Summary
여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.
Abstract
1차 실륨은 고슴도치(Hh)가 세포 표면으로부터 자극을 신호하는 거의 모든 세포에서 발견되는 중요한 신호 세포입니다. 과립 세포 전구체(GCP)에서, 1차 실슘은 Hh 신호 경로를 조절하여 전구체 세포 증식을 오케스트레이션하는 중추적인 신호 센터역할을 한다. 1차 실슘 의존Hh 시그널링 기계류의 조사는 경로 구성 요소의 체외 유전자 조작에 의해 촉진되어 동적 국소화를 1차 실륨으로 시각화합니다. 그러나, 현재 알려진 전기기화 방법을 사용하는 GCP의 1차 배양에서 의 전염은 일반적으로 비용이 많이 들며 종종 낮은 세포 생존력과 바람직하지 않은 트랜스포션 효율을 초래한다. 이 백서는 ~80-90%의 높은 배분 효율과 최적의 세포 생존가능성을 보여주는 효율적이고 비용 효율적이며 간단한 전기 기립 프로토콜을 소개합니다. 이것은 1 차적인 GCP 문화에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 연구 결과에 적용되는 간단하고 재현 가능하고 능률적인 유전 수정 방법입니다.
Introduction
소뇌GCP는 생체 내에서 Hh 신호 경로에 대한 높은 풍부함과 높은 민감성으로 인해 뉴런 전구 세포 유형의 Hh 신호 경로의 기계를 연구하는 데 널리 사용됩니다. GCP에서, 1차 실슘은 전구체 세포의 증식을 조율하는 중추적인 Hh 신호 변환 허브5로서 작용한다6,7,8. 1차 실륨에서 Hh 신호 성분의 체외 시각화는 낮은 내인성 기저 수준으로 인해 종종 도전적입니다. 따라서, 관심 유전자의 단백질 발현 수준 및 형광소 태깅의 유전자 변형은 분자 해상도에서 경로를 연구하는 유용한 접근이다. 그러나, 지방성 기지를 둔 transfection 접근을 사용하여 GCP 1 차적인 배양을 유전 조작은 수시로 더 분자 조사를 방해하는 낮은 transfection 효율성 귀착됩니다9. 전기기화는 효율성을 증가하지만 일반적으로 엄청난 공급 업체 별 및 세포 유형 제한 전기 기리 작용10이 필요합니다.
이 논문은 GCP 1차 배양에서 Hh 신호 경로 구성 요소를 조작하는 고효율 및 비용 효율적인 전기 포기법을 소개합니다. 이러한 변형된 전기기화 프로토콜을 사용하여, 녹색 형광 단백질(GFP)-태그된 스무텐 트랜스진(pEGFP-Smo)은 GCP에 효율적으로 전달되었고 높은 세포 생존율(80-90%)을 달성하였다. 더욱이, 면역세포화학 염색에 의해 입증된 바와 같이, 감염된 GCP는 EGFP-Smo를 1차 섬모로 인신매매함으로써 Hh 신호 경로의 편평한 작용제 유도 활성화에 높은 민감성을 보였다. 이 프로토콜은 인간 및 설치류 1차 세포 배양뿐만 아니라 인간 유도 만능 줄기 세포와 같이 트랜스펙트하기 어려운 세포 유형의 체외 유전자 변형을 포함하는 실험에 직접적으로 적용되고 유익합니다.
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Protocol
모든 동물 관련 절차는 동물 취급 지침과 홍콩 보건부에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 동물 실험 면허 (실험 의 제어) 조례 (캡. 340) 보건부에서 취득되었다, 홍콩 정부. 동물 작업은 HKBU 연구실 및 실험실 안전 위원회가 승인한 동물 안전 윤리에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 사전 실험 준비
- 문화 미디어 및 버퍼 준비
- 세럼 프리 매체(SFM)
- SFM 50mL를 준비하려면 100x L-글루타민 대용품 500 μL, 페니실린-스트렙토마이신 500μL, 피루바테 나트륨 1mM, 1M KCl(최종 250 μM)의 12.5μL을 신경계 중간 값49mL에 추가한다.
- SFM을 50mL 원뿔관에 10mL및 40mL의 2개의 알리쿼트로 분할하여 최대 1개월 동안 4°C에 보관합니다.
- 소화 차단 매체: SFM에서 10% FBS
- 1.1mL의 열 활성화 FBS를 SFM의 10mL 알리쿼트에 추가하여 소화 차단 매체를 준비합니다.
- GCP 배양 매체: B27을 가진 SFM
- GCP 배양 매체를 준비하려면 SFM의 40mL 알리쿼트에 800 μL의 세럼 프리 B-27 보충제를 추가합니다.
참고: B-27 보충 SFM은 최대 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다. 그러나 갓 준비된 미디어는 최적의 결과를 낳습니다.
- GCP 배양 매체를 준비하려면 SFM의 40mL 알리쿼트에 800 μL의 세럼 프리 B-27 보충제를 추가합니다.
- 해부 버퍼 : 포도당 + HEPES를 가진 EBSS
- 10m HEPES(4-(2-하이드록세틸)-1-피프라진에탈레술포닉산을 함유한 칼슘과 마그네슘 이없는 얼의 균형잡힌 소금 용액(EBSS)에 6g/L의 포도당을 추가합니다.
- 0.2 μm 주사기 필터를 통과하여 용액을 살균하고 4°C에 저장하여 장기 보관하십시오.
- 소화 버퍼
참고: 사용하기 전에 갓 준비하십시오.- 2-4 소뇌 조직의 소화를 위한 소화 완충제 2mL및 4-10 조직에 대한 4mL를 준비하십시오. 4mL의 소화 완충액을 준비하려면 EBSS 4mL에서 L-시스테인(최종 농도 200-400 μg/mL)을 1.5 mg으로 용해하십시오. 분말이 완전히 용해 될 때까지 튜브를 반복적으로 반전시면 됩니다.
- 0.2 μm 주사기 필터와 5mL 주사기를 사용하여 용액을 살균하고 용액을 멸균 35mm 세포 배양 접시로 이송합니다.
- 파팡 4 μL(20단위/mg의 육수 농도에서 1:1,000 희석) 및 DNase I40 μL(1:100 희석/10 mg/mL 스톡에서 최종 농도0.1 mg/mL)을 추가합니다.
- 적어도 30 분 또는 사용 전까지 CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 용액을 배양하십시오.
참고: 이 단계는 파아픔을 활성화하는 데 중요합니다. 최적의 결과를 위해 사용하기 전에 37 °C에서 45 분이상초과하지 마십시오. 솔루션이 투명하게 변하고 사용하기 전에 흰색 침전이 없는지 확인합니다.
- 세럼 프리 매체(SFM)
- 프리코팅 커버립
- 세포 부착을 위한 커버립을 준비하려면, 37°C에서 적어도 1h2O에 대해 100 μg/mL의 폴리 D-lysine(PDL, 멸균 dH2O의 1 mg/mL)를 가진 오토클레이브 12mm 유리 커버립을 배양한다. 사용 전까지 동일한 PDL 용액에 커버립을 4°C로 유지합니다.
- 1차 세포 배양 당일, 깨끗한 원추형 튜브에서 PDL을 수집하고 잔류 PDL을 제거하기 위해 멸균 dH2O로 커버립을 세 번 헹구십시오.
참고: PDL은 재사용을 위해 4°C에 저장할 수 있습니다. - PDL 코팅 유리 커버립을 각 웰에 하나의 커버슬립을 배치하여 24웰 플레이트에 전달합니다.
- 여분의 물을 제거하고 200-300 μL의 Matrigel (혈청이없는 DMEM-F12의 제품 데이터 시트의 지침에 따라 재구성)를 추가하여 커버립을 완전히 덮습니다.
- CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 마트리겔의 커버립을 배양한다.
참고: 세포 시드 전에 대교겔을 제거합니다. 이 대교는 여러 재사용을 위해 4°C에서 수집 및 보관할 수 있다.
- 문화 요리 준비
- 100 μg/mL PDL의 2mL로 60mm 세포 배양 접시를 코팅하십시오(멸균 dH2O에서 1 mg/mL PDL 스톡 용액을 재구성)을 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션하여 코팅합니다.
- 세포 파종 직전에, 깨끗한 원문 관에서 사용된 PDL을 제거하고 수집하고 여러 재용도로 4°C에 보관하십시오. 멸균 dH2O로 PDL 코팅 접시를 세 번 헹구고 씻어 내십시오.
- 최대 2개의 전체 소뇌 조직에서 수확한 종자 세포에 60mm 세포 배양 접시 1개를 사용하십시오.
- 추가 소뇌를 위해 추가 문화 요리를 준비하십시오.
참고: 준비 문화 접시의 사용에 대 한 단계 2.1.18 및 2.1.19 를 참조 하십시오.
2. 실험일 0
- 마우스 기본 GCP의 격리 및 배양
참고: GCP 배양 방법은 표준 프로토콜에서 수정되었으며 간략한 프로토콜은 이전 작업에서 간략하게 설명되었습니다.6,11,12. 최적의 GCP 수율을 위해, GCP의 분리를 위해 산후(P) 일 6 일 또는 P7 새끼를 사용하십시오. 최적의 세포 생존을 위해 가능한 한 빨리 다음 해부 단계 2.1.6-2.1.10을 완료하십시오.- 전동 SFM, 소화 차단 매체, 배양 배지 및 Opti-MEM은 해부 시 37°C에서.
- 깨끗한 벤치에, 소독에 대한 70 % 에탄올에 모든 해부 장치를 미리 흡수.
- 60mm 세포 배양 접시에 2-3mL의 해부 버퍼를 채우고 얼음에 식힙니다.
- 섹션 1.1.5에 설명된 대로 신선한 소화 버퍼를 준비하고 37°C에서 따뜻하게 유지하십시오.
- 70%에탄올을 사용하여 소독을 위해 강아지의 머리를 닦으세요.
- 마취없이 새끼를 참수하십시오. 집게를 사용하여 머리를 잡고 외과 가위를 살균하여 두개골 뒤쪽에서 잘라 새끼를 참수하십시오. 조심스럽게 포셉을 사용하여 뇌를 발견하기 위해 피부와 두개골을 제거합니다.
- 집게를 사용하여 소뇌를 꼬집어 2.1.3 단계에서 준비된 미리 차가운 해부 버퍼에 빠르게 담급니다.
- 해부 현미경의 밑에 해부 버퍼에 잠긴 소뇌로 수막을 제거합니다. 혈관이 풍부한 수막은 해부 현미경의 밑에 분홍빛이 나야 합니다.
- 집게를 사용하여 모든 수막을 제거합니다.
참고 : 수막이없는 소뇌는 희끄무레한 모양을 가져야합니다. - 눈에 보이는 중뇌 조직과 소뇌에서 치로이드 신경을 제거합니다.
- 소뇌를 2.1.4 단계에서 준비한 따뜻한 소화 버퍼로 미리 채워진 35mm 배양 접시로 옮는다. 과도한 해부 버퍼를 전송하지 마십시오. 소뇌를 가능한 한 빨리 마이크로 스프링 가위를 사용하여 미세 한 조각으로 잘라냅니다.
- CO2 인큐베이터에서 15분 동안 37°C에서 다진 소뇌를 즉시 배양합니다. 4개 이상의 소뇌가 처리될 경우 잠복시간을 20분으로 연장합니다.
참고 : 잠복 후, 조직은 함께 뭉쳐집니다. - 소화조직을 소화 차단 매체로 P1000 파이펫 팁 프리웨트(소화 완충제 전송방지)를 사용하여 새로운 멸균 15mL 원심분리기 튜브의 바닥으로 즉시 이송한다.
- 적절한 양의 소화 차단 매체(1mL용 1mL)를 추가하여 P1000 마이크로파이프를 사용하여 소화및 파이펫을 30회 위아래로 부드럽게 종료하여 조직을 단일 셀 현탁액으로 더욱 해리시합니다. 기포 형성을 피하십시오.
- 70 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 멸균 원심분리기 튜브에 부드럽게 전달하여 세포 덩어리를 제거합니다.
- 세포 여과기를 통해 신선한 소화 차단 배지의 추가 1 mL을 전달하여 세포 여과기에서 잔류 세포를 수집합니다.
- 실온(RT)에서 5분 동안 200 × g 의 여과를 원심분리합니다. 상체를 제거하고 SFM의 1 mL로 펠릿을 다시 중단합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 기포를 형성하지 마십시오.
- GCP 배양 배지의 최종 부피 2mL로 펠릿을 재차 중단하고 1.3단계에서 제조된 PDL 코팅 60mm 프레라팅 배양 접시로 셀 서스펜션을 전송한다. CO2 인큐베이터에서 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
참고: 20분 초과하지 마십시오. - 인큐베이션 후, 배양 접시를 옆에서 탭하여 느슨하게 부착된 GCP 세포를 빼낸다. P1000 파이펫을 사용하여 부드러운 파이펫팅을 통해 배양 배지에서 부착된 GCP 세포를 수집합니다. 이 GCP 서스펜션을 새로운 15mL 원심분리기 튜브로 수집합니다. 60mm 접시를 버리십시오.
참고: 강하게 부착된 천체 세포와 섬유아세포 세포는 60mm 접시 바닥에 부착된 상태로 유지되며 이 단계에서 분리됩니다. 이 단계를 생략하면 GCP 문화의 순도가 손상됩니다. - 세포를 계산하고 즉시 전기 화로 진행합니다.
- 체외 (DIV) 0일: Hh 수용체 간질 과발현을 위한 전기포기: pEGFP-Smo
- 2mm 갭 큐벳을 이용한 전기포이션의 경우, 1.2× 106 세포 및 pEGFP-mSmo의 10μg(트라이-EDTA 완충또는 멸균 dH2O의 경우 DNA 육수 농도를 ~2-5 μg/μL로 조정)에 대해 다음과 같은 플라스미드 세포 전기포기 혼합물을 준비한다.
참고: 세포가 부족한 경우 총 세포 수를 줄입니다(전기기화 효율이 저하될 수 있음). 그러나, 큐벳 당 사용되는 Opti-MEM의 플라스미드 양이나 총 부피를 조정하지 마십시오. 실험에 필요한 총 세포 수가 1.5 × 106세포를 초과하는 경우, 그에 따라 전기기 혼합물을 확장하고 다중 전기기 반응을 별도로 수행한다. 큐벳은 최대 5회 재사용할 수 있습니다. - 코팅 된 커버립 (1.2 단계에서)을 포함하는 24 웰 배양 판의 각 웰에 배양 배지의 0.5 mL을 추가하여 후 전기 포기 세포 파종 플레이트를 준비하고 CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 따뜻하게 유지하십시오.
- 2.1.20 단계에서, 파이펫은 필요한 수의 세포를 멸균 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 전환하고 RT에서 5분 동안 200 × g에서 회전합니다. Opti-MEM을 사용하여 이 단계를 두 번 반복하여 잔류 배양 배지가 튜브에 존재하지 않도록 합니다.
참고: 24웰 플레이트의 모든 웰/커버슬립에 대해, 전극 및 종자 1.2-1.3 × 106 세포/웰을 얻기 위해 ~70-75% 세포 인플루엔시성을 얻기 위하여 배양의 다음 날에. - 표 1에 표시된 대로 전기 기화의 매개 변수를 설정합니다.
- 파이펫 은 전자 기화 반응을 부드럽게 잘 혼합하고 긴 P200 팁을 사용하여 혼합물의 100 μL의 정확한 부피를 2mm 갭 큐벳으로 전송합니다. 거품을 형성하지 마십시오.
- 큐벳 챔버에 큐벳을 놓습니다.
- 전기 포레이터의 Ω 버튼을 누르고 ( 재료의 표 참조) ~ 30-35해야 임피던스 값의 메모를합니다. 전기 임피던스 Ω 값이 30-35 범위 내에 있는지 확인하려면 100 μL의 정확한 부피를 준수하십시오.
- 시작 버튼을 눌러 펄스를 시작합니다.
- 판독 프레임에 표시된 측정된 전류 및 줄의 값을 기록합니다.
- 큐벳 챔버에서 큐벳을 제거합니다.
- 즉시 100 μL의 예동 배양 배지를 큐벳에 넣고 2-3번 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 재연합니다. 즉시 2.2.2 단계에서 준비된 24웰 플레이트로 셀 서스펜션을 이체한다.
참고: 세포 사멸을 최소화하기 위해 전기기 후 즉시 세포를 시드하십시오. - CO2 인큐베이터에서 세포를 37°C로 배양한다. 세포 분리를 피하기 위해 세포를 3 시간 동안 방해받지 않도록 둡니다.
- 3h 포스트 파싱에서, 부드럽게 흡인하고 부유 죽은 세포와 파편을 제거하고 예동 배양 배지의 동일한 양으로 교체하는 상체 매체의 절반을 폐기.
- CO2 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양하고 격일로 배지의 절반을 보충한다.
- 다음 날, 즉, Div1(도 1)에 대한 형광 현미경하에서 세포를 관찰하여 SMO 과발현의 효율을 결정한다.
- 배지의 절반을 보충한 후 DIV 1에서 Hh 신호 경로의 자극을 위해, 대조군에 동일한 부피를 추가하면서 세포에 0.2 μM 스무디온 고뇌스트(SAG)를 추가한다. 세포 고정 전에 24 시간 동안 배양하십시오.
참고: DMSO/SAG의 볼륨을 가능한 한 낮게 추가합니다. 여기서, 0.5 μL DMSO 또는 0.2 mMM SAG의 0.5 μL은 우물당 배지의 500 μL당 첨가되었으며, 이는 1:1,000의 희석 비입니다.
- 2mm 갭 큐벳을 이용한 전기포이션의 경우, 1.2× 106 세포 및 pEGFP-mSmo의 10μg(트라이-EDTA 완충또는 멸균 dH2O의 경우 DNA 육수 농도를 ~2-5 μg/μL로 조정)에 대해 다음과 같은 플라스미드 세포 전기포기 혼합물을 준비한다.
3. DIV 2: 1차 섬모의 시각화 및 Hh 신호 경로 조사
- 셀 고정
- 24시간 후 처리에서, 배양 배지를 제거하고 세포를 탈지하지 않도록 일회용 파스퇴르 파이펫을 사용하여 인산염 완충식식염수(PBS)로 세포를 2-3회 헹구는 다.
- 4% 파라포름알데히드(PBS에서 제조)의 ~400 μL을 첨가하여 세포를 수정하고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
- 일회용 파스퇴르 파이펫을 사용하여 PBS로 2-3회 헹구고 씻습니다.
- PBS에 최대 2개월 동안 4°C에 저장하거나 면역염색을 진행한다.
- GCP 및 1차 실륨 마커의 면역 세포화학 적 염색
- 24웰 플레이트에서 PBS에서 매번 5분 동안 부드러운 흔들림으로 셀을 두 번 씻습니다.
- 100mM 암모늄 의 0.5mL를 세포에 넣고 RT에서 10분 동안 배양하여 고정을 담금질합니다.
- 한 번 헹구고 PBS로 2-3번 씻어 내고 매번 10분 동안 부드러운 흔들림으로 씻습니다.
- 부드럽게 파이펫 30 블로킹 버퍼의 μL (BB: 0.1% 트리톤 X-100, 1% BSA, PBS의 2% 열 비활성화 말 혈청) 파라필름 조각에 기포없이 물방울을 형성합니다.
- 커버슬립을 우물에서 BB 액적에 부드럽게 옮기고 셀 시드 측이 아래쪽으로 향합니다. RT에서 1 h에 대한 습한 챔버에서 BB로 세포를 배양.
- 재료의 표에 표시된 바와 같이 BB에서 1 차 적인 항체 혼합을 준비합니다. 1 차적인 항체를 가진 세포를 탐구하기 위하여는, 1 차적인 항체 혼합으로 BB를 대체하는 단계 3.2.4 및 3.2.5를 반복합니다. RT에서 2h에 대한 1 차 항체로 세포를 배양한다.
- 집게를 사용하여 커버립을 24웰 플레이트로 다시 옮기고 셀 시드 측이 위쪽으로 향합니다. 세포를 한 번 헹구고 PBS에서 매번 10 분 동안 부드러운 흔들림으로 3-4 번 씻습니다.
- 재료의 표에 표시된 바와 같이 BB에서 이차 항체 믹스를 준비합니다. 이차 항체로 세포를 배양하기 위해, BB를 이차 항체 혼합물로 대체하여 3.2.4 및 3.2.5 단계를 반복한다. RT에서 1 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
- 반복 단계 3.2.7 후 이차 항체 인큐베이션 세척에 대 한.
- 장착 매체를 사용하여 깨끗한 미세한 유리 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.
- 밤새 어둠 속에서 슬라이드를 공기 건조시키고 공초점 이미징13로 진행합니다.
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Representative Results
Opti-MEM( 재료의 표 참조)을 보편적 시약으로 사용하여, 이 제안된 전기기화 방법론은 ~80-90%(그림 1)에서 일관되게 높은 전기기화 효율을 달성할 수 있었다. Smo-EGFP 벡터의 전기기화 효율은 모든 페어링된 상자 단백질-6(Pax6)-발현 GCP 세포에서 녹색 형광 양성 세포의 백분율을 정량화함으로써 DIV 2 후 전기기화에서 결정되었다. DMSO 및 SAG 처리 군의 전기기 효율은 비교할 수 있는 것으로 나타났다(그림 1 및 표 2).
또한, 1차 실슘 마커인 Arl13b의 면역염색은 DIV 2에서 GCP의 모온률이 차량 및 SAG 처리군 모두에서 ~18%였으며(DMSO: 17.35% ± 0.59%; SAG: 18.24% ± 0.88%). 섬광 속도는 DIV 2 후 전기포레이션(도 2 및 표 3)에서 세포 표면에 1차 실륨(Arl13b-positive)을 베어링하는 Pax6-expressing GCP의 백분율로 도시된다.
1차 실륨 의존적 Hh 신호 통로를 해독하기 위해 SAG의 고뇌스트인 SAG는 Hh 신호 경로를 활성화하는 데 사용되었습니다. Hh 통로 활성화시, Smo 수용체는 1차 cilium14의 차손메에서 농축됩니다. 우리의 결과는 24 h 포스트 SAG 처리에서 Pax6 표현 GCP 세포의 1 차적인 cilium axoneme에 Smo-EGFP 현지화를 현저하게 증가표시 (그림 3, 이전 작업에서 수정 된 정량화 데이터 6), 1 차 적인 cilium 의존 Hh 신호 경로의 심오한 활성화를 나타내는.
그림 1: 전기화 설정 및 GCP의 전기 기화 효율. (A) 전기 기화 설정. 오른쪽, 검은 색 화살촉은 전기 화기 큐벳을 나타냅니다. (B, C) 대표적인 이미지는 모든 Pax6-expressing GCP 세포(표 2)에서 GFP 양성 세포의 백분율을 정량화하여 결정된 Smo-EGFP 벡터의 전기기화 효율을 나타낸다. 대표적인 이미지는 (B) DMSO 및 (C) SAG를 가진 24 시간 처리 후에 DIV 2 포스트 전기기화에 Pax6 표현 (보라색) GCP 세포에 녹색 형광 신호를 묘사합니다. 핵은 DAPI(파란색)로 표지되었다. 스케일 바 = 20 μm. 약어: GCP = 과립 세포 전구체; GFP = 녹색 형광 단백질; Pax6 = 페어링된 박스 단백질-6; DIV = 시험관 내 일; DMSO = 디메틸 설옥화물; SAG = 부드러운 고뇌스트; DAPI = 4',6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: GCP 기본 문화권 DIV 2의 섬모 비율. (A, B) 대표적인 이미지는 GCP 기본 문화권의 DIV 2에서 의 모양 비율을 묘사합니다. 대표적인 이미지는 (A) DMSO 및 (B) SAG를 가진 24시간 처리 후에 DIV 2 포스트 전기기화에 Pax6 표현(red) GCP 세포에 1차 섬모(녹색)를 묘사한다. 핵은 DAPI(파란색)로 표지되었다. 기본 실륨(녹색)은 흰색 화살촉으로 표시됩니다. 스케일 바 = 20 μm. (C) 그래프는 4개의 독립적인 실험의 정량화를 보여 줍니다. 통계 분석, 짝을 이루지 않은 학생의 t-테스트. 오류 막대는 ±SEM. 약어를 묘사: GCP = 과립 세포 전구체; Pax6 = 페어링된 박스 단백질-6; DIV = 시험관 내 일; DMSO = 디메틸 설옥화물; SAG = 부드러운 고뇌스트; DAPI = 4',6-디아미드노-2-페닐린돌; n.s. = 중요하지 않음; SEM = 평균의 표준 오류; Arl13b = ADP 리보실화 인자 같은 단백질 13B. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
도 3: SAG 처리 시 Pax6-expressing GCP 세포의 1차 실륨에 대한 스모 국산화 증가. (A) 대표적인 이미지는 DMSO 및 SAG로 24시간 치료 후 DIV6-expressing(보라색) GCP 세포에서 1차 실리움(빨간색, 흰색 사각형 상자)에 스모-EGFP 국소화(녹색)를 묘사한다. 핵은 DAPI(파란색)로 표지되었다. 스케일 바 = 5 μm. (B) 그래프는 4개의 독립적인 실험의 정량화를 보여 줍니다. 통계 분석, 짝을 이루지 않은 학생의 t-테스트. P ≤ 0.001. 오류 막대는 DMSO 그룹에 대한 ± SEM. 토탈 n = 97, SAG 그룹에 대한 총 n = 130을 묘사합니다. 도 3B 는 6에서 수정되었습니다. 약어: GCP = 과립 세포 전구체; 스모 = 스무딩; Pax6 = 페어링된 박스 단백질-6; DIV = 시험관 내 일; DMSO = 디메틸 설옥화물; SAG = 부드러운 고뇌스트; DAPI = 4',6-디아미드노-2-페닐린돌; SEM = 평균의 표준 오류; Arl13b = ADP 리보실화 인자 같은 단백질 13B. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
| 포링 펄스 설정 | 펄스 설정 전송 | |||
| 마우스 기본 GCP | 1 차적인 뉴런 | 마우스 기본 GCP | 1 차적인 뉴런 | |
| 전압 | 275 V | 275 V | 20 V | 20 V |
| 길이 | 미스 1 | 0.5 ms | 50 ms | 50 ms |
| 간 | 50 ms | 50 ms | 50 ms | 50 ms |
| 아니요. | 2 | 2 | 5 | 5 |
| D 비율 | 10% | 10% | 40% | 40% |
| 극성 | + | + | ± | ± |
표 1: 슈퍼 일렉트로포레이터 NEPA21 TYPE II를 사용하여 마우스 기본 GCP 및 1차 뉴런의 전기포기 파라미터. 약어: GCP = 과립 세포 전구체.
| 전기 기공 효율 | Exp. 1 (n = 486) | Exp. 2 (n = 1314) | Exp. 3 (n = 704) | Exp. 4 (n = 476) | 평균의 |
| DMSO 처리 그룹 | 90.57% ± 10.12% | 96.62% ± 3.09% | 98.89% ± 0.97% | 90.72% ± 11.31% | 94.02% ± 1.36% |
| SAG 처리 그룹 | 91.8% ± 8.69% | 79.97% ± 2.77% | 89.35% ± 5.67% | 88.59% ± 13.54% | 87.42% ± 1.71% |
| 평균 전기 기공 효율 | 91.31% ± 7.99% | 88.27% ± 10.81% | 94.12% ± 6.36% | 89.65% ± 11.21% | 90.84% ± 0.84% |
표 2: 모든 Pax6-현현 GCP 세포에서 GFP 양성 세포의 백분율의 Smo-EGFP 벡터결정정량화의 전기포기 효율. 4개의 독립적인 실험(Exp.)의 데이터가 표시됩니다. (총 n = 2980). 약어 : 스모 = 스무딩; GFP = 녹색 형광 단백질; GCP = 과립 세포 전구체; Pax6 = 페어링된 박스 단백질-6.
| 소모1 | 소모2 | 소모수 3 | Exp. 4 | 평균의 | |
| 진동률 - DMSO | 18.88% ± 3.61% | 19.58% ± 7.42% | 16.60% ± 1.48% | 14.35% ± 7.99% | 17.35% ± 0.59% |
| 용액 속도 - SAG | 13.93% ± 3.39% | 17.30% ± 2.15% | 22.19% ± 10.35% | 19.56% ± 1.15% | 18.24% ± 0.88% |
표 3: GCP 기본 문화권 의 DIV 2에 대한 섬모비율입니다. 4개의 독립적인 실험(Exp.)의 데이터가 표시됩니다. (DMSO 그룹에 대한 총 n = 1169, SAG 그룹에 대한 총 n = 816). 약어: GCP = 과립 세포 전구체; DIV = 시험관 내 일; DMSO = 디메틸 설옥화물; SAG = 부드러운 고뇌스트.
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Discussion
전기기화 방법에 의한 1차 GCP 배양에서 의 전형적 트랜스펙트(transfection)는 전형적으로 낮은 세포 생존력 및 불량한 형질 효율9,10과 연관된다. 이 백서는 고효율과 생존력을 입증한 비용 효율적이고 재현 가능한 전기 화 프로토콜을 소개합니다. 또한, 우리는 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 cilium 의존적인 Hh 신호 통로를 공부하는 간단한 방법을 보여줍니다.
그밖 일반적인 전기기화 방법은 수시로 특정 제조자에서 구입해야 하는 비용이 많이 드는 세포 모형 특정 전기기 시약을 요구합니다. 여기에 기재된 방법은 상이한 세포 유형에 대한 일반적이고 경제적인 전기기시약을 사용하기 때문에 유리한 것으로 간주된다. 더욱이, 이들 데이터는 전기기공 효율이 ~80-90%에 도달한 것으로 나타났으며, 이는 다른 전기기공및 경화 방법에 비해 매우 효율적입니다9,10.
더 높은 세포 생존력을 유지하기 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 소뇌 해부 및 해리 절차는 1-2 h의 가장 짧은 시간 내에 완료되어야합니다. 또 다른 중요한 단계는 전기 기화 중 펄스 전에 플라스미드 세포 전기 기화 혼합물에서 기포 형성을 피하는 것입니다. 펄스 후, 예열된 배양 배지는 큐벳에 즉시 첨가되어야 하며 가능한 한 빨리 종자된 세포를 첨가해야 합니다. 세포는 처음 3 h 포스트 셀 파싱에서 방해받지 않아야 합니다. 상기 예방 조치는 문화의 둘째 날에 약 70-80 %까지 세포 생존력을 향상시킬 것입니다.
1차 배양 플랫폼에서 1차 실륨을 연구하는 한 가지 주목할 만한 한계는 배양된 세포에서 의 섬광 속도가 일반적으로 생체 내에서 관찰된 것보다 낮다는 것입니다. 이전 데이터 6 은 E15.5와 P15 모두에서 GCP에 대한 용 액의 생체 내 비율이 약 60-80%인 것으로 나타났다. 대조적으로, 1차 GCP 배양 에서 의 체차 율은 ~20%6이었다. 그럼에도 불구 하 고, 이것은 대부분의 에 걸쳐 식별 할 수 있는 일반적인 현상 (전부는 아니지만) 세포 유형 시험관 내와 생체 내 연구 사이 섬광의 비율을 비교할 때.
특히, 이 방법은 또한 신경 전구 세포 및 피질 및 해마 뉴런 배양과 같은 다른 1차 배양에 적용되며, 이는 전기포기 파라미터, 즉 포링 펄스 전압, 길이 및 펄스 수를 수정하여 달성가능하다. 이 프로토콜의 적용을 더 넓은 연구 분야로 확장하기 위해 기본 뉴런에 권장되는 전기 기화 매개 변수가 표 1에 제공됩니다. 또한, 본 프로토콜에 사용되는 범용 전기기 분기 시약, 즉 Opti-MEM은 시약 호환성에 대하여 최적화가 필요한 다른 전기기화 프로토콜에 비해 추가적인 지루한 최적화 노력을 피하는 데 도움이 된다. 1차 GCP 배양에서 의한 1차 실슘 및 Hh 시그널링의 조사를 위한 최적화되고 비용 효율적인 전기기화 프로토콜은 1차 배양을 이용한 다른 주요 실륨 관련 연구의 기준 절차로 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 HKBU 시드 펀드와 Tier-2 스타트업 그랜트 (RG-SGT2/18-19/SCI/SCI/009), 연구 보조금 위원회-협력 연구 기금 (CRF-C2103-20GF)에서 C.H.H. Hor에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
