Summary
Deze publicatie beschrijft het ontwerp van laboratoriumfotobioreactoren (PBR's) met aanpasbare lichtregimes. De groei van cyanobacteriën of microalgen, met bicarbonaat als koolstofbron, wordt continu bewaakt door de volumetrische zuurstofproductie te meten. Deze PBR's maken snelle, gerepliceerde laboratoriumgroeivergelijkingen mogelijk met weinig tussenkomst van de gebruiker tijdens experimenten.
Abstract
De laboratoriumstudie van microalgen kan experimenteel uitdagend zijn. Naast de teeltvereisten van niet-fotosynthetische micro-organismen, vereisen fototrofen ook verlichting. Routinematig proberen onderzoekers aangepaste lichtvoorzieningen te bieden, d.w.z. de lichtintensiteit en tijd waarin het wordt geleverd te variëren. Een dergelijke flexibiliteit is moeilijk met standaard tafelverlichting. Meestal vereisen teeltstudies ook groeivergelijkingen tussen experimentele behandelingen. Vaak wordt de groei beoordeeld over een langere duur, bijvoorbeeld meerdere keren per dag gedurende een proef van een week. Handmatige metingen kunnen tijdrovend zijn en missen gegevensresolutie. Daarom zijn fotobioreactoren (PBR's) met automatische groeimonitoring en aanpasbare lichttoevoer nuttig voor gerepliceerde experimenten met meerdere behandelingen. Het huidige werk presenteert het ontwerp, de constructie en de werking van laboratorium PBR's. De materialen zijn gemakkelijk in te kopen en relatief goedkoop. Het ontwerp kon met matige vaardigheid worden gedupliceerd. Elke structuur heeft een voetafdruk van ~ 40 cm2 en herbergt drie glazen flessen van 1 L voor drievoudige replicatie. Flessen rusten op platforms met magneetroerders en zijn verticaal gerangschikt in een polyvinylchloride (PVC) buis met een diameter van 1 m hoog en 15 cm. Het binnenste van de buis is bekleed met light-emitting diodes (LED's). Deze LED's produceren continue lichtintensiteiten van 0-2400 μmol fotonen m-2 s-1 van fotosynthetisch actieve straling (PAR). Gebruikers ontwerpen een aangepast verlichtingsprogramma. De lichtintensiteit kan elke seconde worden aangepast of constant worden gehouden voor langere duur. Zuurstof geproduceerd uit fotosynthese verlaat elke fles via een eenrichtingsvolumetrische gassensor. Software wordt gebruikt om gassensorgegevens vast te leggen. De hoeveelheid geproduceerde zuurstof kan worden gecorreleerd aan de groei van biomassa. Als biomassamonsters nodig zijn, kan een spuit worden gebruikt om cultuur te extraheren. De methode is geschikt voor microalgen gekweekt met bicarbonaat als koolstofbron. Deze PBR's zijn waardevol voor een laboratorium dat gerepliceerde experimenten, flexibiliteit van het lichtregime en continue groeigegevens met hoge resolutie vereist.
Introduction
Microalgen en cyanobacteriën, gezamenlijk microalgen genoemd voor eenvoud, worden verdedigd voor hun potentieel in duurzame biotechnologie. Ze zijn aantrekkelijke kandidaten vanwege hun snelle groei, het vermogen om te worden gekweekt op niet-bouwland en voor hun gebruik van zonlicht om de omzetting van koolstofdioxide in biomassa te stimuleren 1,2,3. Microalgenbiomassa kan worden omgezet in producten zoals bio-energie in de vorm van olie of gas, kleurstoffen en voedingssupplementen, en materialen zoals biopolymeren 1,4,5,6,7. Bovendien kunnen ze worden gebruikt om afvalwater te behandelen of waterlichamen te saneren door overtollige voedingsstoffen te consumeren 8,9. Daarom is microalgenonderzoek wijdverspreid en gevestigd. Het veld groeit naarmate de samenleving de koolstofintensiteit en ecologische duurzaamheid van de huidige productie- en energieopwekkingsbenaderingen heroverweegt.
Drie fundamentele vereisten van laboratoriumgebaseerde microalgenstudies zijn een kweekvat, een lichtbron en een methode om de groei te kwantificeren. De term fotobioreactor (PBR) beschrijft een opstelling waarin kweekvaten worden verlicht10. Gewoonlijk zijn studies van microalgen gericht op het vergelijken van de groei tussen twee of meer behandelingen, bijvoorbeeld verschillende groeimedia, lichtregimes of soorten 11,12,13. Voor statistische relevantie moet elke aandoening, bijvoorbeeld behandeling en controle, worden gerepliceerd. Als controle en behandeling gelijktijdig worden uitgevoerd, betekent dit dat veel PBR's moeten worden gecontroleerd en bemonsterd voor de duur van een experiment. De uitdaging bij het bedienen van meerdere PBR's is tweeledig. Ten eerste is het leveren van een uniforme lichtintensiteit aan elke PBR essentieel voor de reproduceerbaarheid, maar kan het moeilijk zijn. De hoeveelheid lichtinval op het scheepsoppervlak wordt beïnvloed door de afstand tot de lichtbron, schaduw van aangrenzende vaten en achtergrondlichtfluctuaties14. Ten tweede moet een methode worden gekozen om de groei nauwkeurig te kwantificeren.
Groei wordt gewoonlijk gemeten aan de hand van het aantal cellen, optische dichtheid (OD), chlorofyl A-gehalte, drooggewicht (DW) dichtheid en asvrije drooggewicht (AFDW) dichtheid15. Celtellingen, chlorofyl A-gehalte en gravimetrische methoden zijn handmatige processen die discrete gegevenspunten produceren. OD kan continu en niet-invasief worden gemeten met een spectrofotometer, op voorwaarde dat het goed is gekalibreerd tegen een andere methode zoals AFDW-dichtheid15. OD-metingen en chlorofyl A-gehalte kunnen echter onbetrouwbaar zijn omdat de resultaten variëren onder verschillende kweekomstandigheden, bijvoorbeeld tussen soorten en gedurende de groeicyclus15,16. Voor chlorofyl A kan de extractiemethode ook van invloed zijn op de pigmentopbrengst17. Chlorofyl A-gehalte is vooral nuttig bij het volgen van de groei van microalgen binnen microbiële gemeenschappen die ook niet-fotosynthetische organismen bevatten17,18. Bij het kiezen van een methode om de groei te bepalen, is het essentieel om rekening te houden met de morfologie van de suspensie. Wanneer organismen klonteren en niet goed gemengd zijn, zijn OD- en celtellingen niet mogelijk15. Een enkele methode is niet geschikt voor alle experimentele toepassingen - onderzoekers moeten beslissen welke methoden praktisch en relevant zijn voor hun experimentele doelen.
AFDW is een betrouwbare methode die groeivergelijkingen tussen verschillende kweekomstandigheden mogelijk maakt, met name tussen soorten en kweekmedia 15,19,20. Om AFDW te berekenen, wordt eerst een monster van microalgencultuur geconcentreerd, hetzij door filtratie of centrifugatie, en gedroogd. In dit stadium kan de DW worden bepaald. Gewoonlijk bevat het DW-monster ten minste 8-10% as-anorganisch materiaal zoals zouten en deeltjes15. DW volgt groeitrends, maar kan worden scheefgetrokken als de bijdrage van anorganische geneesmiddelen varieert. Om de AFDW-dichtheid te bepalen, wordt droge biomassa bij hoge temperatuur verbrand; dit verdampt het organische of nuttige deel terwijl as (anorganisch)achterblijft 19. Om de AFDW te berekenen, wordt het gewicht van de asfractie afgetrokken van dat van de DW-fractie. Typisch, in microalgen suspensies, varieert AFDW van 0,1-3 g / L 12,21,22. Kleine volumes verdunde suspensies leveren weinig droge biomassa op, < 10 mg. Na verbranding mag as slechts 1 mg wegen. Daarom vereist deze methode, afhankelijk van de kweekdichtheid, volumes tussen 5-100 ml en analytische schalen met een nauwkeurigheid van 0,1 mg 12,15,19,22. Laboratorium PBR's zijn meestal klein, hooguit een paar liter, vandaar dat elk vloeibaar monster het kweekvolume uitput. Verder is de AFDW-methode handmatig en duurt het 2-3 dagen. Voor gerepliceerde en repetitieve experimenten heeft een geautomatiseerd en continu proces de voorkeur.
Voor microalgen die bicarbonaat als koolstofbron gebruiken, kunnen continu twee extra groeistatistieken worden gemeten. Fotosynthese verbruikt bicarbonaat en produceert zuurstof. Bicarbonaat verbruik drijft de gemiddelde pH23 op. Een ondergedompelde pH-sonde kan deze verandering meten. Fotosynthetische zuurstofproductie verhoogt de concentratie opgeloste zuurstof (DO) van het medium totdat het medium verzadigd is. Naast verzadiging bestaat zuurstof als bubbels. Zuurstofproductie wordt gemeten met veel verschillende technieken: sondes meten do-concentratie, manometrische apparaten beoordelen de druk van de hoofdruimte, gaschromatografie meet de samenstelling van de headspace en volumetrische sensoren registreren de gasuitstroom 24,25,26,27. Wanneer zuurstof wordt gebruikt als een groei-proxy, moeten kweekvaten volledig worden afgesloten of alleen gasuitstroom toestaan. Voor pH- en zuurstofmetingen moet koolstof worden geleverd in de vorm van bicarbonaat, niet door CO2-spaarming. CO 2-spaarzaamheid verlaagt de gemiddelde pH23 en kan als gas de zuurstofmetingen verstoren. Een voordeel van pH en zuurstof ten opzichte van optische dichtheid is dat de methode niet in het gedrang komt als microalgen klonten vormen. Hoewel indirect, zijn zowel pH als zuurstof effectief in het vergelijken van groei tussen behandelingen.
PBR's die tegenwoordig in gebruik zijn, variëren in complexiteit. Laboratoria kunnen eenvoudige tafelkolven, aangepaste prototypes of in de handel verkrijgbare producten gebruiken. Voor onderzoeksgroepen die willen upgraden van kolven, kunnen de kosten van commerciële PBR's of technische vaardigheden en onderdeelfabricage die nodig zijn om veel prototypes te bouwen een barrière zijn. Dit manuscript is bedoeld om het stapsgewijze ontwerp, de constructie en de werking van laboratorium-PBR's te beschrijven die deze kloof overbruggen. Deze PBR's hebben een aanpasbaar lichtregime en monitoren de groei continu door de volumetrische zuurstofproductie te registreren. Dit ontwerp herbergt drie kweekschepen voor drievoudige replicatie en kan worden gebouwd met matige vaardigheid en gemakkelijk toegankelijke materialen. Deze PBR is een waardevolle aanvulling op een laboratorium dat zijn capaciteit voor microalgenonderzoek wil uitbreiden zonder te investeren in zeer technische of dure producten. Bij de keuze om een PBR te verwerven of te bouwen, moeten onderzoekers rekening houden met de geschiktheid van een ontwerp voor hun cultuuromstandigheden, financiële positie en onderzoeksvragen.
Protocol
1. Bouw van de PBR-stand
- Snijd met een handzaag vijf lengtes van 380 mm en twee lengtes van 200 mm van schuin gegroefd staal. Bevestig samen met bouten en grote hoekbeugels om de basis van een standaard te maken (figuur 1A). Lijm op veiligheidseinddoppen.
- Verbind twee ongesneden (1220 mm) verticale lengtes van schuin gegroefd staal op de basis. Veilig met bouten en metalen hoeksteunen (figuur 1B). Lijm op veiligheidseinddoppen.
- Snijd vier vlakke lengtes van 65 mm van gegroefd staal. Bout deze onder een hoek van 90° op de verticale steunen - bevestig er twee aan elke steun, één 130 mm omhoog vanaf de basis (figuur 1C) en één 60 mm omlaag vanaf de bovenkant.
- Bevestig verticale steunen over hun bovenkant met een horizontale 140 mm lengte van plat gegroefd staal (dwarsbalk) vastgeschroefd aan de achterkant van het frame (figuur 2A).
2. Constructie van de lichtkamer
- Snijd een witte polyvinylchloride (PVC) buis met een diameter van 153 mm tot een lengte van 1070 mm. Snijd de pijp in de lengte doormidden met een lintzaag. Schuur alle randen.
- Gelijkmatig ruimte en midden vier aluminium koellichaamkanalen verticaal samen met de binnenkant van de buis. Bevestig geen kanalen binnen 20 mm van de snijrand van de buis. Zet met kleine bouten de kanalen aan de boven- en onderkant op hun plaats (figuur 2B).
- Bout de helft van de buis aan de standaard met behulp van de horizontale steunen die in stap 1.3 zijn gevormd.
- Leg de reactor neer en herenig de pijphelften door ze aan elkaar te plakken. Centreer het pianoscharnier langs één snijlijn. Traceer de scharniergaten en boor de pijp dienovereenkomstig. Gebruik een klinknagelpistool en klinknagels van gemiddelde lengte om het scharnier aan de pijp te bevestigen.
- Gebruik een klein bungeekoord (zie Materiaaltabel) om de pijp dicht te houden (figuur 1C).
- Raadpleeg een elektricien om de LED-lampjes aan te sluiten en installeer de volgende vier componenten: LED-driver, digitale multiplex (DMX) decoder, DMX-verlichtingscontroller en schakelkast (zie Materiaaltafel). Bevestig alle componenten aan de achterkant van de PBR volgens figuur 2A.
3. Bouw van de flessenplatforms
- Knip platformvormen (figuur 3A) uit hard plastic, bijvoorbeeld polyethyleen met hoge dichtheid (HDPE) (zie Materiaaltabel), met behulp van CNC-frezen (computer numerical control). Maak er drie van elke vorm.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om reserve boven- en onderlagen te snijden. - Plak de onderste en bovenste laag aan elkaar. Markeer en boor vijf kleine gaatjes met een diameter van 6 mm door beide vormen (figuur 3A). Gebruik een grotere boor, breid het oppervlak van deze gaten voorzichtig uit, zodat boutkoppen kunnen worden verzonken (figuur 3B).
- Bout voor elk van de drie platforms twee kleine hoekbeugels op de achterste helft van de buis.
OPMERKING: De afstand tussen de bovenkant van de beugel moet 350 mm zijn. - Centreer elke onderste laag bovenop de beugel. Markeer de locatie van de boorgaten van onder de beugel. Boor twee gaten met een diameter van 6 mm. Gebruik een grotere boor, breid het oppervlak van de gaten voorzichtig uit, zodat bouten kunnen worden verzonken.
- Bout onderste lagen aan hun beugels (figuur 3B-C).
- Snijd vijftien stukken van 12 mm lange 6,35 mm buitendiameter (OD) stijve buizen. Sandwich vijf stukken van de stijve buis tussen elke bovenste en onderste laag. Bevestig lagen en buizen aan elkaar met lange smalle bouten volgens figuur 3B-D.
- Boor een groot gat in de PVC-buis achter elk platform. Plaats elke micromagnetische roerder in het platform. Rijg de elektrische kabel van elke roerder door deze nieuw gesneden gaten (figuur 3C-E). Sluit elke roerder aan op de betreffende besturingseenheid en op een stopcontact.
- Plaats een fles van 1 L op elk platform. Voeg oogbouten toe in de achterpijp op fleshalshoogte. Wikkel een klein bungeekoord om elke flessenhals om stabiliteit toe te voegen (figuur 4A).
OPMERKING: In het hele protocol zijn kleurcoderingsplatforms, flessen, magneetroerders en alle bijbehorende kabels en sensoren nuttig.
4. Constructie van de vloeistofbemonsteringspoorten (optioneel)
- Snijd drie 60 mm lengtes van 6,35 mm OD stijve buizen. Boor met behulp van een boor van 5 mm gaten door elke rubberen stop. Duw stijve buislengtes door de stop.
- Snijd drie 60 mm lengtes van 3,18 mm OD stijve buizen. Verbind deze met een recht verloopstuk op de uitstekende buis aan de onderkant van elke stop.
- Plaats een eenrichtingsstopkraanklep (bijv. poort 1 = vrouwelijke Luer, poort 2 = mannelijke slip Luer) in de uitstekende buis op elk stopoppervlak (figuur 4A).
- Knip drie 30 mm lengtes van 3,18 mm OD flexibele buizen. Plaats Luer-fittingen (bijv. mannelijke Luer naar slanghaak en vrouwelijke Luer naar slanghaak) aan beide uiteinden.
- Sluit de in stap 4.4 gemaakte stukken aan op de stopkraankleppen op het oppervlak van elke rubberen stop (figuur 4A).
OPMERKING: Veel combinaties van stopkranen en Luer fittingen kunnen hetzelfde resultaat opleveren. Het ontwerp moet het mogelijk maken vloeistof uit te trekken of in te brengen via een spuit.
5. Volumetrische gassensoren aansluiten
- Bereid gassensoren voor volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Dit omvat voornamelijk het vullen van gassensoren met verpakkingsvloeistof (figuur 4B). - Om de gasleidingen te maken, snijdt u drie 1000 mm lengtes van 3,18 mm OD flexibele buizen.
- Boor drie gaten met een diameter van 4 mm in de achterste PVC-buis. Plaats gaten naast het scharnier op flessenhalshoogte. Draadgasleidingen door deze gaten (figuur 4A).
- Voeg aan het einde van de gasleiding in de PVC-buis een Luer-fitting toe (bijv. slanghaak aan mannelijke Luer) en sluit een eenrichtingsstopkraanklep aan (bijv. Poort 1 = vrouwelijke Luer, poort 2 = mannelijke Luer).
OPMERKING: De klep is alleen nodig wanneer er ook vloeistofbemonsteringspoorten zijn geïnstalleerd. - Verbind het andere uiteinde van de gasleiding met de inlaatpoort van de gassensor met behulp van een recht verloopstuk. Zet deze verbinding vast met een ritssluiting.
- Sluit alle gassensoren aan op de digitale ingangsmodule (DIM) met jack plug-kabels en de DIM op een computer in de buurt.
- Installeer de software voor gegevensverzameling (zie Materiaaltabel) op een Windows-besturingssysteem en sluit de dongle voor de licentiesleutel aan. Voeg sensorkalibratiebestanden toe aan de kalibratiemap van de software.
6. Programmering van het lichtregime
- Schakel met de aan/uit-schakelaar aan de achterzijde de PBR in en sluit de DMX-verlichtingscontroller aan op een computer via een micro-USB-kabel.
- Download Store Upgrade Tools (SUT) en de LED-besturingssoftware (zie Materiaaltabel). Registreer de DMX-verlichtingscontroller online.
- Open de LED-besturingssoftware en selecteer Klik hier om te werken met de USB-DMX-interface: SUSHI-RB-RJ.
- Selecteer op het tabblad Instellen in het vak ScanLibrary de map Generic en Single Channel. Wijzig scanlibrary-instellingen in DMX-universum 1, het aantal armaturen in 4 en het indexnummer in 1. Wijzig in de rechterbovenhoek de vervolgkeuzelijst in Lijstweergave. Klik ten slotte op Patch (aanvullende figuur 1).
OPMERKING: In het DMX-universum test één vak de besturing van elke LED-strip door de dimmerknoppen te verschuiven of een numerieke waarde in het tekstvak in te voeren. - Maak een standaardcurve die de digitale lichtinstelling in de lichtregelsoftware relateert aan de lichtintensiteit die in het midden van de PVC-buis wordt ervaren (figuur 5). Meet de interne lichtintensiteit met een kleine bolvormige sonde (zie materiaaltabel) die in het midden van de PVC-buis hangt.
- Ga naar het tabblad Editor . Als u een aangepast lichtprogramma wilt maken, maakt u een nieuwe scène en begint u met het toevoegen van stappen. Zie Aanvullende tabel 1 voor een voorbeeld van een dagprogramma van 16:8 uur. Stel de scène in op loop.
OPMERKING: Stappen splitsen scènes op in tijdblokken, die elk kunnen worden ingesteld op verschillende lichtintensiteit. Stappen variëren van 1 s tot 43 min. Hier zijn stappen van 30 minuten het handigst. Meerdere scènes kunnen op één DMX-verlichtingscontrollerapparaat worden geladen. - Maak een extra helperscène die onmiddellijk herkenbaar is, bijvoorbeeld twee van de vier LED's aan.
OPMERKING: Scènes kunnen handmatig worden doorlopen met behulp van de knop aan de zijkant van de DMX-verlichtingscontroller. Als het gewenste lichtprogramma 's nachts begint, is het onmogelijk om te onderscheiden of het lichtprogramma al is gestart. De helperscène dient als een indicator dat de DMX-verlichtingscontroller correct functioneert. - Sla de scènes op en ga naar het tabblad Stand Alone . Schrijf het geheugen van de DMX-verlichtingscontroller en koppel het apparaat los van de computer.
- Sluit de DMX-verlichtingscontroller aan op de voedingsbron via een micro-USB.
- Voordat u een experiment start, test u het lichtprogramma door de interne lichtintensiteit gedurende 24 uur te registreren. Als de vloeistoftemperatuur van belang is, log dit dan gelijktijdig met een ondergedompelde temperatuursonde (figuur 6).
7. Een experiment starten
- Steriliseer media, flessen, roerstaafjes, rubberen stoppers, bemonsteringspoorten, schroefdoppen met schroefopening met schroefdraad en slangen.
OPMERKING: Alle componenten die in dit ontwerp worden gebruikt, zijn autoclaveerbaar, behalve de kleppen en Luer-fittingen - er zijn autoclaveerbare alternatieven van andere fabrikanten. - Open de data-acquisitiesoftware en vul de configuratiepagina in (aanvullende figuur 2). Wijs kalibratiebestanden toe aan hun respectievelijke sensoren.
- Selecteer onder Mapbestandsnaam de bijbehorende dim-poortnummermap. Klik op Huidige map en herhaal voor alle poorten.
- Klik op OK om door te gaan naar de logboekpagina.
- Vul flessen tot het gewenste volume met teeltmedium (aanvullende tabellen 2,3).
OPMERKING: Elk van deze flessen bevat een maximum van ~ 1,1 L met een kleine headspace (~ 80 ml, inclusief de gasleiding). - Centrifugeer de voorraadcultuur in drie gebalanceerde buizen van 50 ml gedurende 15 minuten bij 4500 x g om drie pellets te verkrijgen. Voeg één pellet toe aan elke fles - was in pellets met een serologische pipet en vers medium.
OPMERKING: De cultuurdichtheid van dag 0 wordt ook wel de initiële biomassaconcentratie (IBC) genoemd. Om de IBC in gAFDW te meten. L-1, mag in stap 7.6 een extra buis van 50 ml worden gecentrifugeerd. De resulterende pellet kan vervolgens worden gedroogd enverbrand 15,19. Stap 7.6 zal waarschijnlijk moeten worden aangepast op basis van de individuele doelen van gebruikers en hun experimenten. - Laat een magneetroerder, 25 x 8 mm, in elke fles vallen.
- Sluit elke flesopening af met een rubberen stop en een schroefdop met schroefdraadopening (figuur 4A). Als er optionele bemonsteringspoorten zijn geïnstalleerd, sluit u de kleppen.
- Zoek het uiteinde van elke gasleiding in de PVC-buis (ingebouwd in stap 5.4) en bevestig een naald aan de mannelijke Luer-poort van de klep.
- Sluit elke fles aan op de gassensor door elke rubberen stop met de bijbehorende naald te doorboren.
- Start elke gassensor afzonderlijk door het selectievakje aan de linkerkant van het scherm aan te vinken, op Start te klikken en een bestandsnaam in te voeren. Klik op OK en herhaal voor alle sensoren (aanvullende figuur 3).
OPMERKING: Sluit tijdens het loggen het venster voor gegevensverzameling niet af. Stel de energie- en slaapstandinstellingen van de computer in op nooit en stel computerupdates uit voor de duur van het experiment. - Schakel de PBR in en zorg ervoor dat de DMX-verlichtingscontroller is aangesloten op een voeding. De eerste geprogrammeerde scène wordt automatisch gestart. Raadpleeg stap 6.7 om te controleren of de DMX-verlichtingscontroller correct werkt.
8. Flesbemonstering (optioneel)
- Bereid een extra 500 ml van het verse medium voordat u met het experiment begint (aanvullende tabel 2).
OPMERKING: Als een 24-uurs lichtprogramma met een dagelijkse cyclus van 16:8 uur om 9.00 uur werd gestart, zouden de bemonsteringstijden voor de schemering en zonsopgang om 8.00 uur en 16.00 uur vallen (aanvullende tabel 1). Hier verwijzen zonsopgang en schemering naar stappen van 30 minuten die lichten van AAN naar UIT en vice versa overbrengen. - Sluit de klep op de gasleiding.
- Sluit een spuit (10 ml) aan op de bemonsteringspoortklep (figuur 4A).
- Open de bemonsteringspoortklep en trek 8 ml cultuur op.
OPMERKING: Tussen 5-10 ml wordt aanbevolen. Het verwijderen van vloeistof genereert een vacuüm in de headspace, waardoor volumes > 10 ml moeilijk te extraheren zijn. - Sluit de bemonsteringspoortklep en koppel de spuit los.
- Sluit een spuit met 8 ml vers medium (vanaf stap 8.1) aan op de bemonsteringspoortklep.
- Open de bemonsteringspoortklep en injecteer vers medium.
OPMERKING: Het vervangen van het volume van de bemonsterde cultuur door vers medium dient om een gelijk volume en druk van de headspace te behouden en de bemonsteringspoortleiding te spoelen. - Sluit de bemonsteringspoortklep voordat u de spuit loskoppelt.
- Herhaal stap 8.2 tot en met 8.8 bij elke bemonsteringstijd.
9. Een experiment beëindigen
- Vink alle selectievakjes voor actieve poorten aan in het venster voor gegevensverzameling en klik op Stoppen.
- Als u gegevens wilt exporteren, selecteert u Bestand en offlinegegevens. Selecteer alle relevante logbestanden. Exporteer de gegevens naar spreadsheetsoftware en sla ze op.
- Converteer voor elke fles het totale zuurstofvolume gemeten in ml naar mol met behulp van de ideale gaswet. Voorspel het gewicht van de geteelde biomassa (gAFDW) als 1,05 mol O2 wordt gegenereerd voor elke mol geproduceerde biomassa. Neem het molaire gewicht van biomassa als 24,6 g mol-1.
- Beheer de stroomsnelheidsgegevens handmatig. Gebruik eenheden van ml / h en een 3-punts voortschrijdend gemiddelde.
Representative Results
Hier is de zuurstofstroomsnelheid een maat voor de fotosynthetische snelheid van de cultuur. Hogere snelheden van fotosynthese, en dus koolstoffixatie, vertalen zich in hogere groeisnelheden. Dit betekent dat de gebruiker zuurstofstroomsnelheden tussen verschillende behandelingen en operationele dagen kan vergelijken als een proxy voor groei. In het kort werkt de gassensor door gasbellen in een meetcel met twee kamers op te vangen en vrij te geven (figuur 4B). Gasbellen van de inlaat aan de basis van de sensor reizen omhoog door de verpakkingsvloeistof. Bubbels hopen zich op in één kamer van de meetcel tot een volume van ~ 3,2 ml. Zodra deze drempel is bereikt, worden de meetcelpunten gegeven. Hierdoor komt het gas vrij en wordt het systeem gereset. Elke tip wordt vastgelegd door de data-acquisitiesoftware.
In de voorbeeldgegevens werd de groeisnelheid van drie behandelingen met variërende lichtintensiteiten overdag en initiële biomassaconcentraties (IBC's) vergeleken. Deze behandelingen werden willekeurig gekozen voor demonstratieve doeleinden. Het waren (A) 300 μmolfotonen m-2 s-1 en 0,03 gAFDW L-1, (B) 600 μmolfotonen m-2 s-1 en 0,13 gAFDW L-1, en (C) 600 μmolfotonen m-2 s-1 en 0,40 gAFDW L-1. Deze instralingen werden gemeten met een bolvormige sonde in het midden van de PVC-buis voordat flessen op de platforms werden geplaatst. Cultuurdiepte en -dichtheid beïnvloeden de verzwakking van het licht. Vandaar dat de werkelijke lichtintensiteit die door microalgen wordt ervaren, kan verschillen van de gerapporteerde. Elke behandeling werd uitgevoerd in drievoud - binnen één PBR met drie flessen.
Hier werd een succesvol experiment gekenmerkt door nauw gerepliceerde dagactieve patronen van gasproductie (figuur 7A-C). Tijdens verlichte uren (dag) nam de gasproductie gestaag toe en tijdens niet-verlichte uren (nacht) stopte de gasproductie (figuur 7A-C). Twee gassen worden geproduceerd door microalgen, zuurstof uit fotosynthese en koolstofdioxide uit ademhaling28. Fotosynthese is beperkt tot verlichte uren, terwijl de ademhaling continu plaatsvindt, maar het meest actief is 's nachts28. Fotosynthese bouwt zich op, terwijl ademhaling biomassa kataboliseert28. Aanvankelijk is de samenstelling van headspace gas identiek aan die van de atmosfeer. Bij elke omslag van de meetcel verplaatst O2 atmosferisch gas. Daarom werden gassensormetingen toegeschreven aan de productie van O2, zelfs als het uitgaande gas niet zuiver O2 was. De minimale gasinlaatdruk voor de gassensor is extreem laag, 8-9 mbar, waardoor de druk van de kopruimte van de fles slechts iets boven de atmosfeer ligt (1,01 bar op zeeniveau). Vandaar dat de metingen van de gassensor beginnen kort nadat O2-bellen het medium hebben verlaten.
CO2 die vrijkomt bij de ademhaling draagt om twee redenen niet bij aan de metingen van gassensoren. Ten eerste reageert CO2 in het alkalische medium op bicarbonaat, waardoor de pH afneemt (figuur 8). Ten tweede, als CO2 ontsnapt, lost de gassensorverpakkingsvloeistof, Silox, CO2-bellen op voordat ze de meetcel kunnen bereiken, waardoor CO2 aan het vloeistofoppervlak wordt ontgast29. Dit wordt ondersteund door het ontbreken van nachtelijke gassensormetingen. Degenen die wel optraden, werden geregistreerd kort nadat de lichten waren uitgeschakeld, wat aangeeft dat de metingen de resterende zuurstofafgifte overdag vertegenwoordigden (figuur 7).
In de experimentele opstelling (met behulp van lokale temperatuur- en drukgegevens) had een kopruimte van 80 ml bij omgevingsdruk 340 ml exsolved O2 nodig om een O2 partiële druk van 99% vast te stellen. Hier varieerde het totale zuurstofvolume geproduceerd gedurende 4 dagen van 316 (SEM ± 11) ml in behandeling A tot 902 (SEM ± 51) ml in behandeling C (tabel 1). Daarom zou tegen het einde van het experiment de headspace van alle flessen voornamelijk O2 bevatten. De verhoogde concentratie van headspace O2, en dus de verlaagde concentratie van N2, zou de partiële druk en verzadiging van deze gassen hebben beïnvloed. Met een 99% O2 headspace werd een 5x toename in DO berekend. Voor de 1,1 L-culturen vertaalde dit zich in een extra 23 ml DO. Omgekeerd werd geschat dat de verschuiving naar een N 2-hoofdruimte van 1% ervoor zou hebben gezorgd dat 15 ml N2 zou zijn verdwenen. Dit betekent dat onder een bijna zuivere zuurstofkopruimte meer O2 opgelost was dan N2 werd verplaatst. Omdat er dus meer O2 in het medium overblijft, zou dit effect hebben geleid tot lichte onderschattingen van de hoeveelheid geproduceerde fotosynthetische zuurstof.
De belangrijkste uitdaging van deze methode ontstond toen culturen dicht werden. Met meer biomassa, en dus meer ademhaling, nam de vraag naar O2 toe. Het nachtelijke O2-verbruik genereerde een hoofdruimte onder druk. Dit zorgde ervoor dat gassensorverpakkingsvloeistof door de gasleiding omhoog reisde. Toen de productie van O2 werd hervat, moest verpakkingsvloeistof terug in de gassensoren worden gereden. Dit veroorzaakte een vertraging in de eerste gassensormeting. Op de vierde nacht zorgde de omvang van deze onderdruk er echter voor dat verpakkingsvloeistof twee van de drie replica's van behandeling B bereikte en indruppelde, waardoor een oppervlakteolievlek ontstond. Door het verlaagde vloeistofniveau van de pakking zijn de gassensoren kortgesloten, waardoor ongemeten O2 rechtstreeks in de atmosfeer wordt vrijgegeven. Hierdoor werd de gegevensverzameling afgevlakt (figuur 7B).
Onderdruk kan ook worden veroorzaakt door een temperatuurgeïnduceerde samentrekking van het headspace-volume. Het effect was hier echter minimaal. Koellichaamkanalen en luchtstroom voerden overtollige warmte voldoende af. Van de twee geteste lichtregimes verminderde de maximale temperatuurverandering het volume van de headspace met 1% of minder, wat overeenkomt met een verplaatsing van 800 μL verpakkingsvloeistof in een headspace van 80 ml. De maximale dagelijkse temperatuurschommeling was 1,4 °C voor de 300 μmolfotonen m-2 s-1 regimes (figuur 6) en 3,2 °C voor de 600 μmolfotonen m-2 s-1 regimes. De gemiddelde temperatuurstijging overdag voor de 300 en 600 μmolfotonen m-2 s-1 regimes was respectievelijk 0,7 en 1,8 °C. De cultuurtemperaturen keerden 's nachts terug naar de basislijn (figuur 6).
Gegevens over de groeisnelheid met een hoge resolutie kunnen trends onthullen die anders onopgemerkt zouden kunnen blijven. Denk aan behandelingen B en C. Ondanks hun verschillende IBC's genereerden beide dezelfde hoeveelheid totale biomassa (gAFDW), wat een identieke verschuiving in de gemiddelde pH veroorzaakte (tabel 1). Gegeven alleen start- en eindgegevenspunten, kan een individu terecht aannemen dat er geen verschil is in de gemiddelde groeisnelheid tussen de twee behandelingen (tabel 1). Uit online zuurstofstroomgegevens bleek echter dat elke behandeling verschillende dagelijkse groeisnelheden had. Deze variaties kwamen ook tot uiting in tweemaal daagse pH-metingen (figuur 8). Op de eerste dag was de groeisnelheid van behandeling B lager dan die van behandeling C. Op dag drie keerde dit om met de groeisnelheid van behandeling B die die van behandeling C overtrof (figuur 7B,C). Gegevens over het zuurstofdebiet gaven aan dat de hoogste groeisnelheid optrad op dag drie bij behandeling B (figuur 7B).
Het totale zuurstofvolume dat door elke fles in de drie behandelingen werd gegenereerd, werd gebruikt om hun respectieve verandering in totale biomassa (gAFDW) te schatten. Dit werd bereikt met behulp van een generieke vergelijking voor fotosynthetische biomassasynthese: CO2 + 0,2 NH3 + 0,6 H2O = CH1,8 O0,5 N0,2 + 1,05 O2. De toename van de headspace O2 partiële druk en de daaropvolgende stijging van de DO-verzadiging zouden naar verwachting een lichte onderschatting van de biomassagroei veroorzaken. Dit gold voor vijf van de zeven voorbeelden (tabel 2). Gemiddeld lag de geschatte biomassagroei binnen 10% van de gemeten biomassagroei. Sommige schattingen verschilden slechts 1-3 mg van de gemeten groei. Twee voorbeelden overschatten de groei, d.w.z. er werd meer zuurstof geproduceerd dan de biomassagroei kon verklaren. Elke O2 die 's nachts door ademhaling wordt geconsumeerd, moet de volgende dag worden weerspiegeld in de vertraging in de O2-productie . Hier werden experimenten aan het einde van de nacht beëindigd. Op deze manier wordt nachtelijk biomassakatabolisme tijdens de laatste 8 uur van elk experiment niet gemeten. Dit kan leiden tot overschattingen van de groei van biomassa, vooral in dichte culturen. Als zodanig wordt aanbevolen dat experimenten aan het einde van verlichte uren worden beëindigd.
Figuur 1: Reactorstandaardbasis. (A) Afmetingen van basiscomponenten in mm. (B) Oriëntatie van metalen hoeksteunen die de twee verticale steunen beveiligen. (C) Een van de vier korte staallengtes verbindt de achterste helft van de PVC-buis met de reactorstandaard. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Elektrische componenten. (A) Achteruitkijkspiegel van de PBR met bovenbalk en configuratie van elektrische componenten. (B) Vooraanzicht van PBR na installatie bij licht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Details van het flessenplatform. (A) Afmetingen van de bovenste en onderste laag in mm. (B) Uitsparing van boutkoppen in beide lagen. (C) Beugels verbinden de onderste laag rechtstreeks met de achterste helft van de PVC-buis. (D) Vijf korte stukken stijve buizen die over smalle bouten zijn aangebracht, houden de bovenste en onderste lagen uit elkaar. (E) Wanneer het flessenplatform compleet is, moet het oppervlak vlak zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gasleiding en optionele bemonsteringspoort. (A) Gasleidingen verbinden elke fleskopruimte met externe gassensoren. Als de bemonsteringspoort vereist is, moeten gasleidingen een eenrichtingsklep direct na de naald bevatten. (B) Volumetrische gassensor. Het vloeistofverpakkingsniveau moet de traceerschroef raken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Standaardcurve met betrekking tot led-besturingssoftware-instellingen voor interne lichtintensiteit. Witte cirkels en grijze driehoeken vertegenwoordigen elk een individuele PBR. Voor elke lichtinstelling werden alle vier de armaturen op een identieke waarde ingesteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Cultuurtemperatuurverandering voor de 300 μmolfotonen m-2 s-1 lichtregimes. Tijdens het dagprogramma van 24 uur, 16:8 uur verhoogden LED's de dagcultuurtemperatuur. De blauwe pijl geeft het verschil aan tussen de minimum- en maximumtemperatuur. Een lichte programmafout veroorzaakte de temperatuurdip voor de schemering; dit werd gecorrigeerd voordat het experiment begon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Zuurstofproductie voor drie unieke experimentele omstandigheden. Elke reactor kreeg een andere combinatie van lichtintensiteit en initiële biomassaconcentratie (IBC); (A) 300 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC 0,03 gAFDW L-1, (B) 600 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC 0,13 gAFDW L-1, (C) 600 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC 0,40 gAFDW L-1. Topgrafieken tonen de cumulatieve zuurstofproductie (ml) en het gasdebiet (ml / h). Effen zwarte lijnen, onderbroken blauwe lijnen en gestippelde rode lijnen zijn replicaties. De looptijd voor elk experiment was 104 uur, inclusief vier volledige dag-nachtcycli van 16:8 uur. Donkeroranje schaduw staat voor nachtelijke uren en lichtoranje overdag. Merk op dat bij behandeling B de zuurstofproductie op dag 4 voor twee van de drie repliceert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: pH-respons. Elke reactor kreeg een andere combinatie van lichtintensiteit en IBC; (groene diamanten) 300 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC 0,03 gAFDW L-1, (rode driehoeken) 600 μmolfotonen m2 s-1 en IBC 0,13 gAFDW L-1, (paarse cirkels) 600 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC 0,40 gAFDW L-1 . Donkeroranje schaduw staat voor nachtelijke uren en lichtoranje overdag. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Behandeling | Lichtintensiteit (μmol fotonen m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | Δ totale biomassa (gAFDW) | Δ pH | Totaal geproduceerde zuurstof (ml) |
| Een | 300 | 0.031 | 0,289 (± 0,01) | 0,15 (± 0,01) | 316,2 (±11,4) |
| B | 600 | 0.130 | 0,674 (± 0,02) | 0,52 (± 0,27) | 834.6* |
| C | 600 | 0.400 | 0,675 (± 0,02) | 0,55 (± 0,03) | 902,2 (±50,5) |
| * Slechts één van de drie replica's was succesvol | |||||
Tabel 1: Groeimetrische verschuiving van uur 0 naar 104. Haakjes vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde.
| Behandeling | Lichtintensiteit (μmolfotonen m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | Biomassagroei gemeten (gAFDW) | Biomassagroei voorspeld (gAFDW) | Onderschatten (%) |
| Een | 300 | 0.031 | 0.289 | 0.288 | 0.5 |
| Een | 300 | 0.031 | 0.311 | 0.270 | 13.1 |
| Een | 300 | 0.031 | 0.268 | 0.247 | 7.9 |
| B | 600 | 0.13 | 0.708 | 0.705 | 0.4 |
| C | 600 | 0.4 | 0.718 | 0.796 | -10.9 |
| C | 600 | 0.4 | 0.640 | 0.830 | -29.7 |
| C | 600 | 0.4 | 0.668 | 0.659 | 1.3 |
Tabel 2: Groeischattingen op basis van totaal gemeten zuurstof. Slechts één replica van de 300 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC = 0,13 gAFDW L-1 behandeling liep tot voltooiing.
Aanvullende figuur 1: Screenshot van LED-besturingssoftware. Elk van de vier verlichtingsarmaturen kan onafhankelijk van elkaar worden bediend door de dimmerknoppen te verschuiven of een numerieke waarde in het tekstvak in te voeren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Schermafbeelding van het configuratievenster van de software voor gegevensverzameling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Schermafbeelding van het logboekvenster van de data-acquisitiesoftware. Heldergroene rechthoeken geven online gassensoren aan. Gegevens worden in realtime weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Voorbeeld 24 uur lichtregime. Voor een dagprogramma van 16:8 uur zijn er 48 sets van elk 30 minuten. Sterretjes geven de voorgestelde bemonsteringstijden aan. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Hoge alkaliteit hoge pH-gemiddelde samenstelling. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 3: Trace element oplossing. Voeg toe aan een eindconcentratie van 1 ml/l aan het basismedium. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Binnen dit protocol verhoogt de focus op de volgende stappen de kans op het genereren van reproduceerbare, hoogwaardige gegevens. Bij de bouw van de reactorstandaard (stap 1) moet de basis stevig zijn met goed gealigneerde verticale steunen. Sleufstaal heeft scherpe randen, dus de toevoeging van veiligheidskappen is essentieel. De oppervlakken van het flesplatform moeten volledig vlak zijn, de magneetroerder en boutkoppen moeten beide onder het oppervlak van de bovenste laag zitten (stappen 3.2-3.6). Volgens de instructies van de fabrikant moet de verpakkingsvloeistof van de gassensor worden gevuld met de "traceerschroef voor vloeistofniveau" voor nauwkeurige zuurstofmetingen. Dit vloeistofniveau moet regelmatig worden gecontroleerd, omdat verdamping van de verpakkingsvloeistof de meetcel kan kortsluiten. Alle drie de gasleidingen die in stap 5.2 zijn gemaakt, moeten dezelfde lengte hebben; deze enures die repliceren hebben identieke headspace volumes. Voordat u met een experiment begint, is het raadzaam om het geprogrammeerde lichtregime te testen door de lichtintensiteit gedurende een periode van 24 uur te registreren (stap 6.11). Als de stijging van de vloeistoftemperatuur zorgwekkend is, moet deze test ook een verzegelde fles met een interne temperatuursonde omvatten (stap 6.11). Sluit bij het loggen het venster met software voor gegevensverzameling niet af. hiermee wordt de logboekregistratie beëindigd. Als u kweekmonsters neemt, moet u oppassen dat u geen headspace-gas vrijgeeft door kleppen in de verkeerde volgorde te openen (stappen 8.2-8.8). Houd er bij het beoordelen van experimentele gegevens rekening mee dat de data-acquisitiesoftware automatisch een voortschrijdend gemiddelde van het debiet genereert. Dit verhoogt de waarde van de één of twee stroomsnelheidsmetingen die 's nachts worden gegenereerd. Beheer gassensorlogboeken handmatig om dit te verhelpen.
De meest voorkomende tegenslag bij deze methode is het potentieel om de gassensor kort te sluiten als het vloeistofverpakkingsniveau daalt. Er zijn twee manieren waarop dit kan gebeuren. Ten eerste kan verdamping het vloeistofniveau langzaam verlagen. Dit is echter onwaarschijnlijk tijdens een kortlopend (<7 dagen) experiment29. Ten tweede kunnen hoge ademhalingssnelheden zuurstof in de oplossing trekken en een hoofdruimte onder druk genereren. Wanneer lichtenergie niet beschikbaar is, gebruiken microalgen aerobe ademhaling om de energie te leveren die nodig is voor cellulair onderhoud en reparatie28. Vandaar dat in dichte culturen tijdens niet-verlichte uren het zuurstofverbruik en de daaruit voortvloeiende onderdruk aanzienlijk kan zijn. Dit zuigt verpakkingsvloeistof van de gassensoren in de gasleiding. De afstand die de verpakkingsvloeistof aflegt is evenredig met de hoeveelheid nachtelijke ademhaling. Als de verpakkingsvloeistof in de flessen komt, genereert dit een olievlek op het vloeistofoppervlak.
Als hoge nachtelijke ademhalingssnelheden worden verwacht, kunnen wijzigingen in het protocol worden aangebracht. De eenvoudigste manier om onderdruk te voorkomen, is door de kopruimtes van de fles 's nachts open te laten. Dit heeft ook het voordeel dat de DO-niveaus worden verlaagd door de partiële hoofdruimtedruk van O2 te verlagen. Hoge DO-concentraties worden verondersteld schadelijk te zijn voor de groei, omdat O2 de activiteit van Rubisco kan belemmeren en oxidatieve stress kan veroorzaken30,31. Het is niet ongebruikelijk dat kweeksuspensies 4x oververzadiging bereiken, zelfs wanneer ze in contact komen met de atmosfeer25,32. Om de headspace te openen, koppelt u de gasleiding los van de naald die de rubberen stop bedekt. Nachtelijke uren kunnen dienen als een venster om gassensorverpakkingsvloeistof bij te vullen of continue experimenten te manipuleren met weinig impact op gegevensverzameling. Men kan bijvoorbeeld de cultuurdichtheid veranderen, voedingsstoffen verversen, een wijziging toevoegen of een pathogeen introduceren. Flessen moeten opnieuw worden verzegeld en de gassensorleiding moet opnieuw worden aangesloten voordat de lichten weer aangaan. De zuurstofmetingen verzameld uit experimenten met gesloten versus open nachtelijke headspaces zullen verschillen.
Wanneer flessen verzegeld blijven, vermindert het nachtelijke zuurstofverbruik het aantal mol O2 in de hoofdruimte. Dit zorgt ervoor dat verpakkingsvloeistof de gassensorleiding omhoog kruipt om de druk van de hoofdruimte te behouden. Wanneer de lichten aangaan, wordt de zuurstofproductie hervat. Verpakkingsvloeistof moet terug in de gassensor worden geduwd voordat de metingen van het debiet beginnen. Deze vertraging is dus evenredig met de mate van nachtelijke ademhaling. Op deze manier, wanneer de headspace gesloten blijft, vertegenwoordigen O2-metingen de netto O2-productie (fotosynthetische productie - respiratoire consumptie). Omgekeerd, wanneer de headspace 's nachts open is, vervangt atmosferisch gas wat headspace O2 wordt verbruikt en komt er geen verpakkingsvloeistof in de gasleiding. Het resultaat is dat het verbruik van respiratoir O2 niet wordt meegenomen in de O2-productiegegevens . Dit kan de nauwkeurigheid van afdw biomassagroei schattingen verminderen. Het zou echter geen invloed moeten hebben op het nut van het gebruik van O2-productie overdag als een maatstaf om de groei tussen behandelingen te vergelijken.
Alle laboratorium-PBR's lijden aan dezelfde beperking; kunstlicht kan het zonnespectrum niet nabootsen. Microalgen gebruiken golflengten van licht tussen 400-700 nm voor fotosynthese. Dit gebied wordt fotosynthetisch actieve straling (PAR)33 genoemd. Zonlicht en kunstlicht variëren in hun relatieve bijdrage van golflengten binnen dit bereik. Dit, naast gunstige temperaturen en een constante lichttoevoer, betekent dat laboratoriumgroeigegevens vaak niet betrouwbaar kunnen worden geëxtrapoleerd naar buitenomstandigheden. Deze PBR's kunnen echter een van de beperkingen van de PBR-lichtvoorziening in het laboratorium aanpakken. De intensiteit van het zonlicht is gedurende de dag zeer variabel, waarbij bewolking voorbijgaande schommelingen in incidentele PAR genereert. De lichtregelsoftware en DMX-verlichtingscontroller kunnen lichtintensiteiten bieden van 0 tot 2400 μmolfotonen m-2 s-1 en hoger. Lichtregimes kunnen worden onderverdeeld in individuele stappen zo kort als 1 s. Door de instelbare lichtintensiteit kan de gebruiker buitenlichtpatronen beter nabootsen dan standaard PBR-opstellingen. Hier vervagen gesimuleerde 30 minuten dag- en schemeringsintervallen dag en nacht samen (aanvullende tabel 1).
Hoewel afdw-dichtheid de standaardmaat voor groei is geworden, kan deze methode aanzienlijke kweekvolumes vereisen, een verwerkingsperiode van 2-3 dagen, en genereert één gegevenspunt tegelijk. Verder, als de omstandigheden ongunstig worden en cellen sterven, maakt de AFDW-dichtheid geen onderscheid tussen actief fotosynthetiserende cellen en cellen die ontbinden. Het kwantificeren van de snelheid van fotosynthetische zuurstofproductie dient als een alternatieve groeiproxy. Dit PBR-ontwerp kan de zuurstofproductie continu registreren met weinig tussenkomst van de gebruiker, terwijl het kweekvolume wordt behouden. De gegevensresolutie kan worden verbeterd door een gassensor te selecteren met een lager meetcelvolume, bijvoorbeeld 1 ml. Verder, als culturen goed gemengd zijn, kunnen gebruikers besluiten om een spectrofotometer te installeren voor continue optische dichtheidsmetingen. Indien temperatuurregeling van het medium gewenst is, kan een recirculerende koelmachine worden toegevoegd. Deze PBR's zijn een waardevolle aanvulling op een laboratorium dat zijn microalgenonderzoekscapaciteit wil uitbreiden zonder zware financiële investeringen. Ze zijn vooral geschikt voor mensen die werken met een hoge alkaliteit, hoge pH-soorten zoals Spirulina. Deze PBR's bieden flexibiliteit in het lichtregime en zijn geldig voor snelle, gerepliceerde laboratoriumgroeivergelijkingen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC), Canada Foundation for Innovation (CFI), Canada First Research Excellence Fund (CFREF), Alberta Innovates, General Sir John Monash Foundation, de regering van Alberta en de Universiteit van Calgary. Dank gaat uit naar Mark Toonen voor het elektrische werk en William Richardson voor oplosbaarheidsberekeningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum channels Imperial: 0.90” x 39.37” Metric: 2.3 cm x 100 cm Quantity: 4 |
LED World | AC-AR1-1M | Required as a heat sink |
| Bungee cords, small Quantity: 5 |
- | - | To secure bottles |
| Computer - desktop/laptop Quantity: 1 |
- | - | - |
| Data Logger, HOBO U30 USB Weather Station Quantity: 1 |
HOBO, Hoskin | U30-NRC-VIA-10-S100-000 | Records light sensor information |
| Digital interface module, Rigamo, 4-channel Quantity: 1 |
Ritter | N/A | This is to transmit gas sensor data to the computer |
| DMX decoder, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A Quantity: 1 |
LITECH, LED World | LT-840-6A | Transmit messages which alter the light pattern |
| DMX lighting controller, SUSHI-RB-RJ Quantity: 1 |
Arcolis, Nicolaudie America Inc. | SUSHI-RB-RJ DMX | Encodes the lighting program |
| Gas sensor packing liquid (Silox) Quantity: 1 L |
Ritter | https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox | |
| Gas sensor, volumetric Quantity: 3 |
Ritter | MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en) | Measures oxygen production |
| Glass bottles, round 1 L with GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-1L | Culture vessels |
| Hardware - end caps for slotted steel Quantity: 10 |
Paulin, Home Depot | 142-612 | To cover sharp edges of slotted steel |
| Hardware - eye hooks Quantity: 6 |
- | - | To secure bottles |
| Hardware - metal corner braces (large) Imperial: 4" x 4" Metric: 10 cm x 10 cm Quantity: 8 |
- | - | Larger brackets to construct metal stand |
| Hardware - metal corner braces (small) Imperial: 2 1/2" x 2 1/2" Metric: 6.4 cm x 6.4 cm Quantity: 6 |
- | - | Small brackets to connect bottle platforms to PVC pipe |
| Hardware - metal corner gussets Imperial: 3" x 3" Metric: 7.6 cm x 7.6 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-616 | Flat brackets to construct metal stand |
| Hardware - piano hinge Imperial: 36" Metric: 91 cm Quantity: 1 |
- | - | Connects two halves of PVC pipe |
| Hardware - rivets Quantity: 40 |
- | - | To attach piano hinge to PVC tubing |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 60 |
- | - | Long thin bolts are required to secure bottle platforms around magentic stirrers |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 30 |
- | - | Larger shorter bolts are required to build the metal stand |
| LED driver, constant voltage, 96W 24VDC UL Listed IP65 Driver Class 2 regulated power supply Quantity: 1 |
Magnitude Lighting, LED World | CVN96L24DC | Regulates power to the lights |
| LED lights, Cinco Bright LED Flex Strip Quantity: 4 m roll |
EvenBright, LED World | FA128M57-4M-24V-X | Roll is trimmed into 4 x 1 m lengths and secured inside the PVC tube |
| Light meter, handheld with submersible sperical probe Quantity: 1 |
LI-COR | LA-250A | Calibrate the reactors light intensity |
| Light sensors Photosynthetic Light (PAR) Smart Sensor Quantity: 2 |
HOBO, Hoskin | S-LIA-M003 | Only one is required however two would be good practice in case one malfunctioned |
| Magnetic stirrers (MIXdrive 1 XS) with external control units and power supply (MIXcontrol eco) Quantity: 3 |
2Mag, 2MAG USA | MF 40300 | Stirrers sit sandwiched in bottle platforms |
| Metal plate Imperial: 24" x 8" Metric: 61 cm x 20.3 cm Quantity: 1 |
- | - | This is a surface on which to secure electronics, it is attached to the back of the reactor |
| Pipe, white PVC Imperial: 6" diameter x 42" high Metric: 15.2 cm x 106.7 cm Quantity: 1 |
- | - | Cut lengthwise in two halves, used to house lights and bottles |
| Plastic (HDPE) sheets Imperial: 4" x 4" x 1/4" Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm Quantity: 6 |
Inventables | 30291-01 | For bottle platforms which house magentic stirrers |
| Rubber stoppers - GL45 size Quantity: 3 |
Duran, VWR | 76289-760 | Seals culture vessels |
| Screw caps - with aperture and GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-45HTSC | Generates seal of culture vessels |
| Slotted angle steel lengths Imperial: 1-1/2" X 48" x 0.074" Metric: 3.8 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-202 | Makes up the body of the metal stand |
| Slotted flat steel lenghts Imperial: 1-3/8" x 48" x 0.074" Metric: 3.5 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 3 |
Paulin, Home Depot | 142-222 | Makes up the body of the metal stand |
| Software - Easy Stand Alone (ESA) | https://www.dmxsoft.com/#apps | AKA LED control software | |
| Software - Rigamo v3.1 | AKA data acquisition software | ||
| Software - Storage Upgrade Tools (SUT) | https://store.dmxsoft.com// | ||
| Stir bar Imperial: 1" x 5/16" Metric: 2.5 cm x 0.8 cm Quantity: 3 |
Fisherbrand | 14-513-59 | Stirs culture |
| Switch box Quantity: 1 |
- | - | Turns power on/off to reactor |
| Syringe, 10 mL Quantity: Multiple |
- | - | Optional if you wish to extract culture |
| Tube adaptor fittings, plastic - Stopcock 1-way Quantity: 6 |
Masterflex, Cole Palmer | RK-12023-33 | Close/open culture vessel line |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of male and female luer lock fittings Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of straight connectors Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-40616-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantity: 4 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-02 | Line from culture vessel to gas sensor |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 2 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-05 | Gas sensor standard tubing size |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantiy: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-27 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-30 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Zip ties, small Quantity: 1 packet |
Secure tube fittings |
References
- Benemann, J. R. Opportunities and challenges in algae biofuels production. A position paper in line with Algae World. , (2008).
- Laurens, L. M. L. State of technology review - algae bioenergy. An IEA bioenergy inter-task strategic project. IEA Bioenergy. , (2017).
- Robertson, D. E., et al. A new dawn for industrial photosynthesis. Photosynthesis Research. 107, 269-277 (2011).
- Troschl, C., Meixner, K., Drosg, B. Cyanobacterial PHA production-review of recent advances and a summary of three years' working experience running a pilot plant. Bioengineering. 4 (2), (2017).
- Rizwan, M., Mujtaba, G., Memon, S. A., Lee, K., Rashid, N. Exploring the potential of microalgae for new biotechnology applications and beyond: a review. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 92, 394-404 (2018).
- Niesa, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
- Laurens, L. M. L., Chen-Glasser, M., McMillan, J. D. A perspective on renewable bioenergy from photosynthetic algae as feedstock for biofuels and bioproducts. Algal Research. 24, 261-264 (2017).
- Barreiro-Vescovo, S., Barbera, E., Bertucco, A., Sforza, E. Integration of microalgae cultivation in a biogas production process from organic municipal solid waste: From laboratory to pilot scale. ChemEngineering. 4 (2), 26 (2020).
- Zurano, A. S., et al. Year-long assessment of a pilot-scale thin-layer reactor for microalgae wastewater treatment. Variation in the microalgae-bacteria consortium and the impact of environmental conditions. Algal Research. 50, (2020).
- Deprá, M. C., Severo, I. A., Dias, R. R., Zepka, L. Q., Jacob-Lopes, E. Photobioreactor design for microalgae culture. Microalgae. , Elsevier. 35-61 (2021).
- Osburn, F. S., Wagner, N. D., Scott, J. T. Biological stoichiometry and growth dynamics of a diazotrophic cyanobacteria in nitrogen sufficient and deficient conditions. Harmful Algae. 103, (2021).
- Eustance, E., Badvipour, S., Wray, J. T., Sommerfeld, M. R. Biomass productivity of two Scenedesmus strains cultivated semi-continuously in outdoor raceway ponds and flat-panel photobioreactors. Journal of Applied Phycology. 28 (3), 1471-1483 (2016).
- Qiang, H., Richmond, A., Zarmi, Y. Combined effects of light intensity, light-path and culture density on output rate of spirulina platensis (cyanobacteria). European Journal of Phycology. 33 (2), 165-171 (1998).
- Ooms, M. D., Dinh, C. T., Sargent, E. H., Sinton, D. Photon management for augmented photosynthesis. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
- Moheimani, N. R., Borowitzka, M. A., Isdepsky, A., Sing, S. F. Standard methods for measuring growth of algae and their composition. Algae for biofuels and energy. , Springer. Dordrecht. 265-284 (2013).
- Griffiths, M. J., Garcin, C., van Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density. Journal of Microbiological Methods. 85 (2), 119-123 (2011).
- Schumann, R., Häubner, N., Klausch, S., Karsten, U. Chlorophyll extraction methods for the quantification of green microalgae colonizing building facades. International Biodeterioration and Biodegradation. 55 (3), 213-222 (2005).
- Pinckney, J. L., Richardson, T. L., Millie, D. F., Paerl, H. W. Application of photopigment biomarkers for quantifying microalgal community composition and in situ growth rates. Organic Geochemistry. 32 (4), 585-595 (2001).
- Van Wychen, S., Laurens, L. M. L. Determination of total solids and ash in algal biomass: laboratory analytical procedure (LAP). National Renewable Energy Laboratory. , Golden, CO. (2015).
- Davis, R., Laurens, L. Algal biomass production via open pond algae farm cultivation: 2019 state of technology and future research. National Renewable Energy Laboratory. , Golden, CO. (2020).
- Borovkov, A. B., Gudvilovich, I. N., Avsiyan, A. L. Scale-up of Dunaliella salina cultivation: from strain selection to open ponds. Journal of Applied Phycology. 32 (3), 1545-1558 (2020).
- Davies, F. K., et al. Microbiota associated with the large-scale outdoor cultivation of the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Algal Research. 58, (2021).
- Ataeian, M., et al. Direct capture and conversion of CO2 from air by growing a cyanobacterial consortium at pH up to 11.2. Biotechnology and Bioengineering. 116 (7), 1604-1611 (2019).
- Fu, F., et al. Sustained photosynthesis and oxygen generation of microalgae-embedded silk fibroin hydrogels. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
- Rearte, T. A., et al. Photosynthetic performance of Chlorella vulgaris R117 mass culture is moderated by diurnal oxygen gradients in an outdoor thin layer cascade. Algal Research. 54, (2021).
- Poughon, L., et al. Limnospira indica PCC8005 growth in photobioreactor: model and simulation of the ISS and ground experiments. Life Sciences in Space Research. 25, 53-65 (2020).
- Yen, U. C., Huang, T. C., Yen, T. C. Observation of the circadian photosynthetic rhythm in cyanobacteria with a dissolved-oxygen meter. Plant Science. 166 (4), 949-952 (2004).
- Vermaas, W. F.
- Ritter, MilliGascounter Type MGC-1 Operation Instructions V 3.4. , (2017).
- Sousa, C., De Winter, L., Janssen, M., Vermuë, M. H., Wijffels, R. H. Growth of the microalgae Neochloris oleoabundans at high partial oxygen pressures and sub-saturating light intensity. Bioresource Technology. 104, 565-570 (2012).
- Latifi, A., Ruiz, M., Zhang, C. C.
- Morillas-España, A., Lafarga, T., Gómez-Serrano, C., Acién-Fernández, F. G., González-López, C. V. Year-long production of Scenedesmus almeriensis in pilot-scale raceway and thin-layer cascade photobioreactors. Algal Research. 51, (2020).
- Melis, A. Solar energy conversion efficiencies in photosynthesis: minimizing the chlorophyll antennae to maximize efficiency. Plant Science. 177 (4), 272-280 (2009).
