Summary
Her presenterer vi en reproduserbar in vitro-elektroporasjonsprotokoll for genetisk manipulering av primære cerebellar granulatcelleforløpere (GCPer) som er kostnadseffektive, effektive og levedyktige. Videre demonstrerer denne protokollen også en enkel metode for molekylær studie av primære ciliumavhengige Hedgehog-signalveier i primære GCP-celler.
Abstract
Det primære ciliumet er en kritisk signalorganell som finnes på nesten alle celler som transduserer pinnsvin (Hh) som signaliserer stimuli fra celleoverflaten. I granulatcellens forløper (GCP) fungerer det primære ciliumet som et pivotalt signalsenter som orkestrerer forløpercelleproliferasjon ved å modulere Hh-signalveien. Undersøkelsen av primære cilium-avhengige Hh-signalmaskiner forenkles ved in vitro genetisk manipulering av banekomponentene for å visualisere deres dynamiske lokalisering til det primære ciliumet. Imidlertid er transfeksjon av transgenes i primærkulturene til fastleger ved hjelp av de kjente elektroporasjonsmetodene generelt kostbart og resulterer ofte i lav celle levedyktighet og uønsket transfeksjonseffektivitet. Dette dokumentet introduserer en effektiv, kostnadseffektiv og enkel elektroporasjonsprotokoll som demonstrerer en høy transfeksjonseffektivitet på ~ 80-90% og optimal celle levedyktighet. Dette er en enkel, reproduserbar og effektiv genetisk modifikasjonsmetode som gjelder for studiet av den primære ciliumavhengige Hedgehog-signalveien i primære GCP-kulturer.
Introduction
Cerebellar GCPs er mye brukt til å studere maskineriet til Hh-signalveien i nevronale stamcelletyper på grunn av deres høye overflod og høye følsomhet for Hh-signalveien i vivo1,2,3,4. I fastleger fungerer det primære ciliumet som et sentralt Hh-signaltransduksjonssenter5 som orkestrerer spredningen av forløpercellene6,7,8. In vitro visualisering av Hh-signalkomponenter på det primære ciliumet er ofte utfordrende på grunn av deres lave endogene basale nivåer. Derfor er transgene modifikasjon av proteinuttrykksnivåer og fluoroformerking av genet av interesse nyttige tilnærminger for å studere banen ved molekylær oppløsning. Imidlertid resulterer genetisk manipulering av GCP primærkulturer ved hjelp av liposombaserte transfeksjonsmetoder ofte i lav transfeksjonseffektivitet, noe som hindrer ytterligere molekylære undersøkelser9. Elektroporasjon øker effektiviteten, men krever vanligvis ublu leverandørspesifikke og celletypebegrensede elektroporasjonsreagenser10.
Dette dokumentet introduserer en høyeffektiv og kostnadseffektiv elektroporasjonsmetode for å manipulere Hh-signalveikomponentene i GCP primære kulturer. Ved hjelp av denne modifiserte elektroporasjonsprotokollen ble et grønt fluorescerende protein (GFP)-merket Smoothened transgene (pEGFP-Smo) effektivt levert til GCPer og oppnådde høy celleoverlevelse og transfeksjonshastigheter (80-90%). Videre, som det fremgår av immunocytokjemisk farging, viste de transfekterte fastlegene høy følsomhet for glattet agonistindusert aktivering av Hh-signalveien ved å smugle EGFP-Smo til det primære cilia. Denne protokollen skal være direkte anvendelig og gunstig for eksperimenter som involverer in vitro genetisk modifikasjon av celletyper som er vanskelige å transfektere, for eksempel menneskelige og gnagere primærcellekulturer, samt menneskeskapte pluripotente stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrerelaterte prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjer for dyrehåndtering og protokollen godkjent av Department of Health, Hong Kong. Dyreforsøkslisenser etter Animal (Control of Experiments) Ordinance (Cap. 340) ble hentet fra Department of Health, Hong Kong Government. Dyrearbeidet ble utført i samsvar med dyresikkerhetsetikken godkjent av HKBU Forskningskontor og Laboratoriets sikkerhetskomité. Se materialfortegnelsen hvis du vil ha mer informasjon om alle materialer som brukes i denne protokollen.
1. Preexperiment forberedelse
- Utarbeidelse av kulturmedier og buffere
- Serumfritt medium (SFM)
- For å forberede 50 ml SFM, tilsett 500 μL 100x L-glutaminerstatning, 500 μL Penicillin-Streptomycin, 1 mM natriumpyuvatt og 12,5 μL 1 M KCl (endelig 250 μM) til 49 ml nevrobasalt medium.
- Del SFM i 2 aliquots på 10 ml og 40 ml i 50 ml koniske rør og oppbevar dem ved 4 °C i opptil en måned.
- Fordøyelsesblokkeringsmedium: 10% FBS i SFM
- Tilsett 1,1 ml varmeinaktivert FBS til en 10 ml aliquot SFM for å forberede fordøyelsesblokkeringsmediet.
- GCP kulturmedium: SFM med B27
- For å forberede GCP kulturmedium, legg til 800 μL serumfritt B-27 supplement til en 40 ml aliquot SFM.
MERK: B-27-supplert SFM kan oppbevares ved 4 °C i opptil én måned. Nylagde medier gir imidlertid optimale resultater.
- For å forberede GCP kulturmedium, legg til 800 μL serumfritt B-27 supplement til en 40 ml aliquot SFM.
- Disseksjonsbuffer: EBSS med glukose + HEPES
- Tilsett 6 g/l glukose til kalsium- og magnesiumfri Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) som inneholder 10 mM HEPES (4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre).
- Steriliser oppløsningen ved å passere gjennom et 0,2 μm sprøytefilter og oppbevar det ved 4 °C for langvarig lagring.
- Fordøyelsesbuffer
MERK: Forbered deg på nytt før bruk.- Forbered 2 ml fordøyelsesbuffer for fordøyelsen av 2-4 cerebellar vev og 4 ml for 4-10 vev. For å forberede 4 ml fordøyelsesbuffer oppløses 1,5 mg L-cystein (sluttkonsentrasjon 200-400 μg/ml) i 4 ml EBSS. Snu røret gjentatte ganger til pulveret er helt oppløst.
- Steriliser oppløsningen med et 0,2 μm sprøytefilter og en 5 ml sprøyte, og overfør løsningen til en steril 35 mm cellekulturfat.
- Tilsett 4 μL papain (1:1000 fortynning fra en lagerkonsentrasjon på 20 enheter/mg) og 40 μL DNase I (1:100 fortynning fra en 10 mg/ml lager for en endelig konsentrasjon på 0,1 mg/ml).
- Inkuber oppløsningen ved 37 °C i en CO2-inkubator i minst 30 minutter eller til bruk.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for å aktivere papain. For optimale utfall må du ikke overstige 45 min ved 37 °C før bruk. Forsikre deg om at løsningen blir gjennomsiktig og at det ikke er noen hvite utfellinger før bruk.
- Serumfritt medium (SFM)
- Precoating dekslerlips
- For å klargjøre dekslene for celletilbehør, inkuber autoklavert 12 mm glassdeksler med 100 μg/ml poly-D-lysin (PDL, 1 mg/ml i steril dH2O) i minst 1 time ved 37 °C. Oppbevar dekslene i samme PDL-oppløsning ved 4 °C til bruk.
- På dagen for primærcellekultur, samle PDL i et rent konisk rør og skyll dekslene tre ganger med steril dH2O grundig for å fjerne gjenværende PDL.
MERK: PDL-en kan oppbevares ved 4 °C for gjenbruk. - Overfør de PDL-belagte glassdekslene på en 24-brønns plate ved å plassere en dekslelip i hver brønn.
- Fjern overflødig vann og tilsett 200-300 μL matrigel (rekonstituert i henhold til instruksjonene i produktdataarket i serumfri DMEM-F12) for å dekke dekslene fullt ut.
- Inkuber dekslene i matrigelen i 1 time ved 37 °C i CO2-inkubatoren.
MERK: Fjern matrigelen før cellesåing. Denne matrigelen kan samles og oppbevares ved 4 °C for flere gjenbruk.
- Tilberedning av preplating kulturrett
- Strøk en 60 mm cellekulturfat med 2 ml 100 μg/ml PDL (rekonstituer PDL-oppløsningen på 1 mg/ml i steril dH2O) ved inkubasjon ved 37 °C i 1 time.
- Umiddelbart før cellesåing, fjern og samle den brukte PDL i et rent konisk rør og oppbevar den ved 4 °C for flere gjenbruk. Skyll og vask den PDL-belagte retten tre ganger med steril dH2O. Lufttørk kulturfatet før cellesåing.
- Bruk en 60 mm cellekulturrett til frøceller høstet fra maksimalt 2 hele cerebellumvev.
- Forbered flere kulturretter for ekstra cerebellums.
MERK: Se trinn 2.1.18 og 2.1.19 for bruk av preplating kulturretten.
2. Eksperimentell dag 0
- Isolering og dyrking av musens primære fastleger
MERK: GCP-kulturmetoden ble endret fra en standardprotokoll, og den korte protokollen ble kort beskrevet i vårt tidligere arbeid6,11,12. For optimal GCP-utbytte, bruk postnatal (P) dag 6 eller P7 valper for isolering av GCP. Fullfør følgende disseksjonstrinn 2.1.6-2.1.10 så raskt som mulig for optimal celle levedyktighet.- Prewarm SFM, fordøyelsesblokkeringsmedium, kulturmedium og Opti-MEM ved 37 °C under disseksjonen.
- På en ren benk, presoak alle disseksjonsapparatet i 70% etanol for desinfeksjon.
- Fyll en 60 mm cellekulturfat med 2-3 ml disseksjonsbuffer og kjøl den på is.
- Forbered fersk fordøyelsesbuffer som beskrevet i pkt. 1.1.5 og hold den varm ved 37 °C.
- Bruk 70% etanol for å tørke hodet på valpen for desinfeksjon.
- Decapitate valpen uten anestesi. Bruk tang til å holde hodet og sterilisert kirurgisk saks for å kutte fra baksiden av skallen for å halshugge valpen. Fjern forsiktig huden og skallen for å avdekke hjernen ved hjelp av tang.
- Bruk tang til å klype av cerebellum og raskt suge det i den forhåndskjølte disseksjonsbufferen som ble utarbeidet i trinn 2.1.3.
- Fjern meningene med cerebellum nedsenket i disseksjonsbufferen under et dissekerende mikroskop. Blodkarberikede meninger skal virke rosa under dissekeringsmikroskopet.
- Fjern alle meningene ved hjelp av tang.
MERK: Et cerebellum uten meninger skal ha et hvitt utseende. - Fjern eventuelle synlige midbrainvev og choroid plexus fra cerebellum.
- Overfør cerebellum til en 35 mm kulturrett forhåndsfylt med varm fordøyelsesbuffer tilberedt i trinn 2.1.4. Unngå å overføre overflødig disseksjonsbuffer. Klipp cerebellum i fine biter ved hjelp av mikrospring saks så raskt som mulig.
- Inkuber straks hakket cerebellum ved 37 °C i 15 minutter i en CO2-inkubator. Utvid inkubasjonstiden til 20 min hvis mer enn 4 cerebellum skal behandles.
MERK: Etter inkubasjon vil vevet klumpe seg sammen. - Overfør straks det fordøyde vevet til bunnen av et nytt sterilt 15 ml sentrifugerør ved hjelp av en P1000 pipettespissforkjøp med fordøyelsesblokkeringsmedium (unngå å overføre fordøyelsesbuffer).
- Tilsett et passende volum av fordøyelsesblokkeringsmedium (1 ml for 1 cerebellum) for å avslutte fordøyelsen og pipetten forsiktig opp og ned ved hjelp av en P1000 mikropipette for å ytterligere dissosiere vevet til en encellet suspensjon. Unngå luftbobledannelse.
- Før celleopphenget forsiktig gjennom en 70 μm cellesil inn i et nytt sterilt sentrifugerør for å fjerne celleklumper.
- Send ytterligere 1 ml frisk fordøyelsesblokkeringsmedium gjennom cellesilen for å samle restceller fra cellesilen.
- Sentrifuger filtratet ved 200 × g i 5 min ved romtemperatur (RT). Fjern supernatanten og resuspend pellet med 1 ml SFM. Gjenta dette trinnet to ganger. Unngå å danne luftbobler.
- Resuspend pellet i et siste bind på 2 ml GCP kulturmedium og overfør cellefjæringen til den PDL-belagte 60 mm preplating kulturretten tilberedt i trinn 1.3. Inkuber i 15 min ved 37 °C i en CO2-inkubator .
MERK: Må ikke overstige 20 min. - Etter inkubasjon trykker du på kulturretten fra siden for å løsne de løst tilknyttede GCP-cellene. Samle de festende GCP-cellene i kulturmediet ved skånsom pipettering ved hjelp av en P1000 pipette. Samle denne GCP-fjæringen i et nytt 15 ml sentrifugerør. Kast den 60 mm fatet.
MERK: Sterkt tilhenger astroglia og fibroblastceller forblir festet på 60 mm parabolbunnen og vil bli skilt i dette trinnet. Å utelate dette trinnet vil kompromittere renheten til GCP-kulturen. - Tell cellene og fortsett til elektroporasjon umiddelbart.
- Dag in vitro (DIV) 0: Elektroporasjon for Hh-reseptortransgene overekspressjon: pEGFP-Smo
- For elektroporasjon ved hjelp av en 2 mm gap cuvette, forbered følgende plasmidcelleelektroporasjonsblanding for hver reaksjon av elektroporasjon: 1,2 × 106 celler og 10 μg pEGFP-mSmo (juster DNA-lagerkonsentrasjonen til ~ 2-5 μg / μL i Tris-EDTA-buffer eller steril dH2O) i 100 μL Opti-MEM.
MERK: Reduser det totale cellenummeret hvis cellene ikke er tilstrekkelige (selv om dette kan redusere elektroporasjonseffektiviteten). Du må imidlertid ikke justere mengden plasmid eller det totale volumet av Opti-MEM som brukes per cuvette. Hvis det totale cellenummeret som kreves for eksperimentet overstiger 1,5 × 106 celler, skalerer du opp elektroporasjonsblandingen tilsvarende og utfører flere elektroporasjonsreaksjoner separat. Cuvette kan gjenbrukes opptil 5 ganger. - Forbered post-elektroporasjonscellefrøplaten ved å tilsette 0,5 ml kulturmedium i hver brønn på den 24-brønns kulturplaten som inneholder belagte deksler (fra trinn 1.2) og hold den varm ved 37 °C i en CO2-inkubator .
- Fra trinn 2.1.20, pipette det nødvendige antall celler til et sterilt 1,5 ml mikrosenterrør og spinn ved 200 × g i 5 min ved RT. Kast supernatanten og resuspend cellepellet i 200 μL Opti-MEM. Gjenta dette trinnet to ganger med Opti-MEM for å sikre at det ikke finnes noe gjenværende kulturmedium i røret
MERK: For hver brønn/deksler på en 24-brønns plate, elektroporat og frø 1,2-1,3 × 106 celler/brønn for å oppnå ~70-75% cellesamfluens neste kulturdag. - Still inn parametrene for elektroporasjon som vist i tabell 1.
- Pipette elektroporasjonsreaksjonen forsiktig for å blande godt og bruk en lang P200-spiss for å overføre et nøyaktig volum på 100 μL av blandingen til 2 mm gap cuvette. Unngå å danne bobler.
- Plasser cuvette i cuvette kammeret.
- Trykk på Ω-knappen på elektroporatoren (se materialtabellen) og noter impedansverdien, som skal være ~ 30-35. For å sikre at den elektriske impedansverdien Ω faller innenfor området 30-35, hold deg til et presist volum på 100 μL.
- Trykk på startknappen for å starte pulsen.
- Registrer verdiene for den målte strømmen og joulene som vises på leserammen.
- Fjern cuvette fra cuvette kammeret.
- Tilsett umiddelbart 100 μL forhåndsvarslet kulturmedium i cuvette og resuspend det ved forsiktig pipettering opp og ned 2-3 ganger. Overfør umiddelbart cellefjæringen til 24-brønnsplaten som er fremstilt i trinn 2.2.2.
MERK: For å minimere celledød, frø cellene umiddelbart etter elektroporasjon. - Inkuber cellene ved 37 °C i en CO2-inkubator . La cellene være uforstyrret i 3 timer for å unngå celleavløsning.
- Ved 3 timers etter sådd aspirerer og kaster du forsiktig halvparten av det supernatante mediet for å fjerne flytende døde celler og rusk og erstatte med samme mengde forhåndsvarslet kulturmedium.
- Inkuber cellene ved 37 °C i CO2-inkubatoren og fyll opp halvparten av mediet annenhver dag.
- Vær oppmerksom på cellene under fluorescensmikroskopet neste dag, det vil si DIV1 (figur 1) for GFP-signal for å bestemme effektiviteten til Smo-overekspressering.
- For stimulering av Hh-signalveien på DIV 1 etter påfylling av halvparten av mediet, tilsett 0,2 μM Glattet agonist (SAG) til cellene mens du legger til et likt volum DMSO til kontrollen. Inkuber i 24 timer før cellefiksering.
MERK: Hold volumet av DMSO/SAG lagt til så lavt som mulig. Her ble 0,5 μL DMSO eller 0,5 μL 0,2 mM SAG tilsatt per 500 μL medium per brønn, noe som er et fortynningsforhold på 1:1000.
- For elektroporasjon ved hjelp av en 2 mm gap cuvette, forbered følgende plasmidcelleelektroporasjonsblanding for hver reaksjon av elektroporasjon: 1,2 × 106 celler og 10 μg pEGFP-mSmo (juster DNA-lagerkonsentrasjonen til ~ 2-5 μg / μL i Tris-EDTA-buffer eller steril dH2O) i 100 μL Opti-MEM.
3. DIV 2: Visualisering av primær cilia og undersøkelse av Hh-signalveien
- Cellefiksering
- Ved 24 timers etterbehandling, fjern kulturmediet og skyll cellene 2-3 ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) ved hjelp av en engangs Pasteur pipette mens unngå å løsne cellene.
- Fest cellene ved å legge til ~ 400 μL av 4% paraformaldehyd (tilberedt i PBS) og inkubere ved RT i 10 minutter.
- Skyll og vask 2-3 ganger med PBS med en pasteurpipette til engangsbruk.
- Oppbevares i PBS ved 4 °C i opptil 2 måneder eller fortsette med immunoppfatning.
- Immunocytokjemisk farging av fastleger og primær ciliummarkør
- I en 24-brønns plate vasker du cellene to ganger i PBS med skånsom risting i 5 minutter hver gang.
- Tilsett 0,5 ml 100 mM ammoniumklorid i cellen og inkuber ved RT i 10 minutter for å slukke fikseringsmiddelet.
- Skyll én gang og vask 2-3 ganger med PBS med skånsom risting i 10 minutter hver gang.
- Pipette forsiktig 30 μL blokkeringsbuffer (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% varmeinaktivert hesteserum i PBS) på et stykke parafilm for å danne et dråpe uten luftbobler.
- Overfør forsiktig dekslene fra brønnen til BB-dråpen med den cellefrøede siden vendt nedover. Inkuber cellene med BB i et fuktig kammer i 1 time ved RT.
- Forbered den primære antistoffblandingen i BB som vist i materialtabellen. For å sondere cellene med primært antistoff, gjenta trinn 3.2.4 og 3.2.5, og erstatt BB med den primære antistoffblandingen. Inkuber cellene med det primære antistoffet i 2 timer ved RT.
- Bruk tang, overfør dekslene tilbake til 24-brønnsplaten med cellefrøsiden vendt oppover. Skyll cellene en gang og vask 3-4 ganger i PBS med forsiktig risting i 10 minutter hver gang.
- Forbered den sekundære antistoffblandingen i BB som vist i materialtabellen. For å inkubere cellene med det sekundære antistoffet, gjenta trinn 3.2.4 og 3.2.5, og erstatt BB med den sekundære antistoffblandingen. Inkuber i mørket i 1 time på RT.
- Gjenta trinn 3.2.7 for post-sekundær antistoffinkubasjonsvask.
- Monter dekslene på en ren mikroskopisk glasssklie ved hjelp av monteringsmediet.
- Lufttørk sklien i mørket over natten og fortsett til konfektavbildning13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av Opti-MEM (se materialtabellen) som universalreagens, kan denne foreslåtte elektroporasjonsmetoden oppnå konsekvent høy elektroporasjonseffektivitet på ~ 80-90% (figur 1). Elektroporasjonseffektiviteten til Smo-EGFP-vektoren ble bestemt ved DIV 2 postelektroporasjon ved kvantifisering av prosentandelen grønne fluorescenspositive celler i alle parede boksprotein-6 (Pax6)-uttrykkende GCP-celler. Elektroporasjonseffektiviteten til DMSO- og SAG-behandlede grupper virket sammenlignbar (figur 1 og tabell 2).
I tillegg viser immunisering av den primære ciliummarkøren, Arl13b, at ciliasjonsraten for GCP ved DIV 2 av kulturen var ~ 18% i både kjøretøy- og SAG-behandlede grupper (DMSO: 17,35% ± 0,59%; SAG: 18,24 % ± 0,88 %). Ciliasjonshastigheten er illustrert som prosentandelen av Pax6-uttrykkende GCPer som bærer et primært cilium (Arl13b-positiv) på celleoverflaten ved DIV 2 postelektroporasjon (figur 2 og tabell 3).
For å dechiffrere den primære ciliumavhengige Hh-signalveien, ble en agonist av Smo, SAG, brukt til å aktivere Hh-signalveien. Ved aktivering av Hh-banen er Smo-reseptoren beriket ved axonemet til det primære cilium14. Våre resultater viser betydelig økt Smo-EGFP lokalisering på den primære cilium axoneme av Pax6-uttrykkende GCP celler ved 24 h post SAG behandling (Figur 3, kvantifiseringsdata modifisert fra tidligere arbeid6), indikerer en dyp aktivering av den primære cilium-avhengige Hh signalveien.
Figur 1: Elektroporasjonsoppsett og elektroporasjonseffektiviteten til GCPer. (A) Elektroporasjon oppsett. Høyre, svart pilspiss betegner elektroporasjon cuvette. (B, C) Representative bilder viser elektroporasjonseffektiviteten til Smo-EGFP-vektoren bestemt ved kvantifisering av prosentandelen av GFP-positive celler i alle Pax6-uttrykkende GCP-celler (tabell 2). Representative bilder viser de grønne fluorescerende signalene på Pax6-uttrykkende (fiolette) GCP-celler på DIV 2 postelektroporasjon etter 24 timers behandling med (B) DMSO og (C) SAG. Nuclei ble merket med DAPI (blå). Skalastenger = 20 μm. Forkortelser: Fastleger = granulcelleforløpere; GFP = grønt fluorescerende protein; Pax6 = paret boks protein-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimetylsulfoksid; SAG = Glattet agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Prosentandelen av ciliasjon på DIV 2 av GCP primærkultur. (A, B) Representative bilder viser prosentandelen av ciliasjon på DIV 2 av GCP primærkultur. Representative bilder viser den primære cilia (grønn) på Pax6-uttrykkende (røde) GCP celler på DIV 2 post elektroporasjon etter 24 h behandling med (A) DMSO og (B) SAG. Nuclei ble merket med DAPI (blå). Det primære ciliumet (grønt) er betegnet med hvite pilspisser. Skalastolper = 20 μm. (C) Graf illustrerer kvantifiseringsdata for 4 uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse, Ubetalt student t-test. Feilfelt viser ±SEM. Forkortelser: GCP = granulcelleforløper; Pax6 = paret boks protein-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimetylsulfoksid; SAG = Glattet agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; n.s. = Ikke signifikant; SEM = standardfeil av gjennomsnittet; Arl13b = ADP ribosyleringsfaktorlignende protein 13B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Økt Smo-lokalisering på primær cilium av Pax6-uttrykkende GCP-celler ved SAG-behandling. (A) Representative bilder viser Smo-EGFP-lokaliseringen (grønn) på det primære ciliumet (rød, hvit firkantboks) på Pax6-uttrykkende (fiolett) GCP-celler ved DIV 2 postelektroporasjon etter 24 timers behandling med DMSO og SAG. Nuclei ble merket med DAPI (blå). Skalastolper = 5 μm. (B) Graf illustrerer kvantifiseringsdata for 4 uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse, uparret Student t-test. P ≤ 0,001. Feilfelt viser ± SEM. Totalt n for DMSO-gruppe = 97, totalt n for SAG-gruppe = 130. Figur 3B ble endret fra 6. Forkortelser: GCP = granulcelleforløper; Smo = Utjevnet; Pax6 = paret boks protein-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimetylsulfoksid; SAG = Glattet agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; SEM = standardfeil av gjennomsnittet; Arl13b = ADP ribosyleringsfaktorlignende protein 13B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Innstilling for poringpuls | Innstilling for overføringspuls | |||
| Primær GCPer for mus | Primære nevroner | Primær GCPer for mus | Primære nevroner | |
| Spenning | 275 V | 275 V | 20 V | 20 V |
| Lengde | 1 ms | 0,5 ms | 50 ms | 50 ms |
| Mellomrom | 50 ms | 50 ms | 50 ms | 50 ms |
| Nei. | 2 | 2 | 5 | 5 |
| D-sats | 10% | 10% | 40% | 40% |
| Polaritet | + | + | ± | ± |
Tabell 1: Elektroporasjonsparametrene til musens primære GCPer og primære nevroner ved hjelp av Super Electroporator NEPA21 TYPE II. Forkortelse: GCP = granulcelleforløper.
| Effektivitet for elektroporasjon | Utt. 1 (n = 486) | Utt. 2 (n = 1314) | Utt. 3 (n = 704) | Utt. 4 (n = 476) | Gjennomsnitt |
| DMSO-behandlet gruppe | 90,57 % ± 10,12 % | 96,62 % ± 3,09 % | 98,89 % ± 0,97 % | 90,72 % ± 11,31 % | 94,02 % ± 1,36 % |
| SAG-behandlet gruppe | 91,8 % ± 8,69 % | 79,97 % ± 2,77 % | 89,35 % ± 5,67 % | 88,59 % ± 13,54 % | 87,42 % ± 1,71 % |
| Gjennomsnittlig elektroporasjonseffektivitet | 91.31% ± 7.99% | 88,27 % ± 10,81 % | 94,12 % ± 6,36 % | 89,65 % ± 11,21 % | 90,84 % ± 0,84 % |
Tabell 2: Elektroporasjonseffektivitet for Smo-EGFP-vektordeterminedbyquantifisering av blenderbildet av GFP-positive celler i alle Pax6-uttrykkende GCP-celler. Data om fire uavhengige eksperimenter (Exp.) vises. (Totalt n = 2980). Forkortelser: Smo = Utjevnet; GFP = grønt fluorescerende protein; GCP = granulcelleforløper; Pax6 = paret boks protein-6.
| Utt. 1 | Utt. 2 | Utt. 3 | Utt. 4 | gjennomsnitt | |
| Ciliation rate - DMSO | 18,88 % ± 3,61 % | 19,58 % ± 7,42 % | 16,60 % ± 1,48 % | 14,35 % ± 7,99 % | 17,35 % ± 0,59 % |
| Ciliation rate - SAG | 13,93 % ± 3,39 % | 17,30 % ± 2,15 % | 22.19% ± 10.35% | 19,56 % ± 1,15 % | 18,24 % ± 0,88 % |
Tabell 3: Prosentandelen av ciliasjon på DIV 2 av GCP primærkultur. Data om fire uavhengige eksperimenter (Exp.) vises. (Totalt n for DMSO-gruppe = 1169, Totalt n for SAG-gruppe = 816). Forkortelser: GCP = granulcelleforløper; DIV = dag in vitro; DMSO = dimetylsulfoksid; SAG = Glattet agonist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transfeksjon av transgenes i primær GCP-kultur ved elektroporasjonsmetode er vanligvis forbundet med lav celle levedyktighet og dårlig transfeksjonseffektivitet9,10. Dette dokumentet introduserer en kostnadseffektiv og reproduserbar elektroporasjonsprotokoll som har vist høy effektivitet og levedyktighet. I tillegg viser vi også en enkel metode for å studere den primære ciliumavhengige Hh-signalveien i primære GCP-celler.
Andre vanlige elektroporasjonsmetoder krever ofte kostbare celle-type-spesifikke elektroporasjonsreagenser som må kjøpes fra bestemte produsenter. Metoden beskrevet her anses gunstig da den bruker et vanlig og økonomisk elektroporasjonsreagens for forskjellige celletyper. Videre viste disse dataene at elektroporasjonseffektiviteten nådde ~ 80-90%, noe som er svært effektivt sammenlignet med andre elektroporasjons- og transfeksjonsmetoder9,10.
For å opprettholde høyere celle levedyktighet, er det noen kritiske trinn som man bør ta i betraktning. Cerebellum disseksjons- og dissosiasjonsprosedyrene bør fullføres innen kortest mulig tidsvindu på 1-2 t. Et annet kritisk skritt er å unngå bobledannelse i plasmidcelleelektroporasjonsblandingen før pulser under elektroporasjon. Etter pulser bør forhåndsvarslet kulturmedium tilsettes umiddelbart i dynene og cellene frøs så raskt som mulig. Cellene må være uforstyrret i de første 3 h postcelle sådd. De nevnte forholdsreglene vil forbedre celle levedyktigheten opptil ca. 70-80% på den andre kulturdagen.
En bemerkelsesverdig begrensning ved å studere det primære ciliumet i primærkulturplattformen er at ciliasjonsraten i dyrkede celler generelt er lavere enn den observerte in vivo. Tidligere data 6 viste at in vivo-frekvensen av ciliasjon på GCP både på E15,5 og P15 var ca. 60-80 %. Derimot var in vitro-frekvensen av ciliation i primær GCP-kultur ~ 20%6. Likevel er dette et generelt fenomen som er merkbart på tvers av de fleste (om ikke alle) celletyper når man sammenligner ciliasjonsraten mellom in vitro - og in vivo-studier .
Spesielt er denne metoden også anvendelig for andre primærkulturer som nevrale stamceller og kortikale og hippocampale nevronkultur, som kan oppnås ved å endre elektroporasjonsparameteren, det vil si poring pulsspenning, lengde og antall pulser. For å utvide anvendelsen av denne protokollen til et bredere studiefelt, er de anbefalte elektroporasjonsparametrene for primære nevroner gitt i tabell 1. I tillegg bidrar det universelle elektroporasjonsreagenset, det vil si Opti-MEM som brukes i denne protokollen, også til å unngå ytterligere kjedelig optimaliseringsinnsats sammenlignet med andre elektroporasjonsprotokoller som krever optimalisering med hensyn til reagenskompatibilitet. Denne optimaliserte, kostnadseffektive elektroporasjonsprotokollen for undersøkelse av det primære cilium- og Hh-signalisering i primære GCP-kulturer kan brukes som referanseprosedyre for andre primære ciliumrelaterte studier ved hjelp av primærkulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av HKBU Seed Fund og Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) til C.H.H. Hor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
