Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

طريقة كهربية فعالة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة مسارات الإشارات الأولية المعتمدة على السيليوم في سلائف الخلايا الحبيبية

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63283
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا كهربائيا قابلا للتكرار في المختبر للتلاعب الجيني بسلائف الخلايا الحبيبية المخيخية الأولية (GCPs) وهو فعال من حيث التكلفة وفعال وقابل للحياة. علاوة على ذلك ، يوضح هذا البروتوكول أيضا طريقة مباشرة للدراسة الجزيئية لمسارات إشارات القنفذ الأولية المعتمدة على السيليوم في خلايا GCP الأولية.

Abstract

السيليوم الأولي هو عضية إشارات حرجة موجودة في كل خلية تقريبا تنقل محفزات إشارات القنفذ (Hh) من سطح الخلية. في سلائف الخلايا الحبيبية (GCP) ، يعمل السيليوم الأولي كمركز إشارات محوري ينظم تكاثر خلايا السلائف عن طريق تعديل مسار إشارات Hh. يتم تسهيل التحقيق في آلية إشارات Hh الأولية المعتمدة على السيليوم من خلال التلاعب الجيني في المختبر لمكونات المسار لتصور توطينها الديناميكي إلى السيليوم الأولي. ومع ذلك ، فإن نقل الجينات المحورة في الثقافات الأولية ل GCPs باستخدام طرق electroporation المعروفة حاليا مكلف بشكل عام وغالبا ما يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا وكفاءة النقل غير المرغوب فيها. تقدم هذه الورقة بروتوكولا كهربائيا فعالا وفعالا من حيث التكلفة وبسيطا يوضح كفاءة نقل عالية تبلغ ~ 80-90٪ وجدوى الخلية المثلى. هذه طريقة تعديل وراثي بسيطة وقابلة للتكرار وفعالة تنطبق على دراسة مسار إشارات القنفذ الأولي المعتمد على السيليوم في مزارع GCP الأولية.

Introduction

تستخدم GCPs المخيخية على نطاق واسع لدراسة آلية مسار إشارات Hh في أنواع الخلايا السلفية العصبية بسبب وفرتها العالية وحساسيتها العالية لمسار إشارات Hh في الجسم الحي1,2,3,4. في GCPs ، يعمل السيليوم الأولي كمركز محوري لنقل إشارة Hh5 الذي ينظم تكاثر خلايا السلائف6,7,8. غالبا ما يكون التصور المختبري لمكونات إشارات Hh على السيليوم الأساسي أمرا صعبا بسبب انخفاض مستوياتها القاعدية الذاتية. وبالتالي ، فإن تعديل الجينات المحورة لمستويات التعبير عن البروتين ووضع علامات الفلوروفور على الجين محل الاهتمام هي طرق مفيدة لدراسة المسار بدقة جزيئية. ومع ذلك، فإن التلاعب الجيني بالمزارع الأولية لبرنامج GCP باستخدام نهج النقل القائمة على الجسيمات الشحمية غالبا ما يؤدي إلى انخفاض كفاءة النقل، مما يعوق إجراء المزيد من التحقيقات الجزيئية9. يزيد التفريغ الكهربائي من الكفاءة ولكنه يتطلب عادة كواشف كهربائية باهظة خاصة بالبائع ومقيدة بنوع الخلية10.

تقدم هذه الورقة طريقة كهربية عالية الكفاءة وفعالة من حيث التكلفة لمعالجة مكونات مسار إشارات Hh في الثقافات الأولية ل GCP. باستخدام بروتوكول الإلكتروبوراتيون المعدل هذا، تم تسليم بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسوم بالجين المتحول السلس (pEGFP-Smo) بكفاءة إلى GCPs وحقق معدلات عالية من بقاء الخلايا ونقلها (80-90٪). وعلاوة على ذلك، وكما يتضح من التلطيخ الكيميائي المناعي، أظهرت GCPs المنقولة حساسية عالية للتنشيط الناجم عن الناهض السلس لمسار إشارات Hh عن طريق الاتجار ب EGFP-Smo إلى الأهداب الأولية. يجب أن يكون هذا البروتوكول قابلا للتطبيق بشكل مباشر ومفيدا للتجارب التي تنطوي في المختبر على تعديل جيني لأنواع الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل مزارع الخلايا الأولية البشرية والقوارض ، وكذلك الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للتعامل مع الحيوانات والبروتوكول الذي وافقت عليه وزارة الصحة في هونغ كونغ. تم الحصول على تراخيص التجارب على الحيوانات بعد قانون الحيوانات (مراقبة التجارب) (الفصل 340) من وزارة الصحة ، حكومة هونغ كونغ. تم تنفيذ العمل الحيواني وفقا لأخلاقيات سلامة الحيوان المعتمدة من قبل مكتب أبحاث HKBU ولجنة سلامة المختبرات. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد ما قبل التجربة

  1. إعداد وسائل الإعلام الثقافية والحواجز
    1. وسط خال من المصل (SFM)
      1. لإعداد 50 مل من SFM ، أضف 500 ميكرولتر من 100x L-glutamine بديل ، و 500 ميكرولتر من البنسلين الستربتومايسين ، و 1 mM من بيروفات الصوديوم ، و 12.5 ميكرولتر من 1 M KCl (النهائي 250 ميكرومتر) إلى 49 مل من الوسط العصبي القاعدي.
      2. قسم SFM إلى 2 درجة حرارة من 10 مل و 40 مل في أنابيب مخروطية سعة 50 مل وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    2. وسيط حجب الهضم: 10٪ FBS في SFM
      1. أضف 1.1 مل من FBS المعطل للحرارة إلى 10 مل من SFM لإعداد وسط مانع للهضم.
    3. وسيط ثقافة GCP: SFM مع B27
      1. لتحضير وسط زراعة GCP، أضف 800 ميكرولتر من مكمل B-27 الخالي من المصل إلى 40 مل من SFM.
        ملاحظة: يمكن تخزين SFM المكمل B-27 عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. ومع ذلك ، فإن وسائل الإعلام المعدة حديثا تنتج نتائج مثالية.
    4. المخزن المؤقت للتشريح: EBSS مع الجلوكوز + HEPES
      1. أضف 6 جم / لتر من الجلوكوز إلى محلول الملح المتوازن الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم (EBSS) الذي يحتوي على 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid).
      2. تعقيم المحلول عن طريق المرور عبر مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    5. المخزن المؤقت للهضم
      ملاحظة: تحضير طازجة قبل الاستخدام.
      1. تحضير 2 مل من المخزن المؤقت للهضم لهضم 2-4 أنسجة مخيخية و 4 مل ل 4-10 أنسجة. لإعداد 4 مل من المخزن المؤقت للهضم ، قم بإذابة 1.5 ملغ من L-cysteine (التركيز النهائي 200-400 ميكروغرام / مل) في 4 مل من EBSS. اقلب الأنبوب مرارا وتكرارا حتى يذوب المسحوق بالكامل.
      2. تعقيم المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر ومحقنة 5 مل ، ونقل المحلول إلى طبق معقم لزراعة الخلايا 35 مم.
      3. أضف 4 ميكرولتر من الغراء (تخفيف 1:1000 من تركيز مخزون 20 وحدة/ملغ) و40 ميكرولتر من DNase I (تخفيف 1:100 من مخزون 10 ملغم/مل لتركيز نهائي قدره 0.1 ملغم/مل).
      4. احتضن المحلول عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 لمدة 30 دقيقة على الأقل أو حتى الاستخدام.
        ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتنشيط غراء. للحصول على أفضل النتائج، لا تتجاوز 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تأكد من أن المحلول يتحول إلى شفاف ولا توجد رواسب بيضاء قبل الاستخدام.
  2. أغطية الطلاء المسبق
    1. لإعداد الأغطية لربط الخلايا، قم باحتضان أغطية زجاجية معقمة مقاس 12 مم مع 100 ميكروغرام/مل من البولي دي ليسين (PDL، 1 ملغم/مل في dH2O المعقم) لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية. احتفظ بأغطية الغطاء في نفس محلول PDL عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    2. في يوم زراعة الخلايا الأولية ، اجمع PDL في أنبوب مخروطي نظيف واشطف الأغطية ثلاث مرات باستخدام dH2O المعقم جيدا لإزالة PDL المتبقي.
      ملاحظة: يمكن تخزين PDL عند 4 درجات مئوية لإعادة الاستخدام.
    3. انقل الأغطية الزجاجية المطلية ب PDL إلى صفيحة مكونة من 24 بئرا عن طريق وضع غطاء واحد في كل بئر.
    4. قم بإزالة الماء الزائد وأضف 200-300 ميكرولتر من Matrigel (أعيد تشكيله وفقا للتعليمات الواردة في ورقة بيانات المنتج في DMEM-F12 الخالي من المصل) لتغطية الأغطية بالكامل.
    5. احتضن الأغطية في Matrigel لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 .
      ملاحظة: قم بإزالة Matrigel قبل بذر الخلايا. يمكن جمع هذا Matrigel وتخزينه عند 4 درجات مئوية لإعادة الاستخدام المتعدد.
  3. إعداد طبق الاستزراع التحضيري
    1. قم بطلاء طبق زراعة الخلايا 60 مم ب 2 مل من 100 ميكروغرام / مل PDL (أعد تشكيل محلول مخزون PDL 1 مجم / مل في dH2O المعقم) عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. مباشرة قبل بذر الخلايا ، قم بإزالة وجمع PDL المستخدم في أنبوب مخروطي نظيف وتخزينه عند 4 درجات مئوية لإعادة الاستخدام المتعدد. شطف وغسل الطبق المغلف PDL ثلاث مرات مع dH2O المعقمة.
    3. استخدم طبقا واحدا من زراعة الخلايا 60 مم لخلايا البذور التي يتم حصادها من 2 أنسجة مخيخ كاملة كحد أقصى.
    4. قم بإعداد أطباق استزراع إضافية للمخيخ الإضافي.
      ملاحظة: راجع الخطوتين 2-1-18 و2-1-19 للاطلاع على استخدام طبق الاستزراع التحضيري.

2. يوم تجريبي 0

  1. عزل وزراعة GCPs الأولية للماوس
    ملاحظة: تم تعديل طريقة ثقافة GCP من بروتوكول قياسي ، وتم وصف البروتوكول الموجز بإيجاز في عملنا السابق6,11,12. للحصول على العائد الأمثل ل GCP ، استخدمي جراء ما بعد الولادة (P) في اليوم 6 أو P7 لعزل GCP. أكمل خطوات التشريح التالية 2.1.6-2.1.10 في أسرع وقت ممكن للحصول على البقاء الأمثل للخلية.
    1. SFM قبل الدفء ، وسط حجب الهضم ، وسط الثقافة ، و Opti-MEM عند 37 درجة مئوية أثناء التشريح.
    2. على مقعد نظيف ، قم بمسح جميع أجهزة التشريح في 70٪ من الإيثانول للتطهير.
    3. املأ طبق زراعة الخلايا مقاس 60 مم ب 2-3 مل من المخزن المؤقت للتشريح وقم بتبريده على الثلج.
    4. قم بإعداد المخزن المؤقت الطازج للهضم كما هو موضح في القسم 1.1.5 واجعله دافئا عند 37 درجة مئوية.
    5. استخدم 70٪ من الإيثانول لمسح رأس الجرو للتطهير.
    6. قطع رأس الجرو دون تخدير. استخدم الملقط لحمل الرأس والمقص الجراحي المعقم للقطع من الجزء الخلفي من الجمجمة لقطع رأس الجرو. قم بإزالة الجلد والجمجمة بعناية للكشف عن الدماغ باستخدام الملقط.
    7. استخدم الملقط لقرصة المخيخ وانقعه بسرعة في المخزن المؤقت للتشريح المبرد مسبقا المعد في الخطوة 2.1.3.
    8. قم بإزالة السحايا مع المخيخ المغمور في المخزن المؤقت للتشريح تحت مجهر تشريح. يجب أن تظهر السحايا الغنية بالأوعية الدموية وردية اللون تحت المجهر التشريحي.
    9. إزالة جميع السحايا باستخدام ملقط.
      ملاحظة: يجب أن يكون للمخيخ بدون سحايا مظهر أبيض.
    10. قم بإزالة أي أنسجة دماغية متوسطة مرئية والضفيرة المشيمية من المخيخ.
    11. انقل المخيخ إلى طبق استزراع 35 مم مملوء مسبقا بمخزن مؤقت للهضم الدافئ تم إعداده في الخطوة 2.1.4. تجنب نقل المخزن المؤقت للتشريح الزائد. قطع المخيخ إلى قطع دقيقة باستخدام مقص microspring في أسرع وقت ممكن.
    12. احتضن المخيخ المفروم على الفور عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاضنة CO2 . قم بتمديد وقت الحضانة إلى 20 دقيقة إذا كان سيتم معالجة أكثر من 4 مخيخ.
      ملاحظة: بعد الحضانة ، سوف تتجمع الأنسجة معا.
    13. انقل الأنسجة المهضومة على الفور إلى الجزء السفلي من أنبوب طرد مركزي معقم جديد سعة 15 مل باستخدام غطاء طرف ماصة P1000 مع وسيط مانع للهضم (تجنب نقل المخزن المؤقت للهضم).
    14. أضف حجما مناسبا من وسط حجب الهضم (1 مل لمخيخ واحد) لإنهاء الهضم والماصة لأعلى ولأسفل بلطف 30 مرة باستخدام أنبوبة صغيرة P1000 لزيادة فصل الأنسجة إلى تعليق أحادي الخلية. تجنب تكوين فقاعة الهواء.
    15. مرر تعليق الخلية بلطف عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي معقم جديد لإزالة كتل الخلايا.
    16. مرر 1 مل إضافي من وسط حجب الهضم الطازج عبر مصفاة الخلية لجمع الخلايا المتبقية من مصفاة الخلية.
    17. جهاز الطرد المركزي الترشيح في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بإزالة supernatant وأعد تعليق الكريات ب 1 مل من SFM. كرر هذه الخطوة مرتين. تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
    18. أعد تعليق الكريات في حجم نهائي قدره 2 مل من وسط زراعة GCP وانقل تعليق الخلية إلى طبق الاستزراع المسبق 60 مم المطلي ب PDL المعد في الخطوة 1.3. الحضانة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 .
      ملاحظة: لا تتجاوز 20 دقيقة.
    19. بعد الحضانة ، انقر فوق طبق الثقافة من الجانب لإزاحة خلايا GCP الملتصقة بشكل فضفاض. اجمع خلايا GCP الملتصقة في وسط الثقافة عن طريق السحب اللطيف باستخدام ماصة P1000. اجمع نظام تعليق GCP هذا في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. تخلص من الطبق مقاس 60 مم.
      ملاحظة: ستبقى الخلايا الدبقية النجمية والخلايا الليفية الملتصقة بشدة متصلة بقاع الطبق الذي يبلغ طوله 60 مم وسيتم فصلها في هذه الخطوة. إن حذف هذه الخطوة سيضر بنقاء ثقافة GCP.
    20. عد الخلايا وانتقل إلى الكهربية على الفور.
  2. يوم في المختبر (DIV) 0: Electroporation ل Hh مستقبلات عبر الجينات التعبير: pEGFP-Smo
    1. بالنسبة للتبخر الكهربائي باستخدام كوفيت فجوة 2 مم ، قم بإعداد خليط كهربية خلايا البلازميد التالي لكل تفاعل من إلكتروباتوريشن: 1.2 × 106 خلايا و 10 ميكروغرام من pEGFP-mSmo (اضبط تركيز مخزون الحمض النووي إلى ~ 2-5 ميكروغرام / ميكرولتر في المخزن المؤقت Tris-EDTA أو dH2O المعقم) في 100 ميكرولتر من Opti-MEM.
      ملاحظة: تقليل إجمالي عدد الخلايا إذا كانت الخلايا غير كافية (على الرغم من أن هذا قد يقلل من كفاءة electroporation). ومع ذلك ، لا تقم بضبط كمية البلازميد ولا الحجم الإجمالي ل Opti-MEM المستخدم لكل كوفيت. إذا تجاوز العدد الإجمالي للخلية المطلوبة للتجربة 1.5 × 106 خلايا، فقم بتوسيع نطاق خليط الكهربية وفقا لذلك وقم بإجراء تفاعلات كهربائية متعددة بشكل منفصل. يمكن إعادة استخدام الكوفيت حتى 5 مرات.
    2. قم بإعداد صفيحة بذر الخلايا بعد الكهربية عن طريق إضافة 0.5 مل من وسط الاستزراع إلى كل بئر من لوحة الاستزراع المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على أغطية مغلفة (من الخطوة 1.2) واحتفظ بها دافئة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 .
    3. من الخطوة 2.1.20 ، قم بتقطيع العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل وقم بالدوران عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من supernatant وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من Opti-MEM. كرر هذه الخطوة مرتين باستخدام Opti-MEM لضمان عدم وجود وسيط استزراع متبقي في الأنبوب
      ملاحظة: لكل بئر / غطاء صفيحة 24 بئرا ، الكهروبورات والبذور 1.2-1.3 × 106 خلية / بئر للحصول على ~ 70-75 ٪ التقاء الخلايا في اليوم التالي من الثقافة.
    4. اضبط معلمات الإلكتروباتوريون كما هو موضح في الجدول 1.
    5. ماصة تفاعل electroporation بلطف لخلط جيدا واستخدام طرف P200 طويل لنقل حجم دقيق من 100 ميكرولتر من الخليط إلى كوفيت الفجوة 2 مم. تجنب تشكيل الفقاعات.
    6. ضع الكوفيت في غرفة الكوفيت.
    7. اضغط على زر Ω الخاص بالمؤنث الكهربائي (انظر جدول المواد) وقم بتدوين قيمة المعاوقة ، والتي يجب أن تكون ~ 30-35. لضمان أن قيمة المعاوقة الكهربائية Ω تقع ضمن نطاق 30-35 ، التزم بحجم دقيق يبلغ 100 ميكرولتر.
    8. اضغط على زر البدء لبدء النبض.
    9. سجل قيم التيار المقاس والجول الموضح في إطار القراءة.
    10. قم بإزالة الكوفيت من غرفة الكوفيت.
    11. أضف على الفور 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع المحموم مسبقا إلى الكوفيت وأعد تعليقه عن طريق السحب اللطيف لأعلى ولأسفل 2-3 مرات. انقل تعليق الخلية على الفور إلى لوحة 24 بئرا المعدة في الخطوة 2.2.2.
      ملاحظة: لتقليل موت الخلايا، قم بزرع الخلايا مباشرة بعد التفريغ الكهربائي.
    12. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 . اترك الخلايا دون إزعاج لمدة 3 ساعات لتجنب انفصال الخلايا.
    13. في الساعة 3 بعد البذر ، قم بشفط نصف الوسط الفائق بلطف وتخلص منه لإزالة الخلايا الميتة العائمة والحطام واستبداله بنفس الكمية من وسط الاستزراع قبل الدفء.
    14. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 وتجديد نصف الوسط كل يومين.
    15. راقب الخلايا تحت المجهر الفلوري في اليوم التالي ، أي DIV1 (الشكل 1) لإشارة GFP لتحديد كفاءة التعبير المفرط ل Smo.
    16. لتحفيز مسار إشارات Hh على DIV 1 بعد تجديد نصف الوسط ، أضف ناهض 0.2 ميكرومتر الناعم (SAG) إلى الخلايا مع إضافة حجم متساو من DMSO إلى عنصر التحكم. احتضان لمدة 24 ساعة قبل تثبيت الخلية.
      ملاحظة: حافظ على إضافة حجم DMSO/SAG إلى أدنى مستوى ممكن. هنا ، تمت إضافة 0.5 ميكرولتر DMSO أو 0.5 ميكرولتر من 0.2 mM SAG لكل 500 ميكرولتر من الوسط لكل بئر ، وهي نسبة تخفيف تبلغ 1: 1000.

3. DIV 2: تصور الأهداب الأولية والتحقيق في مسار إشارات Hh

  1. تثبيت الخلايا
    1. في 24 ساعة بعد العلاج ، قم بإزالة وسط المزرعة وشطف الخلايا 2-3 مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) باستخدام ماصة باستور يمكن التخلص منها مع تجنب إزاحة الخلايا.
    2. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة ~ 400 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (أعدت في PBS) واحتضان في RT لمدة 10 دقائق.
    3. شطف وغسل 2-3 مرات مع PBS باستخدام ماصة باستور يمكن التخلص منها.
    4. تخزينها في PBS في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أشهر أو المضي قدما في التلطيخ المناعي.
  2. تلطيخ كيميائي مناعي ل GCPs وعلامة السيليوم الأولية
    1. في طبق من 24 بئرا ، اغسل الخلايا مرتين في PBS مع اهتزاز لطيف لمدة 5 دقائق في كل مرة.
    2. أضف 0.5 مل من كلوريد الأمونيوم 100 ملليمتر إلى الخلية واحتضن في RT لمدة 10 دقائق لإخماد المثبت.
    3. شطف مرة واحدة وغسل 2-3 مرات مع PBS مع هز لطيف لمدة 10 دقائق في كل مرة.
    4. ماصة بلطف 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (BB: 0.1٪ Triton X-100 ، 1٪ BSA ، 2٪ مصل الحصان المعطل للحرارة في PBS) على قطعة من parafilm لتشكيل قطرة بدون فقاعات هواء.
    5. انقل الغطاء برفق من البئر إلى قطرة BB مع توجيه الجانب المزروع بالخلية لأسفل. احتضان الخلايا مع BB في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة في RT.
    6. تحضير مزيج الأجسام المضادة الأولية في BB كما هو موضح في جدول المواد. لفحص الخلايا ذات الأجسام المضادة الأولية ، كرر الخطوتين 3.2.4 و 3.2.5 ، مع استبدال BB بمزيج الأجسام المضادة الأساسي. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد الأساسي لمدة 2 ساعة في RT.
    7. باستخدام الملقط ، انقل الأغطية مرة أخرى إلى اللوحة المكونة من 24 بئرا مع توجيه الجانب المزروع بالخلايا لأعلى. شطف الخلايا مرة واحدة وغسل 3-4 مرات في PBS مع هز لطيف لمدة 10 دقائق في كل مرة.
    8. تحضير مزيج الأجسام المضادة الثانوية في BB كما هو موضح في جدول المواد. لاحتضان الخلايا بالجسم المضاد الثانوي ، كرر الخطوتين 3.2.4 و 3.2.5 ، مع استبدال BB بمزيج الأجسام المضادة الثانوي. احتضن في الظلام لمدة 1 ساعة في RT.
    9. كرر الخطوة 3.2.7 لغسل حضانة الأجسام المضادة بعد المرحلة الثانوية.
    10. قم بتركيب زلة الغطاء على شريحة زجاجية مجهرية نظيفة باستخدام وسيط التركيب.
    11. جفف الشريحة في الظلام طوال الليل وانتقل إلى التصوير البؤري13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام Opti-MEM (انظر جدول المواد) ككاشف عالمي ، يمكن لمنهجية electroporation المقترحة هذه تحقيق كفاءة عالية باستمرار في الكهربية بنسبة ~ 80-90٪ (الشكل 1). تم تحديد كفاءة التفريغ الكهربائي لناقل Smo-EGFP في DIV 2 بعد الإلكتروبورات عن طريق القياس الكمي للنسبة المئوية للخلايا الإيجابية الفلورية الخضراء في جميع خلايا GCP التي تعبر عن البروتين المربع المقترن -6 (Pax6). وبدت كفاءة التحليل الكهربائي للمجموعات المعالجة ب DMSO وSAG قابلة للمقارنة (الشكل 1 والجدول 2).

وبالإضافة إلى ذلك، فإن التلطيخ المناعي لعلامة السيليوم الأولية، Arl13b، يوضح أن معدل هدب GCP في DIV 2 من الثقافة كان ~ 18٪ في كل من المجموعات المعالجة بالمركبات و SAG (DMSO: 17.35٪ ± 0.59٪; SAG: 18.24٪ ± 0.88٪). ويوضح معدل الهدب كنسبة مئوية من GCPs المعبرة عن Pax6 التي تحمل سيليوم أولي (Arl13b-positive) على سطح الخلية في DIV 2 بعد الإلكتروبوراتيون (الشكل 2 والجدول 3).

لفك رموز مسار إشارات Hh الأساسي المعتمد على السيليوم ، تم استخدام ناهض Smo ، SAG ، لتنشيط مسار إشارات Hh. عند تنشيط مسار Hh ، يتم إثراء مستقبل Smo في محور السيليوم الأساسي14. تظهر نتائجنا زيادة كبيرة في توطين Smo-EGFP على محور السيليوم الأولي لخلايا GCP المعبرة عن Pax6 في 24 ساعة بعد معالجة SAG (الشكل 3 ، بيانات القياس الكمي المعدلة من العمل السابق6) ، مما يشير إلى تنشيط عميق لمسار إشارات Hh الأساسي المعتمد على السيليوم.

Figure 1
الشكل 1: إعداد Electroporation وكفاءة electroporation من GCPs. (أ) إعداد الكهرباء. يمين ، يشير رأس السهم الأسود إلى كوفيت الكهربية. (ب، ج) تصور الصور التمثيلية الكفاءة الكهربائية لمتجه Smo-EGFP المحددة عن طريق القياس الكمي للنسبة المئوية للخلايا الموجبة ل GFP في جميع خلايا GCP المعبرة عن Pax6 (الجدول 2). تصور الصور التمثيلية إشارات الفلورسنت الخضراء على خلايا GCP (البنفسجية) المعبرة عن Pax6 على DIV 2 بعد العلاج الكهربائي بعد 24 ساعة باستخدام (B) DMSO و (C) SAG. تم تصنيف النوى ب DAPI (أزرق). أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: GCPs = سلائف الخلايا الحبيبية. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. Pax6 = بروتين مربع مقترن-6 ; DIV = يوم في المختبر; DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد; SAG = ناهض ناعم؛ DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: النسبة المئوية للهدب على DIV 2 من الثقافة الأولية GCP. (A ، B) الصور التمثيلية تصور النسبة المئوية للهدب على DIV 2 من الثقافة الأولية GCP. تصور الصور التمثيلية الأهداب الأولية (الخضراء) على خلايا GCP (الحمراء) المعبرة عن Pax6 على DIV 2 بعد العلاج الكهربائي بعد 24 ساعة باستخدام (A) DMSO و (B) SAG. تم تصنيف النوى ب DAPI (أزرق). يشار إلى السيليوم الأساسي (الأخضر) برؤوس أسهم بيضاء. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر (C) يوضح الرسم البياني بيانات القياس الكمي ل 4 تجارب مستقلة. التحليل الإحصائي ، اختبار t للطالب غير المقترن. أشرطة الخطأ تصور ±SEM. الاختصارات: GCP = سلائف الخلايا الحبيبية. Pax6 = بروتين مربع مقترن-6 ; DIV = يوم في المختبر; DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد; SAG = ناهض ناعم؛ DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; n.s. = غير مهم; SEM = الخطأ المعياري للمتوسط ؛ Arl13b = بروتين يشبه عامل الريبوسيل ADP 13B. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: زيادة توطين Smo على السيليوم الأولي لخلايا GCP المعبرة عن Pax6 عند علاج SAG. (أ) تصور الصور التمثيلية توطين Smo-EGFP (الأخضر) على السيليوم الأولي (مربع مربع أحمر وأبيض) على خلايا GCP المعبرة عن Pax6 (البنفسجي) في DIV 2 بعد المعالجة الكهربائية بعد 24 ساعة باستخدام DMSO و SAG. تم تصنيف النوى ب DAPI (أزرق). أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر (B) يوضح الرسم البياني بيانات القياس الكمي ل 4 تجارب مستقلة. التحليل الإحصائي ، اختبار t غير المقترن للطالب. ف ≤ 0.001. أشرطة الخطأ تصور ± SEM. المجموع n لمجموعة DMSO = 97، المجموع n لمجموعة SAG = 130. تم تعديل الشكل 3B من 6. الاختصارات: GCP = سلائف الخلايا الحبيبية. Smo = ناعم. Pax6 = بروتين مربع مقترن-6 ; DIV = يوم في المختبر; DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد; SAG = ناهض ناعم؛ DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; SEM = الخطأ المعياري للمتوسط ؛ Arl13b = بروتين يشبه عامل الريبوسيل ADP 13B. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إعداد نبض المسام إعداد نقل النبض
GCPs الأساسية للماوس الخلايا العصبية الأولية GCPs الأساسية للماوس الخلايا العصبية الأولية
ضغط 275 فولت 275 فولت 20 فولت 20 فولت
طول 1 مللي ثانية 0.5 مللي ثانية 50 مللي ثانية 50 مللي ثانية
فترة 50 مللي ثانية 50 مللي ثانية 50 مللي ثانية 50 مللي ثانية
لا. 2 2 5 5
معدل D 10% 10% 40% 40%
قطبيه + + ± ±

الجدول 1: معلمات التبخر الكهربائي ل GCPs الأولية للفئران والخلايا العصبية الأولية باستخدام Super Electroporator NEPA21 TYPE II. اختصار: GCP = سلائف الخلايا الحبيبية.

كفاءة الكهربية إكسب 1 (ن = 486) Exp. 2 (n = 1314) إكسب 3 (ن = 704) إكسب 4 (ن = 476) متوسط
المجموعة المعالجة ب DMSO 90.57٪ ± 10.12٪ 96.62٪ ± 3.09٪ 98.89٪ ± 0.97٪ 90.72٪ ± 11.31٪ 94.02٪ ± 1.36٪
المجموعة المعالجة ب SAG 91.8٪ ± 8.69٪ 79.97٪ ± 2.77٪ 89.35٪ ± 5.67٪ 88.59٪ ± 13.54٪ 87.42٪ ± 1.71٪
متوسط كفاءة الكهربية 91.31٪ ± 7.99٪ 88.27٪ ± 10.81٪ 94.12٪ ± 6.36٪ 89.65٪ ± 11.21٪ 90.84٪ ± 0.84٪

الجدول 2: الكفاءة الكهربائية لمتجه Smo-EGFPمحددة كميا لنسبة الخلايا الموجبة ل GFP في جميع خلايا GCP المعبرة عن Pax6. يتم عرض بيانات أربع تجارب مستقلة (Exp.). (المجموع n = 2980). الاختصارات: Smo = سلس. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. GCP = سلائف الخلايا الحبيبية. Pax6 = بروتين مربع مقترن-6.

إكسب 1 إكسب 2 إكسب 3 إكسب 4 متوسط
معدل التهذيب - DMSO 18.88٪ ± 3.61٪ 19.58٪ ± 7.42٪ 16.60٪ ± 1.48٪ 14.35٪ ± 7.99٪ 17.35٪ ± 0.59٪
معدل الهدب - SAG 13.93٪ ± 3.39٪ 17.30٪ ± 2.15٪ 22.19٪ ± 10.35٪ 19.56٪ ± 1.15٪ 18.24٪ ± 0.88٪

الجدول 3: النسبة المئوية للهدب في DIV 2 من الثقافة الأولية لبرنامج GCP. يتم عرض بيانات أربع تجارب مستقلة (Exp.). (المجموع n لمجموعة DMSO = 1169 ، المجموع n لمجموعة SAG = 816). الاختصارات: GCP = سلائف الخلايا الحبيبية. DIV = يوم في المختبر; DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد; SAG = ناهض ناعم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عادة ما يرتبط نقل الجينات المحورة في ثقافة GCP الأولية عن طريق طريقة electroporation بانخفاض صلاحية الخلايا وضعف كفاءة النقل9,10. تقدم هذه الورقة بروتوكولا كهربائيا فعالا من حيث التكلفة وقابلا للتكرار أظهر كفاءة عالية وقابلية للتطبيق. بالإضافة إلى ذلك ، نعرض أيضا طريقة مباشرة لدراسة مسار إشارات Hh الأساسي المعتمد على السيليوم في خلايا GCP الأولية.

غالبا ما تتطلب طرق التفريغ الكهربائي الشائعة الأخرى كواشف كهربائية مكلفة خاصة بنوع الخلية يجب شراؤها من شركات تصنيع محددة. تعتبر الطريقة الموضحة هنا مواتية لأنها تستخدم كاشفا كهربائيا شائعا واقتصاديا لأنواع الخلايا المختلفة. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه البيانات أن كفاءة electroporation وصلت إلى ~ 80-90 ٪ ، وهي كفاءة عالية مقارنة بطرق electroporation و transfection الأخرى9,10.

للحفاظ على قدرة أعلى على البقاء في الخلية ، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب على المرء أن يأخذها في الاعتبار. يجب إكمال إجراءات تشريح المخيخ والتفكك في أقصر فترة زمنية ممكنة من 1-2 ساعة. خطوة حاسمة أخرى هي تجنب تكوين فقاعة في خليط البلازميد الخلوي الكهربائي قبل النبضات أثناء الإلكتروبوراتيون. بعد النبضات ، يجب إضافة وسط الثقافة المحتشد مسبقا على الفور إلى الكوفيت والخلايا المزروعة في أسرع وقت ممكن. يجب أن تكون الخلايا دون إزعاج في أول 3 ساعات بعد بذر الخلية. ستعزز الاحتياطات المذكورة أعلاه صلاحية الخلية بنسبة تصل إلى حوالي 70-80٪ في اليوم الثاني من الثقافة.

أحد القيود الملحوظة لدراسة السيليوم الأولي في منصة الاستزراع الأولي هو أن معدل الهدب في الخلايا المستزرعة أقل عموما من ذلك الذي لوحظ في الجسم الحي. أظهرت البيانات السابقة 6 أن معدل الهدب في الجسم الحي على GCP في كل من E15.5 و P15 كان حوالي 60-80٪. في المقابل ، كان معدل الهدب في المختبر في ثقافة GCP الأولية ~ 20٪ 6. ومع ذلك ، هذه ظاهرة عامة يمكن تمييزها عبر معظم أنواع الخلايا (إن لم يكن كلها) عند مقارنة معدل الهدب بين الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي .

ومن الجدير بالذكر أن هذه الطريقة تنطبق أيضا على الثقافات الأولية الأخرى مثل الخلايا السلفية العصبية وثقافة الخلايا العصبية القشرية والحصين ، والتي يمكن تحقيقها عن طريق تعديل معلمة electroporation ، أي جهد نبضة الاختراق وطولها وعدد النبضات. لتوسيع نطاق تطبيق هذا البروتوكول ليشمل مجالا أوسع من الدراسة ، يتم توفير معلمات التبخر الكهربائي الموصى بها للخلايا العصبية الأولية في الجدول 1. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد كاشف electroporation العالمي ، أي Opti-MEM المستخدم في هذا البروتوكول أيضا على تجنب جهد التحسين الإضافي الممل مقارنة ببروتوكولات electroporation الأخرى التي تتطلب التحسين فيما يتعلق بتوافق الكاشف. ويمكن استخدام بروتوكول الإلكتروبوراتيون الأمثل والفعال من حيث التكلفة للتحقيق في إشارات السيليوم الأولية وإشارات Hh في مزارع GCP الأولية كإجراء مرجعي للدراسات الأولية الأخرى المتعلقة بالسيليوم باستخدام الثقافات الأولية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في المصالح ليعلنا.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل صندوق HKBU التأسيسي ومنحة بدء التشغيل من المستوى 2 (RG-SGT2/18-19/SCI/009) ، ومجلس المنح البحثية - صندوق البحوث التعاونية (CRF-C2103-20GF) إلى C.H.H. Hor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
  3. Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
  4. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
  5. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
  6. Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
  7. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
  8. Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
  9. Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
  10. Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
  11. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
  12. Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
  13. Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
  14. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 177 ، الأهداب الأولية ، السلائف الحبيبية المخيخية ، في المختبر الكهربائي ، مسار إشارات القنفذ ، ثقافة GCP الأولية ، Smoothned
طريقة كهربية فعالة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة مسارات الإشارات الأولية المعتمدة على السيليوم في سلائف الخلايا الحبيبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C.… More

Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C. H. H. Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor. J. Vis. Exp. (177), e63283, doi:10.3791/63283 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter