Summary
Diese Veröffentlichung beschreibt das Design von Labor-Photobioreaktoren (PBRs) mit anpassbaren Lichtregimen. Das Wachstum von Cyanobakterien oder Mikroalgen, die Bicarbonat als Kohlenstoffquelle verwenden, wird kontinuierlich überwacht, indem die volumetrische Sauerstoffproduktion gemessen wird. Diese PBRs ermöglichen schnelle, replizierte Laborwachstumsvergleiche mit wenig Benutzereingriffen während der Experimente.
Abstract
Die Laboruntersuchung von Mikroalgen kann experimentell herausfordernd sein. Neben den Kultivierungsanforderungen von nicht-photosynthetischen Mikroorganismen benötigen Phototrophe auch eine Beleuchtung. Routinemäßig versuchen Forscher, maßgeschneiderte Lichtlieferungen bereitzustellen, d.h. die Lichtintensität und die Zeit, über die es geliefert wird, zu variieren. Eine solche Flexibilität ist bei Standard-Tischleuchten schwierig. In der Regel erfordern Kultivierungsstudien auch Wachstumsvergleiche zwischen experimentellen Behandlungen. Häufig wird das Wachstum über einen längeren Zeitraum bewertet, z. B. mehrmals täglich über eine einwöchige Studie. Manuelle Messungen können zeitaufwändig sein und es fehlt an Datenauflösung. Daher sind Photobioreaktoren (PBRs) mit automatischer Wachstumsüberwachung und anpassbarer Lichtversorgung nützlich für replizierte Experimente mit mehreren Behandlungen. Die aktuelle Arbeit stellt die Planung, den Bau und den Betrieb von Labor-PBRs vor. Die Materialien sind leicht zu beschaffen und relativ kostengünstig. Das Design konnte mit mäßigem Geschick dupliziert werden. Jede Struktur hat eine Grundfläche von ~ 40 cm2 und beherbergt drei 1-L-Glasflaschen für die dreifache Replikation. Die Flaschen ruhen auf Plattformen mit Magnetrührern und sind vertikal in einem 1 m hohen Polyvinylchlorid (PVC)-Rohr mit einem Durchmesser von 15 cm angeordnet. Der Rohrinnenraum ist mit Leuchtdioden (LEDs) ausgekleidet. Diese LEDs erzeugen kontinuierliche Lichtintensitäten von 0–2400 μmol Photonen m-2 s-1 photosynthetisch aktiver Strahlung (PAR). Benutzer entwerfen ein benutzerdefiniertes Beleuchtungsprogramm. Die Lichtintensität kann sekundengenau eingestellt oder über längere Zeit konstant gehalten werden. Der bei der Photosynthese erzeugte Sauerstoff verlässt jede Flasche über einen Einweg-Volumengassensor. Software wird verwendet, um Gassensordaten aufzuzeichnen. Die Menge an produziertem Sauerstoff kann mit dem Wachstum der Biomasse korreliert werden. Wenn Biomasseproben benötigt werden, kann eine Spritze zur Extraktion der Kultur verwendet werden. Die Methode eignet sich für Mikroalgen, die mit Bicarbonat als Kohlenstoffquelle gezüchtet werden. Diese PBRs sind wertvoll für ein Labor, das replizierte Experimente, Flexibilität des Lichtregimes und kontinuierliche hochauflösende Wachstumsdaten benötigt.
Introduction
Mikroalgen und Cyanobakterien, der Einfachheit halber zusammenfassend als Mikroalgen bezeichnet, werden für ihr Potenzial in der nachhaltigen Biotechnologie eingesetzt. Sie sind attraktive Kandidaten aufgrund ihres schnellen Wachstums, ihrer Fähigkeit, auf Nicht-Ackerland angebaut zu werden, und ihrer Nutzung von Sonnenlicht, um die Umwandlung von Kohlendioxid in Biomasse voranzutreiben 1,2,3. Mikroalgenbiomasse kann in Produkte wie Bioenergie in Form von Öl oder Gas, Lebensmittelfarbstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln sowie Materialien wie Biopolymere 1,4,5,6,7 umgewandelt werden. Darüber hinaus können sie zur Behandlung von Abwasser oder zur Sanierung von Gewässern verwendet werden, indem überschüssige Nährstoffe verbrauchtwerden 8,9. Vor diesem Hintergrund ist die Mikroalgenforschung weit verbreitet und etabliert. Das Feld wächst, da die Gesellschaft die Kohlenstoffintensität und die ökologische Nachhaltigkeit der derzeitigen Produktions- und Energieerzeugungsansätze überdenkt.
Drei grundlegende Anforderungen an laborbasierte Mikroalgenstudien sind ein Kulturgefäß, eine Lichtquelle und eine Methode zur Quantifizierung des Wachstums. Der Begriff Photobioreaktor (PBR) beschreibt einen Aufbau, bei dem Kulturgefäße10 beleuchtet werden. Üblicherweise zielen Studien an Mikroalgen darauf ab, das Wachstum zwischen zwei oder mehr Behandlungen zu vergleichen, z. B. verschiedenen Wachstumsmedien, Lichtregimen oder Spezies11,12,13. Für die statistische Relevanz sollte jede Erkrankung, z. B. Behandlung und Kontrolle, repliziert werden. Wenn Kontrolle und Behandlung gleichzeitig durchgeführt werden, bedeutet dies, dass viele PBRs für die Dauer eines Experiments überwacht und beprobt werden müssen. Die Herausforderung beim Betrieb mehrerer PBRs ist zweifach. Erstens ist die Bereitstellung einer gleichmäßigen Lichtintensität für jeden Züchterhaushalt für die Reproduzierbarkeit unerlässlich, kann aber schwierig sein. Die auf die Schiffsoberfläche einfallende Lichtmenge wird durch den Abstand von der Lichtquelle, die Beschattung benachbarter Gefäße und die Schwankungen des Hintergrundlichts beeinflusst14. Zweitens muss eine Methode zur genauen Quantifizierung des Wachstums gewählt werden.
Das Wachstum wird üblicherweise durch Zellzahl, optische Dichte (OD), Chlorophyll-A-Gehalt, Trockengewichtsdichte (DW) und aschefreie Trockengewichtsdichte (AFDW)gemessen 15. Zellzählungen, Chlorophyll-A-Gehalt und gravimetrische Methoden sind manuelle Prozesse, die diskrete Datenpunkte erzeugen. OD kann kontinuierlich und nicht-invasiv mit einem Spektralphotometer gemessen werden, vorausgesetzt, es ist gut kalibriert gegen eine andere Methode wie AFDW density15. OD-Messungen und der Chlorophyll-A-Gehalt können jedoch unzuverlässig sein, da die Ergebnisse unter verschiedenen Kulturbedingungen variieren, z. B. zwischen Arten und während des gesamten Wachstumszyklus15,16. Für Chlorophyll A kann die Extraktionsmethode auch die Pigmentausbeute beeinflussen17. Der Gehalt an Chlorophyll A ist besonders nützlich, um das Wachstum von Mikroalgen in mikrobiellen Gemeinschaften zu verfolgen, die auch nicht-photosynthetische Organismen enthalten17,18. Bei der Auswahl einer Methode zur Bestimmung des Wachstums ist es wichtig, die Morphologie der Suspension zu berücksichtigen. Wenn Organismen verklumpen und nicht gut vermischt sind, sind OD- und Zellzahlen nicht möglich15. Eine einzige Methode ist nicht für alle experimentellen Anwendungen geeignet - Forscher müssen entscheiden, welche Methoden für ihre experimentellen Ziele praktikabel und relevant sind.
AFDW ist eine zuverlässige Methode, die Wachstumsvergleiche zwischen verschiedenen Kulturbedingungen, insbesondere zwischen Arten und Kulturmedien15,19,20, ermöglicht. Zur Berechnung der AFDW wird zunächst eine Probe der Mikroalgenkultur konzentriert, entweder durch Filtration oder Zentrifugation, und getrocknet. In diesem Stadium kann die DW bestimmt werden. Normalerweise enthält die DW-Probe mindestens 8–10% ascheanorganisches Material wie Salze und Feinstaub15. DW verfolgt Wachstumstrends, kann aber verzerrt sein, wenn der Beitrag von anorganischen Stoffen variiert. Um die AFDW-Dichte zu bestimmen, wird trockene Biomasse bei hoher Temperatur verbrannt; Dadurch wird der organische oder nützliche Teil verdampft, während Asche (anorganische Stoffe) hinter19 zurückbleibt. Zur Berechnung der AFDW wird das Gewicht der Aschefraktion von dem der DW-Fraktion abgezogen. Typischerweise reicht AFDW in Mikroalgensuspensionen von 0,1–3 g/L12,21,22. Kleine Mengen verdünnter Suspensionen ergeben wenig trockene Biomasse <10 mg. Nach der Verbrennung darf Asche nur 1 mg wiegen. Daher erfordert diese Methode, abhängig von der Kulturdichte, Volumina zwischen 5-100 ml und analytische Skalen mit einer Genauigkeit von 0,1 mg 12,15,19,22. Labor-PBRs sind in der Regel klein, höchstens ein paar Liter, daher erschöpft jede flüssige Probe das Kulturvolumen. Darüber hinaus ist die AFDW-Methode manuell und dauert 2-3 Tage. Für replizierte und sich wiederholende Experimente ist ein automatisierter und kontinuierlicher Prozess vorzuziehen.
Für Mikroalgen, die Bicarbonat als Kohlenstoffquelle verwenden, können zwei zusätzliche Wachstumsmetriken kontinuierlich gemessen werden. Die Photosynthese verbraucht Bicarbonat und produziert Sauerstoff. Der Bicarbonatverbrauch treibt den mittleren pH-Wertauf 23 in die Höhe. Eine eingetauchte pH-Sonde kann diese Veränderung messen. Die photosynthetische Sauerstoffproduktion erhöht die Konzentration des Mediums an gelöstem Sauerstoff (DO), bis das Medium gesättigt ist. Jenseits der Sättigung existiert Sauerstoff als Blasen. Die Sauerstoffproduktion wird durch viele verschiedene Techniken gemessen: Sonden messen die DO-Konzentration, manometrische Geräte messen den Kopfraumdruck, die Gaschromatographie misst die Zusammensetzung des Kopfraums und volumetrische Sensoren erfassen den Gasabfluss24,25,26,27. Wenn Sauerstoff als Wachstumsproxy verwendet wird, müssen Kulturgefäße vollständig verschlossen sein oder nur Gasaustritt zulassen. Für pH- und Sauerstoffmessungen muss Kohlenstoff in Form von Bicarbonat zugeführt werden, nicht durch CO2 Sparging. CO2 Sparging senkt das Medium pH23 und kann als Gas Sauerstoffmessungen stören. Ein Vorteil von pH-Wert und Sauerstoff gegenüber der optischen Dichte besteht darin, dass die Methode nicht beeinträchtigt wird, wenn Mikroalgen Klumpen bilden. Obwohl indirekt, sind sowohl der pH-Wert als auch der Sauerstoff beim Vergleich des Wachstums zwischen den Behandlungen wirksam.
PBRs, die heute verwendet werden, variieren in ihrer Komplexität. Labore können einfache Tischkolben, kundenspezifische Prototypen oder kommerziell erhältliche Produkte verwenden. Für Forschungsgruppen, die ein Upgrade von Kolben anstreben, können die Kosten für kommerzielle PBRs oder technische Fähigkeiten und die Herstellung von Teilen, die für den Bau vieler Prototypen erforderlich sind, ein Hindernis darstellen. Dieses Manuskript zielt darauf ab, das Schritt-für-Schritt-Design, den Aufbau und den Betrieb von Labor-PBRs zu beschreiben, die diese Lücke schließen. Diese PBRs verfügen über ein anpassbares Lichtregime und überwachen das Wachstum kontinuierlich, indem sie die volumetrische Sauerstoffproduktion aufzeichnen. Dieses Design beherbergt drei Kulturgefäße für die dreifache Replikation und kann mit mäßigem Geschick und leicht zugänglichen Materialien gebaut werden. Dieser PBR ist eine wertvolle Ergänzung für ein Labor, das seine Kapazität für die Mikroalgenforschung erweitern möchte, ohne in sehr technische oder teure Produkte zu investieren. Bei der Entscheidung, ein PBR zu erwerben oder zu erstellen, müssen Forscher die Eignung eines Designs für ihre kulturellen Bedingungen, ihre finanzielle Lage und ihre Forschungsfragen berücksichtigen.
Protocol
1. Bau des Züchterrechtsstandes
- Mit einer Handbügelsäge schneiden Sie fünf 380 mm Längen und zwei 200 mm Längen aus abgewinkeltem Schlitzstahl. Befestigung zusammen mit Schrauben und großen Eckstreben, um die Basis eines Ständers zu bilden (Abbildung 1A). Kleben Sie Sicherheits-Endkappen auf.
- Verbinden Sie zwei ungeschnittene (1220 mm) vertikale Längen aus abgewinkeltem Schlitzstahl mit der Basis. Sichern Sie mit Schrauben und Eckzwickeln aus Metall (Abbildung 1B). Kleben Sie Sicherheits-Endkappen auf.
- Schneiden Sie vier 65 mm flache Längen aus geschlitztem Stahl. Schrauben Sie diese in 90°-Winkeln auf die vertikalen Stützen – befestigen Sie zwei an jeder Stütze, eine 130 mm von der Basis (Abbildung 1C) und eine 60 mm von oben nach unten.
- Befestigen Sie vertikale Stützen über ihrer Oberseite mit einer horizontalen Länge von 140 mm aus flachem geschlitztem Stahl (Querträger), der mit der Rückseite des Rahmens verschraubt ist (Abbildung 2A).
2. Bau der Lichtkammer
- Schneiden Sie ein weißes Rohr aus Polyvinylchlorid (PVC) mit einem Durchmesser von 153 mm auf eine Länge von 1070 mm. Schneiden Sie das Rohr der Länge nach mit einer Bandsäge in zwei Hälften. Schleifen Sie alle Kanten.
- Gleichmäßig Raum und Mitte vier Aluminium-Kühlkörperkanäle vertikal zusammen mit dem Inneren des Rohres. Schließen Sie keine Kanäle innerhalb von 20 mm von der Schnittkante des Rohres an. Befestigen Sie die Kanäle oben und unten mit kleinen Schrauben (Abbildung 2B).
- Schrauben Sie eine Hälfte des Rohrs mit den in Schritt 1.3 hergestellten horizontalen Stützen an den Ständer.
- Legen Sie den Reaktor ab und vereinen Sie die Rohrhälften wieder, indem Sie sie zusammenkleben. Zentrieren Sie das Klavierscharnier entlang einer Schnittlinie. Verfolgen Sie die Scharnierlöcher und bohren Sie das Rohr entsprechend. Verwenden Sie eine Nietpistole und mittellange Nieten, um das Scharnier am Rohr zu befestigen.
- Verwenden Sie ein kleines Bungee-Kabel (siehe Materialtabelle), um das Rohr geschlossen zu halten (Abbildung 1C).
- Wenden Sie sich an einen Elektriker, um die LED-Leuchten einzubinden, und installieren Sie die folgenden vier Komponenten: LED-Treiber, digitaler Multiplex-Decoder (DMX), DMX-Beleuchtungscontroller und Schaltkasten (siehe Materialtabelle). Befestigen Sie alle Komponenten an der Rückseite des Züchterrechts gemäß Abbildung 2A.
3. Bau der Flaschenplattformen
- Schneiden Sie Plattformformen (Abbildung 3A) aus Hartplastik, z. B. Polyethylen hoher Dichte (HDPE) (siehe Materialtabelle), mit CNC-Fräsen (Computer Numerical Control). Machen Sie drei aus jeder Form.
HINWEIS: Es wird empfohlen, überschüssige obere und untere Schichten zu schneiden. - Kleben Sie die untere und obere Schicht zusammen. Markieren und bohren Sie fünf kleine Löcher mit einem Durchmesser von 6 mm durch beide Formen (Abbildung 3A). Wenn Sie einen größeren Bohrer verwenden, erweitern Sie vorsichtig die Oberfläche dieser Löcher, so dass die Bolzenköpfe versenkt werden können (Abbildung 3B).
- Für jede der drei Plattformen verschrauben Sie zwei kleine Eckstreben an der hinteren Hälfte des Rohres.
HINWEIS: Der Abstand zwischen der Oberseite der Zahnspange sollte 350 mm betragen. - Zentrieren Sie jede untere Schicht auf ihre Zahnspangen. Markieren Sie die Position der Bohrlöcher unter den Zahnspangen. Bohren Sie zwei Löcher mit einem Durchmesser von 6 mm. Verwenden Sie einen größeren Bohrer, erweitern Sie vorsichtig die Oberfläche der Löcher, so dass die Schrauben versenkt werden können.
- Verschrauben Sie die unteren Schichten an ihren Zahnspangen (Abbildung 3B–C).
- Schneiden Sie fünfzehn Stück von 12 mm langen starren Rohren mit einem Außendurchmesser (OD) von 6,35 mm. Sandwich fünf Stücke des starren Rohres zwischen jeder oberen und unteren Schicht. Befestigen Sie Schichten und Schläuche zusammen mit langen schmalen Schrauben gemäß Abbildung 3B–D.
- Bohren Sie ein großes Loch in das PVC-Rohr hinter jeder Plattform. Setzen Sie jeden Mikromagnetrührer in seine Plattform ein. Fädeln Sie das elektrische Kabel jedes Rührers durch diese neu geschnittenen Löcher (Abbildung 3C–E). Schließen Sie jeden Rührer an seine jeweilige Steuereinheit sowie an eine Steckdose an.
- Platzieren Sie eine 1-L-Flasche auf jeder Plattform. Fügen Sie Augenschrauben im hinteren Rohr auf Flaschenhalshöhe hinzu. Wickeln Sie eine kleine Bungee-Schnur um jeden Flaschenhals, um Stabilität zu verleihen (Abbildung 4A).
HINWEIS: Während des gesamten Protokolls sind Farbcodierungsplattformen, Flaschen, Magnetrührer und alle zugehörigen Kabel und Sensoren hilfreich.
4. Aufbau der Flüssigkeitsprobenahmeanschlüsse (optional)
- Schneiden Sie drei 60 mm Längen von 6,35 mm OD starren Rohren. Bohren Sie mit einem 5-mm-Bohrer Löcher durch jeden Gummistopfen. Schieben Sie starre Rohrlängen durch den Stopfen.
- Schneiden Sie drei 60 mm Längen von 3,18 mm OD starren Rohren. Verbinden Sie diese mit einem geraden Reduzierstück mit dem hervorstehenden Rohr an der Unterseite jedes Stoppers.
- Setzen Sie ein Einweg-Absperrhahnventil (z. B. Anschluss 1 = weiblicher Luer, Anschluss 2 = männlicher Schlupf Luer) in das hervorstehende Rohr auf jeder Stopfenoberfläche ein (Abbildung 4A).
- Schneiden Sie drei 30 mm Längen von 3,18 mm OD flexiblen Schläuchen. Führen Sie an beiden Enden Luer-Armaturen ein (z. B. männliche Luer zu Schlauchbarbe und weibliche Luer zu Schlauchbarbe).
- Verbinden Sie die in Schritt 4.4 hergestellten Teile mit den Absperrhahnventilen auf der Oberfläche jedes Gummistopfens (Abbildung 4A).
HINWEIS: Viele Kombinationen von Absperrhähnen und Luer-Armaturen können zum gleichen Ergebnis führen. Das Design sollte es ermöglichen, Flüssigkeit über eine Spritze herauszuziehen oder einzuführen.
5. Anschließen volumetrischer Gassensoren
- Bereiten Sie Gassensoren gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
HINWEIS: Dabei handelt es sich hauptsächlich um das Befüllen von Gassensoren mit Verpackungsflüssigkeit (Abbildung 4B). - Um die Gasleitungen herzustellen, schneiden Sie drei 1000 mm Längen von 3,18 mm OD flexiblen Schläuchen.
- Bohren Sie drei Löcher mit einem Durchmesser von 4 mm in das hintere PVC-Rohr. Positionieren Sie Löcher neben dem Scharnier in Flaschenhalshöhe. Einfädeln Sie Gasleitungen durch diese Bohrungen (Abbildung 4A).
- Am Ende der Gasleitung innerhalb des PVC-Rohrs fügen Sie eine Luer-Armatur hinzu (z. B. Schlauchwiderhaken zum männlichen Luer) und schließen Sie ein Einweg-Absperrhahnventil an (z. B. Port 1 = weiblicher Luer, Port 2 = männlicher Luer).
HINWEIS: Das Ventil ist nur erforderlich, wenn auch Flüssigkeitsprobenahmeanschlüsse installiert sind. - Verbinden Sie das andere Ende der Gasleitung mit einem geraden Reduzierstück mit dem Einlassanschluss des Gassensors. Sichern Sie diese Verbindung mit einem Reißverschluss.
- Schließen Sie alle Gassensoren mit Klinkensteckerkabeln an das digitale Eingangsmodul (DIM) und das DIM an einen Computer in der Nähe an.
- Installieren Sie die Datenerfassungssoftware (siehe Materialverzeichnis) auf einem Windows-Betriebssystem und schließen Sie den Lizenzschlüssel-Dongle an. Fügen Sie Sensorkalibrierungsdateien zum Kalibrierungsverzeichnis der Software hinzu.
6. Programmierung des Lichtregimes
- Schalten Sie mit dem hinteren Ein-/Ausschalter den PBR ein und schließen Sie den DMX-Lichtcontroller über ein Micro-USB-Kabel an einen Computer an.
- Laden Sie Store Upgrade Tools (SUT) und die LED-Steuerungssoftware herunter (siehe Materialverzeichnis). Registrieren Sie den DMX-Lichtcontroller online.
- Öffnen Sie die LED-Steuerungssoftware und wählen Sie Klicken Sie hier, um mit der USB-DMX-Schnittstelle zu arbeiten: SUSHI-RB-RJ.
- Wählen Sie im Feld ScanLibrary auf der Registerkarte Einrichten den Ordner Generic und Single Channel aus. Ändern Sie die ScanLibrary-Einstellungen in DMX-Universum 1, die Anzahl der Geräte in 4 und die Indexnummer in 1. Ändern Sie in der oberen rechten Ecke das Dropdownfeld in Listenansicht. Klicken Sie abschließend auf Patch (Ergänzende Abbildung 1).
HINWEIS: Im DMX-Universum testet ein Feld die Steuerung jedes LED-Streifens, indem die Dimmertasten verschoben oder ein numerischer Wert in das Textfeld eingegeben wird. - Erstellen Sie eine Standardkurve, die die digitale Lichteinstellung in der Lichtsteuerungssoftware mit der Lichtintensität in der Mitte des PVC-Rohrs in Beziehung setzt (Abbildung 5). Messen Sie die interne Lichtintensität mit einer kleinen kugelförmigen Sonde (siehe Materialtabelle), die in der Mitte des PVC-Rohrs aufgehängt ist.
- Wechseln Sie zur Registerkarte Editor . Um ein benutzerdefiniertes Lichtprogramm zu erstellen, erstellen Sie eine neue Szene und beginnen Sie mit dem Hinzufügen von Schritten. Ein Beispiel für ein tägliches Programm von 16:8 h finden Sie in der Ergänzenden Tabelle 1. Legen Sie die Szene auf Schleife fest.
HINWEIS: Schritte unterteilen Szenen in Zeitblöcke, von denen jeder auf unterschiedliche Lichtintensität eingestellt werden kann. Die Schritte reichen von 1 s bis 43 min. Hier sind 30 Minuten Schritte am bequemsten. Mehrere Szenen können auf ein DMX-Lichtsteuerungsgerät geladen werden. - Erstellen Sie eine zusätzliche Hilfsszene, die sofort erkennbar ist, z.B. zwei der vier LEDs eingeschaltet.
HINWEIS: Szenen können manuell über die Taste an der Seite des DMX-Lichtcontrollers durchlaufen werden. Wenn das gewünschte Lichtprogramm in der Nacht beginnt, ist es unmöglich zu unterscheiden, ob das Lichtprogramm bereits gestartet wurde. Die Hilfsszene dient als Indikator dafür, dass die DMX-Lichtsteuerung korrekt funktioniert. - Speichern Sie die Szenen und fahren Sie mit der Registerkarte "Eigenständig " fort. Schreiben Sie den Speicher des DMX-Beleuchtungscontrollers und trennen Sie das Gerät vom Computer.
- Schließen Sie den DMX-Beleuchtungscontroller über einen Micro-USB an seine Stromquelle an.
- Bevor Sie ein Experiment starten, testen Sie das Lichtprogramm, indem Sie die interne Lichtintensität für eine Dauer von 24 Stunden protokollieren. Wenn die Flüssigkeitstemperatur von Interesse ist, protokollieren Sie dies gleichzeitig mit einem untergetauchten Temperaturfühler (Abbildung 6).
7. Starten eines Experiments
- Sterilisieren Sie Medien, Flaschen, Rührstangen, Gummistopfen, Probenahmeanschlüsse, Gewindeöffnungsschraubverschlüsse und Schläuche.
HINWEIS: Alle in diesem Design verwendeten Komponenten sind mit Ausnahme der Ventile und Luer-Armaturen autoklavierbar - es gibt autoklavierbare Alternativen von anderen Herstellern. - Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware und füllen Sie die Konfigurationsseite aus (Ergänzende Abbildung 2). Weisen Sie den jeweiligen Sensoren Kalibrierungsdateien zu.
- Wählen Sie unter Verzeichnisdateiname den entsprechenden Ordner für die DIM-Portnummer aus. Klicken Sie auf Aktueller Ordner und wiederholen Sie den Vorgang für alle Ports.
- Klicken Sie auf OK, um zur Protokollierungsseite zu gelangen.
- Flaschen auf das gewünschte Volumen mit Kulturmedium füllen (Ergänzungstabellen 2,3).
HINWEIS: Jede dieser Flaschen fasst maximal ~ 1,1 L mit einem kleinen Kopfraum (~ 80 ml, einschließlich der Gasleitung). - Zentrifugieren Sie die Stammkultur in drei ausbalancierten 50-ml-Röhrchen für 15 min bei 4500 x g , um drei Pellets zu erhalten. Fügen Sie ein Pellet zu jeder Flasche hinzu - waschen Sie Pellets mit einer serologischen Pipette und frischem Medium.
HINWEIS: Die Kulturdichte von Tag 0 wird auch als anfängliche Biomassekonzentration (IBC) bezeichnet. Zur Messung der IBC in gAFDW. L-1, ein zusätzliches 50-ml-Rohr kann in Schritt 7.6 zentrifugiert werden. Das resultierende Pellet kann dann getrocknet und verbranntwerden 15,19. Schritt 7.6 erfordert wahrscheinlich eine Änderung, die auf den individuellen Zielen der Benutzer und ihren Experimenten basiert. - Lassen Sie einen Magnetrührer, 25 x 8 mm, in jede Flasche fallen.
- Verschließen Sie jede Flaschenöffnung mit einem Gummistopfen und einem Schraubverschluss mit Gewindeöffnung (Abbildung 4A). Wenn optionale Probenahmeanschlüsse installiert sind, schließen Sie die Ventile.
- Suchen Sie das Ende jeder Gasleitung innerhalb des PVC-Rohrs (eingebaut in Schritt 5.4) und befestigen Sie eine Nadel am Luer-Außenanschluss des Ventils.
- Verbinden Sie jede Flasche mit ihrem Gassensor, indem Sie jeden Gummistopfen mit der entsprechenden Nadel durchstechen.
- Starten Sie jeden Gassensor einzeln, indem Sie das Kontrollkästchen auf der linken Seite des Bildschirms aktivieren, auf Start klicken und einen Dateinamen eingeben. Klicken Sie auf OK und wiederholen Sie den Vorgang für alle Sensoren (Ergänzende Abbildung 3).
HINWEIS: Beenden Sie während der Protokollierung das Datenerfassungsfenster nicht. Legen Sie die Energie- und Standeinstellungen des Computers auf Nie fest und verschieben Sie Computeraktualisierungen für die Dauer des Experiments. - Schalten Sie den PBR ein und stellen Sie sicher, dass der DMX-Lichtregler an ein Netzteil angeschlossen ist. Die erste programmierte Szene beginnt automatisch. Lesen Sie Schritt 6.7, um zu überprüfen, ob der DMX-Beleuchtungscontroller ordnungsgemäß funktioniert.
8. Flaschenprobenahme (optional)
- Bereiten Sie zusätzliche 500 ml des frischen Mediums vor, bevor Sie mit dem Experiment beginnen (Ergänzende Tabelle 2).
HINWEIS: Wenn um 9 Uhr ein 24-Stunden-Lichtprogramm mit einem 16:8-stündigen Tageszyklus gestartet wurde, fielen die Abtastzeiten vor Einbruch der Dunkelheit und Morgendämmerung um 8 Uhr und 16 Uhr (Ergänzende Tabelle 1). Hier beziehen sich Morgen- und Abenddämmerung auf 30-minütige Schritte, die die Lichter von EIN nach AUS und umgekehrt überführen. - Schließen Sie das Ventil an der Gasleitung.
- Schließen Sie eine Spritze (10 ml) an das Probenahme-Anschlussventil an (Abbildung 4A).
- Öffnen Sie das Probenahme-Anschlussventil und entnehmen Sie 8 ml Kultur.
HINWEIS: Zwischen 5-10 ml wird empfohlen. Das Entfernen von Flüssigkeit erzeugt ein Vakuum im Kopfraum, wodurch Volumen > 10 ml schwer zu extrahieren sind. - Schließen Sie das Probenahme-Anschlussventil und trennen Sie die Spritze.
- Schließen Sie eine Spritze mit 8 ml frischem Medium (ab Schritt 8.1) an das Probenahme-Anschlussventil an.
- Öffnen Sie das Probenahme-Anschlussventil und injizieren Sie frisches Medium.
HINWEIS: Das Ersetzen des Volumens der beprobten Kultur durch frisches Medium dient dazu, ein gleiches Kopfraumvolumen und -druck aufrechtzuerhalten und die Probenahmeöffnungsleitung zu spülen. - Schließen Sie das Probenahme-Anschlussventil, bevor Sie die Spritze abklemmen.
- Wiederholen Sie die Schritte 8.2 bis 8.8 zu jedem Zeitpunkt der Probenahme.
9. Beenden eines Experiments
- Aktivieren Sie alle aktiven Port-Kontrollkästchen im Datenerfassungsfenster und klicken Sie auf Stop.
- Um Daten zu exportieren, wählen Sie Datei und Offlinedaten aus. Wählen Sie alle relevanten Protokolldateien aus. Exportieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulationssoftware und speichern Sie sie.
- Für jede Flasche wird das Gesamtvolumen des in ml gemessenen Sauerstoffs unter Verwendung des idealen Gasgesetzes in Mol umgerechnet. Prognostizieren Sie das Gewicht der angebauten Biomasse (gAFDW), wenn für jedes produzierte Mol Biomasse 1,05 MolO2 erzeugt werden. Nehmen Sie das molare Gewicht der Biomasse als 24,6 g mol-1.
- Kuratieren Sie die Durchflussdaten manuell. Verwenden Sie Einheiten von ml / h und einen gleitenden 3-Punkte-Durchschnitt.
Representative Results
Hier ist die Sauerstoffflussrate ein Maß für die Photosyntheserate der Kultur. Höhere Raten der Photosynthese und damit der Kohlenstofffixierung führen zu höheren Wachstumsraten. Dies bedeutet, dass der Benutzer die Sauerstoffflussraten zwischen verschiedenen Behandlungen und Betriebstagen als Proxy für das Wachstum vergleichen kann. Kurz gesagt, der Gassensor arbeitet durch Einfangen und Freisetzen von Gasblasen in einer Zweikammer-Messzelle (Abbildung 4B). Gasblasen aus dem Einlass an der Basis des Sensors wandern durch die Packungsflüssigkeit nach oben. Blasen sammeln sich in einer Kammer der Messzelle bis zu einem Volumen von ~3,2 ml an. Sobald dieser Schwellenwert erreicht ist, spitzen sich die Messzellen. Dadurch wird das Gas freigesetzt und das System zurückgesetzt. Jeder Tipp wird von der Datenerfassungssoftware aufgezeichnet.
In den Beispieldaten wurde die Wachstumsrate von drei Behandlungen mit unterschiedlichen Tageslichtintensitäten und anfänglichen Biomassekonzentrationen (IBCs) verglichen. Diese Behandlungen wurden willkürlich zu Demonstrationszwecken ausgewählt. Sie waren (A) 300 μmol Photonen m-2 s-1 und 0,03 g AFDW L-1, (B) 600 μmol Photonen m-2 s-1 und 0,13 g AFDW L-1 und (C) 600 μmolPhotonen m-2 s-1 und 0,40 gAFDW L-1. Diese Bestrahlungsstärken wurden mit einer kugelförmigen Sonde in der Mitte des PVC-Rohrs gemessen, bevor Flaschen auf die Plattformen gestellt wurden. Kulturtiefe und -dichte beeinflussen die Lichtdämpfung. Daher kann die tatsächliche Lichtintensität von Mikroalgen von den berichteten abweichen. Jede Behandlung wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt – innerhalb eines PBR mit drei Flaschen.
Hier war ein erfolgreiches Experiment durch genau replizierte Tagesmuster der Gasproduktion gekennzeichnet (Abbildung 7A–C). Während der beleuchteten Stunden (Tag) stieg die Gasproduktion stetig an, und über nicht beleuchtete Stunden (Nacht) stoppte die Gasproduktion (Abbildung 7A-C). Zwei Gase werden von Mikroalgen produziert, Sauerstoff aus der Photosynthese und Kohlendioxid aus der Atmung28. Die Photosynthese ist auf beleuchtete Stunden beschränkt, während die Atmung kontinuierlich stattfindet, aber nachts am aktivsten ist28. Photosynthese baut sich auf, während die Atmung Biomassekatabolisiert 28. Anfangs ist die Zusammensetzung des Kopfraumgases identisch mit der der Atmosphäre. Mit jedem Flip der Messzelle verdrängtO2 atmosphärisches Gas. Daher wurden Gassensorwerte der Produktion von O2 zugeschrieben, auch wenn das ausgehende Gas kein reinesO2 war. Der minimale Gaseingangsdruck für den Gassensor ist mit 8–9 mbar extrem niedrig, wodurch der Flaschenkopfraumdruck nur geringfügig über der Atmosphäre liegt (1,01 bar auf Meereshöhe). Daher beginnen die Gassensormessungen kurz nachdemO2-Blasen das Medium verlassen haben.
CO2, das aus der Atmung freigesetzt wird, trägt aus zwei Gründen nicht zu den Messwerten des Gassensors bei. Erstens reagiert CO2 im alkalischen Medium zu Bicarbonat und senkt den pH-Wert (Abbildung 8). Zweitens, wenn CO 2 entweicht, löst die Gassensor-Packflüssigkeit, Silox, CO 2-Blasen, bevor sie dieMesszelle erreichen können, und entgast CO2 an der Flüssigkeitsoberfläche29. Dies wird durch das Fehlen von Gassensorwerten über Nacht unterstützt. Diejenigen, die auftraten, wurden kurz nach dem Ausschalten der Lichter aufgezeichnet, was darauf hindeutet, dass die Messwerte die verbleibende Sauerstofffreisetzung tagsüber darstellten (Abbildung 7).
Im Versuchsaufbau (unter Verwendung lokaler Temperatur- und Druckdaten) benötigte ein 80 ml Kopfraum bei Umgebungsdruck 340 mL gelöstes O2, um einenO2-Partialdruck von 99 % zu erreichen. Hier reichte das Gesamtvolumen des über 4 Tage produzierten Sauerstoffs von 316 (SEM ± 11) ml in Behandlung A bis 902 (SEM ± 51) ml in Behandlung C (Tabelle 1). Daher hätte der Kopfraum aller Flaschen am Ende des Experiments hauptsächlichO2 enthalten. Die erhöhte Konzentration des Kopfraums O2 und damit die verringerte Konzentration vonN2 hätte den Partialdruck und die Sättigung dieser Gase beeinflusst. Mit einem 99%O2 Headspace wurde eine 5-fache Steigerung der DO berechnet. Für die 1,1-Liter-Kulturen bedeutete dies zusätzliche 23 ml DO. Umgekehrt wurde geschätzt, dass die Verschiebung auf einen 1%N2-Kopfraum dazu geführt hätte, dass 15 mlN2 aufgelöst worden wären. Dies bedeutet, dass unter einem nahezu reinenSauerstoffkopfraum mehr O2 gelöst alsN2 verdrängt wurde. Da also mehr O2 im Medium verbleibt, hätte dieser Effekt zu leichten Unterschätzungen der Menge an produziertemphotosynthetischem Sauerstoff geführt.
Die größte Herausforderung dieser Methode ergab sich, als die Kulturen dicht wurden. Mit mehr Biomasse und damit mehr Atmung stieg die Nachfrage nachO2. Der nächtlicheO2-Verbrauch erzeugte einen Kopfraumunterdruck. Dies führte dazu, dass die Flüssigkeit der Gassensorpackung durch die Gasleitung nach oben wanderte. Als dieO2-Produktion wieder aufgenommen wurde, musste Verpackungsflüssigkeit zurück in die Gassensoren getrieben werden. Dies führte zu einer Verzögerung bei der ersten Gassensorablesung. In der vierten Nacht führte das Ausmaß dieses Unterdrucks jedoch dazu, dass die Packungsflüssigkeit zwei der drei Replikate der Behandlung B erreichte und tropfte, wodurch ein Oberflächenölteppich erzeugt wurde. Aufgrund des reduzierten Füllstands der Packflüssigkeit schlossen die Gassensoren einen Kurzschluss ab undsetzten ungemessenes O2 direkt in die Atmosphäre frei. Dies führte dazu, dass die Datenerfassung flach wurde (Abbildung 7B).
Unterdruck kann auch durch eine temperaturbedingte Kontraktion des Kopfraumvolumens verursacht werden. Der Effekt hier war jedoch minimal. Kühlkörperkanäle und Luftstrom haben überschüssige Wärme ausreichend abgeführt. Von den beiden getesteten Lichtregimen reduzierte die maximale Temperaturänderung das Headspace-Volumen um 1% oder weniger, was einer 800-μL-Packungsflüssigkeitsverdrängung in einem 80-ml-Headspace entspricht. Die maximale Tagestemperaturschwankung betrug 1,4 °C für die 300 μmol Photonen m-2 s-1 Regime (Abbildung 6) und 3,2 °C für die 600 μmolPhotonen m-2 s-1 Regime. Der durchschnittliche Tagestemperaturanstieg für die 300 und 600 μmolPhotonen m-2 s-1 Regime betrug 0,7 bzw. 1,8 °C. Die Kulturtemperaturen kehrten über Nacht zum Ausgangswert zurück (Abbildung 6).
Hochauflösende Wachstumsratendaten können Trends aufdecken, die sonst unbemerkt bleiben könnten. Betrachten Sie die Behandlungen B und C. Trotz ihrer unterschiedlichen IBCs erzeugten beide die gleiche Menge an Gesamtbiomasse (gAFDW), was zu einer identischen Verschiebung des mittleren pH-Werts führte (Tabelle 1). Wenn man nur die Anfangs- und Enddaten betrachtet, kann eine Person zu Recht davon ausgehen, dass es keinen Unterschied in der durchschnittlichen Wachstumsrate zwischen den beiden Behandlungen gibt (Tabelle 1). Online-Sauerstoffflussdaten zeigten jedoch, dass jede Behandlung unterschiedliche tägliche Wachstumsraten aufwies. Diese Schwankungen spiegelten sich auch in zweimal täglichen pH-Messungen wider (Abbildung 8). Am ersten Tag war die Wachstumsrate von Behandlung B niedriger als die von Behandlung C. Am dritten Tag kehrte sich dies um, wobei die Wachstumsrate von Behandlung B die von Behandlung C übertraf (Abbildung 7B, C). Daten zur Sauerstoffdurchflussrate zeigten, dass die höchste Wachstumsrate am dritten Tag in Behandlung B auftrat (Abbildung 7B).
Das Gesamtvolumen des Sauerstoffs, das von jeder Flasche in den drei Behandlungen erzeugt wurde, wurde verwendet, um ihre jeweilige Veränderung der Gesamtbiomasse (gAFDW) abzuschätzen. Dies wurde mit einer generischen Gleichung für die photosynthetische Biomassesynthese erreicht:CO2 + 0,2NH3 + 0,6 H2 O = CH 1,8 O 0,5 N0,2 +1,05 O2. Es wurde erwartet, dass der Anstieg des O2-Partialdrucks im Headspace und der anschließende Anstieg der DO-Sättigung zu einer leichten Unterschätzung des Biomassewachstums führen würden. Dies galt für fünf von sieben Beispielen (Tabelle 2). Im Durchschnitt lag das geschätzte Biomassewachstum innerhalb von 10% des gemessenen Biomassewachstums. Einige Schätzungen wichen nur um 1–3 mg vom gemessenen Wachstum ab. Zwei Beispiele überschätzten das Wachstum, d.h. es wurde mehr Sauerstoff produziert, als das Wachstum der Biomasse erklären könnte. Jedes O2, das über Nacht durch die Atmung verbraucht wird, sollte sich in der Verzögerung derO2-Produktion am folgenden Tag widerspiegeln. Hier wurden die Experimente am Ende der Nacht beendet. Auf diese Weise bleibt der Biomassekatabolismus über Nacht während der letzten 8 Stunden jedes Experiments ungemessen. Dies kann zu Überschätzungen des Biomassewachstums führen, insbesondere in dichten Kulturen. Daher wird empfohlen, dass Experimente am Ende der beleuchteten Stunden beendet werden.
Abbildung 1: Reaktorständerboden . (A) Abmessungen der Basiskomponenten in mm. (B) Ausrichtung der Eckzwickel aus Metall, die die beiden vertikalen Stützen sichern. (C) Eine von vier kurzen Stahllängen verbindet die hintere Hälfte des PVC-Rohrs mit dem Reaktorständer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Elektrische Komponenten. (A) Rückansicht des Züchterrechts, die den oberen Querträger und die Konfiguration der elektrischen Komponenten zeigt. (B) Vorderansicht des Züchterrechts nach der Lichtinstallation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Details zur Flaschenplattform . (A) Abmessungen der oberen und unteren Schicht in mm. (B) Einbau der Bolzenköpfe in beide Schichten. (C) Zahnspangen verbinden die untere Schicht direkt mit der hinteren Hälfte des PVC-Rohrs. (D) Fünf kurze Stücke starrer Rohre, die über schmalen Schrauben angebracht sind, halten die obere und untere Schicht auseinander. (E) Wenn die Flaschenplattform fertiggestellt ist, sollte die Oberfläche bündig sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Gasleitung und optionaler Probenahmeanschluss . (A) Gasleitungen verbinden jeden Flaschenkopfraum mit externen Gassensoren. Wenn der Probenahmeanschluss erforderlich ist, sollten Gasleitungen ein Einwegventil unmittelbar hinter der Nadel enthalten. (B) Volumetrischer Gassensor. Der Flüssigkeitspackungsgrad sollte die Nachlaufschraube berühren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Standardkurve, die die Einstellungen der LED-Steuerungssoftware mit der internen Lichtintensität in Beziehung setzt. Weiße Kreise und graue Dreiecke stellen jeweils einen individuellen PBR dar. Für jede Lichteinstellung wurden alle vier Leuchten auf einen identischen Wert eingestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Kulturtemperaturänderung für die 300 μmolPhotonen m-2 s-1 Lichtregime. Während des 24-stündigen, 16:8-stündigen Tagesprogramms erhöhten LEDs die Tageskulturtemperatur. Der blaue Pfeil zeigt die Differenz zwischen der minimalen und der maximalen Temperatur an. Ein leichter Programmfehler verursachte den Temperaturabfall vor Einbruch der Dämmerung; Dies wurde korrigiert, bevor das Experiment begann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Sauerstoffproduktion für drei einzigartige experimentelle Bedingungen. Jeder Reaktor erhielt eine andere Kombination aus Lichtintensität und anfänglicher Biomassekonzentration (IBC); (A) 300 μmol Photonen m-2 s-1 und IBC 0,03 g AFDW L-1, (B) 600 μmol Photonen m-2 s-1 und IBC 0,13 g AFDW L-1, (C) 600 μmolPhotonen m-2 s-1 und IBC 0,40 g AFDW L-1. Die oberen Diagramme zeigen die kumulative Sauerstoffproduktion (mL) und den Gasdurchsatz (ml/h). Durchgezogene schwarze Linien, gestrichelte blaue Linien und gepunktete rote Linien sind Nachbildungen. Die Laufzeit für jedes Experiment betrug 104 h, was vier komplette 16:8 h Tag-Nacht-Zyklen beinhaltete. Dunkelorange Schattierungen repräsentieren Nachtstunden und hellorange Tagesstunden. Beachten Sie, dass in Behandlung B die Sauerstoffproduktion an Tag 4 für zwei der drei Replikate flach wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: pH-Reaktion. Jeder Reaktor erhielt eine andere Kombination aus Lichtintensität und IBC; (grüne Diamanten) 300 μmol Photonen m-2 s-1 und IBC 0,03 g AFDW L-1, (rote Dreiecke) 600 μmol Photonenm2 s-1 und IBC 0,13 g AFDW L-1, (violette Kreise) 600 μmol Photonen m-2 s-1 und IBC 0,40 g AFDW L-1 . Dunkelorange Schattierungen repräsentieren Nachtstunden und hellorange Tagesstunden. Fehlerindikatoren stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Behandlung | Lichtintensität (μmol Photonen m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | Δ Biomasse insgesamt (gAFDW) | Δ pH-Wert | Gesamterzeugter Sauerstoff (mL) |
| Ein | 300 | 0.031 | 0,289 (± 0,01) | 0,15 (± 0,01) | 316,2 (±11,4) |
| B | 600 | 0.130 | 0,674 (± 0,02) | 0,52 (± 0,27) | 834.6* |
| C | 600 | 0.400 | 0,675 (± 0,02) | 0,55 (± 0,03) | 902,2 (±50,5) |
| * Nur eines der drei Replikate war erfolgreich | |||||
Tabelle 1: Verschiebung der Wachstumsmetrik von Stunde 0 auf 104. Klammern stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar.
| Behandlung | Lichtintensität (μmolPhotonen m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | Biomassewachstum gemessen (gAFDW) | Biomassewachstum vorhergesagt (gAFDW) | Unterschätzung (%) |
| Ein | 300 | 0.031 | 0.289 | 0.288 | 0.5 |
| Ein | 300 | 0.031 | 0.311 | 0.270 | 13.1 |
| Ein | 300 | 0.031 | 0.268 | 0.247 | 7.9 |
| B | 600 | 0.13 | 0.708 | 0.705 | 0.4 |
| C | 600 | 0.4 | 0.718 | 0.796 | -10.9 |
| C | 600 | 0.4 | 0.640 | 0.830 | -29.7 |
| C | 600 | 0.4 | 0.668 | 0.659 | 1.3 |
Tabelle 2: Wachstumsschätzungen auf der Grundlage des gemessenen Gesamtsauerstoffs. Nur ein Replikat aus der 300 μmolPhotonen m-2 s-1 und IBC = 0,13 gAFDW L-1 Behandlung lief zum Abschluss.
Ergänzende Abbildung 1: Screenshot der LED-Steuerungssoftware. Jede der vier Leuchten kann unabhängig voneinander gesteuert werden, indem die Dimmertasten geschoben oder ein numerischer Wert in das Textfeld eingegeben wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Screenshot des Konfigurationsfensters für die Datenerfassungssoftware. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Screenshot des Protokollierungsfensters der Datenerfassungssoftware. Hellgrüne Rechtecke zeigen Online-Gassensoren an. Die Daten werden in Echtzeit angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Beispiel 24 h Lichtgang. Für ein 16:8 h Tagesprogramm gibt es 48 Sätze zu je 30 Minuten. Sternchen zeigen die vorgeschlagenen Probenahmezeiten an. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: Mittlere Zusammensetzung mit hohem pH-Wert mit hoher Alkalität. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 3: Spurenelementlösung. Zu einer Endkonzentration von 1 ml/l in das Basismedium geben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
Innerhalb dieses Protokolls erhöht der Fokus auf die folgenden Schritte die Wahrscheinlichkeit, reproduzierbare und qualitativ hochwertige Daten zu generieren. Beim Bau des Reaktorständers (Schritt 1) muss die Basis mit gut abgestimmten vertikalen Stützen stabil sein. Schlitzstahl hat scharfe Kanten, daher ist das Hinzufügen von Sicherheitskappen unerlässlich. Flaschenplattformoberflächen müssen vollständig flach sein, der Magnetrührer und die Bolzenköpfe sollten beide unter der Oberfläche der obersten Schicht sitzen (Schritte 3.2–3.6). Gemäß der Anweisung des Herstellers sollte die Gassensor-Packflüssigkeit für genaue Sauerstoffmessungen auf die "Tracing-Schraube für den Flüssigkeitsstand" aufgefüllt werden. Dieser Flüssigkeitsstand sollte regelmäßig überprüft werden, da eine Verdunstung der Packungsflüssigkeit die Messzelle kurzschließen kann. Alle drei in Schritt 5.2 hergestellten Gasleitungen sollten gleich lang sein; Dies führt dazu, dass Replikate identische Headspace-Volumes haben. Vor Beginn eines Experiments ist es ratsam, das programmierte Lichtregime zu testen, indem die Lichtintensität über einen Zeitraum von 24 Stunden aufgezeichnet wird (Schritt 6.11). Wenn Erhöhungen der Flüssigkeitstemperatur von Belang sind, sollte dieser Test auch eine versiegelte Flasche mit einem internen Temperaturfühler umfassen (Schritt 6.11). Beenden Sie bei der Protokollierung nicht das Fenster der Datenerfassungssoftware. Dadurch wird die Protokollierung beendet. Wenn Sie Kulturproben entnehmen, achten Sie darauf, dass Sie kein Headspace-Gas freisetzen, indem Sie die Ventile in der falschen Reihenfolge öffnen (Schritte 8.2-8.8). Bei der Überprüfung experimenteller Daten ist darauf hinzuweisen, dass die Datenerfassungssoftware automatisch einen gleitenden Durchschnitt der Durchflussrate generiert. Dadurch wird der Wert der ein oder zwei über Nacht erzeugten Durchflusswerte aufgebläht. Kuratieren Sie Gassensorprotokolle manuell, um dies zu beheben.
Der häufigste Rückschlag bei dieser Methode ist die Möglichkeit, den Gassensor kurzzuschließen, wenn der Flüssigkeitspackungsgrad abnimmt. Es gibt zwei Möglichkeiten, wie dies geschehen kann. Erstens kann die Verdunstung den Flüssigkeitsstand langsam reduzieren. Dies ist jedoch bei einem kurzfristigen (<7-tägigen) Experimentunwahrscheinlich 29. Zweitens können hohe Atemfrequenzen Sauerstoff in die Lösung ziehen und einen Kopfraum unter Druck erzeugen. Wenn Lichtenergie nicht verfügbar ist, nutzen Mikroalgen die aerobe Atmung, um die Energie zu liefern, die für die Wartung und Reparatur von Zellen benötigt wird28. Daher kann in dichten Kulturen während nicht beleuchteter Stunden der Sauerstoffverbrauch und der daraus resultierende Unterdruck erheblich sein. Dadurch wird Packungsflüssigkeit von den Gassensoren in die Gasleitung gesaugt. Die Strecke, die die Packflüssigkeit zurücklegt, ist proportional zur Menge der nächtlichen Atmung. Wenn die Verpackungsflüssigkeit in die Flaschen gelangt, erzeugt dies einen Ölteppich auf der Flüssigkeitsoberfläche.
Wenn hohe nächtliche Atemfrequenzen erwartet werden, können Änderungen am Protokoll vorgenommen werden. Der einfachste Weg, Unterdruck zu vermeiden, besteht darin, die Flaschenkopfräume über Nacht offen zu lassen. Dies hat auch den Vorteil, dass die DO-Werte durch Verringerung des partiellen Kopfraumdrucks vonO2 gesenkt werden. Es wird angenommen, dass hohe DO-Konzentrationen schädlich für das Wachstum sind, daO2 die Aktivität von Rubisco behindern und oxidativen Stress auslösenkann 30,31. Es ist nicht ungewöhnlich, dass Kultursuspensionen eine 4-fache Übersättigung erreichen, selbst wenn sie mit der Atmosphäre in Kontakt kommen25,32. Um den Kopfraum zu öffnen, trennen Sie die Gasleitung von der Nadel, die den Gummistopfen überspannt. Die Nachtstunden können als Fenster dienen, um die Flüssigkeit des Gassensors nachzufüllen oder kontinuierliche Experimente mit geringen Auswirkungen auf die Datenerfassung zu manipulieren. Zum Beispiel kann man die Kulturdichte verändern, Nährstoffe auffrischen, eine Änderung hinzufügen oder einen Krankheitserreger einführen. Flaschen müssen wieder verschlossen und die Gassensorleitung wieder angeschlossen werden, bevor die Lichter wieder angehen. Die Sauerstoffmessungen, die aus Experimenten mit geschlossenen und offenen nächtlichen Headspaces gesammelt wurden, werden sich unterscheiden.
Wenn die Flaschen verschlossen bleiben, reduziert der nächtliche Sauerstoffverbrauch die Anzahl der MolO2 im Kopfraum. Dies führt dazu, dass Packungsflüssigkeit die Gassensorleitung hochkriecht, um den Kopfraumdruck aufrechtzuerhalten. Wenn das Licht angeht, wird die Sauerstoffproduktion wieder aufgenommen. Packflüssigkeit muss in den Gassensor zurückgeschoben werden, bevor die Durchflussmessungen beginnen. Diese Verzögerung ist daher proportional zum Grad der nächtlichen Atmung. Auf diese Weise stellen die O2-Messwerte die Netto-O2-Produktion (photosynthetische Produktion- Atemverbrauch) dar, wenn der Headspace geschlossen bleibt. Umgekehrt, wenn der Kopfraum nachts geöffnet ist, ersetzt atmosphärisches Gas den KopfraumO2, der verbraucht wird, und keine Verpackungsflüssigkeit gelangt in die Gasleitung. Das Ergebnis ist, dass der Verbrauch von Atmungs-O2 in denO2-Produktionsdaten nicht berücksichtigt wird. Dies kann die Genauigkeit der AFDW-Biomassewachstumsschätzungen verringern. Es sollte jedoch keinen Einfluss auf den Nutzen der Verwendung derO2-Tagesproduktion als Metrik für den Vergleich des Wachstums zwischen den Behandlungen haben.
Alle Labor-PBRs unterliegen der gleichen Einschränkung; Künstliches Licht kann das Sonnenspektrum nicht replizieren. Mikroalgen nutzen Wellenlängen des Lichts zwischen 400 und 700 nm für die Photosynthese. Dieser Bereich wird als photosynthetisch aktive Strahlung (PAR)33 bezeichnet. Sonnenlicht und künstliches Licht variieren in ihrem relativen Beitrag der Wellenlängen innerhalb dieses Bereichs. Dies, zusammen mit günstigen Temperaturen und einer konstanten Lichtversorgung, bedeutet, dass Laborwachstumsdaten oft nicht zuverlässig auf die Außenbedingungen extrapoliert werden können. Diese PBRs können jedoch eine der Einschränkungen der PBR-Lichtversorgung im Labor beheben. Die Intensität des Sonnenlichts ist den ganzen Tag über sehr variabel, wobei die Wolkendecke vorübergehende Schwankungen der einfallenden PAR erzeugt. Die Lichtsteuerungssoftware und der DMX-Beleuchtungscontroller können Lichtintensitäten von 0 bis 2400 μmolPhotonen m-2 s-1 und darüber hinaus bereitstellen. Lichtregime können in einzelne Inkremente von nur 1 s unterteilt werden. Die abstimmbare Lichtintensität ermöglicht es dem Benutzer, Außenlichtmuster genauer nachzuahmen als Standard-PBR-Setups. Hier verblassen simulierte 30-minütige Dämmerungs- und Abenddämmerungsintervalle Tag- und Nachtzyklen zusammen (Ergänzende Tabelle 1).
Obwohl die AFDW-Dichte zum Standardmaß für das Wachstum geworden ist, kann diese Methode erhebliche Kulturvolumina, eine Verarbeitungsdauer von 2 bis 3 Tagen und die Generierung eines Datenpunkts nach dem anderen erfordern. Wenn die Bedingungen ungünstig werden und Zellen absterben, unterscheidet die AFDW-Dichte nicht zwischen aktiv photosynthetisierenden Zellen und denen, die sich zersetzen. Die Quantifizierung der Rate der photosynthetischen Sauerstoffproduktion dient als alternativer Wachstumsproxy. Dieses PBR-Design kann die Sauerstoffproduktion kontinuierlich mit wenig Benutzereingriff aufzeichnen und gleichzeitig das Kulturvolumen erhalten. Die Datenauflösung könnte durch die Auswahl eines Gassensors mit einem geringeren Messzellenvolumen, z. B. 1 ml, verbessert werden. Wenn die Kulturen gut gemischt sind, können Benutzer außerdem ein Spektralphotometer für kontinuierliche optische Dichtemessungen installieren. Wenn eine Temperaturregelung des Mediums gewünscht wird, könnte ein Umlaufkühler hinzugefügt werden. Diese PBRs sind eine wertvolle Ergänzung für ein Labor, das seine Mikroalgenforschungskapazität ohne hohe finanzielle Investitionen erweitern möchte. Sie eignen sich besonders für diejenigen, die mit Arten mit hoher Alkalität und hohem pH-Wert wie Spirulina arbeiten. Diese PBRs bieten Flexibilität beim leichten Regime und eignen sich für schnelle, replizierte Laborwachstumsvergleiche.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC), der Canada Foundation for Innovation (CFI), dem Canada First Research Excellence Fund (CFREF), Alberta Innovates, der General Sir John Monash Foundation, der Regierung von Alberta und der University of Calgary unterstützt. Unser Dank gilt Mark Toonen für die elektrischen Arbeiten und William Richardson für die Löslichkeitsberechnungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum channels Imperial: 0.90” x 39.37” Metric: 2.3 cm x 100 cm Quantity: 4 |
LED World | AC-AR1-1M | Required as a heat sink |
| Bungee cords, small Quantity: 5 |
- | - | To secure bottles |
| Computer - desktop/laptop Quantity: 1 |
- | - | - |
| Data Logger, HOBO U30 USB Weather Station Quantity: 1 |
HOBO, Hoskin | U30-NRC-VIA-10-S100-000 | Records light sensor information |
| Digital interface module, Rigamo, 4-channel Quantity: 1 |
Ritter | N/A | This is to transmit gas sensor data to the computer |
| DMX decoder, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A Quantity: 1 |
LITECH, LED World | LT-840-6A | Transmit messages which alter the light pattern |
| DMX lighting controller, SUSHI-RB-RJ Quantity: 1 |
Arcolis, Nicolaudie America Inc. | SUSHI-RB-RJ DMX | Encodes the lighting program |
| Gas sensor packing liquid (Silox) Quantity: 1 L |
Ritter | https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox | |
| Gas sensor, volumetric Quantity: 3 |
Ritter | MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en) | Measures oxygen production |
| Glass bottles, round 1 L with GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-1L | Culture vessels |
| Hardware - end caps for slotted steel Quantity: 10 |
Paulin, Home Depot | 142-612 | To cover sharp edges of slotted steel |
| Hardware - eye hooks Quantity: 6 |
- | - | To secure bottles |
| Hardware - metal corner braces (large) Imperial: 4" x 4" Metric: 10 cm x 10 cm Quantity: 8 |
- | - | Larger brackets to construct metal stand |
| Hardware - metal corner braces (small) Imperial: 2 1/2" x 2 1/2" Metric: 6.4 cm x 6.4 cm Quantity: 6 |
- | - | Small brackets to connect bottle platforms to PVC pipe |
| Hardware - metal corner gussets Imperial: 3" x 3" Metric: 7.6 cm x 7.6 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-616 | Flat brackets to construct metal stand |
| Hardware - piano hinge Imperial: 36" Metric: 91 cm Quantity: 1 |
- | - | Connects two halves of PVC pipe |
| Hardware - rivets Quantity: 40 |
- | - | To attach piano hinge to PVC tubing |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 60 |
- | - | Long thin bolts are required to secure bottle platforms around magentic stirrers |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 30 |
- | - | Larger shorter bolts are required to build the metal stand |
| LED driver, constant voltage, 96W 24VDC UL Listed IP65 Driver Class 2 regulated power supply Quantity: 1 |
Magnitude Lighting, LED World | CVN96L24DC | Regulates power to the lights |
| LED lights, Cinco Bright LED Flex Strip Quantity: 4 m roll |
EvenBright, LED World | FA128M57-4M-24V-X | Roll is trimmed into 4 x 1 m lengths and secured inside the PVC tube |
| Light meter, handheld with submersible sperical probe Quantity: 1 |
LI-COR | LA-250A | Calibrate the reactors light intensity |
| Light sensors Photosynthetic Light (PAR) Smart Sensor Quantity: 2 |
HOBO, Hoskin | S-LIA-M003 | Only one is required however two would be good practice in case one malfunctioned |
| Magnetic stirrers (MIXdrive 1 XS) with external control units and power supply (MIXcontrol eco) Quantity: 3 |
2Mag, 2MAG USA | MF 40300 | Stirrers sit sandwiched in bottle platforms |
| Metal plate Imperial: 24" x 8" Metric: 61 cm x 20.3 cm Quantity: 1 |
- | - | This is a surface on which to secure electronics, it is attached to the back of the reactor |
| Pipe, white PVC Imperial: 6" diameter x 42" high Metric: 15.2 cm x 106.7 cm Quantity: 1 |
- | - | Cut lengthwise in two halves, used to house lights and bottles |
| Plastic (HDPE) sheets Imperial: 4" x 4" x 1/4" Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm Quantity: 6 |
Inventables | 30291-01 | For bottle platforms which house magentic stirrers |
| Rubber stoppers - GL45 size Quantity: 3 |
Duran, VWR | 76289-760 | Seals culture vessels |
| Screw caps - with aperture and GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-45HTSC | Generates seal of culture vessels |
| Slotted angle steel lengths Imperial: 1-1/2" X 48" x 0.074" Metric: 3.8 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-202 | Makes up the body of the metal stand |
| Slotted flat steel lenghts Imperial: 1-3/8" x 48" x 0.074" Metric: 3.5 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 3 |
Paulin, Home Depot | 142-222 | Makes up the body of the metal stand |
| Software - Easy Stand Alone (ESA) | https://www.dmxsoft.com/#apps | AKA LED control software | |
| Software - Rigamo v3.1 | AKA data acquisition software | ||
| Software - Storage Upgrade Tools (SUT) | https://store.dmxsoft.com// | ||
| Stir bar Imperial: 1" x 5/16" Metric: 2.5 cm x 0.8 cm Quantity: 3 |
Fisherbrand | 14-513-59 | Stirs culture |
| Switch box Quantity: 1 |
- | - | Turns power on/off to reactor |
| Syringe, 10 mL Quantity: Multiple |
- | - | Optional if you wish to extract culture |
| Tube adaptor fittings, plastic - Stopcock 1-way Quantity: 6 |
Masterflex, Cole Palmer | RK-12023-33 | Close/open culture vessel line |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of male and female luer lock fittings Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of straight connectors Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-40616-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantity: 4 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-02 | Line from culture vessel to gas sensor |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 2 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-05 | Gas sensor standard tubing size |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantiy: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-27 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-30 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Zip ties, small Quantity: 1 packet |
Secure tube fittings |
References
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