEM arabelleği | 360 μL | 360 μL | - | - | |
| EM arabelleği | - | - | 360 μL | 360 μL | |
| Proteinaz K (10 mg/mL) | - | 4 μL | - | 4 μL | |
Tablo 2: Hipotonik şişlik yapmak için pipetleme şeması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol, submitochondrial bölmelerdeki protein lokalizasyonunu belirlemek için uzun süredir başarıyla kullanılmış ve sürekli olarak optimize edilmiştir13,14,18,21,22,23. Bu protokolün güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği, mitokondriyal preparatların saflığına ve bütünlüğüne güçlü bir şekilde bağlıdır18. Bu gereksinimlerin her ikisi de ham mitokondriyal preparatlara ek bir saflaştırma adımı (sakkaroz yoğunluğu gradyan santrifüjleme) eklenerek elde edilir13,24,25(Şekil 1). İstenmeyen nonmitochondrial kirleticileri ortadan kaldırmanın yanı sıra, bu ek saflaştırma adımı, protokol sırasında numunenin çok sayıda fiziksel manipülasyonundan kaynaklanabilecek kırık mitokondrileri ve mitoplastları da ortadan kaldırır18. Bu nedenle, prosedürün süresini artırmasına rağmen, bu sakkaroz gradyan arıtma adımı, submitochondrial fraksiyonasyon protokolünün başarısı için gerekli olduğu düşünülen son derece saflaştırılmış bozulmamış mitokondri oluşturur18,22.
Vögtle ve işbirlikçileri, dondurulmuş organellerin (-80 °C'de) submitochondrial fraksiyonasyonu13 için de başarıyla kullanılabileceğini bildirdi; ancak, taze mitokondriyal preparat kullanmanızı öneririz. Seçimden bağımsız olarak, saflaştırılmış mitokondrilerin sağlamlığı, intermembran uzay proteinlerinin dışarıdan eklenen proteinaz K'ye karşı duyarlılığı kontrol edilerek doğrulanabilir. Organeller sağlamsa, Cyt gibi bu bölmenin proteinleri. b2 ve Sco1, dış zarın sağladığı bariyer nedeniyle proteolitik bozulmaya karşı korunmalıdır (Şekil 2B, şerit 2). Buna karşılık, organeller hiposmotik bir tamponda inkübe edildiğinde, dış zarın ozmotik şok (şişme) nedeniyle yırtılması, bu proteinleri proteaz bozulmasına eğilimli hale getirir (Şekil 2B, şerit 4). Öte yandan, α-KGD gibi matris bölmesinde bulunan proteinler, iç zarın bütünlüğü nedeniyle hem mitokondrilerde hem de mitoplastlarda bozulmaya karşı korunmalıdır (Şekil 2B, şerit 2 ve 4). Bu nedenle, bu iyi çalışılmış mitokondriyal belirteç proteinlerinin profilleri, mitokondriyal preparatların bütünlüğünü veya fraksiyonasyon protokolünün başarısını değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, ilgi çekici bir proteinin submitochondrial lokalizasyonu, fraksiyonasyon profilinin marker proteinlerinden gelenlerle karşılaştırılmasıyla elde edilir18,22 (Şekil 2B). Daha da önemlisi, mitokondriyal belirteç proteinleri yukarıda açıklanandan farklı bir davranış gösteriyorsa, organellerin bütünlüğü muhtemelen tehlikeye girer ve bu nedenle mitokondriyal preparat bu protokolün amacı için kullanılmamalıdır.
Hipotonik şokun intermembran uzay proteinleri ile matris arasında ayrım yapmak için güvenilir bir yöntem olduğu kanıtlanmış olsa da, bu yöntem bir matris proteininin çözünür mü yoksa mitokondriyal iç zara bağlı mı olduğu hakkında bilgi sağlamaz. Bu bilgiler mitokondrilerin sonikasyona ve ardından sodyum karbonat ile alkali ekstraksiyona sunulmasıyla elde edilebilir (Şekil 3). Çözünür matris proteinlerinin sonication üzerine süpernatant fraksiyona salınması beklenirken, membranlarla ilişkili proteinler çökelti13'te olma eğilimindedir. Öte yandan, sodyum karbonat ile alkali ekstraksiyon, membranlara periferik olarak bağlı proteinleri verimli bir şekilde çözünür, ancak integral membran proteinlerini değil13,20. Bu nedenle, bir protein şişlikten sonra proteaz bozulmasına karşı dirençliyse, ancak alkali tedavisi ile süpernatant içine salınırsa, muhtemelen matris bölmesine bakan periferik olarak bağlı bir iç zar proteinidir. Proteaz duyarlılığı testinin başarısının, sindirim için kullanılan proteaz karşı ilgi proteininin hassasiyetine çarpıcı bir şekilde bağlı olduğunu akılda tutmak önemlidir. Bazı mitokondriyal proteinler, genellikle subfractionation protokollerinde kullanılan standart proteinaz K konsantrasyonunda (0,1 mg/mL) proteolitik bozulmaya karşı dirençli görünmektedir (Şekil 2B, şerit 8)19. Proteinaz K konsantrasyonunun iki katına çıkarılması (0.2 mg/mL) tam bir proteolitik bozulmayı sağlamak için yeterli görünmektedir. Bununla birlikte, daha yüksek proteaz konsantrasyonlarının dış mitokondriyal zarın dengesini bozabileceğini ve sonunda protokolün etkinliğini tehlikeye atabileceğini unutmayın.
Hiç şüphe yok ki, mitokondriyal proteinlerin işlevini aydınlatmak için, boyunkondriyal lokalizasyonlarını belirlemek önemlidir. Bu bağlamda, bu protokol mitokondrileri incelemeye başlayan araştırmacılar için güçlü bir aracı temsil eder. Mayaya yönlendirilmesine rağmen, ilkelerinin çoğu diğer organizmalar için kolayca uygulanabilir. Gerçekten de, mitokondriyal arınma adımları hariç, protokolün geri kalanı diğer organizmalar için bildirilenlere çok benzer26,27,28. Bu protokolün bir diğer önemli katkısı, değiştirilmiş mitokondriyal biyogenez gösteren S. cerevisiae mutantlarının çalışmasındaki uygulanabilirliğidir. Mitokondriyal protein ithalat makineleri için maya mutantlarının mitokondriyal proteinlerin değiştirilmiş bir dağılımını gösterdiği yaygın olarak bildirilmiştir5,29. Bu nedenle, bu protokol rutin olarak mitokondriyal biyogenez değiştirebilen mutasyonların neden olduğu mitokondriyal protein dağılımı üzerindeki sonuçları araştırmak için kullanılabilir. Son olarak, protokol özellikle çift mitokondriyal lokalizasyon gösteren proteinleri araştırmak için yararlı olabilir19,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Dr. A. Tzagoloff'a (Columbia Üniversitesi) boyunokondriyal belirteç proteinleri Cyt'e karşı yetiştirilen antikorları sağladığı için teşekkür ederiz. b2, αKGD ve Sco1. Ayrıca, bu protokolün oluşturulması sırasında yararlı tartışmalar ve yorumlar için Dr. Mario Henrique de Barros'a (Universidade de São Paulo) teşekkür ederiz.
Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) araştırma hibeleri ile desteklendi (grant 2013/07937-8).
Fernando Gomes ve Helena Turano da SıRASıYLA 2017/09443-3 ve 2017/23839-7 hibeleri olan FAPESP tarafından desteklenmektedir. Angélica Ramos ayrıca Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
- Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
- Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
- Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
- Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
- Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
- Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
- Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
- Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
- Vögtle, F. N., et al.
- Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
- Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
- Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
- Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
- Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
- Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
- Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
- Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N.
- Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
- Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
- Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
- Neupert, W., Herrmann, J. M.
- Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).
