Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Оценка локализации субпохондриального белка в почковых дрожжах Saccharomyces cerevisiae

Published: July 19, 2021 doi: 10.3791/62853
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo

Summary

Несмотря на недавние достижения, многие дрожжевые митохондриальные белки по-прежнему остаются со своими функциями совершенно неизвестными. Этот протокол обеспечивает простой и надежный метод определения субтохондриальной локализации белков, который был основополагающим для выяснения их молекулярных функций.

Abstract

Несмотря на недавние успехи в характеристике митохондриального протеома дрожжей, субпохондриальная локализация значительного числа белков остается неуловимой. Здесь мы описываем надежный и эффективный метод определения суборганелларной локализации дрожжевых митохондриальных белков, который считается фундаментальным шагом при выяснении функции митохондриального белка. Этот метод включает в себя начальный этап, который заключается в получении высокочистых интактных митохондрий. Эти митохондриальные препараты затем подвергают протоколу субфракционации, состоящему из гипотонического шока (отека) и инкубации с протеиназой К (протеазой). Во время отека внешняя митохондриальная мембрана избирательно нарушается, позволяя протеиназе К переваривать белки межмембранного космического отсека. Параллельно для получения информации о топологии мембранных белков митохондриальные препараты сначала обрабатывают ультразвуком, а затем подвергают щелочной экстракции карбонатом натрия. Наконец, после центрифугирования фракции гранул и супернатантов из этих различных обработок анализируются с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Постохондриальная локализация, а также мембранная топология интересующего белка получены путем сравнения его западного блот-профиля с известными стандартами.

Introduction

Митохондрии являются важнейшими органеллами эукариотических клеток, которые играют решающую роль в биоэнергетике, клеточном метаболизме и сигнальных путях1. Для правильного выполнения этих задач митохондрии полагаются на уникальный набор белков и липидов, отвечающих за их структуру и функцию. Почковые дрожжи Saccharomyces cerevisiae широко используются в качестве модельной системы для исследований митохондриальных процессов, а также для других органелл2. Митохондриальный геном кодирует только восемь белков в дрожжах; подавляющее большинство митохондриальных белков (~99%) кодируются ядерными генами, которые транслируются на цитозольных рибосомах, а затем импортируются в их правильные притохондриальные компартменты сложными механизмами импорта белка3,4,5. Таким образом, митохондриальный биогенез зависит от скоординированной экспрессии как ядерного, так и митохондриального геномов6,7. Генетические мутации, вызывающие дефекты митохондриального биогенеза, связаны с заболеваниями человека8,9,10.

За последние два десятилетия высокопроизводительные протеомные исследования, нацеленные на высокоочищенные митохондрии, привели к всесторонней характеристике дрожжевого митохондриального протеома, который, по оценкам, состоит из не менее 900 белков11,12,13,14. Хотя эти исследования предоставили ценную информацию, суборганелларная локализация каждого белка в четырех митохондриальных подкомпартментах, а именно внешней мембране (OM), межмембранном пространстве (IMS), внутренней мембране (IM) и матрице, все еще требуется. Этот вопрос был частично решен с помощью протеомных исследований двух меньших митохондриальных подкомпартментов (OM и IMS)15,16. Совсем недавно Vögtle и его коллеги сделали большой шаг вперед, создав высококачественную глобальную карту распределения субтохондриального белка в дрожжах. Используя комплексный подход, сочетающий количественную масс-спектрометрию на основе SILAC, различные протоколы фракционирования постохондрий и набор данных из протеомов OM и IMS, авторы выделили 818 белков в четыре митохондриальных подкомпартмента13.

Несмотря на успехи, достигнутые этими высокопроизводительными протеомными исследованиями, наши знания о составе протеома постохондрий далеко не полны. Действительно, среди 986 белков, о которых Vögtle и его коллеги сообщили как локализованные в дрожжевых митохондриях, 168 не могли быть отнесены ни к одному из четырех подсоландохондриальных компартментов13. Более того, авторы не предоставили информацию о мембранной топологии белков, которые, как прогнозировалось, будут периферически прикреплены к периферии митохондриальных мембран. Например, невозможно узнать, обращен ли белок, который был назначен периферически прикрепленным к внутренней мембране, к матрице или межмембранному пространству. Помимо этих недостающих данных из общепротеомных исследований, есть противоречивая информация о суборганелларной локализации значительного числа митохондриальных белков. Одним из примеров является протеаза Prd1, которая была назначена в качестве межмембранного космического белка в общих базах данных, таких как Saccharomyces Genome Database (SGD) и Uniprot. Удивительно, но используя протокол субфракционации, подобный описанному здесь, Фёгтле и его коллеги ясно показали, что Prd1 является подлинным матричным белком13. Как упоминалось выше, необходимо прояснить или переоценить субтохондриальную локализацию многих митохондриальных белков. Здесь мы предоставляем простой и надежный протокол для определения суборганелларной локализации дрожжевых митохондриальных белков. Этот протокол был разработан и оптимизирован различными исследовательскими группами и регулярно используется для определения локализации постохондрий, а также мембранной топологии многих митохондриальных белков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Рост дрожжевых клеток

  1. Изолируйте отдельные колонии интересующего штамма, переместив небольшую часть клеток из запаса глицерина -80 ° C на агаровую пластину YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы). Инкубировать пластину при 30 °C в течение 2-3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм S. cerevisiae, используемый в настоящем протоколе, получен из BY4741 (MATα; его3Δ1; лей2Δ0; мет15Δ0; ura3Δ0). За исключением генов ауксотрофных маркеров, этот штамм не содержит ни одного удаленного гена и не несет никакой плазмиды. Таким образом, его можно успешно культивировать в богатой среде, стимулируя энергичный рост клеток. При работе со штаммами, трансформируемыми плазмидами, используют соответствующую минимальную среду для отбора плазмид.
  2. Подготовьте закваску путем инокуляции 2-3 отдельных колоний из агаровой пластины YPD в 10-20 мл среды YPGal (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% галактозы) в колбе Эрленмейера объемом 100 мл. Инкубировать при 30 °C в течение 24 ч с энергичным встряхиванием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор питательной среды зависит от штамма дрожжей, используемого в протоколе. Как YPD, так и YPGal содержат ферментируемые источники углерода, которые позволяют расти штаммам, которые не выполняют митохондриальное дыхание. Однако, поскольку глюкоза подавляет экспрессию многих митохондриальных генов, не рекомендуется использовать этот источник углерода, поскольку он будет производить меньшее количество митохондрий. При работе с респираторными компетентными штаммами, которые могут дыхнуть, также можно использовать источники углерода, такие как глицерин и этанол, в попытке получить более высокий выход митохондрий.
  3. Разбавьте закваску в 1 л свежей среды YPGal до OD600 менее 0,1. Культивируют клетки при 30 °C с энергичным встряхиванием до тех пор, пока OD600 не достигнет 1-1,5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите скорость роста (время удвоения) для каждого штамма дрожжей перед выполнением эксперимента. Это позволит получить точную оценку времени инкубации, необходимого для того, чтобы культура достигла OD600 1-1,5.

2. Выделение высокоочищенных митохондрий

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован с17, с незначительными изменениями.

  1. Собирают клетки методом центрифугирования при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  2. Промыть ячейки дистиллированной водой и собрать их центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Определите влажный вес клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самый простой способ измерить вес гранулы ячейки на этапе 2.2 - это определить вес пустой трубки центрифуги непосредственно перед сбором ячеек. После центрифугирования отбросьте супернатант и измерьте массу той же трубки с клетками. Вес клеток — это разница между двумя измерениями.
  4. Повторное суспендирование клеток в буфере DTT (2 мл на 1 г клеток) с помощью пипетки Пастера или наконечника P5000. В таблице 1 приведена информация о составе буфера ДДТ.
  5. Инкубируйте клетки при 30 °C в течение 20 мин с легким встряхиванием (~70 об/мин).
  6. Центрифуга при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для гранулирования ячеек.
  7. Промыть клетки с помощью зимолиазного буфера без фермента (около 7 мл на 1 г клеток).
    См. таблицу 1 для буферной композиции зимолиазы.
  8. Центрифуга при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для гранулирования ячеек.
  9. Повторное суспендирование клеток в буфере без зимолиазы (7 мл на 1 г клеток).
  10. Переложите клеточную суспензию в колбу Эрленмейера объемом 250 мл и добавьте Зимолязу-20Т (3 мг на г живого веса).
  11. Инкубировать клетки при 30 °C в течение 30-40 мин с легким встряхиванием (~70 об/мин). Проверьте эффективность этого процесса, сравнив мутность клеточной суспензии до и после лечения зимолиазой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки будут преобразованы в сферопласты из-за переваривания клеточной стенки зимолиазой.
    1. Для этого добавляют по 50 мкл каждой клеточной суспензии в отдельные стеклянные трубки, содержащие 2 мл воды. После энергичного перемешивания мутность клеточной суспензии, обработанной зимолязой, должна быстро уменьшаться из-за осмотического нарушения сферопластов. С другой стороны, мутность необработанной клеточной суспензии должна оставаться неизменной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффекты мутности также можно контролировать с помощью простого визуального осмотра или путем измерения OD600 обоих образцов. Во втором случае OD600 образца, обработанного зимолиазой, должен составлять 10-20% от необработанного образца. Альтернативный метод включает подсчет клеток в обоих образцах с помощью световой микроскопии.
    2. Если выход образования сферопластов низкий, добавляют больше зимолязы и инкубируют в течение еще 15 мин интервала.
  12. Собирают сферопласты центрифугированием при 2500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все дальнейшие шаги следует проводить быстро и на льду или при 4 °C, чтобы избежать деградации белка гидролитическими ферментами.
  13. Дважды промыть сферопласты ледяным буфером гомогенизации (около 6,5 мл на 1 г клеток) и гранулированием центрифугированием при 2 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. См. таблицу 1 для буферного состава гомогенизации.
  14. Повторно суспендируют сферопласты в буфере гомогенизации ледяного холода (6,5 мл на 1 г клеток) и переносят его в предварительно охлажденный стеклянный гомогенизатор Dounce. Используйте большой гомогенизатор стекла примерно 30 мл.
  15. Гомогенизируйте сферопласты 15 ударами с помощью пестика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ударов должно быть отрегулировано в зависимости от посадки пестика. Для тугого пестика достаточно 15 ударов. С другой стороны, при использовании рыхлого пестика рекомендуется выполнять до 25 ударов.
  16. Переложите гомогенат в трубку центрифуги объемом 50 мл и добавьте 1 объем буфера гомогенизации ледяного холода.
  17. Центрифугируйте гомогенат на низкой скорости, 1,500 x g в течение 5 мин при 4 °C к ядрам гранул, клеточному мусору и неразрывным клеткам.
  18. Перенесите супернатант в новую центрифужную трубку объемом 50 мл с помощью пипетки Пастера или наконечника P5000, позаботившись о том, чтобы избежать разрушения гранулы.
  19. Центрифуга при 4 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  20. Переложите супернатант в высокоскоростную центрифужную трубку и центрифугу при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C в гранулу сырой фракции митохондрий.
  21. Отбросьте надосадочный материал и аккуратно промыть сырую митохондриальную гранулу в буфере гомогенизации ледяного холода объемом 20-30 мл путем бережного пипетирования с использованием наконечника P5000.
  22. Переложите суспензию в центрифужную трубку объемом 50 мл и центрифугу при 4000 х г в течение 5 мин при 4 °C, чтобы гранулировать оставшийся клеточный мусор.
  23. Переложите супернатант в высокоскоростную центрифужную трубку и центрифугу при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C в гранулу сырой фракции митохондрий.
  24. Выбросьте супернатант и осторожно повторно суспендируйте сырую митохондриальную гранулу в небольшом объеме (обычно 1000 мкл) ледяного буфера SEM путем мягкого пипетирования с использованием наконечника P1000. См. таблицу 1 для состава буфера SEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя эта сырая митохондриальная фракция может быть использована непосредственно в некоторых приложениях, таких как импортные анализы белка органелло , она содержит значительное количество других клеточных компонентов. Эти загрязнения могут привести к неправильной интерпретации результатов при определении субтохондриальной локализации белка. Поэтому для получения высокоочищенного митохондриального препарата требуются дальнейшие этапы очистки, как описано ниже.
  25. Готовят растворы сахарозы в ЭМ-буфере в концентрациях 60%, 32%, 23% и 15% (мас./об.). Эти растворы стабильны до 1 месяца при 4 °C. См. таблицу 1 состава эм-буфера.
  26. Подготовьте 4-ступенчатый градиент сахарозы в ультрацентрифужной трубке следующим образом: Поместите 1,5 мл 60% (мас./об.) сахарозы на дно трубки центрифуги. Далее пипетку осторожно ступенчато: 4 мл 32%, 1,5 мл 23% и 1,5 мл 15% сахарозы (мас./об.). Позаботьтесь о том, чтобы не нарушить фазы.
  27. Осторожно загрузите сырую митохондриальную фракцию поверх градиента сахарозы.
  28. Центрифуга в течение 1 ч при 134 000 х г при 4 °C в качающемся роторе ковша.
  29. Осторожно продолжайте удалять раствор сахарозы до тех пор, пока не будет достигнута высокоочищенная фракция митохондрий, которая представлена коричневой полосой на границе раздела сахарозы 60%/32%.
  30. Извлеките очищенные митохондрии с помощью режущего наконечника P1000 и поместите его в предварительно охлажденную высокоскоростную центрифужную трубку.
  31. Разбавляют восстановленные митохондрии 5-10 объемами ледяного SEM-буфера.
  32. Центрифуга в течение 30 мин при 12 000 х г при 4 °C.
  33. Повторное суспендирование чистых митохондрий в 500 мкл ледяного буфера SEM путем бережной пипетки с использованием режущего наконечника P1000.
  34. Определить концентрацию белка высокоочищенного митохондриального препарата с помощью процедуры Брэдфорда в соответствии с инструкциями производителя. Отрегулируйте концентрацию белка до 10 мг белка/мл с помощью ледяного SEM-буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для протокола фракционирования эссетохондрий, описанного ниже, рекомендуется использовать свежеприготовленные митохондрии. Тем не менее, Vögtle и его коллеги провели подробный анализ контроля качества митохондриальной интактности и показали, что замороженные органеллы также могут быть использованы в этом протоколе13. Для этого делают аликвоты по 40 мкл и замораживают их в жидком азоте. Хранить при температуре -80 °C.

3. Протокол индохондриального фракционирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из ссылки18 и состоит из двух этапов: (1) гипотонический отек в присутствии или отсутствии протеиназы К и (2) обработка ультразвуком с последующей экстракцией карбоната. Выполняйте все этапы обоих протоколов на льду или при 4 °C, чтобы избежать деградации белка.

  1. Гипотонический отек в присутствии протеиназы К
    1. Перенесите 40 мкл высокоочищенных митохондрий по 10 мг/мл (400 мкг) в четыре предварительно охлажденные меченые микроцентрифужные трубки по 1,5 мл.
    2. Добавьте 360 мкл SEM-буфера в пробирки 1 и 2.
    3. Добавьте 360 мкл ЭМ-буфера в пробирки 3 и 4.
    4. Добавьте 4 мкл протеиназы К (10 мг/мл) в пробирки 2 и 4. Используйте схему пипетирования, приведенную в таблице 2 , чтобы избежать ошибок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 10 мг/мл раствора протеиназы К в воде непосредственно перед использованием. Конечная концентрация протеиназы К в эксперименте должна составлять около 50-100 мкг/мл. Пожалуйста, смотрите раздел Обсуждение для получения более подробной информации.
    5. Аккуратно перемешайте все пробирки и высиживайте на льду в течение 30 минут с периодическим перемешиванием.
    6. Добавьте 4 мкл 200 мМ PMSF во все четыре пробирки, чтобы остановить активность протеиназы K.
      ВНИМАНИЕ: PMSF очень токсичен. Надевайте перчатки при работе с растворами, содержащими PMSF.
    7. Центрифуга при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
    8. Соберите супернатант и переложите его в новую 1,5 мл предварительно охлажденную меченую микроцентрифужную трубку. Позаботьтесь о том, чтобы не нарушить гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть непосредственно повторно использована в буфере образца для дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Однако следы протеиназы K могут оставаться активными даже после обработки PMSF и в конечном итоге могут переваривать некоторые белки после того, как гранула была растворена в SDS-содержащем буфере образца. Чтобы избежать этой проблемы, протеиназа К может быть полностью инактивирована путем обработки образцов трихлоруксусной кислотой (ТЦА), как описано ниже.
      ВНИМАНИЕ: ТЦА очень токсичен. Надевайте перчатки при работе с растворами, содержащими ТЦА.
    9. Повторное суспендирование гранулы со стадии 3.1.8 в 400 мкл ледяного SEM-буфера.
    10. Осаждение супернатанта (со стадии 3.1.8) и повторно суспендированной гранулы (со стадии 3.1.9) с TCA до конечной концентрации 10% (мас./об.).
    11. Высиживать все тюбики на льду в течение 10 мин.
    12. Центрифугируйте образцы, обработанные TCA, в течение 10 мин при 12 000 х г при 4 °C.
    13. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл буфера образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что индикатор рН бромфенола синего становится желтым из-за кислотной обработки. Если это произойдет, добавьте небольшие аликвоты (1-5 мкл) основания 1 M Tris до тех пор, пока оно не станет синим.
    14. Добавьте 4 мкл 200 мМ PMSF во все пробирки.
    15. Храните все образцы при -80 °C до дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттингом.
  2. Обработка ультразвуком и карбонатная экстракция
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе нет необходимости использовать свежеприготовленные митохондрии после того, как обработка ультразвуком вызывает разрыв митохондриальных мембран.
    1. Перенесите 200 мкл высокоочищенных митохондрий при 10 мг/мл (2 мг белка) в предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    2. Разбавьте митохондрии в один раз ледяным буфером SEM.
    3. Ультразвуковые митохондрии в течение 3 х 30 с на льду. Используйте ультразвуковой аппарат, совместимый с небольшими объемами.
    4. Центрифугируйте образец в течение 30 мин при 100 000 х г при 4 °C.
    5. Соберите супернатант и перенесите его в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Держите его на льду. Этот образец будет называться растворимой белковой фракцией (S).
    6. Повторное суспендирование гранулы со стадии 3.2.4 в 400 мкл ледяного SEM-буфера.
    7. Возьмите 100 мкл повторно суспендированной гранулы со стадии 3.2.6 и переложите ее в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Держите его на льду. Этот образец будет называться фракцией постохондриальных частиц (SMP).
    8. Оставшиеся 300 мкл со стадии 3.2.6 разбавить свежеприготовленным карбонатом натрия 200 мМ.
    9. Инкубируйте образец с этапа 3.2.8 на льду в течение 30 мин.
    10. Центрифугируйте образец в течение 30 мин при 100 000 х г при 4 °C.
    11. Соберите супернатант и перенесите его в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Держите его на льду. Этот образец будет называться карбонатной фракцией супернатанта (CS).
    12. Повторное суспендирование гранулы со стадии 3.2.10 в 400 мкл ледяного SEM-буфера. Этот образец будет называться карбонатной осажденной фракцией (CP).
    13. Осаждение всех образцов (S, SMP, CS и CP) с TCA до конечной концентрации 10% (мас./об.).
    14. Высиживать все тюбики на льду в течение 10 мин.
    15. Центрифугируйте образцы, обработанные TCA, в течение 10 мин при 12 000 х г при 4 °C.
    16. Удалите супернатант и повторно суспендируйте каждую гранулу в буфере образца. Если буфер образца становится желтым, добавьте небольшие аликвоты (1-5 мкл) основания 1 M Tris, пока оно не станет синим.
    17. Добавьте 1 мкл 200 мМ PMSF во все пробирки.
    18. Храните все образцы при -80 °C до дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттингом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Успех протокола субтохондриального фракционирования зависит от получения высокоочищенных интактных митохондрий. Для этого важно, чтобы во время лизиса дрожжевых клеток целостность органелл оставалась почти полностью сохраненной. Это достигается с помощью протокола лизиса клеток, который сочетает ферментативное сбраживание клеточной стенки с последующим физическим разрушением плазматической мембраны с использованием гомогенизатора Dounce. Затем митохондриальное содержимое собирается путем дифференциального центрифугирования. Это субклеточное фракционирование дает обогащенную митохондриальную фракцию, что подтверждается наличием высоких уровней порина (Por1), белка митохондриального маркера (рисунок 1, полоса 2). Однако это сырая фракция митохондрий, которая содержит значительное количество других клеточных компартментов, включая эндоплазматический ретикулум, вакуоль, цитозоль и эндосому (рисунок 1, полоса 2). Эти загрязнения могут вводить артефакты в некоторые приложения, такие как эксперименты по локализации белка. Чтобы уменьшить количество этих загрязнений, сырую митохондриальную фракцию дополнительно очищают при центрифугировании градиента плотности сахарозы. Эта дополнительная стадия очистки генерирует высокочистую митохондриальную фракцию, о чем свидетельствует значительное снижение содержания белковых маркеров для других клеточных компартментов (рисунок 1, полоса 3).

Чтобы определить субтохондриальную локализацию белков, высокоочищенные митохондрии дополнительно фракционируют на их подкомпартменты (рисунок 2А). Этот протокол включает в себя превращение митохондрий в митопласты гипотоническим осмотическим шоком. В этом процессе интактные митохондрии инкубируются в гипоосмотическом буфере, что приводит к отеку органеллы. Во время набухания внешняя митохондриальная мембрана избирательно разрывается осмотическим дисбалансом, и содержание белка межмембранного пространства высвобождается в супернатант. Вся эта процедура проводится при наличии или отсутствии протеиназы К. Как следствие разрушения внешней мембраны, протеаза получает доступ к содержанию белка межмембранного пространства и способствует деградации соответствующих белков. Напротив, содержание белка в митохондриальном матриксе остается защищенным от атаки протеазы из-за целостности внутренней митохондриальной мембраны. После этих процедур содержание белка в различных образцах оценивается с помощью анализов SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.

Эффективное превращение митохондрий в митопласты путем осмотического шока (отека) можно контролировать двумя способами: (1) исчезновение растворимого белка межмембранного пространственного маркера (например, цитохромового цита. б2) в гранулированной фракции из митопластов с сопутствующим ей появлением в надводящей фракции (рис. 2В, сравните полосу 3 с полосой 7); (2) селективная деградация внутримембранного маркерного белка, обращенного к межмембранному пространству (например, ScoI), протеиназой К только в митопластах (фиг.2В, полоса 4). Кроме того, защита маркерами Cyt. b2 и ScoI против деградации протеиназы К в гранулированной фракции из митохондрий используются для подтверждения целостности внешней митохондриальной мембраны (рисунок 2B, полоса 2). С другой стороны, целостность внутренней митохондриальной мембраны подтверждается защитой матриксного растворимого белкового маркера α-КГД от деградации протеиназы К (рисунок 2В, полоса 4). Чтобы определить постохондриальную локализацию интересующего белка, просто сравните его профиль вестерн-блот с профилями этих стандартов с известной локализацией.

В случае белка, изображенного на рисунке 2B (Prx1), его профиль западного блоттинга указывает на белок с двойной митохондриальной локализацией: межмембранное пространство и матрица. На первый взгляд, его профиль фракционирования аналогичен α-KGD, что указывает на локализацию матрицы. Однако его присутствие в супернатанте митопластов также указывает на локализацию межмембранного пространства. Описанные выше профили фракционирования белковых маркеров устраняют возможные артефакты, связанные с целостностью митохондриального препарата, и подтверждают двойную локализацию Prx119.

Чтобы исследовать топологию белков на митохондриальных мембранах, митохондрии подвергают двум дополнительным методам лечения: обработке ультразвуком и экстракции карбоната (рисунок 3A). В то время как ультразвук высвобождает только растворимые белки в надпомную фракцию13, щелочная экстракция карбонатом натрия дополнительно солюбилизирует периферически мембраноассоциированные белки13,20. В обеих обработках интегральные мембранные белки остаются в гранулированной фракции13. Эти предположения подтверждаются анализом вестерн-блоттинга фракций гранул и надменных веществ из обеих обработок (рисунок 3B). Ожидается, что интегральный белок митохондриальной мембраны (например, порин Por1) будет полностью обнаружен во фракции гранул, даже после щелочной обработки карбонатом натрия (рисунок 3B, полосы 3 и 5). С другой стороны, ожидается, что растворимый матричный белок (например, α-KGD) будет полностью солюбилизирован в обеих обработках (рисунок 3B, полосы 2 и 4). Значительное удержание α-KGD в гранулах от обработки ультразвуком (рисунок 3B, полоса 3, фракция SMP) может быть связано с незначительными изменениями параметров обработки ультразвуком, которые могут влиять на образование так называемых субтохондриальных частиц, которые эффективно осаждены ультрацентрифугированием. Поведение этих белков с известными профилями растворимости затем используется для определения митохондриальной растворимости интересующего белка. В случае Prx1 его профиль западного пятна наводит на мысль о белке, связанном с периферией мембраны, а щелочная обработка индуцирует его солюбилизацию (рисунок 3B, полоса 4).

Figure 1
Рисунок 1: Выделение высокоочищенных митохондрий. Вестерн-блоттинговый анализ общей лизатной фракции (полоса 1), сырой митохондриальной фракции (полоса 2) и высокоочищенной митохондриальной фракции (полоса 3). Фракции разделяли SDS-PAGE на 12% полиакриламидном геле, переносили в нитроцеллюлозу и исследовали антителами, поднятыми против маркеров для отдельных клеточных компартментов, как описано на правой стороне геля. Этот показатель был изменен по сравнению со ссылкой19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Протокол субпохондриального фракционирования гипотоническим отеком в присутствии протеиназы К. (А) Схематическое представление протокола субпохондриального фракционирования. Высокоочищенные митохондрии отдельно подвергают изотоническим или гипотоническим обработкам (отеку) в присутствии (+) или отсутствии (-) протеиназы К. После лечения активность протеиназы К ингибируется добавлением PMSF, а митохондрии и митопласты восстанавливаются центрифугированием. Содержание белка в полученных фракциях гранул и супернатантов осаждается TCA, а затем анализируется SDS-PAGE и вестерн-блоттингом. Цветовые сферы представляют собой субтохондриальные белковые маркеры для: растворимого белка межмембранного пространства (зеленый), белка внутренней мембраны, который обращен к межмембранному пространству (розовый), и растворимого матричного белка (светло-голубого). (B) Вестерн-блоттинг гранулированных и надосадочных фракций из протокола субпохондриального фракционирования. Фракции были разделены SDS-PAGE на 12% полиакриламидном геле, перенесены в нитроцеллюлозу и исследованы антителами, поднятыми против маркеров для отдельных потохондриальных компартментов, как показано в A. Смотрите текст для получения более подробной информации. Этот показатель был изменен с 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Протокол субпохондриального фракционирования ультразвуком и карбонатной экстракцией. (А) Схематическое представление протокола, используемого для определения растворимости и мембранной топологии митохондриальных белков. Митохондрии первоначально обрабатываются ультразвуком и центрифугируются, в результате чего образуется растворимая белковая фракция (S) и компартментированный мембранный продукт, называемый субтохондриальной частицей (SMP). Гранулу со стадии обработки ультразвуком впоследствии подвергают щелочной обработке карбонатом натрия (Na2CO3) и центрифугируют, в результате чего образуется карбонатный супернатант (CS) и карбонатно-осажденные фракции (CP). (B) Вестерн-блоттинг гранул и фракций супернатантов из протокола ультразвуковой обработки и экстракции карбоната. Фракции были разделены SDS-PAGE на 12% полиакриламидном геле, перенесены в нитроцеллюлозу и исследованы антителами, поднятыми против белковых маркеров, показывающих различные уровни растворимости. Смотрите текст для получения более подробной информации. Этот показатель был изменен с 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Решение Компоненты Комментарии
YPD среда 1% (мас./об.) дрожжевого экстракта, 2% (мас./об.) пептона, 2% (мас./об.) глюкозы Растворите 10 г экстракта дрожжей Bacto, 20 г Bacto Peptone и 20 г глюкозы в 900 м добавленной дистиллированной воды. Залить до 1000 мл и стерилизовать автоклавом.
YPGal средний 1% (мас./об.) дрожжевой экстракт, 2% (мас./об.) пептона, 2% (мас./об.) галактозы Растворите 10 г экстракта дрожжей Бакто, 20 г Бакто Пептона и 20 г галактозы в 900 м дистиллированной воды. Залить до 1000 мл и стерилизовать автоклавом.
Буфер DTT 100 мМ Tris-H2SO4 (рН 9,4), 10 мМ дитиотрейтол (DTT) Для приготовления 15 мл: смешать 1,5 мл 1 M Tris-H2SO4, рН 9,4 со 150 мкл 1M DTT предварительно при 30 °C.
Объем до 15 мл с ddH2O
Приготовьте свежее перед использованием
Зимолиазный буфер 20 мМ буфер фосфата калия (рН 7,4), 1,2 М сорбита Для приготовления 100 мл: смешайте 2 мл 1 М фосфатного калия буфера (рН 7,4) с 60 мл сорбита 2 М
Объем до 15 мл с ddH2O
Растворите порошок (3 мг на грамм живого веса) Зимолиазы-20Т из Arthrobacter luteus (MP Biomedicals, Irvine, CA) в буфере непосредственно перед использованием
Буфер гомогенизации 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4), 0,6 М сорбита, 1 мМ ЭДТА, 0,2% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) Для получения 250 мл: смешайте 2,5 мл буфера 1 M Tris-HCl (pH 7,4) с 75 мл 2 М сорбита, 500 мкл 500 мМ ЭДТА и 0,5 г BSA (по существу без жирных кислот)
Объем до 250 мл с ddH2O
Предварительное охлаждение при 4°C
Добавление PMSF и BSA в буфер непосредственно перед использованием
Буфер SEM 10 мМ MOPS-KOH (рН 7,2), сахароза 250 мМ, ЭДТА 1 мМ Для приготовления 250 мл: смешайте 2,5 мл 1 MOPS-KOH буфера (рН 7,2) с 31,25 мл 2 М сахарозы и 500 мкл 500 мМ ЭДТА
Объем до 250 мл с ddH2O
Предварительно охладите при 4°C непосредственно перед использованием.
ЭМ-буфер 10 мМ МОПС-КОН (рН 7,2), 1 мМ ЭДТА Для приготовления 250 мл: смешайте 2,5 мл 1 M MOPS-KOH буфера (рН 7,2) с 500 мкл 500 мМ ЭДТА
Объем до 250 мл с ddH2O
Предварительное охлаждение при 4°C непосредственно перед использованием
буфер образцов 2% (мас./об.) додецилсульфат натрия (SDS), 50 мМ DTT, 10% (v/v) глицерин, 0,02% бромфенол
синий, 60 мМ Tris-HCl (рН 6,8),

Таблица 1: Носители, решения и буферы.

Реагент 1 2 3 4
Митохондрии (10 мг/мл) 40 мкл 40 мкл 40 мкл 40 мкл
Буфер SEM 360 мкл 360 мкл - -
ЭМ-буфер - - 360 мкл 360 мкл
Протеиназа К (10 мг/мл) - 4 мкл - 4 мкл

Таблица 2: Схема пипетирования для выполнения гипотонического отека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Представленный здесь протокол успешно используется и непрерывно оптимизируется в течение длительного времени для определения локализации белка в притохондриальных компартментах13,14,18,21,22,23. Надежность и воспроизводимость этого протокола сильно зависят от чистоты и целостности митохондриальных препаратов18. Оба эти требования достигаются путем добавления дополнительной стадии очистки (центрифугирование градиента плотности сахарозы) к неочищенным митохондриальным препаратам13,24,25 (рисунок 1). Помимо устранения нежелательных немитохондриальных загрязнений, этот дополнительный этап очистки также устраняет разрушенные митохондрии и митопласты, которые могут возникнуть в результате многочисленных физических манипуляций с образцом во время протокола18. Таким образом, несмотря на увеличение времени процедуры, эта стадия очистки градиента сахарозы генерирует высокоочищенные интактные митохондрии, что считается необходимым для успеха протокола фракционирования субтохондрий18,22.

Фёгтле и его коллеги сообщили, что замороженные органеллы (при -80 °C) также могут быть успешно использованы для субтохондриального фракционирования13; мы, однако, рекомендуем использовать свежий митохондриальный препарат. Независимо от выбора, неповрежденность очищенных митохондрий может быть подтверждена путем проверки чувствительности межмембранных космических белков к добавленной извне протеиназе К. Если органеллы неповреждены, белки этого компартмента такие как Cyt. b2 и Sco1 должны оставаться защищенными от протеолитической деградации из-за барьера, обеспечиваемого наружной мембраной (рисунок 2B, полоса 2). Напротив, когда органеллы инкубируются в гипоосмотическом буфере, разрыв наружной мембраны из-за осмотического шока (отека) делает эти белки склонными к деградации протеазы (рисунок 2B, полоса 4). С другой стороны, белки, присутствующие в матричном компартменте, такие как α-KGD, должны оставаться защищенными от деградации как в митохондриях, так и в митопластах из-за целостности внутренней мембраны (рисунок 2B, полосы 2 и 4). Таким образом, профили этих хорошо изученных митохондриальных маркерных белков могут быть использованы либо для оценки целостности митохондриальных препаратов, либо для успешности протокола фракционирования. Кроме того, постохондриальная локализация интересующего белка получена простым сравнением его профиля фракционирования с профилями из маркерных белков18,22 (рисунок 2В). Важно отметить, что если митохондриальные маркерные белки демонстрируют поведение, отличное от описанного выше, целостность органелл, вероятно, нарушена, и, таким образом, митохондриальный препарат не должен использоваться для целей этого протокола.

Хотя гипотонический шок оказался надежным методом различения белков межмембранного пространства и матрицы, этот метод не дает информации о том, является ли матричный белок растворимым или прикрепленным к внутренней мембране митохондрий. Эта информация может быть достигнута путем передачи митохондрий на обработку ультразвуком с последующей щелочной экстракцией карбонатом натрия (рисунок 3). В то время как растворимые матричные белки, как ожидается, будут высвобождаться в фракцию супернатанта при обработке ультразвуком, белки, связанные с мембранами, как правило, находятся в осадке13. С другой стороны, щелочная экстракция карбонатом натрия эффективно солюбилизирует белки, периферически прикрепленные к мембранам, но не интегральные мембранные белки13,20. Таким образом, если белок устойчив к деградации протеазы после отека, но высвобождается в супернатант при щелочной обработке, он, вероятно, является периферически прикрепленным внутримембранным белком, обращенным к матричному отсеку. Важно иметь в виду, что успех анализа чувствительности к протеазе поразительно зависит от чувствительности интересующего белка к протеазе, используемой для пищеварения. Некоторые митохондриальные белки, по-видимому, устойчивы к протеолитической деградации при стандартной концентрации протеиназы К (0,1 мг/мл), обычно используемой в протоколах субфракционирования (рисунок 2B, полоса 8)19. Удвоение концентрации протеиназы К (0,2 мг/мл), по-видимому, достаточно для обеспечения полной протеолитической деградации. Однако имейте в виду, что более высокие концентрации протеазы могут дестабилизировать внешнюю митохондриальную мембрану и в конечном итоге поставить под угрозу эффективность протокола.

Нет сомнений в том, что для выяснения функции митохондриальных белков необходимо определить их постохондриальную локализацию. В связи с этим данный протокол представляет собой мощный инструмент для исследователей, которые начинают изучать митохондрии. Несмотря на то, что он направлен на дрожжи, многие из его принципов могут быть легко применимы к другим организмам. Действительно, за исключением этапов очистки митохондрий, остальная часть протокола очень похожа на те, о которых сообщалось для других организмов26,27,28. Другим важным вкладом этого протокола является его применимость в изучении мутантов S. cerevisiae, которые показывают измененный митохондриальный биогенез. Широко сообщалось, что дрожжевые мутанты для механизма импорта митохондриального белка показывают измененное распределение митохондриальных белков5,29. Таким образом, этот протокол может быть регулярно использован для исследования последствий распределения митохондриального белка, вызванных мутациями, которые могут изменить митохондриальный биогенез. Наконец, протокол может быть особенно полезен для исследования белков, которые показывают двойную митохондриальную локализацию19,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора А. Цаголова (Колумбийский университет) за предоставление антител, выращенных против субтохондриальных маркерных белков Cyt. b2, αKGD и Sco1. Мы также благодарим д-ра Марио Энрике де Барроса (Университет Сан-Паулу) за полезное обсуждение и комментарии в ходе разработки этого протокола.

Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Фонда ампаро в Пескизе сан-Паулу (FAPESP) (грант 2013/07937-8).

Фернандо Гомес и Хелена Турано также поддерживаются FAPESP, гранты 2017/09443-3 и 2017/23839-7 соответственно. Angélica Ramos также поддерживается Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Peptone BD 211677
Bacto Yeast extract BD 212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm Beckman Coulter 344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) Sigma-Aldrich A7030 Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43815 Component of DDT buffer
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
Galactose Sigma-Aldrich G0625
Glucose Sigma-Aldrich G7021
MOPS Sigma-Aldrich M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662
Proteinase K Sigma-Aldrich
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus MP Biomedicals, Irvine, CA 320921 Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
  3. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
  4. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
  5. Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
  6. Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
  7. Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
  8. Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
  9. Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
  10. Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
  11. Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
  12. Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
  13. Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).
  14. Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
  15. Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
  16. Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
  17. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
  18. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
  19. Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
  20. Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
  21. Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
  22. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
  23. Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
  24. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
  25. Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), Clifton, N.J. 33-39 (2006).
  26. Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
  27. Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
  28. Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
  29. Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
  30. Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).

Tags

Биохимия выпуск 173 митохондрии почковые дрожжи Saccharomyces cerevisiae подсоландохондриальные компартменты субсохондриальное фракционирование подсохондриальная локализация ультразвук карбонатная экстракция вестерн-блот
Оценка локализации субпохондриального белка в почковых <em>дрожжах Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gomes, F., Turano, H., Ramos, A.,… More

Gomes, F., Turano, H., Ramos, A., Netto, L. E. S. Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (173), e62853, doi:10.3791/62853 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter