Genetica inversa per ingegnerizzare varianti virali a RNA a senso positivo

Sommario

Il protocollo descrive un metodo per introdurre la diversità genetica controllabile nel genoma del virus dell'epatite C combinando la sintesi di RNA mutante a lunghezza intera utilizzando la PCR soggetta a errori e la genetica inversa. Il metodo fornisce un modello per la selezione del fenotipo e può essere utilizzato per genomi di virus a RNA a senso positivo lunghi 10 kb.

Abstract

La mancanza di un metodo conveniente per la generazione iterativa di diverse varianti virali a lunghezza intera ha impedito lo studio dell'evoluzione diretta nei virus a RNA. Integrando una PCR a RNA a base di errore del genoma completo e la genetica inversa, è possibile indurre una mutagenesi di sostituzione casuale a livello di genoma. Abbiamo sviluppato un metodo che utilizza questa tecnica per sintetizzare diverse librerie per identificare mutanti virali con fenotipi di interesse. Questo metodo, chiamato sintesi di RNA mutante a lunghezza intera (FL-MRS), offre i seguenti vantaggi: (i) la capacità di creare una grande libreria tramite una PCR altamente efficiente in una sola fase soggetta a errori; (ii) la capacità di creare gruppi di librerie con diversi livelli di diversità genetica manipolando la fedeltà della DNA polimerasi; (iii) la creazione di un prodotto di PCR full-length che possa fungere direttamente da modello per la sintesi di RNA mutante; e (iv) la capacità di creare RNA che può essere consegnato nelle cellule ospiti come pool di input non selezionato per lo screening di mutanti virali del fenotipo desiderato. Abbiamo scoperto, utilizzando un approccio di genetica inversa, che FL-MRS è uno strumento affidabile per studiare l'evoluzione virale-diretta in tutte le fasi del ciclo di vita del virus dell'epatite C, JFH1 isolato. Questa tecnica sembra essere uno strumento inestimabile per impiegare l'evoluzione diretta per comprendere l'adattamento, la replicazione e il ruolo dei geni virali nella patogenesi e nella resistenza antivirale nei virus a RNA a senso positivo.

Introduzione

Lo screening genetico in avanti inizia con un fenotipo virale di interesse e poi, attraverso il sequenziamento del suo genoma e il confronto con quello del ceppo originale, tenta di identificare la mutazione o le mutazioni che causano quel fenotipo. Al contrario, negli screening genetici inversi, vengono introdotte mutazioni casuali in un gene bersaglio, seguite da un esame del fenotipo o dei fenotipi ^risultanti1. Per l'approccio di genetica inversa, la mutagenesi in vitro è la tecnica più utilizzata per creare un pool di varianti che vengono successivamente sottoposte a screening per i fenotipi di interesse. Sono stati descritti vari ....

Protocollo

NOTA: Il ceppo JFH1 (WT) utilizzato qui è stato un gentile regalo di Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. La linea cellulare di epatoma umano, Huh7.5, è stata un gentile regalo di Charles Rice, della Rockefeller University. Uno schema del metodo è mostrato nella Figura 1.

1. Mutagenesi da sostituzione genomica di JFH1 mediante PCR a rischio di errore

1. Per eseguire la ep-PCR, preparare la miscela master per quattro serie di esperimenti con i primer J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' e J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (F....

Risultati

Una pletora di varianti complete di HCV può essere generata e sottoposta a screening per i fenotipi resistenti ai farmaci di interesse seguendo le procedure descritte nella Figura 1. Le librerie mutanti dell'intero genoma sono state sintetizzate utilizzando clonal-pJFH1 in quantità decrescenti (100-10 ng), come mostrato nella Figura 2. Le rese medie dei prodotti ep-PCR (librerie mutanti) variavano da 3,8 a 12,5 ng/μL. La Figura 3 mo.......

Discussione

In questo studio, abbiamo dettagliato una procedura FL-MRS semplice e rapida che integra ep-PCR¹⁸ e genetica inversa per sintetizzare librerie di genoma completo dell'HCV, che possono quindi essere utilizzate in un sistema di coltura cellulare per generare varianti competenti per la replicazione per lo screening di fenotipi resistenti ai farmaci. L'uso della Taq DNA polimerasi a bassa fedeltà è un prerequisito della ep-PCR che consente l'incorporazione di sostituzioni durante l'amplificazione PCR .......

Materiali

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 kb più scala del DNA	Thermo Fisher	10787018
provetta da centrifuga da 1,5 ml	Tarsons	500010
provetta da centrifuga da 15 ml	Tarsons	546021
piatto per coltura cellulare da 35 mm	Tarsons	960010
Provetta da centrifuga da 50 ml	Tarsons	546041
Acido acetico	Merck	A6283
Agarosio	HiMedia	MB080
Unità di elettroforesi su gel	Agrose BioRad	1704406
Cabina di biosicurezza, Classe II	ESCO	AC2 4S
Albumina sierica bovina	Centrifuga HiMedia	MB083
	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Sistema di rilevamento PCR in tempo reale	BioRad	1855201
Piastre di clonazione 90 mm	Incubatore di CO
	Colibri Galaxy 170R		del Nuovo Brunswick
	Titertek-Berthold	11050140
DAB  Substrato  Kit	Abcam	ab94665
Soluzione dATP	NEB	N0440S
Set di soluzioni di deossinucleotide (dNTP)	NEB	N0446
Pirocarbonato di dietil (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimetil solfossido (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM ad alto glucosio	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA sale tetrasodico diidrato	HiMedia	GRM4918
Bromuro di etidio	Amresco	X328
Siero fetale bovino	Gibco	26140079
Formaldeide	Fishser Scientific	12755
Sistema di documentazione su gel	ALPHA IMAGER
Capra anti-topo IgG (H+L) Anticorpo secondario, HRP	Thermo Fisher	A16066
Perossido di idrogeno 30%	Merck	107209
Microscopio invertito	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB brodo	HiMedia	M1245
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher		116680270 reagente di trasfezione
Set di pipette meccaniche	Eppendorf
Metanolo	Merck	106009
Micro Punte 0,2-10 &; l	Tarsons	521000
Micro Punte 10 - 100 &5; l	Tarsons	521010
Micro Punte 200-1000 & micro; l	Tarsons	521020
tampone MOPS	GeNei	3601805001730
Aminoacidi non essenziali (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chimicamente competente E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5&;
Opti-MEM	Gibco	1105-021	provette PCR medie essenziali minime
0,2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomicina	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer salino (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion  Ad alta fedeltà DNA polimerasi	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Controller per pipette	Gilson
platino Taq DNA polimerasi	Software
Prism	GraphPad
QIAamp Mini kit di RNA virale	di isolamento virale	Qiagen	52904
Kit QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106
Kit di purificazione PCR QIAGEN	28104	Kit di purificazione del cokum
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	Kit di pulizia dell'RNA
Pipette sierologiche 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Pipette sierologiche 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Pipette sierologiche 10 ml	Thermo Fisher	170356N
Marcatore RNA a filamento singolo 0,2-10 kb	Merck	R7020
Latte scremato	HiMedia	M530
Sodio azide 0,1 M soluzione	Merck	8591
SuperScript III Trascrittasi inversa	Invitrogen	18080044	trascrittasi inversa
T100 Termociclatore	BioRad	1861096
Pallone per colture cellulari T175	Tarsons	159910
Pallone per colture cellulari T25	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Sistema di produzione di RNA su larga scala	Promega	P1320	Sistema di produzione di RNA su larga scala
Pallone per colture cellulari T75	Tarsons	950050
Taq DNA polimerasi	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT Kit in 1 fase	Biosistemi applicati	4392653
TaqMan RNA-to-CT  1-Passo  Kit	Thermo Fisher	4392653	kit qRT-PCR commerciale.
TOPO-XL--2 Kit completo di clonazione PCR	Kit Thermo Fisher	K8050-10	per la clonazione di prodotti a lungo termine PCR
Tris base	HiMedia	TC072
Soluzione tripsina-EDTA	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Concentratore a vuoto	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Bagnomaria	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S

Tarson 460091 Spettrometro per microvolumi 3120000909F110120 di analisi statistica Thermo 10966034 Kit