Summary
Nonostante i recenti progressi, molte proteine mitocondriali del lievito rimangono ancora con le loro funzioni completamente sconosciute. Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per determinare la localizzazione sottocondriale delle proteine, che è stato fondamentale per la delucidazione delle loro funzioni molecolari.
Abstract
Nonostante i recenti progressi nella caratterizzazione del proteoma mitocondriale del lievito, la localizzazione sottocondriale di un numero significativo di proteine rimane sfuggente. Qui, descriviamo un metodo robusto ed efficace per determinare la localizzazione suborganellare delle proteine mitocondriali del lievito, che è considerato un passo fondamentale durante la delucidazione della funzione proteica mitocondriale. Questo metodo prevede un primo passo che consiste nell'ottenere mitocondri intatti altamente puri. Questi preparati mitocondriali vengono poi sottoposti ad un protocollo di subfrazionamento costituito da shock ipotonico (gonfiore) e incubazione con proteinasi K (proteasi). Durante il gonfiore, la membrana mitocondriale esterna viene interrotta selettivamente, consentendo alla proteinasi K di digerire le proteine del compartimento spaziale intermembrana. Parallelamente, per ottenere informazioni sulla topologia delle proteine di membrana, i preparati mitocondriali vengono inizialmente sonicati e quindi sottoposti ad estrazione alcalina con carbonato di sodio. Infine, dopo la centrifugazione, le frazioni di pellet e surnatante di questi diversi trattamenti vengono analizzate da SDS-PAGE e western blot. La localizzazione submitocondriale e la topologia di membrana della proteina di interesse si ottengono confrontando il suo profilo western blot con standard noti.
Introduction
I mitocondri sono organelli essenziali delle cellule eucariotiche che svolgono ruoli cruciali nella bioenergetica, nel metabolismo cellulare e nelle vie di segnalazione1. Per eseguire correttamente questi compiti, i mitocondri si basano su un insieme unico di proteine e lipidi responsabili della loro struttura e funzione. Il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente utilizzato come sistema modello per le indagini sui processi mitocondriali, così come per altri organelli2. Il genoma mitocondriale codifica solo per otto proteine nel lievito; la stragrande maggioranza delle proteine mitocondriali (~99%) sono codificate da geni nucleari, che vengono tradotti su ribosomi citosolici e successivamente importati nei loro corretti compartimenti sottocondriali da sofisticati macchinari per l'importazione di proteine3,4,5. Pertanto, la biogenesi mitocondriale dipende dall'espressione coordinata sia del genoma nucleare che di quello mitocondriale6,7. Le mutazioni genetiche che causano difetti nella biogenesi mitocondriale sono associate a malattie umane8,9,10.
Negli ultimi due decenni, studi proteomici ad alto rendimento mirati a mitocondri altamente purificati hanno portato a una caratterizzazione completa del proteoma mitocondriale del lievito, che è stato stimato essere composto da almeno 900 proteine11,12,13,14. Sebbene questi studi abbiano fornito informazioni preziose, la localizzazione suborganellare di ciascuna proteina nei quattro sottocompartimenti mitocondriali, vale a dire la membrana esterna (OM), lo spazio intermembrana (IMS), la membrana interna (IM) e la matrice, è ancora necessaria. Questa domanda è stata parzialmente affrontata con studi proteomici dei due sottocompartimenti mitocondriali più piccoli (OM e IMS)15,16. Più recentemente, Vögtle e collaboratori hanno fatto un importante passo avanti generando una mappa globale di alta qualità della distribuzione delle proteine submitocondriali nel lievito. Utilizzando un approccio integrato che combina la spettrometria di massa quantitativa basata su SILAC, diversi protocolli di frazionamento submitocondriale e il set di dati dei proteomi OM e IMS, gli autori hanno assegnato 818 proteine nei quattro sottocompartimenti mitocondriali13.
Nonostante i progressi raggiunti da questi studi proteomici ad alto rendimento, la nostra conoscenza della composizione del proteoma submitocondriale è lungi dall'essere completa. Infatti, tra le 986 proteine segnalate da Vögtle e collaboratori come localizzate nei mitocondri del lievito, 168 non potevano essere assegnate in nessuno dei quattro compartimenti sottocondriali13. Inoltre, gli autori non hanno fornito informazioni sulla topologia di membrana delle proteine che si prevedeva fossero attaccate perifericamente alla periferia delle membrane mitocondriali. Ad esempio, non è possibile sapere se una proteina che è stata assegnata come attaccata perifericamente alla membrana interna è rivolta verso la matrice o lo spazio intermembrana. Oltre a questi dati mancanti dagli studi a livello di proteoma, ci sono informazioni contrastanti sulla localizzazione suborganellare di un numero significativo di proteine mitocondriali. Un esempio è la proteasi Prd1, che è stata assegnata come proteina dello spazio intermembrana nei database comuni come Saccharomyces Genome Database (SGD) e Uniprot. Sorprendentemente, utilizzando un protocollo di sottofrazionazione simile a quello qui descritto, Vögtle e collaboratori hanno mostrato chiaramente che Prd1 è una vera e propria proteina della matrice13. Come accennato in precedenza, la localizzazione sottocondriale di molte proteine mitocondriali deve essere chiarita o rivalutata. Qui, forniamo un protocollo semplice e affidabile per determinare la localizzazione suborganellare delle proteine mitocondriali del lievito. Questo protocollo è stato sviluppato e ottimizzato da vari gruppi di ricerca ed è stato regolarmente utilizzato per determinare la localizzazione sottocondriale, nonché la topologia di membrana di molte proteine mitocondriali.
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Protocol
1. Crescita delle cellule di lievito
- Isolare singole colonie del ceppo di interesse strisciando una piccola porzione delle cellule da uno stock di glicerolo a -80 °C su una piastra di agar YPD (1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% glucosio). Incubare la piastra a 30 °C per 2-3 giorni.
NOTA: Il ceppo S. cerevisiae utilizzato in questo protocollo è derivato da BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Ad eccezione dei geni marcatori auxotrofici, questo ceppo non contiene alcun gene cancellato e non trasporta alcun plasmide. Pertanto, può essere coltivato con successo in un mezzo ricco, stimolando la crescita cellulare vigorosa. Quando si lavora con ceppi trasformati con plasmidi, utilizzare il mezzo minimo appropriato per la selezione del plasmide. - Preparare una coltura iniziale inoculando 2-3 singole colonie dalla piastra di agar YPD in 10-20 ml di mezzo YPGal (1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% galattosio) in un matraccio Erlenmeyer da 100 ml. Incubare a 30 °C per 24 ore con agitazione vigorosa.
NOTA: La scelta del mezzo di coltura dipende dal ceppo di lievito utilizzato nel protocollo. Sia YPD che YPGal contengono fonti di carbonio fermentabile, che consentono la crescita di ceppi che non eseguono la respirazione mitocondriale. Tuttavia, poiché il glucosio reprime l'espressione di molti geni mitocondriali, non è consigliabile utilizzare questa fonte di carbonio poiché produrrà quantità inferiori di mitocondri. Quando si lavora con ceppi respiratori competenti che possono respirare, è anche possibile utilizzare fonti di carbonio come glicerolo ed etanolo nel tentativo di ottenere una maggiore resa dei mitocondri. - Diluire la coltura iniziale in 1 L di mezzo YPGal fresco a un OD600 inferiore a 0,1. Coltivare le cellule a 30 °C con un vigoroso scuotimento fino a quando OD600 raggiunge 1-1,5.
NOTA: Determinare il tasso di crescita (tempo di raddoppio) per ogni ceppo di lievito prima di eseguire l'esperimento. Ciò fornirà una stima accurata del tempo di incubazione necessario affinché la coltura raggiunga un OD600 di 1-1,5.
2. Isolamento di mitocondri altamente purificati
NOTA: questo protocollo è adattato da17, con piccole modifiche.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le celle con acqua distillata e raccoglierle per centrifugazione a 3.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Determinare il peso umido delle cellule.
NOTA: Il modo più semplice per misurare il peso del pellet di cella dal passaggio 2.2 è determinare il peso del tubo della centrifuga vuoto poco prima della raccolta delle celle. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e misurare il peso dello stesso tubo con le cellule. Il peso delle celle è la differenza tra le due misurazioni. - Risospesciare le celle nel tampone DTT (2 mL per 1 g di celle) utilizzando una pipetta Pasteur o una punta P5000. Vedere la Tabella 1 per la composizione del buffer DDT.
- Incubare le celle a 30 °C per 20 minuti con un leggero scuotimento (~70 rpm).
- Centrifugare a 3.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettizzare le celle.
- Lavare le cellule con tampone di zipoliasi senza l'enzima (circa 7 ml per 1 g di cellule).
Vedere Tabella 1 per la composizione del tampone di zymolyase. - Centrifugare a 3.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettizzare le celle.
- Risospendare le cellule nel tampone senza zymolyase (7 mL per 1 g di cellule).
- Trasferire la sospensione cellulare in un matraccio Erlenmeyer da 250 mL e aggiungere Zymolyase-20T (3 mg per g di peso umido).
- Incubare le celle a 30 °C per 30-40 minuti con un leggero scuotimento (~70 rpm). Controllare l'efficienza di questo processo confrontando la torbidità della sospensione cellulare prima e dopo il trattamento con zymolyase.
NOTA: In questa fase, le cellule saranno convertite in sferoplasti a causa della digestione della parete cellulare da parte della zipoliasi.- Per questo, aggiungere 50 μL di ciascuna sospensione cellulare a tubi di vetro separati contenenti 2 ml di acqua. Dopo aver miscelato vigorosamente, la torbidità della sospensione cellulare trattata con Zymolyase dovrebbe diminuire rapidamente a causa della rottura osmotica degli sferoplasti. D'altra parte, la torbidità della sospensione cellulare non trattata dovrebbe rimanere invariata.
NOTA: Gli effetti della torbidità possono anche essere monitorati con una semplice ispezione visiva o misurando l'OD600 di entrambi i campioni. Nel secondo caso, l'OD600 del campione trattato con zipoliasi deve essere pari al 10%-20% del campione non trattato. Un metodo alternativo prevede il conteggio delle cellule in entrambi i campioni utilizzando la microscopia ottica. - Se la resa della formazione di sferoplasti è bassa, aggiungere più zymolyase e incubare per un ulteriore intervallo di 15 minuti.
- Per questo, aggiungere 50 μL di ciascuna sospensione cellulare a tubi di vetro separati contenenti 2 ml di acqua. Dopo aver miscelato vigorosamente, la torbidità della sospensione cellulare trattata con Zymolyase dovrebbe diminuire rapidamente a causa della rottura osmotica degli sferoplasti. D'altra parte, la torbidità della sospensione cellulare non trattata dovrebbe rimanere invariata.
- Raccogliere gli sferoplasti per centrifugazione a 2500 x g per 5 min a 4 °C.
NOTA: Tutte le ulteriori fasi devono essere eseguite rapidamente e su ghiaccio o a 4 °C per evitare la degradazione delle proteine da parte degli enzimi idrolitici. - Lavare due volte gli sferoplasti con tampone di omogeneizzazione ghiacciato (circa 6,5 mL per 1 g di celle) e pellet centrifugando a 2.500 x g per 5 min a 4 °C. Vedere la Tabella 1 per la composizione del buffer di omogeneizzazione.
- Risospese gli sferoplasti in un tampone di omogeneizzazione ghiacciato (6,5 ml per 1 g di cellule) e trasferirlo in un omogeneizzatore Dounce in vetro pre-refrigerato. Utilizzare un grande omogeneizzatore di vetro di circa 30 ml.
- Omogeneizzare gli sferoplasti con 15 colpi usando un pestello.
NOTA: il numero di colpi deve essere regolato in base al raccordo del pestello. Per il pestello stretto, sono sufficienti 15 colpi. D'altra parte, se si utilizza un pestello sciolto, si consiglia di eseguire fino a 25 colpi. - Trasferire l'omogeneizzato in un tubo centrifugo da 50 ml e aggiungere 1 volume di tampone di omogeneizzazione ghiacciato.
- Centrifugare l'omogeneizzato a bassa velocità, 1.500 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare nuclei, detriti cellulari e celle ininterrotte.
- Trasferire il surnatante in un nuovo tubo di centrifuga da 50 ml utilizzando una pipetta Pasteur o una punta P5000 avendo cura di evitare di interrompere il pellet.
- Centrifugare a 4.000 x g per 5 min a 4 °C.
- Trasferire il surnatante in un tubo centrifugo ad alta velocità e centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C per pellettizzare la frazione dei mitocondri grezzi.
- Scartare il surnatante e lavare delicatamente il pellet mitocondriale grezzo in 20-30 ml di tampone di omogeneizzazione ghiacciato mediante un delicato pipettaggio utilizzando una punta P5000.
- Trasferire la sospensione in un tubo centrifuga da 50 mL e centrifugare a 4.000 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettizzare i detriti cellulari rimanenti.
- Trasferire il surnatante in un tubo centrifugo ad alta velocità e centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C per pellettizzare la frazione dei mitocondri grezzi.
- Scartare il surnatante e risospescere delicatamente il pellet mitocondriale grezzo in un piccolo volume (tipicamente 1000 μL) di tampone SEM ghiacciato mediante un delicato pipettaggio utilizzando una punta P1000. Vedere la Tabella 1 per la composizione del buffer SEM.
NOTA: Sebbene questa frazione mitocondriale grezza possa essere utilizzata direttamente in alcune applicazioni come nei saggi di importazione di proteine organello , contiene quantità sostanziali di altri componenti cellulari. Queste contaminazioni potrebbero portare a interpretazioni errate dei risultati nel determinare la localizzazione sottocondriale di una proteina. Pertanto, sono necessarie ulteriori fasi di purificazione per ottenere una preparazione mitocondriale altamente purificata, come descritto di seguito. - Preparare soluzioni di saccarosio nel tampone EM a concentrazioni del 60%, 32%, 23% e 15% (p/v). Queste soluzioni sono stabili fino a 1 mese a 4 °C. Vedere la Tabella 1 per la composizione del buffer EM.
- Preparare un gradiente di saccarosio in 4 fasi in un tubo ultracentrifuga come segue: Posizionare 1,5 mL di saccarosio al 60% (p/v) sul fondo del tubo della centrifuga. Successivamente, pipettare accuratamente gradualmente: 4 mL del 32%, 1,5 mL del 23% e 1,5 mL del 15% di saccarosio (p / v). Fare attenzione ad evitare di interrompere le fasi.
- Caricare con attenzione la frazione mitocondriale grezza sopra il gradiente di saccarosio.
- Centrifuga per 1 ora a 134.000 x g a 4 °C in un rotore a benna oscillante.
- Continuare con cautela a rimuovere la soluzione di saccarosio fino a raggiungere la frazione mitocondriale altamente purificata che è rappresentata da una banda marrone all'interfaccia del 60%/32% di saccarosio.
- Recuperare i mitocondri purificati utilizzando una punta tagliata P1000 e metterlo in un tubo centrifugo ad alta velocità pre-refrigerato.
- Diluire i mitocondri recuperati con 5-10 volumi di tampone SEM ghiacciato.
- Centrifuga per 30 min a 12.000 x g a 4 °C.
- Risospesciare i mitocondri puri in 500 μL di tampone SEM ghiacciato mediante un pipettaggio delicato utilizzando una punta tagliata P1000.
- Determinare la concentrazione proteica del preparato mitocondriale altamente purificato utilizzando la procedura Bradford seguendo le istruzioni del produttore. Regolare la concentrazione proteica a 10 mg di proteine/mL con tampone SEM ghiacciato.
NOTA: Per il protocollo di frazionamento submitocondriale descritto di seguito, si consiglia di utilizzare mitocondri preparati al momento. Tuttavia, Vögtle e collaboratori hanno eseguito un'analisi dettagliata del controllo di qualità dell'integrità mitocondriale e hanno dimostrato che gli organelli congelati possono essere utilizzati anche in questo protocollo13. Per questo, fare aliquote di 40 μL e congelarle in azoto liquido. Conservare a -80 °C.
3. Protocollo di frazionamento submitocondriale
NOTA: Questo protocollo è adattato dal riferimento18 ed è composto da due fasi: (1) gonfiore ipotonico in presenza o assenza di proteinasi K e (2) sonicazione seguita da estrazione carbonatica. Eseguire tutti i passaggi di entrambi i protocolli su ghiaccio o a 4 °C per evitare la degradazione delle proteine.
- Gonfiore ipotonico in presenza di proteinasi K
- Trasferire 40 μL di mitocondri altamente purificati a 10 mg/mL (400 μg) in quattro tubi microcentrifuga marcati pre-refrigerati da 1,5 mL.
- Aggiungere 360 μL di tampone SEM nei tubi 1 e 2.
- Aggiungere 360 μL di tampone EM nei tubi 3 e 4.
- Aggiungere 4 μL di proteinasi K (10 mg/mL) nelle provette 2 e 4. Utilizzare lo schema di pipettaggio elencato nella Tabella 2 per evitare errori.
NOTA: Preparare una soluzione da 10 mg/mL di proteinasi K in acqua immediatamente prima dell'uso. La concentrazione finale di proteinasi K nell'esperimento dovrebbe essere di circa 50-100 μg/mL. Si prega di consultare la sezione Discussione per ulteriori dettagli. - Mescolare delicatamente tutti i tubi e incubare su ghiaccio per 30 minuti con miscelazione occasionale.
- Aggiungere 4 μL di PMSF 200 mM a tutti e quattro i tubi per fermare l'attività della proteinasi K.
ATTENZIONE: PMSF è altamente tossico. Indossare guanti quando si lavora con soluzioni contenenti PMSF. - Centrifugare a 20.000 x g per 30 min a 4 °C.
- Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo microcentrifuga etichettato pre-refrigerato da 1,5 ml. Fare attenzione ad evitare di interrompere il pellet.
NOTA: il pellet può essere risospeso direttamente nel buffer del campione per ulteriori analisi SDS-PAGE e western blot. Tuttavia, tracce di proteinasi K possono rimanere attive anche dopo il trattamento con PMSF e alla fine possono digerire alcune proteine dopo che il pellet è stato sciolto nel tampone campione contenente SDS. Per evitare questo problema, la proteinasi K potrebbe essere completamente inattivata dal trattamento dei campioni con acido tricloroacetico (TCA) come descritto di seguito.
ATTENZIONE: il TCA è altamente tossico. Indossare guanti quando si lavora con soluzioni contenenti TCA. - Risospesare il pellet dal punto 3.1.8 in 400 μL di tampone SEM ghiacciato.
- Precipitare il surnatante (dal passo 3.1.8) e il pellet risospeso (dal passo 3.1.9) con TCA ad una concentrazione finale del 10% (p/v).
- Incubare tutti i tubi sul ghiaccio per 10 minuti.
- Centrifugare i campioni trattati con TCA per 10 minuti a 12.000 x g a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet in 200 μL di tampone campione.
NOTA: È possibile che l'indicatore di pH blu bromofenolo diventi giallo a causa del trattamento acido. Se ciò accade, aggiungere piccole aliquote (1-5 μL) di 1 M Tris base fino a quando non diventa blu. - Aggiungere 4 μL di PMSF da 200 mM a tutti i tubi.
- Conservare tutti i campioni a -80 °C fino a ulteriori analisi da parte di SDS-PAGE e western blot.
- Sonicazione ed estrazione carbonatica
NOTA: In questo protocollo, non è necessario utilizzare mitocondri appena preparati una volta che la sonicazione provoca la rottura delle membrane mitocondriali.- Trasferire 200 μL di mitocondri altamente purificati a 10 mg/mL (2 mg di proteine) in un tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 mL.
- Mitocondri diluiti di una volta con tampone SEM ghiacciato.
- Mitocondri sonicati per 3 x 30 s su ghiaccio. Utilizzare un sonicatore compatibile per piccoli volumi.
- Centrifugare il campione per 30 minuti a 100.000 x g a 4 °C.
- Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 mL. Tienilo sul ghiaccio. Questo campione sarà denominato frazione proteica solubile (S).
- Risospesciare il pellet dal punto 3.2.4 in 400 μL di tampone SEM ghiacciato.
- Prelevare 100 μL del pellet risospeso dal punto 3.2.6 e trasferirlo in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 mL. Tienilo sul ghiaccio. Questo campione sarà denominato frazione di particelle submitocondriali (SMP).
- Diluire i restanti 300 μL dal punto 3.2.6 di una volta con carbonato di sodio da 200 mM appena preparato.
- Incubare il campione dal passaggio 3.2.8 sul ghiaccio per 30 minuti.
- Centrifugare il campione per 30 minuti a 100.000 x g a 4 °C.
- Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 mL. Tienilo sul ghiaccio. Questo campione sarà chiamato frazione surnatante carbonatica (CS).
- Risospesciare il pellet dal punto 3.2.10 in 400 μL di tampone SEM ghiacciato. Questo campione sarà denominato frazione precipitata carbonatica (CP).
- Precipitare tutti i campioni (S, SMP, CS e CP) con TCA ad una concentrazione finale del 10% (p/v).
- Incubare tutti i tubi sul ghiaccio per 10 minuti.
- Centrifugare i campioni trattati con TCA per 10 minuti a 12.000 x g a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospesare ogni pellet nel tampone del campione. Se il tampone del campione diventa giallo, aggiungere piccole aliquote (1-5 μL) di 1 M Tris base fino a quando non diventa blu.
- Aggiungere 1 μL di PMSF da 200 mM a tutti i tubi.
- Conservare tutti i campioni a -80 °C fino a ulteriori analisi da parte di SDS-PAGE e western blot.
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Representative Results
Il successo del protocollo di frazionamento submitocondriale dipende dall'ottenimento di mitocondri intatti altamente purificati. Per questo, è essenziale che durante la lisi cellulare del lievito, l'integrità degli organelli rimanga quasi totalmente preservata. Ciò si ottiene utilizzando un protocollo di lisi cellulare che combina la digestione enzimatica della parete cellulare seguita da un'interruzione fisica della membrana plasmatica utilizzando un omogeneizzatore Dounce. I contenuti mitocondriali vengono quindi raccolti mediante centrifugazione differenziale. Questo frazionamento subcellulare produce una frazione mitocondriale arricchita, come confermato dalla presenza di alti livelli di porina (Por1), una proteina marcatore mitocondriale (Figura 1, corsia 2). Tuttavia, questa è una frazione di mitocondri grezza, che contiene quantità sostanziali di altri compartimenti cellulari, tra cui reticolo endoplasmatico, vacuolo, citosol ed endosoma (Figura 1, corsia 2). Queste contaminazioni possono introdurre artefatti in alcune applicazioni, come gli esperimenti di localizzazione delle proteine submitocondriali. Per diminuire la quantità di queste contaminazioni, la frazione mitocondriale grezza viene ulteriormente purificata mediante centrifugazione a gradiente di densità di saccarosio. Questa ulteriore fase di purificazione genera una frazione mitocondriale altamente pura, come evidenziato da una significativa riduzione del contenuto dei marcatori proteici per altri compartimenti cellulari (Figura 1, corsia 3).
Al fine di determinare la localizzazione sottocondriale delle proteine, i mitocondri altamente purificati vengono ulteriormente frazionati nei loro sottocompartimenti (Figura 2A). Questo protocollo prevede la conversione dei mitocondri in mitoplasti mediante shock osmotico ipotonico. In questo processo, i mitocondri intatti vengono incubati in un tampone ipoosmotico con conseguente gonfiore dell'organello. Durante il gonfiore, la membrana mitocondriale esterna viene selettivamente rotta dallo squilibrio osmotico e il contenuto proteico dello spazio intermembrana viene rilasciato nel surnatante. Tutta questa procedura viene eseguita in presenza o in assenza di proteinasi K. Come conseguenza della rottura della membrana esterna, la proteasi ottiene l'accesso al contenuto proteico dello spazio intermembrana e promuove la degradazione delle proteine corrispondenti. Al contrario, il contenuto proteico della matrice mitocondriale rimane protetto dall'attacco della proteasi a causa dell'integrità della membrana mitocondriale interna. Dopo questi trattamenti, il contenuto proteico dei diversi campioni viene valutato dalle analisi SDS-PAGE e western blot.
La conversione efficiente dei mitocondri in mitoplasti mediante shock osmotico (gonfiore) può essere monitorata in due modi: (1) scomparsa della proteina marcatore dello spazio intermembrana solubile (ad esempio, citocromo Cyt). b2) nella frazione di pellet da mitoplasti con la sua comparsa concomitante nella frazione surnatante (Figura 2B, confrontare la corsia 3 con la corsia 7); (2) degradazione selettiva della proteina marcatore della membrana interna rivolta verso lo spazio intermembrana (ad esempio, ScoI) da parte della proteinasi K solo nei mitoplasti (Figura 2B, corsia 4). Inoltre, la protezione dei marcatori Cyt. b2 e ScoI contro la degradazione della proteinasi K nella frazione di pellet dai mitocondri sono utilizzati per confermare l'integrità della membrana mitocondriale esterna (Figura 2B, corsia 2). D'altra parte, l'integrità della membrana mitocondriale interna è confermata dalla protezione del marcatore proteico solubile della matrice α-KGD contro la degradazione della proteinasi K (Figura 2B, corsia 4). Per determinare la localizzazione submitocondriale di una proteina di interesse, è sufficiente confrontare il suo profilo western blot con i profili di questi standard con localizzazione nota.
Nel caso della proteina raffigurata in Figura 2B (Prx1), il suo profilo western blot è indicativo di una proteina con doppia localizzazione mitocondriale: spazio intermembrana e matrice. A prima vista, il suo profilo di frazionamento è simile a α-KGD, indicando una localizzazione della matrice. Tuttavia, la sua presenza nel surnatante dei mitoplasti indica anche una localizzazione dello spazio intermembrana. I profili di frazionamento dei marcatori proteici sopra descritti eliminano i possibili artefatti associati all'integrità della preparazione mitocondriale e confermano la doppia localizzazione di Prx119.
Per studiare la topologia delle proteine sulle membrane mitocondriali, i mitocondri sono sottoposti a due trattamenti aggiuntivi: sonicazione ed estrazione carbonatica (Figura 3A). Mentre la sonicazione rilascia solo proteine solubili nella frazione surnatante13, l'estrazione alcalina con carbonato di sodio solubilizza ulteriormente le proteine associate alla membrana periferica13,20. In entrambi i trattamenti, le proteine di membrana integrali rimangono nella frazione di pellet13. Queste ipotesi sono confermate dall'analisi western blot delle frazioni di pellet e surnatante di entrambi i trattamenti (Figura 3B). Si prevede che una proteina di membrana mitocondriale integrale (ad esempio, porina Por1) si trovi totalmente nella frazione di pellet, anche dopo il trattamento alcalino con carbonato di sodio (Figura 3B, corsie 3 e 5). D'altra parte, una proteina della matrice solubile (ad esempio, α-KGD) dovrebbe essere completamente solubilizzata in entrambi i trattamenti (Figura 3B, corsie 2 e 4). La significativa ritenzione di α-KGD nel pellet dalla sonicazione (Figura 3B, corsia 3, frazione SMP) potrebbe essere dovuta a lievi variazioni nei parametri di sonicazione che possono influenzare la formazione delle cosiddette particelle sottocondriali, che vengono sedimentate in modo efficiente mediante ultracentrifugazione. Il comportamento di queste proteine con profili di solubilità noti viene quindi utilizzato per determinare la solubilità mitocondriale di una proteina di interesse. Nel caso di Prx1, il suo profilo western blot è indicativo di una proteina associata alla periferia di membrana e il trattamento alcalino ne induce la solubilizzazione (Figura 3B, corsia 4).
Figura 1: Isolamento di mitocondri altamente purificati. Analisi Western blot della frazione lisata totale (corsia 1), di una frazione mitocondriale grezza (corsia 2) e della frazione mitocondriale altamente purificata (corsia 3). Le frazioni sono state separate da SDS-PAGE su un gel di poliacrilammide al 12%, trasferito alla nitrocellulosa e sondato con anticorpi sollevati contro marcatori per compartimenti cellulari distinti come descritto sul lato destro del gel. Questa cifra è stata modificata dal riferimento19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Protocollo di frazionamento submitocondriale per gonfiore ipotonico in presenza di proteinasi K. (A) Rappresentazione schematica del protocollo di frazionamento sottocondria. I mitocondri altamente purificati sono sottoposti separatamente a trattamenti isotonici o ipotonici (gonfiore) in presenza (+) o assenza (-) di proteinasi K. Dopo il trattamento, l'attività della proteinasi K viene inibita dall'aggiunta di PMSF e i mitocondri e i mitoplasti vengono recuperati mediante centrifugazione. Il contenuto proteico delle frazioni di pellet e surnatante risultanti viene precipitato dal TCA e quindi analizzato da SDS-PAGE e western blot. Le sfere di colore rappresentano marcatori proteici sottocondriali per: una proteina solubile dello spazio intermembrana (verde), una proteina della membrana interna che si affaccia sullo spazio intermembrana (rosa) e una proteina della matrice solubile (azzurro). (B) Analisi Western blot di frazioni di pellet e surnatante dal protocollo di frazionamento sottocondriale. Le frazioni sono state separate da SDS-PAGE su un gel di poliacrilammide al 12%, trasferito alla nitrocellulosa e sondato con anticorpi sollevati contro marcatori per compartimenti sottocondriali distinti come illustrato in A. Vedi il testo per maggiori dettagli. Questa cifra è stata modificata da19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Protocollo di frazionamento sottocondria mediante sonicazione ed estrazione carbonatica. (A) Rappresentazione schematica del protocollo utilizzato per determinare la solubilità e la topologia di membrana delle proteine mitocondriali. I mitocondri sono inizialmente sonicati e centrifugati, risultando in una frazione proteica solubile (S) e il prodotto membranoso compartimentato, chiamato particella sottocondria (SMP). Il pellet della fase di sonicazione viene successivamente sottoposto ad un trattamento alcalino con carbonato di sodio (Na2CO3) e centrifugato, con conseguente surnatante carbonato (CS) e frazioni precipitate carbonatiche (CP). (B) Analisi Western blot di frazioni di pellet e surnatante dal protocollo di sonicazione ed estrazione del carbonato. Le frazioni sono state separate da SDS-PAGE su un gel di poliacrilammide al 12%, trasferito alla nitrocellulosa e sondato con anticorpi sollevati contro marcatori proteici che mostrano livelli distinti di solubilità. Vedi il testo per maggiori dettagli. Questa cifra è stata modificata da19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione | Componenti | Commenti | |
| YPD medio | 1% (p/v) estratto di lievito, 2% (p/v) di peptone, 2% (p/v) di glucosio | Sciogliere 10 g di estratto di lievito bacto, 20 g di bacto peptone e 20 g di glucosio in 900 m di acqua distillata aggiunta. Riempire fino a 1000 ml e sterilizzare in autoclave. | |
| YPGal medio | 1% (p/v) estratto di lievito, 2% (p/v) peptone, 2% (p/v) galattosio | Sciogliere 10 g di estratto di Lievito Bacto, 20 g di Bacto Peptone e 20 g di galattosio in 900 m di acqua distillata aggiunta. Riempire fino a 1000 ml e sterilizzare in autoclave. | |
| Buffer DTT | 100 mM Tris-H2SO4 (pH 9,4), 10 mM ditiotreitolo (DTT) | Per produrre 15 ml: mescolare 1,5 ml di 1 M Tris-H2SO4, pH 9,4 con 150 μL di 1M DTT preriscaldato a 30 °C. Volume a 15 ml con ddH2O Preparare fresco prima dell'uso |
|
| Tampone della zymolyase | Tampone fosfato di potassio 20 mM (pH 7,4), sorbitolo 1,2 M | Per fare 100 ml: mescolare 2 ml di tampone fosfato di potassio 1 M (pH 7,4) con 60 ml di sorbitolo 2 M Volume a 15 ml con ddH2O Sciogliere la polvere (3 mg per grammo di peso umido) di Zymolyase-20T da Arthrobacter luteus (MP Biomedicals, Irvine, CA) nel tampone appena prima dell'uso |
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| Buffer di omogeneizzazione | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), sorbitolo 0,6 M, 1 mM EDTA, 0,2% (p/v) albumina sierica bovina (BSA), 1 mM fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) | Per produrre 250 ml: mescolare 2,5 ml di tampone Tris-HCl 1 M (pH 7,4) con 75 ml di sorbitolo 2 M, 500 μL di 500 mM EDTA e 0,5 g di BSA (essenzialmente privo di acidi grassi) Volume a 250 ml con ddH2O Pre-raffreddamento a 4°C Aggiungere PMSF e BSA nel buffer appena prima dell'uso |
|
| Buffer SEM | 10 mM MOPS-KOH (pH 7,2), 250 mM saccarosio, 1 mM EDTA | Per produrre 250 ml: mescolare 2,5 ml di tampone M MOPS-KOH (pH 7,2) con 31,25 ml di saccarosio 2 M e 500 μL di 500 mM EDTA Volume a 250 ml con ddH2O Pre-raffreddare a 4°C poco prima dell'uso. |
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| Buffer EM | 10 mM MOPS-KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA | Per produrre 250 ml: mescolare 2,5 ml di tampone M MOPS-KOH (pH 7,2) con 500 μL di 500 mM EDTA Volume a 250 ml con ddH2O Pre-raffreddare a 4°C poco prima dell'uso |
|
| buffer di esempio | 2% (p/v) dodecilsolfato di sodio (SDS), 50 mM DTT, 10% (v/v) glicerolo, 0,02% bromofenolo blu, 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), |
||
Tabella 1: Supporti, soluzioni e buffer.
| Reagente | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Mitocondri (10 mg/mL) | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | |
| Buffer SEM | 360 μL | 360 μL | - | - | |
| Buffer EM | - | - | 360 μL | 360 μL | |
| Proteinasi K (10 mg/mL) | - | 4 μL | - | 4 μL | |
Tabella 2: Schema di pipettaggio per eseguire gonfiore ipotonico.
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Discussion
Il protocollo qui presentato è stato utilizzato con successo e continuamente ottimizzato per un lungo periodo di tempo per determinare la localizzazione delle proteine nei compartimenti sottocondriali13,14,18,21,22,23. L'affidabilità e la riproducibilità di questo protocollo dipendono fortemente dalla purezza e dall'integrità dei preparati mitocondriali18. Entrambi questi requisiti sono raggiunti aggiungendo un'ulteriore fase di purificazione (centrifugazione a gradiente di densità di saccarosio) ai preparati mitocondriali grezzi13,24,25 (Figura 1). Oltre ad eliminare i contaminanti nonmitocondriali indesiderati, questa fase aggiuntiva di purificazione elimina anche i mitocondri e i mitoplasti rotti che possono derivare dalle numerose manipolazioni fisiche del campione durante il protocollo18. Pertanto, nonostante l'aumento del tempo della procedura, questa fase di purificazione del gradiente di saccarosio genera mitocondri intatti altamente purificati, che sono considerati essenziali per il successo del protocollo di frazionamento sottocondria18,22.
Vögtle e collaboratori hanno riferito che gli organelli congelati (a -80 °C) potrebbero anche essere utilizzati con successo per il frazionamento sottocondriale13; raccomandiamo, tuttavia, l'uso di una preparazione mitocondriale fresca. Indipendentemente dalla scelta, l'integrità dei mitocondri purificati può essere confermata controllando la sensibilità delle proteine spaziali intermembrana contro la proteinasi K aggiunta esternamente. Se gli organelli sono intatti, proteine di questo compartimento come Cyt. b2 e Sco1 devono rimanere protetti dalla degradazione proteolitica dovuta alla barriera fornita dalla membrana esterna (Figura 2B, corsia 2). Al contrario, quando gli organelli vengono incubati in un tampone ipoosmotico, la rottura della membrana esterna a causa dello shock osmotico (gonfiore) rende queste proteine inclini alla degradazione della proteasi (Figura 2B, corsia 4). D'altra parte, le proteine presenti nel compartimento della matrice, come α-KGD, dovrebbero rimanere protette contro la degradazione sia nei mitocondri che nei mitoplasti a causa dell'integrità della membrana interna (Figura 2B, corsie 2 e 4). Pertanto, i profili di queste proteine marcatori mitocondriali ben studiate possono essere utilizzati sia per valutare l'integrità dei preparati mitocondriali che il successo del protocollo di frazionamento. Inoltre, la localizzazione sottocondriale di una proteina di interesse si ottiene semplicemente confrontando il suo profilo di frazionamento con quelli delle proteine marcatori18,22 (Figura 2B). È importante sottolineare che, se le proteine marcatori mitocondriali mostrano un comportamento distinto da quello sopra descritto, l'integrità degli organelli è probabilmente compromessa e, quindi, la preparazione mitocondriale non deve essere utilizzata ai fini di questo protocollo.
Sebbene lo shock ipotonico abbia dimostrato di essere un metodo affidabile per distinguere tra proteine spaziali intermembrana e matrice, questo metodo non fornisce informazioni sul fatto che una proteina della matrice sia solubile o attaccata alla membrana interna mitocondriale. Queste informazioni possono essere ottenute sottoponendo i mitocondri alla sonicazione seguita dall'estrazione alcalina con carbonato di sodio (Figura 3). Mentre ci si aspetta che le proteine della matrice solubile vengano rilasciate nella frazione surnatante dopo la sonicazione, le proteine associate alle membrane tendono ad essere nel precipitato13. D'altra parte, l'estrazione alcalina con carbonato di sodio solubilizza in modo efficiente le proteine attaccate perifericamente alle membrane, ma non le proteine di membrana integrali13,20. Pertanto, se una proteina è resistente alla degradazione della proteasi dopo il gonfiore ma viene rilasciata nel surnatante mediante trattamento alcalino, è probabilmente una proteina di membrana interna attaccata perifericamente rivolta verso il compartimento della matrice. È importante tenere presente che il successo del test di sensibilità alla proteasi dipende in modo sorprendente dalla sensibilità della proteina di interesse contro la proteasi utilizzata per la digestione. Alcune proteine mitocondriali sembrano essere resistenti alla degradazione proteolitica alla concentrazione standard di proteinasi K (0,1 mg/mL) solitamente impiegata nei protocolli di sottofrazionazione (Figura 2B, corsia 8)19. Il raddoppio della concentrazione di proteinasi K (0,2 mg/mL) sembra essere sufficiente per consentire una completa degradazione proteolitica. Tuttavia, tieni presente che concentrazioni più elevate di proteasi potrebbero destabilizzare la membrana mitocondriale esterna e alla fine compromettere l'efficacia del protocollo.
Non c'è dubbio che per chiarire la funzione delle proteine mitocondriali, è essenziale determinare la loro localizzazione sottocondriale. A questo proposito, questo protocollo rappresenta un potente strumento per i ricercatori che stanno iniziando a studiare i mitocondri. Nonostante sia diretto al lievito, molti dei suoi principi potrebbero essere facilmente applicabili ad altri organismi. Infatti, ad eccezione delle fasi di purificazione mitocondriale, il resto del protocollo è molto simile a quelli riportati per altri organismi26,27,28. Un altro importante contributo di questo protocollo è la sua applicabilità nello studio dei mutanti di S. cerevisiae che mostrano una biogenesi mitocondriale alterata. È stato ampiamente riportato che i mutanti del lievito per i macchinari di importazione delle proteine mitocondriali mostrano una distribuzione alterata delle proteine mitocondriali5,29. Pertanto, questo protocollo può essere utilizzato di routine per studiare le conseguenze sulla distribuzione delle proteine mitocondriali causate da mutazioni che possono alterare la biogenesi mitocondriale. Infine, il protocollo può essere particolarmente utile per lo studio di proteine che mostrano una doppia localizzazione mitocondriale19,30.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) per aver fornito anticorpi sollevati contro le proteine marcatori submitocondriali Cyt. b2, αKGD e Sco1. Ringraziamo anche il Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) per l'utile discussione e commenti durante l'istituzione di questo protocollo.
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (sovvenzione 2013/07937-8).
Fernando Gomes e Helena Turano sono supportati anche da FAPESP, sovvenzioni 2017/09443-3 e 2017/23839-7, rispettivamente. Angélica Ramos è anche supportata da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
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