Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.
Abstract
מיקרוגליה, תאי החיסון המולדים במוח, הם המגיבים העיקריים לדלקת או לפציעה במערכת העצבים המרכזית (CNS). ניתן לחלק את המיקרוגליה למצב מנוחה ולמצב מופעל והוא יכול לשנות את המצב במהירות בתגובה למיקרו-סביבה של המוח. מיקרוגליה תופעל בתנאים פתולוגיים שונים ותציג פנוטיפים שונים. בנוסף, ישנן תת-קבוצות רבות ושונות של מיקרוגליה מופעלת והטרוגניות רבה בין תת-קבוצות שונות. ההטרוגניות תלויה בעיקר בייחודיות המולקולרית של המיקרוגליה. מחקרים גילו כי מיקרוגליה תופעל ותמלא תפקיד חשוב בתהליך הפתולוגי של דמילינציה דלקתית. כדי להבין טוב יותר את המאפיינים של מיקרוגליה במחלות דלקתיות כגון טרשת נפוצה והפרעת ספקטרום נוירומיאליטיס אופטיקה, אנו מציעים פרוטוקול מיון מיקרוגליאלי ראשוני. פרוטוקול זה משתמש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטית טוררית (MACS) כדי להשיג מיקרוגליה ראשונית מטוהרת מאוד ולשמר את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה כדי לחקור את ההשפעות הפוטנציאליות של מיקרוגליה במחלות דלקתיות.
Introduction
מקורם של המיקרוגליה הוא באבות חלמון-שק, המגיעים למוח העוברי מוקדם מאוד ומשתתפים בפיתוח מערכת העצבים המרכזית 1,2. לדוגמה, הם מעורבים בגיזום סינפטי3 ובוויסות הצמיחה האקסונלית4. הם מפרישים גורמים המקדמים הישרדות עצבית ומסייעים ללוקליזציה עצבית5. במקביל, הם מעורבים בהסרת תאים לא תקינים ותאים אפופטוטיים כדי להבטיח התפתחותמוחית תקינה 6. בנוסף, ככל שהתאים הכשירים לחיסון של המוח, מיקרוגליה חושפת ללא הרף את הפרנכימה המוחית כדי לנקות תאים מתים, סינפסות לא מתפקדות ופסולת תאית7. הוכח כי הפעלה מיקרוגליאלית ממלאת תפקיד חשוב במגוון מחלות, כולל מחלות דלקתיות, מחלות נוירודגנרטיביות וגידולי מוח. מיקרוגליה מופעלת בטרשת נפוצה (MS) תורמת להתמיינות של תאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים (OPCs) ולהתחדשות של מיאלין על ידי בליעת פסולת מיאלין8.
במחלת אלצהיימר (AD), הצטברות של עמילואיד בטא (Aβ) מפעילה מיקרוגליה, המשפיעה על התפקודים הפאגוציטיים והדלקתיים של מיקרוגליה9. מיקרוגליה מופעלת ברקמת הגליומה, הנקראת מיקרוגליה הקשורה לגליומה (GAM), יכולה לווסת את התקדמות הגליומה ובסופו של דבר להשפיע על הפרוגנוזה של חולים10. ההפעלה משנה באופן עמוק את השעתוק המיקרוגליאלי, וכתוצאה מכך שינויים מורפולוגיים, ביטוי של קולטני מערכת החיסון, פעילות פגוציטית מוגברת והפרשת ציטוקיניםמשופרת 11. ישנן תת-קבוצות שונות של מיקרוגליה מופעלת במחלות נוירודגנרטיביות כגון מיקרוגליה הקשורה למחלה (DAM), מיקרוגליה בתגובה פעילה (ARM) ופנוטיפ נוירודגנרטיבי מיקרוגליאלי (MGnD)8.
באופן דומה, תת-קבוצות תפקודיות דינמיות מרובות של מיקרוגליה מתקיימות גם הן יחד במוח במחלות דלקתיות12. הבנת ההטרוגניות בין תת-קבוצות שונות של מיקרוגליה חיונית כדי לחקור את הפתוגנזה של מחלות דלקתיות ולמצוא את האסטרטגיות הטיפוליות הפוטנציאליות שלהן. ההטרוגניות של המיקרוגליה תלויה בעיקר בייחודיות המולקולרית8. חיוני לתאר את השינויים המולקולריים של המיקרוגליה במדויק לחקר ההטרוגניות. ההתקדמות בטכנולוגיית ריצוף ה-RNA החד-תאי (RNA-seq) אפשרה לזהות את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה פעילה בתנאים פתולוגיים13. לכן, היכולת לבודד אוכלוסיות תאים היא קריטית להמשך חקירה של תאי המטרה האלה בתנאים ספציפיים.
מחקרים שבוצעו כדי להבין את המאפיינים והתפקודים של מיקרוגליה הם בדרך כלל מחקרים במבחנה, שכן נמצא כי מספר גדול של מיקרוגליה ראשונית ניתן להכין ולתרבת ממוחות של גורים עכברים (בני 1-3 ימים), אשר מתחברים לצלוחיות התרבית וגדלים על משטח הפלסטיק עם תאי גליה מעורבים אחרים. לאחר מכן, ניתן לבודד מיקרוגליה טהורה על סמך ההדבקה השונה של תאי גליה מעורבים14,15. עם זאת, שיטה זו יכולה רק לבודד מיקרוגליה מהמוח הפרינטלי ונמשכת מספר שבועות. משתנים פוטנציאליים בתרבית תאים עשויים להשפיע על מאפיינים מיקרוגליאליים כגון ביטוי מולקולרי16. יתר על כן, מיקרוגליה המבודדת בשיטות אלה יכולה להשתתף רק בניסויים במבחנה על ידי הדמיית התנאים של מחלות CNS ואינה יכולה לייצג את המאפיינים והתפקודים של מיקרוגליה במצבי מחלה in vivo. לכן, יש צורך לפתח שיטות לבידוד מיקרוגליה ממוח העכבר הבוגר.
מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS) והפרדה מגנטית הם שתי שיטות בשימוש נרחב, אם כי יש להם מגבלות שונות משלהם 16,17,18,19. היתרונות והחסרונות שלהם בהתאמה יהיו מנוגדים בסעיף הדיון. ההבשלה של טכנולוגיית MACS מציעה את האפשרות לטהר במהירות תאים. Huang et al. פיתחו שיטה נוחה לתיוג נגעים demyelinating במוח20. בשילוב שתי הגישות הטכניות הללו, אנו מציעים פרוטוקול הפרדה מגנטית מהיר ויעיל CD11b, המספק תיאור שלב אחר שלב כדי לבודד את המיקרוגליה סביב נגעים מתפרקים במוחות של עכברים בוגרים ולשמר את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה. נגעי הדמילינאט המוקד נגרמו על ידי הזרקה סטריאוטקטית של 2 μL של תמיסת ליזולצית'ין (1% LPC ב-0.9% NaCl) בקורפוס קלוסום 3 ימים לפני תחילת הפרוטוקול21. פרוטוקול זה מניח את היסודות לביצוע השלב הבא בניסויים במבחנה. יתר על כן, פרוטוקול זה חוסך זמן ונשאר אפשרי לשימוש נרחב בניסויים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של המכון לטיפול בבעלי חיים של המכללה הרפואית טונגג'י, אוניברסיטת הואז'ונג למדע וטכנולוגיה, סין.
1. חומרים
- הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת הפרוטוקול.
- הכינו את מאגר ההעמסה על ידי הוספת סרום בקר עוברי (FBS, 2%) לתמיסת מלח מואצרת פוספט (PBS).
- הוסף צבע אדום נייטרלי (NR) (1 סופי%) ל- PBS.
- הכן את הפתרונות הבאים באמצעות ערכת הדיסוציאציה של המוח למבוגרים הזמינה מסחרית (ראה טבלת החומרים).
- כדי להכין תערובת אנזימים 1, פיפטה 1.9 מ"ל של Buffer Z ו-50 μL של אנזים P לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
- כדי להכין תערובת אנזימים 2, פיפטה 20 μL של Buffer Y ו-10 μL של אנזים A לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
- הכן את הפתרון להסרת פסולת.
2. קליטת עכברים וכריתתם
- באופן תוך-צפקי (i.p.) להזריק לעכבר 500 μL של 1% צבע NR ב- PBS 2-3 שעות לפני ההרדמה.
הערה: הזרקה תוך-צפקית של NR במודלים של עכברים מתפרקים עוזרת להבחין בנגעים (איור 1). - מרדימים את העכבר עם פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג, כלומר), וודאו שהעכבר מורדם בהצלחה על ידי בחינת תגובות הכאב.
- פתח את חלל החזה של העכבר וחשוף את הלב.
- חתכו פינה קטנה של האטריום הימני בזהירות והטביעו את העכבר באופן תוך-לבי עם 20-30 מ"ל של PBS קר מהחדר השמאלי.
- ערפו את העכבר בהרדמה.
- פתח את גולגולת העכבר ושחרר בזהירות את המוח מהגולגולת.
- העבירו את המוח לתבנית פרוסת המוח של העכבר וחתכו את המוח לפרוסות של 0.1 ס"מ.
- מוציאים את פרוסות המוח ומניחים אותן ב-PBS קר בצלחת פטרי (60/15 מ"מ). מיקרו-דיסקציה של הנגעים המסומנים על ידי צבע NR סביב קורפוס קלוסום תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות מלקחיים מיקרוכירורגיים.
הערה: ודא שהרקמה המנותחת שלמה ככל האפשר כדי להקל על ההעברה שלאחר מכן; יש להשלים את התקדמות הנתיחה הכוללת תוך 2 שעות. - העבר את הרקמה המנותקת לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל המכילים את הכמות המתאימה של חיץ טעינה קר.
הערה: אסוף את רקמת הקורפוס קלוסום מ-2-3 עכברים יחד בצינור אחד כדגימה אחת.
3. דיסוציאציה של רקמות
- צנטריפוגה הרקמה המנותקת ב 300 ×g במשך 30 שניות (לאחר שהגיע למהירות זו) כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור.
- תערובת אנזים קדם-חימום 1 ותערובת אנזימים 2 עד 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
- הוסיפו 1,950 μL של תערובת אנזימים מחוממת מראש 1 לדגימה אחת ועכלו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- מוסיפים 30 μL של תערובת אנזימים מחוממת מראש 2 ומערבבים בעדינות.
- מעכלים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ומערבבים בעדינות כל 5 דקות.
- מוסיפים 4 מ"ל של PBS קר לצינור לאחר העיכול ומנערים בעדינות.
- הניחו מסנני 70 מיקרומטר על צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל והניחו מראש את המסננים עם 500 μL של PBS קר. לסנן את הרקמה המנותקת על ידי העברת דגימות הרקמה המעוכלות דרך המסננים, ולהעביר את ההשעיה המסוננת בצינור הצנטריפוגה 50 מ"ל לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
הערה: דלג על שלב זה אם כמות הרקמה קטנה מדי. - צנטריפוגה דגימות הרקמה המסוננות ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ושואף את supernatant לאט ושלם.
הערה: יש לבצע את כל השלבים על קרח למעט העיכול האנזימטי.
4. פינוי פסולת
- בצעו החייאה של גלולת התא בעדינות עם 1,550 μL של PBS קר.
- מוסיפים 450 μL של תמיסה קרה להסרת פסולת ומערבבים היטב.
- שכבו את התערובת הנ"ל לאט ובעדינות רבה עם 2 x 1 מ"ל של PBS קר באמצעות פיפטה של 1,000 μL.
הערה: הטה את צינור הצנטריפוגה ב- 45 ° והוסף באיטיות PBS לאורך דופן הצינור עם הפיפטה. - מעבירים את הצינור לאט ובעדינות לצנטריפוגה ומסובבים ב-4 מעלות צלזיוס ו-3,000 × גרם למשך 10 דקות.
- חפשו שלוש שכבות לאחר צנטריפוגה. שאפו את שתי השכבות העליונות לחלוטין על ידי שימוש בפיפטה של 1,000 μL (איור 2).
- מלאו את הצינור עד 5 מ"ל עם חיץ טעינה קר והפכו בעדינות את הצינור שלוש פעמים.
- צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ו-1,000 × גרם למשך 10 דקות. לשאוף את הסופרנטנט לחלוטין ולהימנע משיבוש כדור התא.
5. הפרדה מגנטית של תאים מיקרוגליאליים
- בצעו שימוש חוזר בכדור התא עם 90 μL של מאגר טעינה והוסיפו 10 μL של חרוזי CD11b (Microglia).
- מערבבים היטב ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- הוסיפו 1 מ"ל של מאגר טעינה ופיפטה את הנוזל בעדינות למעלה ולמטה עם פיפטה של 1,000 μL כדי לשטוף את התאים לאחר הדגירה. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-300 × גרם למשך 10 דקות ושואפים את הסופרנאטנט לחלוטין כדי להסיר את החרוזים הלא מאוגדים.
- בצעו החייאה של התאים ב-500 μL של מאגר טעינה.
- מקם את העמודה MS עם המפריד שלה לבחירה חיובית בשדה המגנטי.
- שטפו את העמודה ב-500 μL של מאגר טעינה כדי להגן על התאים ולהבטיח את יעילות המיון המגנטי בהתבסס על פרוטוקול היצרן.
- החל את תרחיף התא על עמודת הטרשת הנפוצה והשליך את ה-flowthrough המכיל תאים ללא תווית.
- הוסיפו 500 μL של מאגר טעינה לעמודה שלוש פעמים כדי לשטוף תאים שנצמדים לדופן העמודה ולהשליך את אורך הזרימה.
הערה: הוסף מאגר טעינה חדש לשטיפה רק כאשר מאגר העמודות ריק לחלוטין. - הסר את העמוד מהמפריד לאחר שטיפת העמוד והנח אותו על צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
- הוסף 1 מ"ל של מאגר טעינה לעמודה ודחף את הבוכנה לתחתית העמודה כדי לשטוף את התאים המסומנים באופן מגנטי. חזור על שלב זה שלוש פעמים כדי לאסוף לחלוטין את התאים המסומנים באופן מגנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוגליה מבודדת באמצעות חרוזי CD11b בעלי טוהר גבוה
תאים מיקרוגליאליים סביב הנגעים במודלים של עכברי דמילינציה בודדו באמצעות הפרוטוקול הנ"ל ונבדקו על ידי ציטומטריה של זרימה. התאים מסומנים באופן פלואורסצנטי עם CD11b-פלואורסציין איזותיוציאנט (FITC) ו-CD45-אלופיקוקיאנין (APC) כדי לקבוע מיקרוגליה בציטומטריה של זרימה על פי הוראות היצרן. ישנן ספרות רבות המדגימות כי נוגדנים CD11b ו- CD45 מספיקים כדי לבדוק את טוהר המיקרוגליההמבודדת 19,22. הפיצוי הפלואורסצנטי הושלם על ציטומטר הזרימה באמצעות דגימות בקרה לא מוכתמות ומוכתמות בודדות. התאים היו מגודרים על ידי גובה פיזור קדמי (FSC-H) וגובה פיזור צד (SSC-H); תאים בודדים היו מגודרים על ידי אזור פיזור קדמי (FSC-A) ו- FSC-H. הפרופורציות של מיקרוגליה (שזוהו כ- CD11b+CD45Intermediate) לפני ואחרי ההפרדה המגנטית נבדקו על ידי ציטומטריית זרימה. טכניקת הלולאה האחורית שימשה להתאמת אסטרטגיית הגטינג של ניתוח ציטומטריה של זרימה על ידי קביעת השער למיקרוגליה. בהשוואה לכ-3 ×-104 תאים ו-6 ×-103 מיקרוגליה לפני ההפרדה המגנטית של כל מוח עכברי (איור 3A), MACS מניב בדרך כלל כ-2.5 ×-103 תאים ו-2 × 103 מיקרוגליה לכל מוח עכבר (איור 3B), שהיוו כ-85% מכלל התאים הבודדים. עם זאת, כמעט 3% מהתאים המיאלואידים (שזוהו כ-CD11b+CD45גבוה) היו נוכחים בתאים המופרדים מ-MACS וקשה היה להסירם מאוכלוסיית CD11b בפרוטוקול זה. ניתן להגדיל את טוהר המיקרוגליה המבודדת ל-95% באמצעות שני עמודים מגנטיים (איור משלים S1). מיון MACS יכול ללכוד כ-33% מהמיקרוגליה בדגימת תערובת המוח.
מיקרוגליה מבודדת באמצעות חרוזי CD11b בעלת כדאיות גבוהה של התאים
פלואורוכרום 7-אמינואקטינומיצין D (7-AAD) משמש לעתים קרובות כדי להראות את הכדאיות של התא בציטומטריית הזרימה. תאים 7-AAD+ מייצגים תאים מתים19. הכדאיות של מיקרוגליה מופרדת MACS הייתה כ-95% על ידי צביעת תאים עם 7-AAD (איור 4).
ניתוח מורפולוגי של מיקרוגליה סביב נגעי דה-מילינאטים הממוינים על ידי MACS
ניתוח מורפולוגי הראה כי מיקרוגליה לא הופעלה על ידי MACS. מיקרוגליה מציגה גוף תא דו קוטבי אורכי טיפוסי לאחר MACS, הדומה למורפולוגיה מיקרוגליאלית לאחר FACS19. מיקרוגליה סביב נגעים demyelinating יופעל במודל של demyelination המושרה LPC21. מיקרוגליה מוכתמת על ידי מולקולת מתאם קשירת סידן מיונן 1 (Iba-1) הראתה מורפולוגיה אמבית טיפוסית של מיקרוגליה מופעלת בפרוטוקול זה. P2ry12 היא מולקולה טיפוסית של מצב מנוחה מיקרוגליאלי. יש חלק קטן של מיקרוגליה מסועפת ו- P2ry12+ לפני MACS בשל הרחבת היקף הנגעים המנותקים. עם זאת, קיומה של מיקרוגליה P2ry12+ לאחר MACS מצביע גם על כך ש-MACS לא יפעיל את המיקרוגליה (איור משלים S2).
איור 1: תמונות של נגעי הדה-מיאלינציה המוקדיים המסומנים על ידי הצבע האדום הנייטרלי.אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות של שלוש השכבות שנוצרו על ידי צנטריפוגה. יש להסיר את שתי השכבות העליונות (שכבה 1 + שכבה 2) בתהליך הסרת פסולת (ראה שלב פרוטוקול 4.5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניתוח ציטומטריה של זרימה של מיקרוגליה שבודדה מנגעי דה-מילינציה של עכברים בוגרים לפני ואחרי MACS. (A) ייצוג סכמטי של אסטרטגיית גטינג ששימשה בניתוח ציטומטריה של זרימה לפני MACS: FSC-H ו-SSC-H לבחירת תאים, FSC-A ו-FSC-H לבחירת תאים בודדים, ו-CD11b-FITC ו-CD45-APC לבחירת תאים מיאלואידיים (למעלה) ומיקרוגליה (למטה). (B) ייצוג סכמטי של אסטרטגיית הגטינג המשמשת במדגם ניתוח ציטומטריה של זרימה לאחר MACS. שיעור המיקרוגליה גדל באופן משמעותי לאחר MACS: FSC-H ו-SSC-H לבחירת תאים, FSC-A ו-FSC-H לבחירת תאים בודדים, ו-CD11b-FITC ו-CD45-APC לבחירת תאים מיאלואידיים (למעלה) ומיקרוגליה (למטה). קיצורים: SSC-H = גובה פיזור צד; FSC-H = גובה פיזור קדימה; FSC-A = אזור פיזור קדמי; CD45-APC = CD45 עם תווית אלופיקוציאנין; CD11b-FITC = פלואורסציין איזותיוציאנט עם תווית CD11b; MACS = מיון תאים המופעל על ידי מגנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: אסטרטגיית גידור FACS לתאים בודדים חיים/מתים אחרי MACS. 7-AAD ו-SSC-H לבחירת תאים חיים לאחר MACS. קיצורים: SSC-H = גובה פיזור צד; 7-AAD = 7-אמינואקטינומיצין D; MACS = מיון תאים המופעלים מגנטית; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים S1: ניתוח ציטומטריה של זרימה של מיקרוגליה שבודדה מעכברי דמילינציה בוגרים. (A) ייצוג סכמטי של אסטרטגיית הגטינג המשמשת במדגם ניתוח ציטומטריה של זרימה לפני MACS. (B) ייצוג סכמטי של אסטרטגיית הגטינג המשמשת בדגימת ניתוח ציטומטריה של זרימה לאחר MACS באמצעות שני עמודים מגנטיים. (C) היסטוגרמה של פרמטר יחיד של CD11b-FITC ו-CD45-APC בציטומטריית זרימה לאחר MACS באמצעות שני עמודים מגנטיים. קיצורים: SSC-H = גובה פיזור צד; FSC-H = גובה פיזור קדימה; FSC-A = אזור פיזור קדמי; CD45-APC = CD45 עם תווית אלופיקוציאנין; CD11b-FITC = פלואורסציין איזותיוציאנט עם תווית CD11b; MACS = מיון תאים המופעלים מגנטית; CD45Int = ביטוי CD45 ביניים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: צביעה אימונופלואורסצנטית של מיקרוגליה עם Iba-1 ו-P2ry12 לפני ואחרי MACS. (A) תמונות של מיקרוגליה לפני MACS. (B) תמונות של מיקרוגליה מבודדת לאחר MACS. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: MACS = מיון תאים המופעלים מגנטית; Iba-1 = מולקולת מתאם קשירת סידן מיונן 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול מציע שיטה לבודד מיקרוגליה סביב נגעי demyelinating, אשר יכול לעזור לחקור את המאפיינים הפונקציונליים של microglia במחלות demyelinating דלקתיות. מיקרוגליה שצולמה באמצעות חרוזי CD11b מפגינה טוהר וכדאיות גבוהים. שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים לוקליזציה מדויקת של מוקדים וטיהור מיקרוגליאלי אופטימלי. בשלב פרוטוקול 2.1, יש צורך להזריק את תמיסת NR 2 שעות לפני הקרבת העכבר כדי להבטיח כי הנגעים יכולים להיות מוצגים במדויק20. בשלב פרוטוקול 2.8, ננקטה הקפדה על הנחת מקטעי רקמת המוח על קופסת קרח לצורך כריתה ולהשלים שלב זה בהקדם האפשרי, ובכך לשפר את כדאיות התאים. בשלב 2.9, יש צורך לבחור רקמה מתאימה כדגימה אחת הן לעיכול אנזים והן להסרת פסולת. לא ניתן לדלג על שלב 3.7 כאשר ההשפעה של פינוי פסולת אינה משביעת רצון. בשלב 4.3, התוספת של PBS חייבת להיות עדינה כדי ליצור שכבות שונות, ולהבטיח שכמה שיותר פסולת תוסר. כל השלבים בפרוטוקול, למעט עיכול אנזימטי, צריכים להתבצע על קרח כדי להבטיח את כדאיות התא ולהפחית את תגובת השעתוק של המיקרוגליה. כל שלב בפרוטוקול הוא מתון ושומר על כדאיות גבוהה, ולכן אין צורך להשתמש בתמיסת הסרת התאים המתים 22,23.
שיטת הדיסוציאציה האנזימטית למוח העכבר בפרוטוקול הוכחה כמתאימה ל-RNA-seq23 חד-תאי. למרות שהאנזימים בפרוטוקול הם קלים, Marsh et al. מצאו כי פרוטוקולי הידרוליזה אנזימטיים שונים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עשויים לשנות באופן משמעותי את השעתוק של מיקרוגליה24. קביעת בקרה בריאה בניסוי לצורך השוואה יכולה לסייע בזיהוי הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי של דה-מילינציה, ובכך לבטל את תגובת השעתוק החריגה בפרוטוקול. בינתיים, כדי לפענח את מצב השעתוק החריג הזה לאחר עיכול אנזימטי, ניתן לייעל את הפרוטוקול על ידי הוספת מעכבי שעתוק ותרגום שונים כגון אקטינומיצין D, טריפטוליד ואניסומיצין בשלבים שונים. השימוש במעכבים אלה יכול לחשוף את ביטוי הגנים האמיתי של microglia in vivo ללא הגדרת בקרה. לכן, הוספת מעכבים אלה לפרוטוקול יכולה להפחית את מספר בעלי החיים או הדגימות הנדרשים בניסוי והיא חסכונית יותר לניתוח במורד הזרם. עם זאת, יש לציין כי כמה גנים של microglia יהיה modulated על ידי מעכבים אלה, אשר עשוי להגביל את השימוש של מעכבים אלה לעבודה עתידית24. שימוש במכשיר הדיסוציאטור המיוחד לאחר הוספת תערובת אנזימים 1 ותערובת אנזימים 2 לדיסוציאציה של רקמות יכול גם להגביל את תגובות השעתוק בשלב פרוטוקול 323.
לפרוטוקול זה יש כמה מגבלות. טוהר המיקרוגליה הוא רק כ-85% בפרוטוקול, שאינו מהווה יותר מ-90% מכלל התאים הבודדים בדומה לספרות אחרת19,22. החלפת עמודת LS בעמודת MS, היעדר המסננים ואיכות המיקרובים עשויים להיות הגורמים הפוטנציאליים. אם טוהר המיקרוגליה המבודדת אינו עומד בדרישות, הארכת זמן הדגירה המגנטי או העברת התאים הממוינים דרך עמודה מגנטית שנייה תשפר את הטוהר (איור משלים S1). אם מספר התאים נמוך, יש לקטוף רקמות מעכברים נוספים ומאובדן תאים עקב שאיפה רשלנית. אם הכדאיות של התא נמוכה, החלפת PBS במאגר הטעינה במדיום RPMI 1640 עשויה לשפר באופן משמעותי את הכדאיות של התא. זה גם מועיל לכדאיות התא כדי להבטיח שכל הפתרונות המשמשים בפרוטוקול הם טריים, והפרוטוקול יושלם בהקדם האפשרי. חשוב למשתמשים לאזן את הטוהר ואת מספר המיקרוגליה המתקבלת באמצעות פרוטוקול זה.
הפרוטוקול משתמש בקשירת המיקרוגליה עם חרוזי CD11b ובהעשרה בשדה מגנטי כדי לטהר את המיקרוגליה. לכן, מיקרוגליה מטוהרת להכיל את הזיהום של תאים מיאלואידים, וזה בלתי נמנע בפרוטוקול זה. בניגוד ל- FACS - תקן הזהב למיון תאים - טוהר המיקרוגליה המבודדת על ידי MACS אינו גבוה מספיק עבור כמה יישומים משוכללים כגון ריצוף עמוק, המגביל את השימוש הנרחב בו. בנוסף, FACS למיון מיקרוגליה יכול לחסל את הזיהום של תאים מיאלואידים. עם זאת, MACS היא שיטה עדינה יותר, שומרת על מאפיינים מורפולוגיים מקוריים יותר של תאי גליה במיוחד אסטרוציטים, לוקחת פחות זמן לבידוד מיקרוגליה, ויש לה תפוקת תאים גבוהה יותר מאשר FACS, מה שמרמז על כך שהיא יכולה להפחית את מספר העכברים שיש להקריב ועשויה להתאים יותר לניסויים תלויי זמן19,25 . בינתיים, MACS חסכוני יותר וזמין באופן נרחב ויש לו דרישות טכניות נמוכות יותר עבור נסיינים. MACS הוכחה כשיטה האמינה והעקבית ביותר לבידוד מיקרוגליה. ניתוח מורפולוגי הראה כי מיקרוגליה לא תופעל על ידי MACS, ו- RNA-seq הראה כי מיקרוגליה המבודדת בשיטה זו שומרת על מצב מנוחהשל 19,26.
בסך הכל, הפרוטוקול חשוב לסקר של מיקרוגליה במחלות דמיאלינציה, וניתן להשתמש במיקרוגליה המבודדת על ידי פרוטוקול זה עבור יישומים שונים במורד הזרם כגון RT-PCR כמותי ו- RNA-seq. הפרוטוקול משתמש בצבע אדום נייטרלי כדי לאתר נגעים מתפרקים, מה שמבטיח את הדיוק של מיקומי הנגעים ומפחית כל בלבול עם רקמה תקינה במהלך הדגימה. לוקליזציה מדויקת של נגעים יכולה לעזור להתמקד בהשפעות של מחלות ולחקור את הפנוטיפ המולקולרי הייחודי ואת המאפיינים התפקודיים של מיקרוגליה במחלות demyelinating. זה יספק בסיס לחקר המנגנון של microglia במחלות demyelinating. שיטה זו של בידוד מיקרוגליה באמצעות חרוזי CD11b מגנטיים יכולה לטהר את המיקרוגליה עם כדאיות ותפוקה גבוהה של תאים תוך זמן קצר, עם דרישות מינימליות לתנאי ניסוי, מה שמאפשר שימוש נרחב לחקר מיקרוגליה בתנאים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים הצהירו כי לא קיימים אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי קרן בית החולים טונג'י (HUST) למדען צעיר מעולה (מענק מס '2020YQ06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M.
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
