Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung primärer Mikroglia in Tiermodellen demyelinisierender Krankheiten unter Verwendung der säulenförmigen magnetisch aktivierten Zellsortierung.
Abstract
Mikroglia, die ansässigen angeborenen Immunzellen im Gehirn, sind die primären Reaktionspersonen auf Entzündungen oder Verletzungen im zentralen Nervensystem (ZNS). Mikroglia können in Ruhezustand und aktivierten Zustand unterteilt werden und können ihren Zustand als Reaktion auf die Mikroumgebung des Gehirns schnell ändern. Mikroglia werden unter verschiedenen pathologischen Bedingungen aktiviert und weisen unterschiedliche Phänotypen auf. Darüber hinaus gibt es viele verschiedene Untergruppen aktivierter Mikroglia und eine große Heterogenität zwischen verschiedenen Untergruppen. Die Heterogenität hängt hauptsächlich von der molekularen Spezifität von Mikroglia ab. Studien haben gezeigt, dass Mikroglia aktiviert werden und eine wichtige Rolle im pathologischen Prozess der entzündlichen Demyelinisierung spielen. Um die Eigenschaften von Mikroglia bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen wie Multipler Sklerose und Neuromyelitis optica spectrum disorder besser zu verstehen, schlagen wir ein periläsionales primäres Mikroglia-Sortierprotokoll vor. Dieses Protokoll verwendet säulenförmige magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS), um hochgereinigte primäre Mikroglia zu erhalten und die molekularen Eigenschaften von Mikroglia zu erhalten, um die möglichen Auswirkungen von Mikroglia bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen.
Introduction
Mikroglia stammen von Dotter-Sack-Vorläufern, die sehr früh das embryonale Gehirn erreichen und an der Entwicklung des ZNS 1,2 beteiligt sind. Zum Beispiel sind sie am synaptischen Beschneiden3 und der Regulierung des axonalen Wachstumsbeteiligt 4. Sie sezernieren Faktoren, die das neuronale Überleben fördern und die neuronale Lokalisation unterstützen5. Gleichzeitig sind sie an der Entfernung abnormaler Zellen und apoptotischer Zellen beteiligt, um eine normale Gehirnentwicklung zu gewährleisten6. Darüber hinaus überwachen Mikroglia als immunkompetente Zellen des Gehirns kontinuierlich das Gehirnparenchym, um tote Zellen, dysfunktionale Synapsen und Zelltrümmer zu beseitigen7. Es wurde gezeigt, dass die Mikrogliaaktivierung eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Krankheiten spielt, einschließlich entzündlicher demyelinisierender Erkrankungen, neurodegenerativer Erkrankungen und Hirntumoren. Aktivierte Mikroglia bei Multipler Sklerose (MS) tragen zur Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) und zur Regeneration von Myelin bei, indem sie Myelintrümmer8 verschlingen.
Bei der Alzheimer-Krankheit (AD) aktiviert die Ansammlung von Amyloid-Beta (Aβ) Mikroglia, die die phagozytären und entzündlichen Funktionen der Mikroglia9 beeinflusst. Aktivierte Mikroglia im Gliomgewebe, sogenannte Gliom-assoziierte Mikroglia (GAM), können das Fortschreiten des Glioms regulieren und letztendlich die Prognose der Patientenbeeinflussen 10. Die Aktivierung verändert das Mikroglia-Transkriptom tiefgreifend, was zu morphologischen Veränderungen, der Expression von Immunrezeptoren, erhöhter phagozytischer Aktivität und einer verbesserten Zytokinsekretionführt 11. Es gibt verschiedene Untergruppen von aktivierten Mikroglia bei neurodegenerativen Erkrankungen wie krankheitsassoziierte Mikroglia (DAM), aktivierte Reaktionsmikroglia (ARM) und mikroglialer neurodegenerativer Phänotyp (MGnD)8.
In ähnlicher Weise koexistieren mehrere dynamische funktionelle Untergruppen von Mikroglia auch im Gehirn bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen12. Das Verständnis der Heterogenität zwischen verschiedenen Untergruppen von Mikroglia ist unerlässlich, um die Pathogenese entzündlicher demyelinisierender Erkrankungen zu untersuchen und ihre potenziellen therapeutischen Strategien zu finden. Die Heterogenität von Mikroglia hängt hauptsächlich von der molekularen Spezifitätab 8. Es ist wichtig, die molekularen Veränderungen von Mikroglia für die Untersuchung der Heterogenität genau zu beschreiben. Fortschritte in der Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnologie (RNA-seq) haben die Identifizierung der molekularen Eigenschaften aktivierter Mikroglia unter pathologischen Zuständenermöglicht 13. Daher ist die Fähigkeit, Zellpopulationen zu isolieren, entscheidend für die weitere Untersuchung dieser Zielzellen unter bestimmten Bedingungen.
Studien, die durchgeführt wurden, um die Eigenschaften und Funktionen von Mikroglia zu verstehen, sind in der Regel In-vitro-Studien, da festgestellt wurde, dass eine große Anzahl von primären Mikroglia aus Mauswelpengehirnen (1-3 Tage alt) hergestellt und kultiviert werden kann, die an den Kulturkolben haften und auf der Kunststoffoberfläche mit anderen gemischten Gliazellen wachsen. Anschließend können reine Mikroglia basierend auf der unterschiedlichen Haftfähigkeit von gemischten Gliazellenisoliert werden 14,15. Diese Methode kann jedoch nur Mikroglia aus dem perinatalen Gehirn isolieren und dauert mehrere Wochen. Potentielle Variablen in der Zellkultur können Mikroglia-Eigenschaften wie die molekulare Expressionbeeinflussen 16. Darüber hinaus können Mikroglia, die mit diesen Methoden isoliert werden, nur an In-vitro-Experimenten teilnehmen, indem sie die Bedingungen von ZNS-Erkrankungen simulieren, und können die Eigenschaften und Funktionen von Mikroglia in In-vivo-Krankheitszuständen nicht darstellen. Daher ist es notwendig, Methoden zur Isolierung von Mikroglia aus dem erwachsenen Mäusegehirn zu entwickeln.
Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und magnetische Trennung sind zwei weit verbreitete Methoden, obwohl sie ihre eigenen unterschiedlichen Einschränkungen haben16,17,18,19. Ihre jeweiligen Vor- und Nachteile werden im Diskussionsteil gegenübergestellt. Die Reifung der MACS-Technologie bietet die Möglichkeit, Zellen schnell zu reinigen. Huang et al. haben eine bequeme Methode entwickelt, um demyelinisierende Läsionen im Gehirnzu markieren 20. Durch die Kombination dieser beiden technischen Ansätze schlagen wir ein schnelles und effizientes säulenförmiges magnetisches CD11b-Trennprotokoll vor, das eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung zur Isolierung von Mikroglia um demyelinisierende Läsionen in erwachsenen Mäusegehirnen und die Erhaltung der molekularen Eigenschaften von Mikroglia liefert. Die fokalen demyelinisierenden Läsionen wurden durch die stereotaktische Injektion von 2 μL Lysolecithinlösung (1% LPC in 0,9% NaCl) in das Corpus callosum 3 Tage vor Beginn des Protokolls21 verursacht. Dieses Protokoll legt den Grundstein für die Durchführung des nächsten Schritts in In-vitro-Experimenten. Darüber hinaus spart dieses Protokoll Zeit und bleibt für den breiten Einsatz in verschiedenen Experimenten machbar.
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Protocol
Alle Tierverfahren wurden vom Institute of Animal Care Committee des Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China, genehmigt.
1. Materialien
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor, bevor Sie mit dem Protokoll beginnen.
- Bereiten Sie den Ladepuffer vor, indem Sie fetales Rinderserum (FBS, 2%) zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Neutralrot (NR) Farbstoff (letzte 1%) zu PBS.
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen mit dem kommerziell erhältlichen Adult Brain Dissociation Kit vor (siehe Materialtabelle).
- Um Enzymmischung 1 herzustellen, pipettieren Sie 1,9 ml Puffer Z und 50 μL Enzym P in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
- Zur Herstellung von Enzymmix 2 pipettieren Sie 20 μL Puffer Y und 10 μL Enzym A in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Bereiten Sie die Lösung zur Entfernung von Ablagerungen vor.
2. Durchblutung und Dissektion von Mäusen
- Intraperitoneal (i.p.) injizieren Sie der Maus 500 μL 1% NR-Farbstoff in PBS 2-3 h vor der Anästhesie.
HINWEIS: Die intraperitoneale Injektion von NR in demyelinisierenden Mausmodellen hilft, die Läsionen zu erkennen (Abbildung 1). - Betäuben Sie die Maus mit Pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) und stellen Sie sicher, dass die Maus erfolgreich betäubt wird, indem Sie die Schmerzreaktionen untersuchen.
- Öffnen Sie die Brusthöhle der Maus und legen Sie das Herz frei.
- Schneiden Sie eine kleine Ecke des rechten Vorhofs vorsichtig ab und durchbluten Sie die Maus intrakardial mit 20-30 ml kaltem PBS aus dem linken Ventrikel.
- Enthaupten Sie die Maus unter Narkose.
- Öffnen Sie den Schädel der Maus und befreien Sie das Gehirn vorsichtig vom Schädel.
- Übertragen Sie das Gehirn auf die Maus-Gehirnscheibenform und schneiden Sie das Gehirn in 0,1 cm große Scheiben.
- Entfernen Sie die Gehirnscheiben und legen Sie sie in kaltes PBS in eine Petrischale (60/15 mm). Mikrodissektieren Sie die durch NR-Farbstoff markierten Läsionen um das Corpus callosum unter einem Stereomikroskop mit einer mikrochirurgischen Pinzette.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das sezierte Gewebe so vollständig wie möglich ist, um den anschließenden Transfer zu erleichtern. Der gesamte Sezierfortschritt sollte in 2 Stunden abgeschlossen sein. - Überführen Sie das sezierte Gewebe in 15-ml-Zentrifugenröhrchen, die die entsprechende Menge an Kaltladepuffer enthalten.
HINWEIS: Poolen Sie das Corpus callosum-Gewebe von 2-3 Mäusen in einer Röhre als eine Probe.
3. Gewebedissoziation
- Zentrifugieren Sie das sezierte Gewebe bei 300 ×g für 30 s (nach Erreichen dieser Geschwindigkeit), um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln.
- Enzymmix 1 und Enzymmix 2 auf 37 °C in einem Inkubator vorheizen.
- 1.950 μL vorgewärmte Enzymmischung 1 in eine Probe geben und in einem Inkubator bei 37 °C für 5 min aufschließen.
- 30 μL vorgewärmter Enzymmix 2 hinzufügen und vorsichtig mischen.
- In einem Inkubator bei 37 °C für 15 min verdauen und alle 5 min vorsichtig vermischen.
- Nach der Verdauung 4 ml kaltes PBS in die Tube geben und vorsichtig schütteln.
- Platzieren Sie 70-μm-Filter auf 50-ml-Zentrifugenröhrchen und benetzen Sie die Filter mit 500 μL kaltem PBS. Filtern Sie das dissoziierte Gewebe, indem Sie die verdauten Gewebeproben durch die Filter leiten, und übertragen Sie die gefilterte Suspension im 50-ml-Zentrifugenröhrchen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die Gewebemenge zu klein ist. - Die gefilterten Gewebeproben bei 300 ×g zentrifugieren Sie 10 min bei 4 °C und saugen Sie den Überstand langsam und vollständig ab.
HINWEIS: Alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden, mit Ausnahme der enzymatischen Verdauung.
4. Entfernung von Ablagerungen
- Resuspendiert das Zellpellet sanft mit 1.550 μL kaltem PBS.
- Fügen Sie 450 μL kalte Lösung zur Entfernung von Ablagerungen hinzu und mischen Sie gut.
- Überlagern Sie die obige Mischung sehr langsam und vorsichtig mit 2 x 1 ml kaltem PBS unter Verwendung einer 1.000 μL Pipette.
HINWEIS: Kippen Sie das Zentrifugenröhrchen um 45 ° und fügen Sie langsam PBS entlang der Rohrwand mit der Pipette hinzu. - Das Röhrchen langsam und schonend in eine Zentrifuge geben und bei 4 °C und 3.000 × g für 10 min drehen.
- Suchen Sie nach der Zentrifugation nach drei Schichten. Die beiden oberen Schichten werden mit einer 1.000-μL-Pipette vollständig abgesaugt (Abbildung 2).
- Füllen Sie das Rohr bis zu 5 ml mit kaltem Ladepuffer und drehen Sie das Rohr dreimal vorsichtig um.
- Zentrifuge bei 4 °C und 1.000 × g für 10 min. Saugen Sie den Überstand vollständig ab und vermeiden Sie es, das Zellpellet zu stören.
5. Magnetische Trennung von Mikrogliazellen
- Resuspendiert das Zellpellet mit 90 μL Ladepuffer und fügt 10 μL CD11b (Microglia) -Perlen hinzu.
- Gut mischen und 15 min bei 4 °C inkubieren.
- Fügen Sie 1 ml Ladepuffer hinzu und pipettieren Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit einer 1.000 μL Pipette auf und ab, um die Zellen nach der Inkubation zu waschen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 4 °C und 300 × g für 10 min und saugen Sie den Überstand vollständig ab, um die ungebundenen Perlen zu entfernen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL Ladepuffer.
- Platzieren Sie die MS-Säule mit ihrem Separator zur positiven Selektion im Magnetfeld.
- Spülen Sie die Säule mit 500 μL Ladepuffer, um die Zellen zu schützen und die Effizienz der magnetischen Sortierung basierend auf dem Protokoll des Herstellers sicherzustellen.
- Tragen Sie die Zellsuspension auf die MS-Säule auf und verwerfen Sie den Durchfluss, der nicht markierte Zellen enthält.
- Fügen Sie der Säule dreimal 500 μL Ladepuffer hinzu, um Zellen wegzuspülen, die an der Säulenwand haften, und verwerfen Sie den Durchfluss.
HINWEIS: Fügen Sie nur dann einen neuen Ladepuffer zum Waschen hinzu, wenn der Säulenbehälter vollständig leer ist. - Entfernen Sie die Säule nach dem Waschen der Säule aus dem Separator und legen Sie sie auf ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 1 ml Ladepuffer in die Säule hinzu und drücken Sie den Kolben an den Boden der Säule, um die magnetisch markierten Zellen auszuspülen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal, um die magnetisch markierten Zellen vollständig zu sammeln.
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Representative Results
Mikroglia, die mit CD11b-Perlen isoliert wurden, haben eine hohe Reinheit
Mikrogliazellen um die Läsionen in Demyelinisierungs-Mausmodellen wurden mit dem oben genannten Protokoll isoliert und mittels Durchflusszytometrie getestet. Die Zellen werden fluoreszierend mit CD11b-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und CD45-Allophycocyanin (APC) markiert, um Mikroglia in der Durchflusszytometrie gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen. Es gibt mehrere Literaturen, die zeigen, dass CD11b- und CD45-Antikörper ausreichen, um die Reinheit isolierter Mikroglia19,22 zu überprüfen. Die Fluoreszenzkompensation wurde am Durchflusszytometer mit unbefleckten und einfach gefärbten Kontrollproben durchgeführt. Die Zellen wurden durch Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) und seitliche Streuhöhe (SSC-H) eingezäunt; einzelne Zellen wurden durch Vorwärtsstreufläche (FSC-A) und FSC-H eingezäunt. Die Anteile der Mikroglia (identifiziert als CD11b + CD45Intermediate) vor und nach der magnetischen Trennung wurden mittels Durchflusszytometrie getestet. Die Back-Loop-Technik wurde verwendet, um die Gating-Strategie der Durchflusszytometrie-Analyse anzupassen, indem das Gate für die Mikroglia bestimmt wurde. Im Vergleich zu etwa 3 × 104 Zellen und 6 × 10 3 Mikroglia vor der magnetischen Trennung jedes Mausgehirns (Abbildung 3A) liefert MACS im Allgemeinen etwa 2,5 × 10 3 Zellen und 2 ×10 3 Mikroglia pro Mausgehirn (Abbildung 3B), was etwa 85% aller Einzelzellen entspricht. Fast 3% der myeloischen Zellen (identifiziert als CD11b + CD45hoch) waren jedoch in den MACS-getrennten Zellen vorhanden und waren in diesem Protokoll schwer aus der CD11b-Population zu entfernen. Die Reinheit der isolierten Mikroglia kann mit Hilfe von zwei Magnetsäulen auf 95% erhöht werden (Ergänzende Abbildung S1). Die MACS-Sortierung könnte etwa 33% der Mikroglia in der Gehirnmischungsprobe erfassen.
Mikroglia, die mit CD11b-Perlen isoliert wurden, haben eine hohe Zelllebensfähigkeit
Fluorochrom 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) wird häufig verwendet, um die Zelllebensfähigkeit in der Durchflusszytometrie nachzuweisen. 7-AAD+ -Zellen stellen tote Zellendar 19. Die Lebensfähigkeit von MACS-getrennten Mikroglia betrug etwa 95% durch Zellfärbung mit 7-AAD (Abbildung 4).
Morphologische Analyse von Mikroglia um demyelinisierende Läsionen, sortiert nach MACS
Morphologische Analysen zeigten, dass Mikroglia nicht durch MACS aktiviert wurden. Mikroglia zeigen nach MACS einen typischen longitudinalen bipolaren Zellkörper, der der Mikrogliamorphologie nach FACS19 ähnelt. Mikroglia um demyelinisierende Läsionen werden im Modell der LPC-induzierten Demyelinisierungaktiviert 21. Mikroglia, die mit dem ionisierten Calciumbindungsadaptermolekül 1 (Iba-1) gefärbt wurden, zeigten in diesem Protokoll eine typische amöbische Morphologie aktivierter Mikroglia. P2ry12 ist ein typisches Molekül des Mikroglia-Ruhezustands. Es gibt einen kleinen Bruchteil der verzweigten und P2ry12 + Mikroglia vor MACS aufgrund der Ausdehnung des Ausmaßes der dissoziierten Läsionen. Die Existenz von P2ry12+ Mikroglia nach MACS deutet jedoch auch darauf hin, dass MACS Mikroglia nicht aktiviert (Ergänzende Abbildung S2).
Abbildung 1: Bilder der fokalen demyelinisierenden Läsionen, die durch den neutralen roten Farbstoff gekennzeichnet sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bilder der drei durch Zentrifugation gebildeten Schichten. Die oberen beiden Schichten (Schicht 1 + Schicht 2) müssen bei der Schmutzentfernung entfernt werden (siehe Protokollschritt 4.5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Durchflusszytometrie-Analyse von Mikroglia, isoliert aus Demyelinisierungsläsionen erwachsener Mäuse vor und nach MACS. (A) Schematische Darstellung der Gating-Strategie, die in der Durchflusszytometrie-Analyse vor MACS verwendet wird: FSC-H und SSC-H für die Auswahl von Zellen, FSC-A und FSC-H für die Auswahl einzelner Zellen und CD11b-FITC und CD45-APC für die Auswahl myeloischer Zellen (oben) und Mikroglia (unten). (B) Schematische Darstellung der Gating-Strategie, die in der Durchflusszytometrie-Analyseprobe nach MACS verwendet wird. Der Anteil der Mikroglia hat nach MACS signifikant zugenommen: FSC-H und SSC-H für die Auswahl von Zellen, FSC-A und FSC-H für die Auswahl einzelner Zellen und CD11b-FITC und CD45-APC für die Selektion myeloischer Zellen (oben) und Mikroglia (unten). Abkürzungen: SSC-H = Seitenstreuhöhe; FSC-H = Vorwärtsstreuhöhe; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; CD45-APC = allophycocyanin-markiertes CD45; CD11b-FITC = Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes CD11b; MACS = magnetisch aktivierte Zellsortierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: FACS-Gating-Strategie für lebende/tote Einzelzellen nach MACS. 7-AAD und SSC-H zur Selektion lebender Zellen nach MACS. Abkürzungen: SSC-H = Seitenstreuhöhe; 7-AAD = 7-Aminoactinomycin D; MACS = magnetisch aktivierte Zellsortierung; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung S1: Durchflusszytometrie-Analyse von Mikroglia, die aus erwachsenen Demyelinisierungsmäusen isoliert wurden. (A) Schematische Darstellung der Gating-Strategie, die in der Durchflusszytometrie-Analyseprobe vor MACS verwendet wurde. (B) Schematische Darstellung der Gating-Strategie, die in der Durchflusszytometrie-Analyseprobe nach MACS unter Verwendung von zwei magnetischen Säulen verwendet wird. (C) Einzelparameter-Histogramm von CD11b-FITC und CD45-APC in der Durchflusszytometrie nach MACS unter Verwendung von zwei magnetischen Säulen. Abkürzungen: SSC-H = Seitenstreuhöhe; FSC-H = Vorwärtsstreuhöhe; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; CD45-APC = allophycocyanin-markiertes CD45; CD11b-FITC = Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes CD11b; MACS = magnetisch aktivierte Zellsortierung; CD45Int = CD45-Zwischenausdruck. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Immunfluoreszenzfärbung von Mikroglia mit Iba-1 und P2ry12 vor und nach MACS. (A) Bilder von Mikroglia vor MACS. (B) Bilder von isolierten Mikroglia nach MACS. Maßstabsstäbe = 20 μm. Abkürzungen: MACS = magnetisch aktivierte Zellsortierung; Iba-1 = ionisiertes Calciumbindungsadaptermolekül 1; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das Protokoll schlägt eine Methode zur Isolierung von Mikroglia um die demyelinisierenden Läsionen vor, die helfen kann, die funktionellen Eigenschaften von Mikroglia bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen. Mikroglia, die mit CD11b-Perlen gewonnen wurden, weisen eine hohe Reinheit und Lebensfähigkeit auf. Kritische Schritte im Protokoll sind die genaue Lokalisierung von Herden und die optimale Reinigung von Mikroglia. Im Protokollschritt 2.1 ist es notwendig, die NR-Lösung 2 h zu injizieren, bevor die Maus geopfert wird, um sicherzustellen, dass die Läsionen genau angezeigt werden können20. In Protokollschritt 2.8 wurde darauf geachtet, Hirngewebeschnitte zur Dissektion auf eine Eisbox zu legen und diesen Schritt so schnell wie möglich abzuschließen, wodurch die Zelllebensfähigkeit verbessert wird. In Schritt 2.9 ist es notwendig, geeignetes Gewebe als eine Probe sowohl für die Enzymverdauung als auch für die Entfernung von Ablagerungen auszuwählen. Schritt 3.7 kann nicht übersprungen werden, wenn die Wirkung der Schmutzentfernung nicht zufriedenstellend ist. In Schritt 4.3 muss die Zugabe von PBS schonend sein, um verschiedene Schichten zu bilden, um sicherzustellen, dass so viel Schutt wie möglich entfernt wird. Alle Schritte des Protokolls, mit Ausnahme der enzymatischen Verdauung, sollten auf Eis durchgeführt werden, um die Zelllebensfähigkeit sicherzustellen und die transkriptionelle Reaktion der Mikroglia zu reduzieren. Jeder Schritt im Protokoll ist mild und behält eine hohe Lebensfähigkeit, so dass es unnötig ist, die Lösung zur Entfernung toter Zellen22,23 zu verwenden.
Die enzymatische Dissoziationsmethode für das Gehirn der Maus im Protokoll hat sich für Einzelzell-RNA-seq23 als geeignet erwiesen. Obwohl die Enzyme im Protokoll mild sind, haben Marsh et al. herausgefunden, dass verschiedene enzymatische Hydrolyseprotokolle bei 37 ° C das Transkriptom von Mikroglia24 signifikant verändern können. Das Einstellen einer gesunden Kontrolle im Experiment zum Vergleich kann helfen, die differentiell exprimierten Gene der Demyelinisierung zu identifizieren und so die abnormale transkriptionelle Reaktion im Protokoll zu eliminieren. Um diesen abnormalen Transkriptionszustand nach der enzymatischen Verdauung zu verhindern, kann das Protokoll optimiert werden, indem verschiedene Transkriptions- und Translationsinhibitoren wie Actinomycin D, Triptolid und Anisomycin in verschiedenen Schritten hinzugefügt werden. Die Verwendung dieser Inhibitoren kann die tatsächliche Genexpression von Mikroglia in vivo ohne die Einstellung einer Kontrolle aufdecken. Daher kann die Zugabe dieser Inhibitoren zum Protokoll die Anzahl der im Experiment erforderlichen Tiere oder Proben reduzieren und ist für die nachgelagerte Analyse wirtschaftlicher. Es sollte jedoch beachtet werden, dass einige Gene von Mikroglia durch diese Inhibitoren moduliert werden, was die Verwendung dieser Inhibitoren für zukünftige Arbeiten einschränken kann24. Die Verwendung des spezialisierten Dissoziatorinstruments nach der Zugabe von Enzymmix 1 und Enzymmix 2 zur Gewebedissoziation kann auch die transkriptionellen Reaktionen in Protokollschritt 323 einschränken.
Dieses Protokoll hat einige Einschränkungen. Die Reinheit der Mikroglia beträgt nur etwa 85% im Protokoll, das nicht mehr als 90% aller Einzelzellen umfasst, ähnlich wie andere Literaturen19,22. Der Ersatz der LS-Säule durch die MS-Säule, das Fehlen der Filter und die Qualität der Mikrokügelchen können die möglichen Ursachen sein. Wenn die Reinheit der isolierten Mikroglia die Anforderungen nicht erfüllt, verbessert die Verlängerung der magnetischen Inkubationszeit oder das Passieren der sortierten Zellen durch eine zweite magnetische Kolonne die Reinheit (Ergänzende Abbildung S1). Wenn die Anzahl der Zellen gering ist, sollte Gewebe von mehr Mäusen geerntet werden und Zellverlust aufgrund von unvorsichtiger Aspiration vermieden werden. Wenn die Zelllebensfähigkeit gering ist, könnte das Ersetzen von PBS im Ladepuffer durch RPMI 1640-Medium die Zelllebensfähigkeit erheblich verbessern. Es ist auch vorteilhaft für die Zelllebensfähigkeit, sicherzustellen, dass alle im Protokoll verwendeten Lösungen frisch sind und das Protokoll so schnell wie möglich abgeschlossen wird. Es ist wichtig, dass die Benutzer die Reinheit und die Anzahl der Mikroglia, die mit diesem Protokoll erhalten werden, in Einklang bringen.
Das Protokoll nutzt die Bindung von Mikroglia mit CD11b-Perlen und die Anreicherung in einem Magnetfeld, um die Mikroglia zu reinigen. Daher enthalten gereinigte Mikroglia die Kontamination myeloischer Zellen, die in diesem Protokoll unvermeidlich ist. Im Gegensatz zu FACS - dem Goldstandard für die Sortierung von Zellen - ist die Reinheit der durch MACS isolierten Mikroglia für einige aufwendige Anwendungen wie die Tiefensequenzierung nicht ausreichend hoch, was ihre weit verbreitete Verwendung einschränkt. Darüber hinaus kann FACS zur Sortierung von Mikroglia die Kontamination myeloischer Zellen beseitigen. MACS ist jedoch eine schonendere Methode, behält mehr ursprüngliche morphologische Eigenschaften von Gliazellen, insbesondere Astrozyten, bei, benötigt weniger Zeit für die Isolierung von Mikroglia und hat eine höhere Zellausbeute als FACS, was darauf hindeutet, dass es die Anzahl der zu opfernden Mäuse reduzieren kann und für zeitkritische Experimente besser geeignet seinkönnte 19,25 . Inzwischen ist MACS kostengünstiger und weit verbreitet und hat niedrigere technische Anforderungen an Experimentatoren. MACS hat sich als die zuverlässigste und konsistenteste Methode zur Isolierung von Mikroglia erwiesen. Die morphologische Analyse zeigte, dass Mikroglia nicht durch MACS aktiviert würden, und RNA-seq hat gezeigt, dass Mikroglia, die mit dieser Methode isoliert wurden, einen Ruhezustandbeibehalten 19,26.
Insgesamt ist das Protokoll wichtig für die Untersuchung von Mikroglia bei demyelinisierenden Erkrankungen, und Mikroglia, die durch dieses Protokoll isoliert wurden, können für verschiedene nachgelagerte Anwendungen wie quantitative RT-PCR und RNA-Seq verwendet werden. Das Protokoll verwendet neutralen roten Farbstoff, um demyelinisierende Läsionen zu lokalisieren, was die Genauigkeit der Läsionsstellen gewährleistet und Verwechslungen mit normalem Gewebe während der Probenahme reduziert. Eine genaue Lokalisierung von Läsionen kann dazu beitragen, sich auf die Auswirkungen von Krankheiten zu konzentrieren und den einzigartigen molekularen Phänotyp und die funktionellen Eigenschaften von Mikroglia bei demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen. Dies wird eine Grundlage für die Untersuchung des Mechanismus von Mikroglia bei demyelinisierenden Erkrankungen bieten. Diese Methode der Isolierung von Mikroglia mit magnetischen CD11b-Perlen kann Mikroglia mit hoher Zelllebensfähigkeit und -ausbeute in kurzer Zeit mit minimalen Anforderungen an experimentelle Bedingungen reinigen, was eine weit verbreitete Verwendung für die Untersuchung von Mikroglia unter verschiedenen Bedingungen ermöglicht.
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Disclosures
Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Acknowledgments
Die Studie wurde von der Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
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