Summary
Nous présentons ici un protocole pour isoler et purifier la microglie primaire dans des modèles animaux de maladies démyélinisantes, en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne.
Abstract
Les microglies, les cellules immunitaires innées résidentes dans le cerveau, sont les principaux répondeurs à l’inflammation ou aux blessures du système nerveux central (SNC). La microglie peut être divisée en état de repos et en état activé et peut rapidement changer d’état en réponse au microenvironnement du cerveau. La microglie sera activée dans différentes conditions pathologiques et présentera différents phénotypes. En outre, il existe de nombreux sous-groupes différents de microglies activées et une grande hétérogénéité entre différents sous-groupes. L’hétérogénéité dépend principalement de la spécificité moléculaire de la microglie. Des études ont révélé que la microglie sera activée et jouera un rôle important dans le processus pathologique de démyélinisation inflammatoire. Pour mieux comprendre les caractéristiques de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes telles que la sclérose en plaques et le trouble du spectre de la neuromyélite optique, nous proposons un protocole de tri microglial primaire périlésionnel. Ce protocole utilise le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne (MACS) pour obtenir une microglie primaire hautement purifiée et préserver les caractéristiques moléculaires de la microglie afin d’étudier les effets potentiels de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes.
Introduction
Les microglies proviennent de progéniteurs du sac vitellin, qui atteignent très tôt le cerveau embryonnaire et participent au développement du SNC 1,2. Par exemple, ils sont impliqués dans l’élagage synaptique3 et la régulation de la croissance axonale4. Ils sécrètent des facteurs qui favorisent la survie neuronale et aident à la localisation neuronale5. Dans le même temps, ils sont impliqués dans l’élimination des cellules anormales et des cellules apoptotiques pour assurer le développement normal du cerveau6. En outre, en tant que cellules immunocompétentes du cerveau, les microglies surveillent continuellement le parenchyme cérébral pour éliminer les cellules mortes, les synapses dysfonctionnelles et les débris cellulaires7. Il a été démontré que l’activation microgliale joue un rôle important dans une variété de maladies, y compris les maladies inflammatoires démyélinisantes, les maladies neurodégénératives et les tumeurs cérébrales. Les microglies activées dans la sclérose en plaques (SEP) contribuent à la différenciation des cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) et à la régénération de la myéline en engloutissant les débris de myéline8.
Dans la maladie d’Alzheimer (MA), l’accumulation de bêta-amyloïde (Aβ) active la microglie, ce qui affecte les fonctions phagocytaires et inflammatoires de la microglie9. La microglie activée dans le tissu du gliome, appelée microglie associée au gliome (GAM), peut réguler la progression du gliome et finalement affecter le pronostic des patients10. L’activation modifie profondément le transcriptome microglial, entraînant des changements morphologiques, l’expression des récepteurs immunitaires, une augmentation de l’activité phagocytaire et une augmentation de la sécrétion de cytokines11. Il existe différents sous-ensembles de microglies activées dans les maladies neurodégénératives telles que la microglie associée à la maladie (DAM), la microglie à réponse activée (ARM) et le phénotype neurodégénératif microglial (MGnD)8.
De même, de multiples sous-ensembles fonctionnels dynamiques de microglies coexistent également dans le cerveau dans les maladies inflammatoires démyélinisantes12. Comprendre l’hétérogénéité entre différents sous-ensembles de microglies est essentiel pour étudier la pathogenèse des maladies inflammatoires démyélinisantes et trouver leurs stratégies thérapeutiques potentielles. L’hétérogénéité de la microglie dépend principalement de la spécificité moléculaire8. Il est essentiel de décrire avec précision les altérations moléculaires de la microglie pour l’étude de l’hétérogénéité. Les progrès de la technologie du séquençage de l’ARN unicellulaire (séquençage de l’ARN) ont permis d’identifier les caractéristiques moléculaires de la microglie activée dans des conditions pathologiques13. Par conséquent, la capacité d’isoler les populations cellulaires est essentielle pour une étude plus approfondie de ces cellules cibles dans des conditions spécifiques.
Les études effectuées pour comprendre les caractéristiques et les fonctions de la microglie sont généralement des études in vitro, car il a été constaté qu’un grand nombre de microglies primaires peuvent être préparées et cultivées à partir de cerveaux de chiots de souris (âgés de 1 à 3 jours), qui se fixent aux flacons de culture et se développent à la surface du plastique avec d’autres cellules gliales mélangées. Par la suite, la microglie pure peut être isolée en fonction de l’adhérence différente des cellules gliales mélangées14,15. Cependant, cette méthode ne peut isoler que la microglie du cerveau périnatal et prend plusieurs semaines. Les variables potentielles en culture cellulaire peuvent influencer les caractéristiques microgliales telles que l’expression moléculaire16. De plus, la microglie isolée par ces méthodes ne peut participer à des expériences in vitro qu’en simulant les conditions des maladies du SNC et ne peut pas représenter les caractéristiques et les fonctions de la microglie dans les états pathologiques in vivo. Par conséquent, il est nécessaire de développer des méthodes pour isoler la microglie du cerveau de la souris adulte.
Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et la séparation magnétique sont deux méthodes largement utilisées, bien qu’elles aient leurs propres limites 16,17,18,19. Leurs avantages et inconvénients respectifs seront mis en contraste dans la section de discussion. La maturation de la technologie MACS offre la possibilité de purifier rapidement les cellules. Huang et al. ont développé une méthode pratique pour étiqueter les lésions démyélinisantes dans le cerveau20. En combinant ces deux approches techniques, nous proposons un protocole de séparation magnétique cylindrique CD11b rapide et efficace, fournissant une description étape par étape pour isoler la microglie autour des lésions démyélinisantes dans le cerveau de souris adultes et préserver les caractéristiques moléculaires de la microglie. Les lésions démyélinisantes focales ont été causées par l’injection stéréotaxique de 2 μL de solution de lysolécithine (1% LPC dans 0,9% de NaCl) dans le corps calleux 3 jours avant le début du protocole21. Ce protocole jette les bases pour effectuer l’étape suivante dans les expériences in vitro. De plus, ce protocole permet de gagner du temps et reste réalisable pour une utilisation généralisée dans diverses expériences.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de l’Institut des soins aux animaux du Tongji Medical College, Université des sciences et de la technologie de Huazhong, en Chine.
1. Matériaux
- Préparez les solutions suivantes avant de commencer le protocole.
- Préparer le tampon de chargement en ajoutant du sérum bovin fœtal (FBS, 2%) à une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajouter le colorant rouge neutre (NR) (final 1%) au PBS.
- Préparez les solutions suivantes à l’aide du kit de dissociation du cerveau adulte disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
- Pour préparer le mélange d’enzymes 1, pipeter 1,9 mL de tampon Z et 50 μL d’enzyme P dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
- Pour préparer le mélange d’enzymes 2, pipeter 20 μL de tampon Y et 10 μL d’enzyme A dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
- Préparez la solution d’enlèvement des débris.
2. Perfusion et dissection de souris
- Injecter par voie intrapéritonéale (i.p.) à la souris 500 μL de colorant NR à 1 % dans le PBS 2-3 h avant l’anesthésie.
REMARQUE : L’injection intrapéritonéale de NR dans des modèles murins démyélinisants aide à discerner les lésions (Figure 1). - Anesthésiez la souris avec du pentobarbital (50 mg/kg, i.p.), et assurez-vous que la souris est anesthésiée avec succès en examinant les réponses à la douleur.
- Ouvrez la cavité thoracique de la souris et exposez le cœur.
- Coupez soigneusement un petit coin de l’oreillette droite et perfusez la souris avec 20 à 30 ml de PBS froid du ventricule gauche.
- Décapiter la souris sous anesthésie.
- Ouvrez le crâne de la souris et libérez soigneusement le cerveau du crâne.
- Transférez le cerveau dans le moule de la tranche de cerveau de la souris et coupez le cerveau en tranches de 0,1 cm.
- Retirez les tranches de cerveau et placez-les dans du PBS froid dans une boîte de Pétri (60/15 mm). Microdissectionnez les lésions marquées par le colorant NR autour du corps calleux sous un stéréomicroscope à l’aide de pinces microchirurgicales.
REMARQUE: S’assurer que le tissu disséqué est aussi complet que possible pour faciliter le transfert ultérieur; l’avancement total de la dissection devrait être achevé en 2 h. - Transférer le tissu disséqué dans des tubes centrifuges de 15 mL contenant la quantité appropriée de tampon de charge à froid.
REMARQUE: Regrouper le tissu du corps calleux de 2-3 souris ensemble dans un tube en un seul échantillon.
3. Dissociation tissulaire
- Centrifuger le tissu disséqué à 300 ×g pendant 30 s (après avoir atteint cette vitesse) pour prélever l’échantillon au fond du tube.
- Préchauffer le mélange d’enzymes 1 et le mélange d’enzymes de 2 à 37 °C dans un incubateur.
- Ajouter 1 950 μL de mélange d’enzymes préchauffé 1 à un échantillon et digérer dans un incubateur à 37 °C pendant 5 min.
- Ajouter 30 μL de mélange d’enzymes préchauffé 2 et mélanger doucement.
- Digester dans un incubateur à 37 °C pendant 15 min et mélanger doucement toutes les 5 min.
- Ajouter 4 mL de PBS froid au tube après la digestion et agiter doucement.
- Placez des filtres de 70 μm sur des tubes centrifuges de 50 mL et préemballez les filtres avec 500 μL de PBS froid. Filtrer le tissu dissocié en faisant passer les échantillons de tissu digérés à travers les filtres et transférer la suspension filtrée dans le tube de centrifugeuse de 50 mL dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
REMARQUE: Ignorez cette étape si la quantité de tissu est trop petite. - Centrifuger les échantillons de tissus filtrés à 300 ×g pendant 10 min à 4 °C et aspirer le surnageant lentement et complètement.
REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées sur de la glace, à l’exception de la digestion enzymatique.
4. Enlèvement des débris
- Remettez en suspension doucement la pastille de la cellule avec 1 550 μL de PBS froid.
- Ajouter 450 μL de solution froide pour l’élimination des débris et bien mélanger.
- Superposer le mélange ci-dessus très lentement et doucement avec 2 x 1 mL de PBS froid à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
REMARQUE: Inclinez le tube de centrifugeuse de 45 ° et ajoutez lentement pbS le long de la paroi du tube avec la pipette. - Transférer le tube lentement et doucement dans une centrifugeuse et tourner à 4 °C et 3 000 × g pendant 10 min.
- Recherchez trois couches après centrifugation. Aspirer complètement les deux couches supérieures à l’aide d’une pipette de 1 000 μL (Figure 2).
- Remplissez le tube jusqu’à 5 mL avec un tampon de chargement à froid et inversez doucement le tube trois fois.
- Centrifuger à 4 °C et 1 000 × g pendant 10 min. Aspirez complètement le surnageant et évitez de perturber la pastille cellulaire.
5. Séparation magnétique des cellules microgliales
- Remettez en suspension la pastille de cellule avec 90 μL de tampon de chargement et ajoutez 10 μL de billes CD11b (Microglia).
- Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 °C.
- Ajouter 1 mL de tampon de chargement et pipeter doucement le liquide de haut en bas avec une pipette de 1 000 μL pour laver les cellules après l’incubation. Centrifuger les cellules à 4 °C et 300 × g pendant 10 min et aspirer complètement le surnageant pour éliminer les billes non liées.
- Remettre en suspension les cellules dans 500 μL de tampon de chargement.
- Placez la colonne MS avec son séparateur pour une sélection positive dans le champ magnétique.
- Rincez la colonne avec 500 μL de tampon de charge pour protéger les cellules et assurer l’efficacité du tri magnétique basé sur le protocole du fabricant.
- Appliquez la suspension de cellule sur la colonne MS et éliminez le flux contenant des cellules non étiquetées.
- Ajoutez trois fois 500 μL de tampon de chargement à la colonne pour éliminer les cellules qui adhèrent à la paroi de la colonne et éliminer le flux.
REMARQUE: N’ajoutez un nouveau tampon de chargement pour le lavage que lorsque le réservoir de colonne est complètement vide. - Retirez la colonne du séparateur après avoir lavé la colonne et placez-la sur un tube de centrifugeuse de 15 mL.
- Ajoutez 1 mL de tampon de chargement dans la colonne et poussez le piston vers le bas de la colonne pour débusquer les cellules marquées magnétiquement. Répétez cette étape trois fois pour collecter complètement les cellules marquées magnétiquement.
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Representative Results
Les microglies isolées à l’aide de billes CD11b ont une grande pureté
Les cellules microgliales autour des lésions dans les modèles murins de démyélinisation ont été isolées à l’aide du protocole mentionné ci-dessus et testées par cytométrie en flux. Les cellules sont marquées par fluorescence avec de l’isothiocyanate de fluorescéine CD11b (FITC) et de l’allophycocyanine CD45 (APC) pour déterminer la microglie dans la cytométrie en flux conformément aux instructions du fabricant. Il existe de nombreuses littératures démontrant que les anticorps CD11b et CD45 sont suffisants pour vérifier la pureté de la microglieisolée 19,22. La compensation de fluorescence a été complétée sur le cytomètre en flux à l’aide d’échantillons témoins non colorés et à coloration unique. Les cellules étaient fermées par hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) et hauteur de dispersion latérale (SSC-H); les cellules individuelles étaient fermées par zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) et FSC-H. Les proportions de microglie (identifiées comme CD11b+CD45intermédiaire) avant et après la séparation magnétique ont été testées par cytométrie en flux. La technique de la boucle arrière a été utilisée pour ajuster la stratégie de contrôle de l’analyse de cytométrie en flux en déterminant la porte de la microglie. Comparé à environ 3 × 104 cellules et 6 × 103 microglies avant la séparation magnétique de chaque cerveau de souris (Figure 3A), macS donne généralement environ 2,5 × 103 cellules et 2 × 103 microglies par cerveau de souris (Figure 3B), soit environ 85% de toutes les cellules individuelles. Cependant, près de 3 % des cellules myéloïdes (identifiées comme CD11b+CD45élevées) étaient présentes dans les cellules séparées par MACS et étaient difficiles à éliminer de la population CD11b dans ce protocole. La pureté de la microglie isolée peut être augmentée à 95 % à l’aide de deux colonnes magnétiques (figure supplémentaire S1). Le tri MACS pourrait capturer environ 33% de microglie dans l’échantillon de mélange cérébral.
Les microglies isolées à l’aide de billes CD11b ont une viabilité cellulaire élevée
La 7-aminoactinomycine D (7-AAD) fluorochrome est souvent utilisée pour montrer la viabilité cellulaire dans la cytométrie en flux. Les cellules 7-AAD+ représentent les cellules mortes19. La viabilité de la microglie séparée par MACS était d’environ 95 % par coloration cellulaire avec 7-AAD (Figure 4).
Analyse morphologique de la microglie autour des lésions démyélinisantes triées par MACS
L’analyse morphologique a montré que les microglies n’étaient pas activées par macs. Les microglies présentent un corps cellulaire bipolaire longitudinal typique après MACS, qui est similaire à la morphologie microgliale après FACS19. La microglie autour des lésions démyélinisantes sera activée dans le modèle de démyélinisation induite par le LPC21. La microglie colorée par la molécule 1 de l’adaptateur de liaison au calcium ionisé (Iba-1) a montré une morphologie amibique typique de la microglie activée dans ce protocole. P2ry12 est une molécule typique de l’état de repos microglial. Il y a une petite fraction de microglie ramifiée et P2ry12+ avant MACS en raison de l’expansion de l’étendue des lésions dissociées. Cependant, l’existence de la microglie P2ry12+ après MACS indique également que MACS n’activera pas la microglie (figure supplémentaire S2).
Figure 1: Images des lésions focales démyélinisantes marquées par le colorant rouge neutre. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Images des trois couches formées par centrifugation. Les deux couches supérieures (couche 1 + couche 2) doivent être enlevées lors du processus d’enlèvement des débris (voir l’étape 4.5 du protocole). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse par cytométrie en flux de microglies isolées de lésions de démyélinisation de souris adultes avant et après MACS. (A) Représentation schématique de la stratégie de contrôle utilisée dans l’analyse de cytométrie en flux avant MACS : FSC-H et SSC-H pour la sélection des cellules, FSC-A et FSC-H pour la sélection des cellules individuelles, et CD11b-FITC et CD45-APC pour la sélection des cellules myéloïdes (vers le haut) et la microglie (vers le bas). (B) Représentation schématique de la stratégie de contrôle utilisée dans l’échantillon d’analyse de cytométrie en flux après MACS. La proportion de microglies a considérablement augmenté après macS: FSC-H et SSC-H pour la sélection des cellules, FSC-A et FSC-H pour la sélection des cellules individuelles, et CD11b-FITC et CD45-APC pour la sélection des cellules myéloïdes (vers le haut) et microglie (vers le bas). Abréviations : SSC-H = hauteur de dispersion latérale; FSC-H = hauteur de diffusion vers l’avant; FSC-A = zone de dispersion vers l’avant; CD45-APC = CD45 marqué par l’allophycocyanine; CD11b-FITC = CD11b marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine; MACS = tri des cellules activées magnétiquement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Stratégie de contrôle du FACS pour les cellules individuelles vivantes/mortes après MACS. 7-AAD et SSC-H pour la sélection des cellules vivantes après MACS. Abréviations : SSC-H = hauteur de dispersion latérale; 7-AAD = 7-aminoactinomycine D; MACS = tri des cellules activées magnétiquement; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Analyse par cytométrie en flux de microglies isolées de souris adultes de démyélinisation. (A) Représentation schématique de la stratégie de contrôle utilisée dans l’échantillon d’analyse de cytométrie en flux avant MACS. (B) Représentation schématique de la stratégie de contrôle utilisée dans l’échantillon d’analyse de cytométrie en flux après MACS à l’aide de deux colonnes magnétiques. (C) Histogramme monoparamètre de CD11b-FITC et CD45-APC en cytométrie en flux après MACS à l’aide de deux colonnes magnétiques. Abréviations : SSC-H = hauteur de dispersion latérale; FSC-H = hauteur de diffusion vers l’avant; FSC-A = zone de dispersion vers l’avant; CD45-APC = CD45 marqué par l’allophycocyanine; CD11b-FITC = CD11b marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine; MACS = tri des cellules activées magnétiquement; CD45Int = expression intermédiaire de CD45. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Coloration par immunofluorescence de la microglie avec Iba-1 et P2ry12 avant et après MACS. (A) Images de microglies avant MACS. (B) Images de microglies isolées après MACS. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations: MACS = tri des cellules activées magnétiquement; Iba-1 = molécule 1 de l’adaptateur de liaison au calcium ionisé; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le protocole propose une méthode pour isoler la microglie autour des lésions démyélinisantes, ce qui peut aider à étudier les caractéristiques fonctionnelles de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes. Les microglies capturées à l’aide de billes CD11b présentent une pureté et une viabilité élevées. Les étapes critiques du protocole comprennent la localisation précise des foyers et la purification microgliale optimale. Dans l’étape de protocole 2.1, il est nécessaire d’injecter la solution NR 2 h avant de sacrifier la souris pour s’assurer que les lésions peuvent être affichées avec précision20. À l’étape 2.8 du protocole, on a pris soin de placer des coupes de tissu cérébral sur une glacière pour la dissection et de terminer cette étape dès que possible, améliorant ainsi la viabilité cellulaire. À l’étape 2.9, il est nécessaire de sélectionner le tissu approprié comme échantillon pour la digestion enzymatique et l’élimination des débris. L’étape 3.7 ne peut être ignorée lorsque l’effet de l’enlèvement des débris n’est pas satisfaisant. À l’étape 4.3, l’ajout de PBS doit être doux pour former différentes couches, en veillant à ce que le plus de débris possible soit enlevé. Toutes les étapes du protocole, à l’exception de la digestion enzymatique, doivent être effectuées sur de la glace pour assurer la viabilité cellulaire et réduire la réponse transcriptionnelle de la microglie. Chaque étape du protocole est douce et conserve une viabilité élevée, il est donc inutile d’utiliser la solution d’élimination des cellules mortes22,23.
La méthode de dissociation enzymatique pour le cerveau de souris dans le protocole s’est avérée appropriée pour l’ARN unicellulaire seq23. Bien que les enzymes du protocole soient légères, Marsh et al. ont constaté que divers protocoles d’hydrolyse enzymatique à 37 °C peuvent modifier de manière significative le transcriptome de la microglie24. L’établissement d’un contrôle sain dans l’expérience à des fins de comparaison peut aider à identifier les gènes de démyélinisation exprimés différemment, éliminant ainsi la réponse transcriptionnelle anormale dans le protocole. En attendant, pour prévenir cet état transcriptionnel anormal après digestion enzymatique, le protocole peut être optimisé en ajoutant divers inhibiteurs de transcription et de traduction tels que l’actinomycine D, le triptolide et l’anisomycine à différentes étapes. L’utilisation de ces inhibiteurs peut révéler l’expression génique réelle de la microglie in vivo sans la mise en place d’un contrôle. Par conséquent, l’ajout de ces inhibiteurs au protocole peut réduire le nombre d’animaux ou d’échantillons requis dans l’expérience et est plus économique pour l’analyse en aval. Cependant, il convient de noter que certains gènes de la microglie seront modulés par ces inhibiteurs, ce qui pourrait limiter l’utilisation de ces inhibiteurs pour les travaux futurs24. L’utilisation de l’instrument dissociateur spécialisé après l’ajout du mélange enzymatique 1 et du mélange enzymatique 2 pour la dissociation tissulaire peut également limiter les réponses transcriptionnelles à l’étape 323 du protocole.
Ce protocole présente certaines limites. La pureté de la microglie n’est que d’environ 85% dans le protocole, qui ne comprend pas plus de 90% de toutes les cellules individuelles similaires à d’autres littératures19,22. Le remplacement de la colonne LS par la colonne MS, l’absence de filtres et la qualité des microbilles peuvent en être les causes potentielles. Si la pureté de la microglie isolée ne répond pas aux exigences, prolonger le temps d’incubation magnétique ou faire passer les cellules triées à travers une deuxième colonne magnétique améliorera la pureté (figure supplémentaire S1). Si le nombre de cellules est faible, les tissus doivent être prélevés sur plus de souris et la perte de cellules due à une aspiration négligente doit être évitée. Si la viabilité de la cellule est faible, le remplacement du PBS dans le tampon de charge par un milieu RPMI 1640 pourrait améliorer considérablement la viabilité de la cellule. Il est également bénéfique pour la viabilité cellulaire de s’assurer que toutes les solutions utilisées dans le protocole sont fraîches et que le protocole est terminé dès que possible. Il est important pour les utilisateurs d’équilibrer la pureté et le nombre de microglies obtenues à l’aide de ce protocole.
Le protocole utilise la liaison de la microglie avec des billes CD11b et l’enrichissement dans un champ magnétique pour purifier la microglie. Par conséquent, les microglies purifiées contiennent la contamination des cellules myéloïdes, ce qui est inévitable dans ce protocole. Contrairement à FACS, l’étalon-or pour le tri des cellules, la pureté de la microglie isolée par MACS n’est pas suffisamment élevée pour certaines applications élaborées telles que le séquençage profond, ce qui limite son utilisation généralisée. De plus, le FACS pour le tri des microglies peut éliminer la contamination des cellules myéloïdes. Cependant, MACS est une méthode plus douce, conserve des caractéristiques morphologiques plus originales des cellules gliales, en particulier des astrocytes, prend moins de temps pour isoler la microglie et a un rendement cellulaire plus élevé que FACS, ce qui suggère qu’il peut réduire le nombre de souris à sacrifier et peut être plus approprié pour les expériences sensibles au temps19,25 . Pendant ce temps, MACS est plus rentable et largement disponible et a des exigences techniques plus faibles pour les expérimentateurs. MACS s’est avéré être la méthode la plus fiable et la plus cohérente pour isoler la microglie. L’analyse morphologique a montré que la microglie ne serait pas activée par le MACS, et RNA-seq a démontré que la microglie isolée par cette méthode maintient un état de repos19,26.
Dans l’ensemble, le protocole est important pour l’étude de la microglie dans les maladies démyélinisantes, et la microglie isolée par ce protocole peut être utilisée pour diverses applications en aval telles que la RT-PCR quantitative et la séquençage de l’ARN. Le protocole utilise un colorant rouge neutre pour localiser les lésions démyélinisantes, ce qui garantit la précision de l’emplacement des lésions et réduit toute confusion avec les tissus normaux lors du prélèvement. La localisation précise des lésions peut aider à se concentrer sur les effets des maladies et à étudier le phénotype moléculaire unique et les caractéristiques fonctionnelles de la microglie dans les maladies démyélinisantes. Cela fournira une base pour étudier le mécanisme de la microglie dans les maladies démyélinisantes. Cette méthode d’isolement de la microglie à l’aide de billes magnétiques CD11b peut purifier la microglie avec une viabilité et un rendement cellulaires élevés en peu de temps, avec des exigences minimales pour les conditions expérimentales, ce qui permet une utilisation généralisée pour l’étude de la microglie dans différentes conditions.
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Disclosures
Les auteurs ont déclaré qu’il n’existait pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
L’étude a été soutenue par la Fondation pour un excellent jeune scientifique de l’hôpital Tongji (HUST) (subvention n ° 2020YQ06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
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