Summary
Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.
Abstract
Microglia, de residente aangeboren immuuncellen in de hersenen, zijn de primaire responders op ontsteking of letsel in het centrale zenuwstelsel (CZS). Microglia kunnen worden onderverdeeld in rusttoestand en geactiveerde toestand en kunnen snel van toestand veranderen als reactie op de micro-omgeving van de hersenen. Microglia worden geactiveerd onder verschillende pathologische omstandigheden en vertonen verschillende fenotypen. Daarnaast zijn er veel verschillende subgroepen van geactiveerde microglia en grote heterogeniteit tussen verschillende subgroepen. De heterogeniteit hangt vooral af van de moleculaire specificiteit van microglia. Studies hebben aangetoond dat microglia worden geactiveerd en een belangrijke rol spelen in het pathologische proces van inflammatoire demyelinisatie. Om de kenmerken van microglia bij inflammatoire demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose en neuromyelitis optica spectrum stoornis beter te begrijpen, stellen we een perilesional primair microgliaal sorteerprotocol voor. Dit protocol maakt gebruik van kolomvormige magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS) om sterk gezuiverde primaire microglia te verkrijgen en de moleculaire kenmerken van microglia te behouden om de potentiële effecten van microglia bij inflammatoire demyeliniserende ziekten te onderzoeken.
Introduction
Microglia zijn afkomstig van dooierzakvoorlopers, die zeer vroeg de embryonale hersenen bereiken en deelnemen aan de ontwikkeling van het CZS 1,2. Ze zijn bijvoorbeeld betrokken bij synaptisch snoeien3 en het reguleren van axonale groei4. Ze scheiden factoren af die neuronale overleving bevorderen en neuronale lokalisatie helpen5. Tegelijkertijd zijn ze betrokken bij het verwijderen van abnormale cellen en apoptotische cellen om een normale hersenontwikkeling te garanderen6. Bovendien, als de immuun-competente cellen van de hersenen, surveilleren microglia voortdurend het hersenparenchym om dode cellen, disfunctionele synapsen en cellulair puinop te ruimen 7. Het is aangetoond dat microgliale activering een belangrijke rol speelt bij een verscheidenheid aan ziekten, waaronder inflammatoire demyeliniserende ziekten, neurodegeneratieve ziekten en hersentumoren. Geactiveerde microglia bij multiple sclerose (MS) dragen bij aan de differentiatie van oligodendrocytenvoorlopercellen (OPC's) en regeneratie van myeline door myeline-puin te verzwelgen8.
Bij de ziekte van Alzheimer (AD) activeert accumulatie van amyloïde bèta (Aβ) microglia, die de fagocytische en ontstekingsfuncties van microglia9 beïnvloeden. Geactiveerde microglia in het glioomweefsel, glioom-geassocieerde microglia (GAM) genoemd, kunnen de progressie van glioom reguleren en uiteindelijk de prognose van patiëntenbeïnvloeden 10. De activering verandert het microgliale transcriptoom grondig, wat resulteert in morfologische veranderingen, expressie van immuunreceptoren, verhoogde fagocytische activiteit en verbeterde cytokinecretie11. Er zijn verschillende subsets van geactiveerde microglia bij neurodegeneratieve ziekten zoals ziekte-geassocieerde microglia (DAM), geactiveerde respons microglia (ARM) en microgliaal neurodegeneratief fenotype (MGnD)8.
Evenzo bestaan er ook meerdere dynamische functionele subsets van microglia naast elkaar in de hersenen bij inflammatoire demyeliniserende ziekten12. Het begrijpen van de heterogeniteit tussen verschillende subsets van microglia is essentieel om de pathogenese van inflammatoire demyeliniserende ziekten te onderzoeken en hun potentiële therapeutische strategieën te vinden. De heterogeniteit van microglia hangt vooral af van de moleculaire specificiteit8. Het is essentieel om de moleculaire veranderingen van microglia nauwkeurig te beschrijven voor de studie van de heterogeniteit. Vooruitgang in eencellige RNA-sequencing (RNA-seq) technologie heeft de identificatie van de moleculaire kenmerken van geactiveerde microglia in pathologische omstandighedenmogelijk gemaakt 13. Daarom is het vermogen om celpopulaties te isoleren van cruciaal belang voor verder onderzoek van deze doelcellen onder specifieke omstandigheden.
Studies die worden uitgevoerd om de kenmerken en functies van microglia te begrijpen, zijn meestal in vitro studies, omdat is gebleken dat grote aantallen primaire microglia kunnen worden bereid en gekweekt uit muizenjonghersenen (1-3 dagen oud), die zich hechten aan de kweekkolven en groeien op het plastic oppervlak met andere gemengde gliacellen. Vervolgens kunnen zuivere microglia worden geïsoleerd op basis van de verschillende kleefkracht van gemengde gliacellen14,15. Deze methode kan echter alleen microglia isoleren uit de perinatale hersenen en duurt enkele weken. Potentiële variabelen in celkweek kunnen microgliale kenmerken beïnvloeden, zoals moleculaire expressie16. Bovendien kunnen microglia die door deze methoden worden geïsoleerd alleen deelnemen aan in vitro experimenten door de omstandigheden van CZS-ziekten te simuleren en kunnen ze niet de kenmerken en functies van microglia in in vivo ziektetoestanden vertegenwoordigen. Daarom is het noodzakelijk om methoden te ontwikkelen voor het isoleren van microglia uit het volwassen muizenbrein.
Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en magnetische scheiding zijn twee veelgebruikte methoden, hoewel ze hun eigen verschillende beperkingen hebben 16,17,18,19. Hun respectievelijke voor- en nadelen zullen in het discussiegedeelte worden vergeleken. De rijping van MACS-technologie biedt de mogelijkheid om cellen snel te zuiveren. Huang et al. hebben een handige methode ontwikkeld om demyeliniserende laesies in hersenen te labelen20. Door deze twee technische benaderingen te combineren, stellen we een snel en efficiënt kolomvormig CD11b magnetisch scheidingsprotocol voor, met een stapsgewijze beschrijving om microglia te isoleren rond demyeliniserende laesies in volwassen muizenhersenen en de moleculaire kenmerken van microglia te behouden. De focale demyeliniserende laesies werden veroorzaakt door de stereotactische injectie van 2 μL lysolecithine-oplossing (1% LPC in 0,9% NaCl) in het corpus callosum 3 dagen voor aanvang van het protocol21. Dit protocol legt de basis om de volgende stap in in vitro experimenten uit te voeren. Bovendien bespaart dit protocol tijd en blijft het haalbaar voor wijdverbreid gebruik in verschillende experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Institute of Animal Care Committee van Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China.
1. Materialen
- Bereid de volgende oplossingen voor voordat u met het protocol begint.
- Bereid de laadbuffer voor door foetaal runderserum (FBS, 2%) toe te voegen aan fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg neutrale rode (NR) kleurstof (laatste 1%) toe aan PBS.
- Bereid de volgende oplossingen voor met behulp van de in de handel verkrijgbare Adult Brain Dissociation Kit (zie de tabel met materialen).
- Om enzymmix 1 te bereiden, pipetteer 1,9 ml buffer Z en 50 μl enzyme P in een centrifugebuis van 15 ml.
- Om enzymmix 2 te bereiden, pipetteer 20 μL buffer Y en 10 μL enzym A in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Bereid de oplossing voor het verwijderen van puin voor.
2. Muizenperfusie en dissectie
- Intraperitoneaal (i.p.) injecteer de muis met 500 μL 1% NR kleurstof in PBS 2-3 uur vóór de anesthesie.
OPMERKING: Intraperitoneale injectie van NR in demyeliniserende muismodellen helpt de laesies te onderscheiden (figuur 1). - Verdoof de muis met pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) en zorg ervoor dat de muis met succes wordt verdoofd door de pijnreacties te onderzoeken.
- Open de thoracale holte van de muis en stel het hart bloot.
- Snijd een klein hoekje van het rechteratrium voorzichtig en intracardiaal doordrenkt de muis met 20-30 ml koude PBS uit de linker ventrikel.
- Onthoofd de muis onder anesthesie.
- Open de schedel van de muis en bevrijd de hersenen voorzichtig van de schedel.
- Breng de hersenen over naar de schimmel van de muishersen en snijd de hersenen in plakjes van 0,1 cm.
- Verwijder de hersenschijfjes en leg ze in koude PBS in een petrischaaltje (60/15 mm). Microdisissek de laesies gelabeld door NR-kleurstof rond het corpus callosum onder een stereomicroscoop met behulp van een microchirurgische tang.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het ontleedde weefsel zo compleet mogelijk is om de daaropvolgende overdracht te vergemakkelijken; de totale voortgang van de dissectie moet binnen 2 uur zijn voltooid. - Breng het ontleedde weefsel over in centrifugebuizen van 15 ml die de juiste hoeveelheid koude belastingsbuffer bevatten.
OPMERKING: Pool het corpus callosum weefsel van 2-3 muizen samen in één buis als één monster.
3. Weefseldissociatie
- Centrifugeer het ontlede weefsel bij 300 ×g gedurende 30 s (na het bereiken van deze snelheid) om het monster op de bodem van de buis te verzamelen.
- Verwarm enzymmix 1 en enzymmix 2 tot 37 °C voor in een incubator.
- Voeg 1.950 μL voorverwarmd enzymmengsel 1 toe aan één monster en verteer in een incubator bij 37 °C gedurende 5 minuten.
- Voeg 30 μL voorverwarmd enzymmengsel 2 toe en meng voorzichtig.
- Verteer in een couveuse bij 37 °C gedurende 15 minuten en meng voorzichtig om de 5 minuten.
- Voeg na de vertering 4 ml koude PBS toe aan de buis en schud voorzichtig.
- Plaats 70 μm filters op centrifugebuizen van 50 ml en bevochtig de filters met 500 μL koude PBS. Filtreer het gedissocieerde weefsel door de verteerde weefselmonsters door de filters te laten gaan en breng de gefilterde suspensie in de centrifugebuis van 50 ml over naar een centrifugebuis van 15 ml.
OPMERKING: Sla deze stap over als de hoeveelheid weefsel te klein is. - Centrifugeer de gefilterde weefselmonsters gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 300 ×g en zuig het supernatant langzaam en volledig op.
OPMERKING: Alle stappen moeten op ijs worden uitgevoerd, behalve de enzymatische spijsvertering.
4. Puin verwijderen
- Resuspend de celkorrel voorzichtig met 1.550 μL koude PBS.
- Voeg 450 μL koude oplossing toe voor het verwijderen van vuil en meng goed.
- Overlay het bovenstaande mengsel zeer langzaam en voorzichtig met 2 x 1 ml koude PBS met behulp van een pipet van 1.000 μL.
OPMERKING: Kantel de centrifugebuis 45 ° en voeg langzaam PBS toe langs de buiswand met de pipet. - Breng de buis langzaam en voorzichtig over in een centrifuge en draai bij 4 °C en 3.000 × g gedurende 10 minuten.
- Zoek naar drie lagen na het centrifugeren. Zuig de twee bovenste lagen volledig op met een pipet van 1.000 μL (figuur 2).
- Vul de buis tot 5 ml met koude laadbuffer en keer de buis voorzichtig drie keer om.
- Centrifugeer bij 4 °C en 1.000 × g gedurende 10 minuten. Zuig het supernatant volledig op en voorkom dat de celkorrel wordt verstoord.
5. Magnetische scheiding van microgliale cellen
- Resuspend de celkorrel met 90 μL laadbuffer en voeg 10 μL CD11b (Microglia) kralen toe.
- Meng goed en incubeer gedurende 15 min bij 4 °C.
- Voeg 1 ml laadbuffer toe en pipetteer de vloeistof voorzichtig op en neer met een pipet van 1.000 μL om de cellen na de incubatie te wassen. Centrifugeer de cellen bij 4 °C en 300 × g gedurende 10 minuten en zuig het supernatant volledig op om de ongebonden kralen te verwijderen.
- Resuspend de cellen in 500 μL laadbuffer.
- Plaats de MS-kolom met de scheidingsteken voor positieve selectie in het magnetisch veld.
- Spoel de kolom met 500 μL laadbuffer om de cellen te beschermen en de efficiëntie van magnetisch sorteren te garanderen op basis van het protocol van de fabrikant.
- Breng de celsuspensie aan op de MS-kolom en gooi de flowthrough met ongelabelde cellen weg.
- Voeg drie keer 500 μL laadbuffer toe aan de kolom om cellen weg te spoelen die aan de kolomwand hechten en gooi de doorstroming weg.
OPMERKING: Voeg alleen een nieuwe laadbuffer toe voor het wassen als het kolomreservoir volledig leeg is. - Verwijder de kolom uit de separator na het wassen van de kolom en plaats deze op een centrifugebuis van 15 ml.
- Voeg 1 ml laadbuffer toe aan de kolom en duw de zuiger naar de onderkant van de kolom om de magnetisch gelabelde cellen weg te spoelen. Herhaal deze stap drie keer om de magnetisch gelabelde cellen volledig te verzamelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microglia geïsoleerd met CD11b kralen hebben een hoge zuiverheid
Microgliale cellen rond de laesies in demyelinisatiemuismodellen werden geïsoleerd met behulp van het bovengenoemde protocol en getest door flowcytometrie. Cellen worden fluorescerend gelabeld met CD11b-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en CD45-allophycocyanine (APC) om microglia in flowcytometrie te bepalen volgens de instructies van de fabrikant. Er zijn meerdere literatuur die aantoont dat CD11b- en CD45-antilichamen voldoende zijn om te controleren op de zuiverheid van geïsoleerde microglia 19,22. De fluorescentiecompensatie werd voltooid op de flowcytometer met behulp van ongekleurde en enkelgekleurde controlemonsters. Cellen werden afgeschermd door voorwaartse strooihoogte (FSC-H) en zijdelingse strooihoogte (SSC-H); afzonderlijke cellen werden afgeschermd door forward scatter-area (FSC-A) en FSC-H. De verhoudingen van microglia (geïdentificeerd als CD11b+CD45Intermediate) voor en na de magnetische scheiding werden getest door flowcytometrie. De back-loop techniek werd gebruikt om de gating strategie van flow cytometrie analyse aan te passen door het bepalen van de poort voor de microglia. Vergeleken met ongeveer 3 × 104 cellen en 6 × 103 microglia vóór de magnetische scheiding van elk muizenbrein (figuur 3A), levert MACS over het algemeen ongeveer 2,5 × 103 cellen en 2 × 103 microglia per muizenhersenhelft op (figuur 3B), wat ongeveer 85% van alle afzonderlijke cellen was. Bijna 3% van de myeloïde cellen (geïdentificeerd als CD11b +CD45hoog) waren echter aanwezig in de MACS-gescheiden cellen en waren moeilijk te verwijderen uit de CD11b-populatie in dit protocol. De zuiverheid van de geïsoleerde microglia kan worden verhoogd tot 95% met behulp van twee magnetische kolommen (aanvullende figuur S1). MACS-sortering kon ongeveer 33% van de microglia in het hersenmengselmonster vangen.
Microglia geïsoleerd met CD11b kralen hebben een hoge cel levensvatbaarheid
Fluorochroom 7-aminoactinomycine D (7-AAD) wordt vaak gebruikt om de levensvatbaarheid van de cel in de flowcytometrie aan te tonen. 7-AAD+ cellen vertegenwoordigen dode cellen19. De levensvatbaarheid van MACS-gescheiden microglia was ongeveer 95% door celkleuring met 7-AAD (figuur 4).
Morfologische analyse van microglia rond demyeliniserende laesies gesorteerd op MACS
Morfologische analyse toonde aan dat microglia niet werden geactiveerd door MACS. Microglia vertonen een typisch longitudinaal bipolair cellichaam na MACS, dat vergelijkbaar is met microgliale morfologie na FACS19. Microglia rond demyeliniserende laesies zullen worden geactiveerd in het model van LPC-geïnduceerde demyelinisatie21. Microglia gekleurd door geïoniseerd calciumbindend adaptormolecuul 1 (Iba-1) vertoonden typische amebe morfologie van geactiveerde microglia in dit protocol. P2ry12 is een typisch molecuul van microgliale rusttoestand. Er is een kleine fractie van vertakte en P2ry12+ microglia vóór MACS als gevolg van de uitbreiding van de omvang van de gedissocieerde laesies. Het bestaan van P2ry12+ microglia na MACS geeft echter ook aan dat MACS microglia niet zal activeren (Supplemental Figure S2).
Figuur 1: Afbeeldingen van de focale demyeliniserende laesies gelabeld door de neutrale rode kleurstof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afbeeldingen van de drie lagen gevormd door centrifugeren. De bovenste twee lagen (laag 1 + laag 2) moeten worden verwijderd in het verwijderingsproces van puin (zie protocolstap 4.5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Flowcytometrie-analyse van microglia geïsoleerd uit demyelinisatielaesies van volwassen muizen voor en na MACS. (A) Schematische weergave van gatingstrategie gebruikt in flowcytometrie-analyse vóór MACS: FSC-H en SSC-H voor het selecteren van cellen, FSC-A en FSC-H voor het selecteren van afzonderlijke cellen, en CD11b-FITC en CD45-APC voor het selecteren van myeloïde cellen (omhoog) en microglia (omlaag). (B) Schematische weergave van de gatingstrategie die wordt gebruikt in het flowcytometrie-analysemonster na MACS. Het aandeel microglia is aanzienlijk toegenomen na MACS: FSC-H en SSC-H voor het selecteren van cellen, FSC-A en FSC-H voor het selecteren van afzonderlijke cellen, en CD11b-FITC en CD45-APC voor het selecteren van myeloïde cellen (omhoog) en microglia (omlaag). Afkortingen: SSC-H = zijverstrooiingshoogte; FSC-H = voorwaartse strooihoogte; FSC-A = voorwaarts strooigebied; CD45-APC = allophycocyanine-gelabelde CD45; CD11b-FITC = fluoresceïne isothiocyanaat-gelabeld CD11b; MACS = magnetisch geactiveerde celsortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: FACS gating strategie voor levende/dode enkelvoudige cellen na MACS. 7-AAD en SSC-H voor het selecteren van levende cellen na MACS. Afkortingen: SSC-H = zijverstrooiingshoogte; 7-AAD = 7-aminoactinomycine D; MACS = magnetisch geactiveerde celsortering; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Flowcytometrie-analyse van microglia geïsoleerd uit volwassen demyelinisatiemuizen. (A) Schematische weergave van de gatingstrategie die wordt gebruikt in flowcytometrie-analysemonster vóór MACS. (B) Schematische weergave van de gatingstrategie die wordt gebruikt in flowcytometrie-analysemonster na MACS met behulp van twee magnetische kolommen. (C) Single-parameter histogram van CD11b-FITC en CD45-APC in flowcytometrie na MACS met behulp van twee magnetische kolommen. Afkortingen: SSC-H = zijverstrooiingshoogte; FSC-H = voorwaartse strooihoogte; FSC-A = voorwaarts strooigebied; CD45-APC = allophycocyanine-gelabelde CD45; CD11b-FITC = fluoresceïne isothiocyanaat-gelabeld CD11b; MACS = magnetisch geactiveerde celsortering; CD45Int = tussenliggende CD45-expressie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Immunofluorescentiekleuring van microglia met Iba-1 en P2ry12 voor en na MACS. (A) Afbeeldingen van microglia vóór MACS. (B) Beelden van geïsoleerde microglia na MACS. Schaalbalken = 20 μm. Afkortingen: MACS = magnetic-activated cell sorting; Iba-1 = geïoniseerd calciumbindend adaptermolecuul 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol stelt een methode voor om microglia rond de demyeliniserende laesies te isoleren, die kan helpen bij het bestuderen van de functionele kenmerken van microglia bij inflammatoire demyeliniserende ziekten. Microglia gevangen met BEHULP VAN CD11b kralen vertonen een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid. Kritieke stappen in het protocol omvatten de nauwkeurige lokalisatie van foci en optimale microgliale zuivering. In protocolstap 2.1 is het noodzakelijk om de NR-oplossing 2 uur te injecteren voordat de muis wordt opgeofferd om ervoor te zorgen dat de laesies nauwkeurig kunnen worden weergegeven20. In protocolstap 2.8 werd ervoor gezorgd dat hersenweefselsecties op een ijskast werden geplaatst voor dissectie en deze stap zo snel mogelijk werd voltooid, waardoor de levensvatbaarheid van cellen werd verbeterd. In stap 2.9 is het noodzakelijk om het juiste weefsel als één monster te selecteren voor zowel enzymvertering als puinverwijdering. Stap 3.7 kan niet worden overgeslagen wanneer het effect van vuilverwijdering niet bevredigend is. In stap 4.3 moet de toevoeging van PBS voorzichtig zijn om verschillende lagen te vormen, zodat zoveel mogelijk vuil wordt verwijderd. Alle stappen in het protocol, behalve enzymatische spijsvertering, moeten op ijs worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cel te waarborgen en de transcriptionele respons van de microglia te verminderen. Elke stap in het protocol is mild en behoudt een hoge levensvatbaarheid, dus het is niet nodig om de oplossing voor het verwijderen van dode cellen22,23 te gebruiken.
De enzymatische dissociatiemethode voor muizenhersenen in het protocol is geschikt gebleken voor eencellig RNA-seq23. Hoewel de enzymen in het protocol mild zijn, hebben Marsh et al. ontdekt dat verschillende enzymatische hydrolyseprotocollen bij 37 °C het transcriptoom van microglia24 aanzienlijk kunnen veranderen. Het instellen van een gezonde controle in het experiment voor vergelijking kan helpen om de differentieel tot expressie gebrachte genen van demyelinisatie te identificeren, waardoor de abnormale transcriptionele respons in het protocol wordt geëlimineerd. Ondertussen, om deze abnormale transcriptionele toestand na enzymatische spijsvertering te voorkomen, kan het protocol worden geoptimaliseerd door verschillende transcriptie- en translatieremmers zoals actinomycine D, triptolide en anisomycine in verschillende stappen toe te voegen. Het gebruik van deze remmers kan de echte genexpressie van microglia in vivo onthullen zonder de instelling van een controle. Daarom kan de toevoeging van deze remmers aan het protocol het aantal dieren of monsters dat nodig is voor het experiment verminderen en is het zuiniger voor downstream-analyse. Er moet echter worden opgemerkt dat sommige genen van microglia door deze remmers zullen worden gemoduleerd, wat het gebruik van deze remmers voor toekomstig werk kan beperken24. Het gebruik van het gespecialiseerde dissociatorinstrument na de toevoeging van enzymmix 1 en enzymmix 2 voor weefseldissociatie kan ook transcriptionele responsen in protocolstap 323 beperken.
Dit protocol heeft enkele beperkingen. De zuiverheid van microglia is slechts ongeveer 85% in het protocol, dat niet meer dan 90% van alle afzonderlijke cellen omvat, vergelijkbaar met andere literatuur19,22. De vervanging van de LS-kolom door de MS-kolom, de afwezigheid van de filters en de kwaliteit van microbeads kunnen de mogelijke oorzaken zijn. Als de zuiverheid van de geïsoleerde microglia niet aan de vereisten voldoet, zal het verlengen van de magnetische incubatietijd of het passeren van de gesorteerde cellen door een tweede magnetische kolom de zuiverheid verbeteren (aanvullende figuur S1). Als het aantal cellen laag is, moet weefsel worden geoogst van meer muizen en celverlies als gevolg van onzorgvuldige aspiratie worden vermeden. Als de levensvatbaarheid van de cel laag is, kan het vervangen van PBS in de belastingsbuffer door RPMI 1640-medium de levensvatbaarheid van de cel aanzienlijk verbeteren. Het is ook gunstig voor de levensvatbaarheid van cellen om ervoor te zorgen dat alle oplossingen die in het protocol worden gebruikt, vers zijn en dat het protocol zo snel mogelijk wordt voltooid. Het is belangrijk voor gebruikers om de zuiverheid en het aantal microglia verkregen met behulp van dit protocol in evenwicht te brengen.
Het protocol maakt gebruik van de binding van microglia met CD11b-kralen en de verrijking in een magnetisch veld om de microglia te zuiveren. Daarom bevatten gezuiverde microglia de besmetting van myeloïde cellen, wat onvermijdelijk is in dit protocol. In tegenstelling tot FACS - de gouden standaard voor het sorteren van cellen - is de zuiverheid van microglia geïsoleerd door MACS niet hoog genoeg voor sommige uitgebreide toepassingen zoals diepe sequencing, wat het wijdverspreide gebruik ervan beperkt. Bovendien kan FACS voor het sorteren van microglia de besmetting van myeloïde cellen elimineren. MACS is echter een zachtere methode, behoudt meer originele morfologische kenmerken van gliacellen, vooral astrocyten, neemt minder tijd in beslag voor het isoleren van microglia en heeft een hogere celopbrengst dan FACS, wat suggereert dat het het aantal op te offeren muizen kan verminderen en mogelijk meer geschikt is voor tijdgevoelige experimenten19,25 . Ondertussen is MACS kosteneffectiever en op grote schaal beschikbaar en heeft het lagere technische vereisten voor experimentatoren. MACS is bewezen de meest betrouwbare en consistente methode om microglia te isoleren. Morfologische analyse toonde aan dat microglia niet zouden worden geactiveerd door MACS, en RNA-seq heeft aangetoond dat microglia geïsoleerd door deze methode een rusttoestandbehouden 19,26.
Over het algemeen is het protocol belangrijk voor het onderzoek van microglia bij demyeliniserende ziekten, en microglia geïsoleerd door dit protocol kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen zoals kwantitatieve RT-PCR en RNA-seq. Het protocol maakt gebruik van neutrale rode kleurstof om demyeliniserende laesies te lokaliseren, wat de nauwkeurigheid van laesielocaties garandeert en eventuele verwarring met normaal weefsel tijdens het nemen van monsters vermindert. Nauwkeurige lokalisatie van laesies kan helpen zich te concentreren op de effecten van ziekten en het unieke moleculaire fenotype en functionele kenmerken van microglia bij demyeliniserende ziekten te bestuderen. Dit zal een basis bieden voor het bestuderen van het mechanisme van microglia bij het demyeliniseren van ziekten. Deze methode voor het isoleren van microglia met behulp van magnetische CD11b-kralen kan microglia met een hoge cel levensvatbaarheid en opbrengst in korte tijd zuiveren, met minimale vereisten voor experimentele omstandigheden, wat wijdverspreid gebruik mogelijk maakt voor het bestuderen van microglia in verschillende omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.
Acknowledgments
De studie werd ondersteund door Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M.
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
