Summary
Hier presenteren we een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van primaire cerebellaire korrelcelprecursoren (GCP's) dat kosteneffectief, efficiënt en levensvatbaar is. Bovendien demonstreert dit protocol ook een eenvoudige methode voor de moleculaire studie van primaire cilium-afhankelijke egelsignaleringsroutes in primaire GCP-cellen.
Abstract
Het primaire cilium is een kritisch signaalorganel dat op bijna elke cel wordt aangetroffen en dat Egel (Hh) signaalprikkels van het celoppervlak transduceert. In de granulaatcelvoorloper (GCP) fungeert het primaire cilium als een cruciaal signaleringscentrum dat de proliferatie van voorlopercellen orkestreert door de Hh-signaalroute te moduleren. Het onderzoek van primaire cilium-afhankelijke Hh-signaleringsmachines wordt vergemakkelijkt door in vitro genetische manipulatie van de pathway-componenten om hun dynamische lokalisatie naar het primaire cilium te visualiseren. Transfectie van transgenen in de primaire culturen van GCP's met behulp van de momenteel bekende elektroporatiemethoden is echter over het algemeen kostbaar en resulteert vaak in een lage levensvatbaarheid van cellen en ongewenste transfectie-efficiëntie. Dit artikel introduceert een efficiënt, kosteneffectief en eenvoudig elektroporatieprotocol dat een hoge transfectie-efficiëntie van ~ 80-90% en optimale levensvatbaarheid van de cel aantoont. Dit is een eenvoudige, reproduceerbare en efficiënte genetische modificatiemethode die van toepassing is op de studie van de primaire ciliumafhankelijke egelsignaleringsroute in primaire GCP-culturen.
Introduction
Cerebellaire GCP's worden veel gebruikt om de machinerie van de Hh-signaleringsroute in neuronale voorloperceltypen te bestuderen vanwege hun hoge abundantie en hoge gevoeligheid voor de Hh-signaleringsroute in vivo1,2,3,4. In GCP's fungeert het primaire cilium als een cruciale Hh-signaaltransductiehub5 die de proliferatie van de voorlopercellen orkestreert6,7,8. In vitro visualisatie van Hh-signaleringscomponenten op het primaire cilium is vaak een uitdaging vanwege hun lage endogene basale niveaus. Vandaar dat transgene modificatie van eiwitexpressieniveaus en fluorofoor tagging van het gen van belang nuttige benaderingen zijn om de route met moleculaire resolutie te bestuderen. Genetische manipulatie van primaire GCP-culturen met behulp van op liposomen gebaseerde transfectiebenaderingen resulteert echter vaak in een lage transfectie-efficiëntie, waardoor verder moleculair onderzoek wordt belemmerd9. Elektroporatie verhoogt de efficiëntie, maar vereist vaak exorbitante leverancierspecifieke en celtype-beperkte elektroporatiereagentia10.
Dit artikel introduceert een zeer efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om de Hh-signaalroutecomponenten in GCP-primaire culturen te manipuleren. Met behulp van dit gemodificeerde elektroporatieprotocol werd een groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld smoothened transgen (pEGFP-Smo) efficiënt afgeleverd aan GCP's en bereikte het hoge celoverlevings- en transfectiesnelheden (80-90%). Bovendien, zoals blijkt uit de immunocytochemische kleuring, vertoonden de getransfecteerde GCP's een hoge gevoeligheid voor gladgestreken agonist-geïnduceerde activering van de Hh-signaleringsroute door EGFP-Smo naar de primaire trilharen te smokkelen. Dit protocol is rechtstreeks toepasselijk en gunstig voor experimenten waarbij in vitro genetische modificatie van moeilijk te transfecteren celtypen, zoals primaire celculturen bij mens en knaagdier, alsmede door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, betrokken zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle diergerelateerde procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor het hanteren van dieren en het protocol dat is goedgekeurd door het ministerie van Volksgezondheid, Hong Kong. Vergunningen voor dierproeven volgens de Animal (Control of Experiments) Ordinance (Cap. 340) werden verkregen van het ministerie van Volksgezondheid, de regering van Hong Kong. Het dierwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de ethiek van de dierveiligheid die is goedgekeurd door het HKBU Research Office en het Laboratory Safety Committee. Raadpleeg de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Voorbereiding op de voorstudie
- Voorbereiding van cultuurmedia en buffers
- Serumvrij medium (SFM)
- Om 50 ml SFM te bereiden, voegt u 500 μL 100x L-glutaminevervanger, 500 μL penicilline-streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat en 12,5 μL 1 M KCl (laatste 250 μM) toe aan 49 ml neurobasaal medium.
- Splits de SFM in 2 aliquots van 10 ml en 40 ml in conische buizen van 50 ml en bewaar ze bij 4 °C gedurende maximaal een maand.
- Vertering blokkerend medium: 10% FBS in SFM
- Voeg 1,1 ml warmte-geïnactiveerde FBS toe aan een aliquot sfm van 10 ml om het verteringsblokkerende medium te bereiden.
- GCP kweekmedium: SFM met B27
- Om GCP-kweekmedium te bereiden, voegt u 800 μL serumvrij B-27-supplement toe aan een aliquot sfm van 40 ml.
OPMERKING: B-27-aangevulde SFM kan maximaal één maand bij 4 °C worden bewaard. Vers bereide media leveren echter optimale resultaten op.
- Om GCP-kweekmedium te bereiden, voegt u 800 μL serumvrij B-27-supplement toe aan een aliquot sfm van 40 ml.
- Dissectiebuffer: EBSS met glucose + HEPES
- Voeg 6 g/L glucose toe aan calcium- en magnesiumvrije Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) met 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur).
- Steriliseer de oplossing door een spuitfilter van 0,2 μm te laten passeren en bewaar deze bij 4 °C voor langdurige opslag.
- Verteringsbuffer
OPMERKING: Bereid vers voor gebruik.- Bereid 2 ml spijsverteringsbuffer voor de vertering van 2-4 cerebellaire weefsels en 4 ml voor 4-10 weefsels. Om 4 ml verteringsbuffer te bereiden, lost u 1,5 mg L-cysteïne (eindconcentratie 200-400 μg / ml) op in 4 ml EBSS. Keer de buis herhaaldelijk om totdat het poeder volledig is opgelost.
- Steriliseer de oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm en een spuit van 5 ml en breng de oplossing over in een steriele celkweekschaal van 35 mm.
- Voeg 4 μL papaïne (1:1.000 verdunning uit een voorraadconcentratie van 20 eenheden/mg) en 40 μL DNase I (1:100 verdunning uit een voorraad van 10 mg/ml voor een eindconcentratie van 0,1 mg/ml) toe.
- Incubeer de oplossing bij 37 °C in een CO2-incubator gedurende ten minste 30 minuten of tot gebruik.
OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om de papaïne te activeren. Voor een optimaal resultaat, niet langer dan 45 minuten bij 37 °C voor gebruik. Zorg ervoor dat de oplossing transparant wordt en dat er geen witte neerslagen zijn voor gebruik.
- Serumvrij medium (SFM)
- Voorcoating coverslips
- Om de coverslips voor te bereiden op celbevestiging, incubeer geautoclaveerde 12 mm glazen coverslips met 100 μg/ml poly-D-lysine (PDL, 1 mg/ml in steriel dH2O) gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C. Bewaar de coverslips in dezelfde PDL-oplossing bij 4 °C tot gebruik.
- Verzamel op de dag van de primaire celkweek de PDL in een schone conische buis en spoel de coverslips drie keer met steriel dH2O grondig om resterende PDL te verwijderen.
OPMERKING: De PDL kan worden bewaard bij 4 °C voor hergebruik. - Breng de PDL-gecoate glazen dekplaten over op een plaat met 24 putten door in elke put één afdekplaat te plaatsen.
- Verwijder overtollig water en voeg 200-300 μL Matrigel toe (gereconstitueerd volgens de instructies in de productfiche in serumvrije DMEM-F12) om de coverslips volledig te bedekken.
- Incubeer de dekplaten in de Matrigel gedurende 1 uur bij 37 °C in de CO2-incubator .
OPMERKING: Verwijder de Matrigel voor het zaaien van de cel. Deze Matrigel kan worden verzameld en opgeslagen bij 4 °C voor meerdere hergebruiken.
- Bereiding van preplating culture dish
- Bestrijk een celkweekschaal van 60 mm met 2 ml 100 μg/ml PDL (reconstitueer de 1 mg/ml PDL-stamoplossing in steriel dH2O) door incubatie bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Verwijder en verzamel onmiddellijk voor het zaaien van cellen de gebruikte PDL in een schone conische buis en bewaar deze bij 4 °C voor meerdere hergebruiken. Spoel en was de pdl-gecoate schaal drie keer met steriel dH2O. Droog de kweekschaal aan de lucht voordat u de cel zaait.
- Gebruik één celkweekschaal van 60 mm om cellen te zaaien die zijn geoogst uit maximaal 2 weefsels met een heel cerebellum.
- Bereid extra cultuurgerechten voor extra cerebellums.
OPMERKING: Zie stap 2.1.18 en 2.1.19 voor het gebruik van de voorplatingcultuurschaal.
2. Experimentele dag 0
- Isolatie en kweek van primaire GCP's van muizen
OPMERKING: De GCP-kweekmethode is gewijzigd van een standaardprotocol en het korte protocol is kort beschreven in ons vorige werk6,11,12. Gebruik voor een optimale GCP-opbrengst postnatale (P) dag 6- of P7-pups voor de isolatie van GCP. Voer de volgende dissectiestappen 2.1.6-2.1.10 zo snel mogelijk uit voor een optimale levensvatbaarheid van de cel.- Voorwarm SFM, digestieblokkerend medium, kweekmedium en Opti-MEM bij 37 °C tijdens dissectie.
- Op een schone bank voorzie je alle dissectieapparatuur in 70% ethanol voor desinfectie.
- Vul een celkweekschaal van 60 mm met 2-3 ml dissectiebuffer en koel deze af op ijs.
- Bereid een verse verteringsbuffer zoals beschreven in punt 1.1.5 en houd deze warm bij 37 °C.
- Gebruik 70% ethanol om het hoofd van de pup af te vegen voor desinfectie.
- Onthoofd de pup zonder anesthesie. Gebruik een tang om het hoofd vast te houden en een gesteriliseerde chirurgische schaar om van de achterkant van de schedel te knippen om de pup te onthoofden. Verwijder voorzichtig de huid en schedel om de hersenen te ontbloten met behulp van een tang.
- Gebruik een tang om het cerebellum af te knijpen en laat het snel weken in de voorgekoelde dissectiebuffer die in stap 2.1.3 is voorbereid.
- Verwijder de hersenvliezen met het cerebellum ondergedompeld in de dissectiebuffer onder een ontleedmicroscoop. Met bloedvaten verrijkte hersenvliezen moeten er roze uitzien onder de ontleedmicroscoop.
- Verwijder alle hersenvliezen met een tang.
OPMERKING: Een cerebellum zonder hersenvliezen moet een witachtig uiterlijk hebben. - Verwijder alle zichtbare weefsels van de middenhersenen en de plexus choroid uit het cerebellum.
- Breng het cerebellum over in een kweekschaal van 35 mm, vooraf gevuld met een warme verteringsbuffer, bereid in stap 2.1.4. Vermijd het overbrengen van overtollige dissectiebuffer. Knip het cerebellum zo snel mogelijk in fijne stukjes met een microveerschaar.
- Incubeer het gehakte cerebellum onmiddellijk bij 37 °C gedurende 15 minuten in een CO2-incubator . Verleng de incubatietijd tot 20 minuten als er meer dan 4 cerebellums moeten worden verwerkt.
OPMERKING: Na incubatie zal het weefsel samenklonteren. - Breng het verteerde weefsel onmiddellijk over naar de bodem van een nieuwe steriele centrifugebuis van 15 ml met behulp van een P1000 pipetpunt prewet met digestieblokkerend medium (vermijd overdracht van de digestiebuffer).
- Voeg een geschikt volume spijsverteringsblokkerend medium (1 ml voor 1 cerebellum) toe om de spijsvertering te beëindigen en pipetteer 30 keer voorzichtig op en neer met behulp van een P1000 micropipette om het weefsel verder te dissociëren in een eencellige suspensie. Vermijd luchtbelvorming.
- Laat de celsuspensie voorzichtig door een celzeef van 70 μm in een nieuwe steriele centrifugebuis gaan om celklonten te verwijderen.
- Breng een extra 1 ml vers verteringsblokkerend medium door de celzeef om resterende cellen uit de celzeef te verzamelen.
- Centrifugeer het filtraat bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder het supernatant en vul de pellet opnieuw op met 1 ml SFM. Herhaal deze stap twee keer. Vermijd het vormen van luchtbellen.
- Resuspend de pellet in een eindvolume van 2 ml GCP-kweekmedium en breng de celsuspensie over naar de pdl-gecoate 60 mm voorkweekschaal die in stap 1.3 is bereid. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C in een CO2-incubator .
OPMERKING: Niet langer dan 20 minuten. - Tik na de incubatie op de kweekschaal vanaf de zijkant om de losjes hechtende GCP-cellen los te maken. Verzamel de aanhangende GCP-cellen in kweekmedium door zachtjes te pipetteren met een P1000-pipet. Verzamel deze GCP-suspensie in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml. Gooi de schaal van 60 mm weg.
OPMERKING: Sterk hechtende astroglia- en fibroblastcellen blijven vastzitten op de 60 mm schaalbodem en worden in deze stap gescheiden. Het weglaten van deze stap zal de zuiverheid van de GCP-cultuur in gevaar brengen. - Tel de cellen en ga onmiddellijk over tot elektroporatie.
- Dag in vitro (DIV) 0: Elektroporatie voor Hh receptor transgene overexpressie: pEGFP-Smo
- Bereid voor elektroporatie met behulp van een 2 mm gap cuvette het volgende plasmide-cel elektroporatiemengsel voor elke reactie van elektroporatie: 1,2 × 106 cellen en 10 μg pEGFP-mSmo (pas de DNA-voorraadconcentratie aan op ~2-5 μg/μL in Tris-EDTA-buffer of steriele dH2O) in 100 μL Opti-MEM.
OPMERKING: Verminder het totale celaantal als de cellen onvoldoende zijn (hoewel dit de elektroporatie-efficiëntie kan verminderen). Pas echter de hoeveelheid plasmide noch het totale volume Opti-MEM dat per cuvette wordt gebruikt niet aan. Als het totale celgetal dat nodig is voor het experiment groter is dan 1,5 × 106 cellen, schaalt u het elektroporatiemengsel dienovereenkomstig op en voert u meerdere elektroporatiereacties afzonderlijk uit. De cuvette mag tot 5 keer worden hergebruikt. - Bereid de post-elektroporatiecelzaaiplaat voor door 0,5 ml kweekmedium toe te voegen aan elke put van de 24-put kweekplaat met gecoate coverslips (vanaf stap 1.2) en houd deze warm bij 37 °C in een CO2-incubator .
- Pipetteer vanaf stap 2.1.20 het vereiste aantal cellen in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en draai gedurende 5 minuten met 200 × g bij RT. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 200 μL Opti-MEM. Herhaal deze stap twee keer met Opti-MEM om ervoor te zorgen dat er geen restkweekmedium in de buis aanwezig is
OPMERKING: Voor elke put / coverslip van een 24-well plaat, elektroporaat en zaad 1.2-1.3 × 106 cellen / put om ~ 70-75% celconfluentie te verkrijgen op de volgende dag van de kweek. - Stel de parameters van elektroporatie in zoals weergegeven in tabel 1.
- Pipetteer de elektroporatiereactie voorzichtig om goed te mengen en gebruik een lange P200-tip om een exact volume van 100 μL van het mengsel over te brengen in de 2 mm gap cuvette. Vermijd het vormen van bubbels.
- Plaats de cuvette in de cuvettekamer.
- Druk op de Ω knop van de elektroporator (zie de tabel met materialen) en noteer de impedantiewaarde, die ~ 30-35 moet zijn. Om ervoor te zorgen dat de elektrische impedantiewaarde Ω binnen het bereik van 30-35 valt, moet u zich houden aan een nauwkeurig volume van 100 μL.
- Druk op de startknop om de puls te starten.
- Noteer de waarden van de gemeten stroom en joules die op het leesframe worden weergegeven.
- Haal de cuvette uit de cuvette kamer.
- Voeg onmiddellijk 100 μL voorverwarmd kweekmedium toe aan de cuvette en resuspend door 2-3 keer zachtjes op en neer te pipetteren. Breng de celsuspensie onmiddellijk over op de in stap 2.2.2 voorbereide 24-putplaat.
OPMERKING: Om celdood te minimaliseren, zaait u de cellen onmiddellijk na elektroporatie. - Incubeer de cellen bij 37 °C in een CO2-incubator . Laat de cellen gedurende 3 uur ongestoord om celloslating te voorkomen.
- Aspirateer en gooi na het zaaien voorzichtig de helft van het supernatant medium weg om zwevende dode cellen en puin te verwijderen en te vervangen door dezelfde hoeveelheid voorverwarmd kweekmedium.
- Incubeer de cellen bij 37 °C in de CO2-incubator en vul om de dag de helft van het medium aan.
- Observeer de cellen onder de fluorescentiemicroscoop op de volgende dag, d.w.z. DIV1 (figuur 1) voor GFP-signaal om de efficiëntie van Smo-overexpressie te bepalen.
- Voor de stimulatie van de Hh-signaalroute op DIV 1 na het aanvullen van de helft van het medium, voegt u 0,2 μM Smoothened agonist (SAG) toe aan de cellen terwijl u een gelijk volume DMSO aan de controle toevoegt. Incubeer gedurende 24 uur voorafgaand aan celfixatie.
OPMERKING: Houd het volume dmso/sag toegevoegd zo laag mogelijk. Hier werd 0,5 μL DMSO of 0,5 μL van 0,2 mM SAG toegevoegd per 500 μL medium per put, wat een verdunningsverhouding is van 1:1.000.
- Bereid voor elektroporatie met behulp van een 2 mm gap cuvette het volgende plasmide-cel elektroporatiemengsel voor elke reactie van elektroporatie: 1,2 × 106 cellen en 10 μg pEGFP-mSmo (pas de DNA-voorraadconcentratie aan op ~2-5 μg/μL in Tris-EDTA-buffer of steriele dH2O) in 100 μL Opti-MEM.
3. DIV 2: Visualisatie van primaire trilharen en onderzoek van de Hh-signaalroute
- Celfixatie
- Verwijder na de behandeling 24 uur na de behandeling het kweekmedium en spoel de cellen 2-3 keer met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een wegwerp pasteurpipet terwijl u voorkomt dat de cellen worden losgelaten.
- Fixeer de cellen door ~400 μL 4% paraformaldehyde (bereid in PBS) toe te voegen en incamineer bij RT gedurende 10 minuten.
- Spoel en was 2-3 keer met PBS met behulp van een pasteurpipet.
- Bewaren in PBS bij 4 °C gedurende maximaal 2 maanden of overgaan tot immunostaining.
- Immunocytochemische kleuring van GCP's en primaire ciliummarker
- Was de cellen in een plaat met 24 putten tweemaal in PBS met zacht schudden gedurende 5 minuten per keer.
- Voeg 0,5 ml 100 mM ammoniumchloride toe aan de cel en incubeer bij RT gedurende 10 minuten om het fixeermiddel te dempen.
- Spoel één keer af en was 2-3 keer met PBS met zacht schudden gedurende 10 minuten elke keer.
- Pipetteer voorzichtig 30 μL blokkerende buffer (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% warmte-geïnactiveerd paardenserum in PBS) op een stuk parafilm om een druppel zonder luchtbellen te vormen.
- Breng de dekplaat voorzichtig over van de put naar de BB-druppel met de celzaadzijde naar beneden gericht. Incubeer de cellen met BB in een vochtige kamer gedurende 1 uur bij RT.
- Bereid het primaire antilichaammengsel in BB zoals weergegeven in de tabel met materialen. Om de cellen met primair antilichaam te onderzoeken, herhaalt u stap 3.2.4 en 3.2.5, waarbij BB wordt vervangen door de primaire antilichaammix. Incubateer de cellen met het primaire antilichaam gedurende 2 uur bij RT.
- Breng met een tang de coverslips terug naar de 24-well plaat met de cel-gezaaide kant naar boven gericht. Spoel de cellen eenmaal en was 3-4 keer in PBS met zacht schudden gedurende 10 minuten elke keer.
- Bereid het secundaire antilichaammengsel in BB zoals weergegeven in de tabel met materialen. Om de cellen met het secundaire antilichaam te incuberen, herhaalt u stap 3.2.4 en 3.2.5, waarbij BB wordt vervangen door het secundaire antilichaammengsel. Incubeer in het donker gedurende 1 uur bij RT.
- Herhaal stap 3.2.7 voor het wassen van postsecundaire antilichaamincubatie.
- Monteer de afdekplaat op een schone microscopische glasplaat met behulp van een montagemedium.
- Droog de glijbaan 's nachts in het donker aan de lucht en ga verder met confocale beeldvorming13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de Opti-MEM (zie de tabel met materialen) als universeel reagens, zou deze voorgestelde elektroporatiemethodologie een consistent hoge elektroporatie-efficiëntie kunnen bereiken bij ~ 80-90% (figuur 1). De elektroporatie-efficiëntie van de Smo-EGFP-vector werd bepaald bij DIV 2 na elektroporatie door kwantificering van het percentage groene fluorescentiepositieve cellen in alle gepaarde boxeiwit-6 (Pax6)-tot expressie brengende GCP-cellen. De elektroporatie-efficiëntie van met DMSO en SAG behandelde groepen leek vergelijkbaar (figuur 1 en tabel 2).
Bovendien toont immunostaining van de primaire ciliummarker, Arl13b, aan dat de ciliatiesnelheid van GCP bij DIV 2 van cultuur ~ 18% was in zowel de met het vehiculum als met SAG behandelde groepen (DMSO: 17,35% ± 0,59%; SAG: 18,24% ± 0,88%). De ciliatiesnelheid wordt geïllustreerd als het percentage Pax6-tot expressie brengende GCP's met een primair cilium (Arl13b-positief) op het celoppervlak bij DIV 2-elektroporatie (figuur 2 en tabel 3).
Om de primaire ciliumafhankelijke Hh-signaalroute te ontcijferen, werd een agonist van Smo, SAG, gebruikt om de Hh-signaleringsroute te activeren. Bij activering van de Hh-route wordt de Smo-receptor verrijkt aan het axoneme van het primaire cilium14. Onze resultaten tonen een significant verhoogde Smo-EGFP-lokalisatie op het primaire cilium axoneme van Pax6-tot expressie brengende GCP-cellen 24 uur na SAG-behandeling (figuur 3, kwantificeringsgegevens gewijzigd uit eerder werk6), wat wijst op een diepgaande activering van de primaire ciliumafhankelijke Hh-signaleringsroute.
Figuur 1: Elektroporatie-opstelling en de elektroporatie-efficiëntie van GCP's. (A) Elektroporatie-opstelling. Rechts, zwarte pijlpunt duidt op elektroporatie cuvette. (B, C) Representatieve afbeeldingen tonen de elektroporatie-efficiëntie van de Smo-EGFP-vector bepaald door kwantificering van het percentage GFP-positieve cellen in alle Pax6-tot expressie brengende GCP-cellen (tabel 2). Representatieve beelden tonen de groene fluorescerende signalen op Pax6-expresserende (violette) GCP-cellen op DIV 2 na elektroporatie na 24 uur behandeling met (B) DMSO en (C) SAG. Kernen werden gelabeld met DAPI (blauw). Schaalbalken = 20 μm. Afkortingen: GCP's = granulaatcelprecursoren; GFP = groen fluorescerend eiwit; Pax6 = gepaard doos eiwit-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimethylsulfoxide; SAG = Gladgestreken agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Percentage ciliatie op DIV 2 van de primaire GCP-cultuur. (A, B) Representatieve afbeeldingen geven het percentage ciliatie op DIV 2 van de primaire GCP-cultuur weer. Representatieve afbeeldingen tonen de primaire trilharen (groen) op Pax6-tot expressie brengende (rode) GCP-cellen op DIV 2 na elektroporatie na 24 uur behandeling met (A) DMSO en (B) SAG. Kernen werden gelabeld met DAPI (blauw). Het primaire cilium (groen) wordt aangeduid met witte pijlpunten. Schaalbalken = 20 μm. (C) Grafiek illustreert kwantificeringsgegevens van 4 onafhankelijke experimenten. Statistische analyse, Unpaired Student's t-test. Foutbalken tonen ±SEM. Afkortingen: GCP = granule cell precursor; Pax6 = gepaard doos eiwit-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimethylsulfoxide; SAG = Gladgestreken agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; n.s. = Niet significant; SEM = standaardfout van het gemiddelde; Arl13b = ADP ribosylatie factor-achtig eiwit 13B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verhoogde Smo-lokalisatie op het primaire cilium van Pax6-tot expressie brengende GCP-cellen na SAG-behandeling. (A) Representatieve beelden tonen de Smo-EGFP-lokalisatie (groen) op het primaire cilium (rode, witte vierkante doos) op Pax6-expresserende (violette) GCP-cellen bij DIV 2 post-elektroporatie na 24 uur behandeling met DMSO en SAG. Kernen werden gelabeld met DAPI (blauw). Schaalbalken = 5 μm. (B) Grafiek illustreert kwantificeringsgegevens van 4 onafhankelijke experimenten. Statistische analyse, ongepaarde Student's t-test. P ≤ 0,001. Foutbalken tonen ± SEM. Totaal n voor DMSO-groep = 97, totaal n voor SAG-groep = 130. Figuur 3B is gewijzigd van 6. Afkortingen: GCP = granule cell precursor; Smo = Gladgestreken; Pax6 = gepaard doos eiwit-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimethylsulfoxide; SAG = Gladgestreken agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; SEM = standaardfout van het gemiddelde; Arl13b = ADP ribosylatie factor-achtig eiwit 13B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Poring Pulse Instelling | Overdrachtspulsinstelling | |||
| Muis primaire GCP's | Primaire neuronen | Muis primaire GCP's | Primaire neuronen | |
| Spanning | 275 v | 275 v | 20 v | 20 v |
| Lengte | 1 ms | 0,5 ms | 50 ms | 50 ms |
| Interval | 50 ms | 50 ms | 50 ms | 50 ms |
| Nee. | 2 | 2 | 5 | 5 |
| D-tarief | 10% | 10% | 40% | 40% |
| Polariteit | + | + | ± | ± |
Tabel 1: De elektroporatieparameters van primaire GCP's van muizen en primaire neuronen met behulp van Super Electroporator NEPA21 TYPE II. Afkorting: GCP = granulaatcelvoorloper.
| Elektroporatie-efficiëntie | Exp. 1 (n = 486) | Exp. 2 (n = 1314) | Exp. 3 (n = 704) | Exp. 4 (n = 476) | Gemiddeld |
| DMSO-behandelde groep | 90,57% ± 10,12% | 96,62% ± 3,09% | 98,89% ± 0,97% | 90,72% ± 11,31% | 94,02% ± 1,36% |
| Met SAG behandelde groep | 91,8% ± 8,69% | 79,97% ± 2,77% | 89,35% ± 5,67% | 88,59% ± 13,54% | 87,42% ± 1,71% |
| Gemiddelde elektroporatie-efficiëntie | 91,31% ± 7,99% | 88,27% ± 10,81% | 94,12% ± 6,36% | 89,65% ± 11,21% | 90,84% ± 0,84% |
Tabel 2: Elektroporatie-efficiëntie van Smo-EGFP-vectorbepaald door kwantificering van het percentage GFP-positieve cellen in alle Pax6-tot expressie brengende GCP-cellen. Gegevens van vier onafhankelijke experimenten (Exp.) worden getoond. (Totaal n = 2980). Afkortingen: Smo = Smoothened; GFP = groen fluorescerend eiwit; GCP = korrelcelvoorloper; Pax6 = gepaard doos eiwit-6.
| Exp. 1 | Exp. 2 | Exp. 3 | Exp. 4 | gemiddeld | |
| Ciliatiesnelheid - DMSO | 18,88% ± 3,61% | 19,58% ± 7,42% | 16,60% ± 1,48% | 14,35% ± 7,99% | 17,35% ± 0,59% |
| Ciliatiesnelheid - SAG | 13,93% ± 3,39% | 17,30% ± 2,15% | 22,19% ± 10,35% | 19,56% ± 1,15% | 18,24% ± 0,88% |
Tabel 3: Het ciliatiepercentage op DIV 2 van de primaire GCP-cultuur. Gegevens van vier onafhankelijke experimenten (Exp.) worden getoond. (Totaal n voor DMSO-groep = 1169, Totaal n voor SAG-groep = 816). Afkortingen: GCP = granule cell precursor; DIV = dag in vitro; DMSO = dimethylsulfoxide; SAG = Gladgestreken agonist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transfectie van transgenen in primaire GCP-cultuur door elektroporatiemethode wordt meestal geassocieerd met een lage levensvatbaarheid van cellen en een slechte transfectie-efficiëntie9,10. Dit artikel introduceert een kosteneffectief en reproduceerbaar elektroporatieprotocol dat een hoge efficiëntie en levensvatbaarheid heeft aangetoond. Daarnaast demonstreren we ook een eenvoudige methode voor het bestuderen van de primaire ciliumafhankelijke Hh-signaleringsroute in primaire GCP-cellen.
Andere veel voorkomende elektroporatiemethoden vereisen vaak dure celtype-specifieke elektroporatiereagentia die bij specifieke fabrikanten moeten worden gekocht. De hier beschreven methode wordt als gunstig beschouwd omdat het een gemeenschappelijk en economisch elektroporatiereagens gebruikt voor verschillende celtypen. Bovendien toonden deze gegevens aan dat de elektroporatie-efficiëntie ~ 80-90% bereikte, wat zeer efficiënt is in vergelijking met andere elektroporatie- en transfectiemethoden9,10.
Om een hogere levensvatbaarheid van cellen te behouden, zijn er een paar kritieke stappen waarmee men rekening moet houden. De cerebellumdissectie- en dissociatieprocedures moeten binnen het kortst mogelijke tijdsbestek van 1-2 uur worden voltooid. Een andere kritische stap is het voorkomen van bubbelvorming in het plasmide-cel elektroporatiemengsel vóór pulsen tijdens elektroporatie. Na peulvruchten moet het voorverwarmde kweekmedium onmiddellijk aan de cuvetten worden toegevoegd en moeten de cellen zo snel mogelijk worden gezaaid. De cellen moeten ongestoord zijn in de eerste 3 uur na het zaaien van de cel. De bovengenoemde voorzorgsmaatregelen zullen de levensvatbaarheid van de cel verbeteren tot ongeveer 70-80% op de tweede dag van de kweek.
Een opmerkelijke beperking van het bestuderen van het primaire cilium in het primaire kweekplatform is dat de snelheid van ciliatie in gekweekte cellen over het algemeen lager is dan die waargenomen in vivo. Eerdere gegevens 6 toonden aan dat de in vivo ciliatiesnelheid op GCP bij zowel E15,5 als P15 ongeveer 60-80% was. Daarentegen was de in vitro ciliatiesnelheid in de primaire GCP-cultuur ~20%6. Niettemin is dit een algemeen fenomeen dat waarneembaar is in de meeste (zo niet alle) celtypen bij het vergelijken van de snelheid van ciliatie tussen in vitro en in vivo studies.
Met name is deze methode ook van toepassing op andere primaire culturen zoals neurale voorlopercellen en corticale en hippocampale neuroncultuur, die haalbaar is door de elektroporatieparameter te wijzigen, d.w.z. poringpulsspanning, lengte en aantal pulsen. Om de toepassing van dit protocol uit te breiden naar een breder studiegebied, zijn de aanbevolen elektroporatieparameters voor primaire neuronen opgenomen in tabel 1. Bovendien helpt het universele elektroporatiereagens, d.w.z. Opti-MEM dat in dit protocol wordt gebruikt, ook extra vervelende optimalisatie-inspanningen te voorkomen in vergelijking met andere elektroporatieprotocollen die optimalisatie vereisen met betrekking tot reagenscompatibiliteit. Dit geoptimaliseerde, kosteneffectieve elektroporatieprotocol voor het onderzoek van het primaire cilium en Hh-signalering in primaire GCP-culturen kan worden gebruikt als referentieprocedure voor andere primaire ciliumgerelateerde studies met primaire culturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door HKBU Seed Fund en Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) aan C.H.H. Hor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
