Summary
Denne protokol beskriver tibial neuroma transponeringsmodellen, som indebærer en læsion af tibialnerven med efterfølgende transponering af den proksimale nerveende mod en subkutan prætibial eller lateral position. Adfærdstest af neuroma smerte og plantar hyperalgesi er kvantificeret ved anvendelse af Von Frey monofilamenter.
Abstract
Tibial neuroma transponering (TNT) er en rottemodel, hvor allodyni på neuromstedet (tibial nerve) uafhængigt kan evalueres fra allodyni på plantaroverfladen af bagpoten inderveret af den intakte surale nerve. Denne TNT-model er velegnet til at teste terapier for neuromsmerter, såsom den potentielle overlegenhed af visse kirurgiske terapier, der allerede anvendes i klinikken, eller til at evaluere nye lægemidler og deres virkning på begge smertemetoder i samme dyr. I denne model fremstilles en distal læsion (neurotmesis) i tibialnerven, og den proksimale nerveende transponeres og fastgøres subkutant og pretibialt for at muliggøre vurderinger af neuromastedet med et 15 g Von Frey-monofilament. For at vurdere allodyni over suralnerven kan Von Frey-monofilamenter anvendes via op-ned-metoden på plantar-lateralområdet af bagpoten. Efter skæring af tibialnerven udvikles mekanisk overfølsomhed på neuromstedet inden for 1 uge efter operationen og vedvarer mindst indtil 12 uger efter operationen. Allodyni på den surale innerverede plantaroverflade udvikler sig inden for 3 uger efter operationen sammenlignet med det kontralaterale lem. Efter 12 uger dannes et neurom på den proksimale ende af den afskårne tibiale nerve, indikeret ved dispersion og hvirvlende af axoner. For TNT-modelkirurgi skal flere kritiske (mikro) kirurgiske trin følges, og nogle kirurgiske praksis under terminal anæstesi anbefales. Sammenlignet med andre neuropatiske smertemodeller, såsom den skånede nerveskademodel, kan allodyni over neuromastedet uafhængigt testes fra sural nerveoverfølsomhed i TNT-modellen. Imidlertid kan neuromastedet kun testes hos rotter, ikke hos mus. De tips og anvisninger, der gives i denne protokol, kan hjælpe forskergrupper, der arbejder med smerte, med succes at implementere TNT-modellen i deres facilitet.
Introduction
Hvert sår, der varierer fra simple flænger til amputation af hele lemmer, ledsages af varierende grader af perifer nerveskade. Sådan nerveskade kan resultere i dannelsen af et neurom, en uorganiseret sammenfiltring af spirende nervefibre. Neuromer bliver smertefulde hos 8% -30% af patienterne, hvilket alvorligt påvirker deres livskvalitet 1,2,3,4,5. Efter amputation af lemmer udvikler neuromsmerter hos 50% af patienterne 6,7,8. Rapporterede symptomer omfatter ømhed, spontan smerte, allodyni, hyperalgesi og mekanisk eller termisk overfølsomhed i det innerverede område9. Når de ikke behandles tilstrækkeligt inden for 1 år, kan neuromsmerter udvikle sig til en kronisk smertetilstand, hvilket resulterer i høj samfundsmæssig byrde og tilhørende medicinske omkostninger 10,11,12,13,14. På grund af den dårlige effekt af nuværende farmakologiske indgreb behandles neuromsmerter fortrinsvis ved kirurgisk fjernelse af det smertefulde neurom og nerven behandles ved forskellige kirurgiske teknikker som beskrevet i litteraturen15. Det er vigtigt at bemærke, at fuldstændig smertelindring er sjælden, smerter forværres ofte over tid, og 40% af patienterne har ikke gavn af operationen, hvilket indikerer, at der er behov for nye behandlinger 1,16.
En standardiseret rottemodel af neuroma smerte hjælper med at forstå de mekanismer, der driver neuroma smerte, og kan hjælpe med at identificere nye behandlinger eller evaluere eksisterende, der anvendes i klinikken. Tibial neuroma transponering (TNT) model blev først beskrevet af Dorsi et al. i 200817 og er blevet brugt af forskellige forskergrupper18,19,20. Det overordnede mål med denne metode er at kunne teste forskellige behandlingsteknikker for neuroma smerte. Fordelen ved modellen i forhold til for eksempel den skånede nerveskade (SNI) model21 er, at den giver mulighed for at teste allodyni på neuromastedet. Dette skyldes, at modellen involverer transponering af tibialnervens proksimale nerveende til en subkutan prætibial position, hvor den kan undersøges med von Frey-monofilamenter. Desuden udvikler allodyni sig på plantaroverfladen af bagpoten inderveret af den intakte suralnerve, som kan vurderes uafhængigt af neuromsmerten hos det samme dyr. Dette ligner symptomer på neuromsmerter hos patienter, hvor vedvarende neuropatisk smerte efter fjernelse af et smertefuldt neurom undertiden skyldes de nærliggende nerver22. Desuden er allodyni over en afskåret nerve med et neurom en anden smertemodalitet end allodyni over den intakte nabonerve. Således letter denne model vurdering af effekten af nye terapier på både allodyni, der er til stede på neuromastedet, og mere udbredt neuropatisk smerte testet i plantaroverfladen af bagpoten. Da operationen, der udføres for at skabe TNT-modellen, kan være udfordrende, uddyber dette papir proceduren for at støtte forskere, der implementerer modellen i deres anlæg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskning blev udført i overensstemmelse med IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) og retningslinjerne for dyreforsøg, projektnummer AVD1150020198824.
1. Von Frey baseline målinger
- Før operationen udføres baselinemålinger i henhold til Von Frey-testproceduren, der er beskrevet nedenfor i afsnit 5 og afsnit 6.
2. Anæstesi og forberedelse
BEMÆRK: Denne undersøgelse blev udført på 15 hanrotter fra Sprague Dawley, der var 12 uger gamle.
- Bedøv dyrene ved induktion med 5% isofluran og oprethold anæstesi med 2% -3% isofluran.
BEMÆRK: Vedligeholdelse med 2% isofluran resulterer normalt i tilstrækkelig bedøvelse og spontan vejrtrækning uden behov for trakeal intubation eller mekanisk ventilation. - Kontroller dyrenes reflekser ved at klemme foden med pincet. Sørg for, at dyret ikke reagerer, før du fortsætter. Barber operationsfeltet fra knæ til ankel med en elektrisk barbermaskine og påfør oftalmisk salve på øjnene for at forhindre tørhed. Injicer 0,5 mg/kg smertestillende carprofen subkutant i abdominalområdet.
- Placer den bedøvede rotte på ryggen med hovedet enten til venstre eller højre og benet, der skal opereres i nærheden af kirurgen. Exoroter den nedre bagben, så den mediale malleolus vender opad. Placer rotten under et stereokirurgisk mikroskop med 6x forstørrelse.
- Desinficer det barberede område med tre skiftende runder jodbaseret skrubbe efterfulgt af alkohol. Placer et sterilt ark med et operativt hul over benet, så kun det operative felt er synligt. Sørg for at opretholde disse sterile tilstande under operationen.
3. Kirurgi
- Placer en lille vatpind under anklen for at holde det operative felt vandret. Find knæet og lav forsigtigt et langsgående snit på 1-2 cm ved hjælp af en skalpel over den mediale side af bagpoten fra midten af læggen til anklen. Hvis det er nødvendigt, skal du åbne huden og subcutis yderligere med mikrosaks, indtil muskellagene er synlige.
- Identificer det overfladiske neurovaskulære bundt som to eller tre hvide og en tykkere lilla / rød linje, nogle gange med mindre grene, der kan bevæge sig frit over muskellagene. Ved hjælp af et elektrokauteri (se materialetabel) koaguleres enhver aktiv blødning eller osning i det operative felt. Pas på ikke at beskadige det neurovaskulære bundt.
- Bluntly dissekere for at åbne fascia mellem gastrocnemius musklerne, lige bagved det overfladiske neurovaskulære bundt af 3,2. Mellem musklernes fascia kan tibialnerven findes. Tibialnerven er ca. tre gange størrelsen af den overfladiske nerve i det neurovaskulære bundt. Brug tibialbenet som et ekstra vartegn (tibialnerven ligger lige bagved tibialbenet).
- Identificer tibialnerven og dens bifurcation.
BEMÆRK: Bifurcationen er normalt synlig med en lysere linje i længderetningen over nerven. - Disseker forsigtigt tibialnerven fri for de omgivende vaskulære bundter. Udfør dissektionen ved stump bevægelse af tibialnerven og skæring af det udsatte væv, der viser en vis strækning, mens du bevæger tibialnerven.
BEMÆRK: Hvis tibialnerven er fastgjort til krydsende vener efter dissektion, kan disse vener koaguleres for at udsætte hele tibialnerven. Pas på ikke at koagulere selve tibialbundtet. - Udsæt tibialnerven proximalt, indtil den forsvinder under et krydsende muskellag. På dette tidspunkt synes tibialnerven at dykke dybere ned i bagpoten mod knæet. Udsæt tibialnerven distalt op til anklen.
BEMÆRK: Når tibialnerven udsættes mere distalt, vil mængden af krydsende kollagenfibre (dvs. fibre vinkelret på nervefibrenes retning) stige. Disse kollagenfibre skal skæres for at muliggøre tilstrækkelig længde til at transponere tibialnerven.- Når hele tibialnerven er udsat, skal du placere muskellagene tilbage for at undgå dehydrering af nerven. Hvis nerven dehydrerer (dvs. den bliver mere stiv, kedelig og rynket), og det ikke er tilstrækkeligt at dække med muskellag, tilsættes dråber saltvand for at hydrere det.
- Brug et stumpt mikrokirurgisk værktøj, helst en mikronåleholder, til at dissekere den prætibiale hud fra det subkutane muskellag for at skabe en subkutan tunnel. For at gøre dette skal du holde huden op og skubbe den stumpe spids ind i vævet parallelt med huden. Sørg for, at enden af tunnelen er placeret prætibialt eller mere lateralt for at sikre let adgang til området til test af neuroma.
- Forøg isofluran til 5%. Gå tilbage til tibialnerven og udsæt den (dvs. gå tilbage til det sted, der er beskrevet i trin 3.6). Skær tibialnerven (dvs. begge plantar grene) på det mest distale niveau nær anklen. Sænk isofluran til det normale niveau på 2% -3%.
- Skift mikroskopforstørrelsen til 10x eller 16x. Identificer epineurium af tibialnerven proksimal til snittet foretaget i trin 3.8, eller i tilfælde af en mere proksimal bifurcation af tibialnerven, identificer epineurium af både de mediale og laterale plantar grene proksimal til snittet i trin 3.8.
BEMÆRK: Epineurium er hvidere og fastere sammenlignet med nervefibrene indeni, som er mere gule og bløde. - Placer forsigtigt en 8-0 nylonsutur (se materialetabel) gennem epineurium i den proksimale nerveende ved forsigtigt at holde epineurium med pincet og sætte nålen mellem nerven og epineurium med et bid på ca. 0,5 mm. Træk suturen igennem og tag en bid med nålen subkutant for enden af den subkutane tunnel lavet i trin 3.7. Lav en knude, som vil transponere nerven lateralt ind i den subkutane tunnel.
BEMÆRK: Hvis begge plantar grene deler et fælles epineurium, bør en sutur være tilstrækkelig. Hvis begge plantar grene har deres eget epineurium, skal hvert epineurium fikseres individuelt. Undgå at placere suturen gennem huden; Fix det kun subkutant. - Placer en tykkere sutur med en mørk farve (helst en blå eller sort 4-0 sutur) flush til den fikserede nerveende, ikke trænger ind i huden. Sørg for, at suturen er synlig fra ydersiden af huden. Kontroller, om nerven forbliver på plads efter bevægelse af pote og muskler. Afskær suturenderne med en lidt længere suturende på 4-0 end på 8-0 sutur.
- Skift mikroskopets forstørrelse tilbage til 6x. Luk huden med intraepidermale suturer ved hjælp af 8-0 sutur og rengør forsigtigt huden med 0,9% NaCl ved hjælp af en vatpind.
4. Postkirurgisk behandling
- Placer rotten i et rent bur under et papirhåndklæde i en behagelig position. Hvis rummet er koldt, skal du placere en varmepude under en del af buret (kun under en del af buret, da dyret skal kunne undslippe varmen, når det er nødvendigt). Sørg for nem adgang til mad og vand.
- Lad ikke den postkirurgiske rotte være uden opsyn, før den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. Rotten kan returneres til andre dyrs selskab, når den er fuldt ud genoprettet fra anæstesi efter operationen. Dette er normalt efter 1 time, og når rotten udviser sit normale gangmønster og adfærd.
- 24 timer og 48 timer efter operationen administreres en dosis på 0,5 mg/kg carprofen subkutant (abdominalregionen) til behandling af postkirurgiske smerter.
5. Von Frey test af plantarsiden af bagpoterne
BEMÆRK: Von Frey-test (trin 5 og 6) udføres før operationen (til baseline-måling) og fra 3 dage efter operationen.
- Placer rotterne i nettrådsbundbure 1 uge før baseline-måling eller 2 uger før operationen for at sikre akklimatisering til testmiljøet.
- Start med baseline foranstaltninger mindst 1 uge før operationen. Sørg for, at tre uafhængige baseline-målinger udføres på separate dage.
- Kontroller, at rotterne er rolige i de netforbundne bundbure. Påfør en række Von Frey-monofilamenter med en logaritmisk skala vinkelret på plantaroverfladen af bagpoten.
- For at stimulere suralnerven (overfølsomhed) påføres monofilamentet på sidesiden tæt på hårgrænsen. Undgå at røre fodpuderne, da disse er mere følsomme.
- For at stimulere tibialnerven (hyposensitivitet) påføres monofilamentet midt på plantaroverfladen af bagpoten. Hvis monofilamentet påføres i det mest mediale område, kan dette også stimulere saphenøs nerve, en gren af lårbensnerven (figur 1). Undgå at røre fodpuderne.
- Start med 4 g monofilamentet. Påfør tilstrækkelig kraft på monofilamentet, så håret bøjes og holdes i 3 s, og kontroller derefter dyrets reaktioner på monofilamentet. Et positivt svar er pludselig pote tilbagetrækning, pludselig flinching, pludselig pote slikker, eller vokalisering. I nogle tilfælde bevæger rotten sig og forsøger at finde/angribe monofilamentet.
- Vælg det næste monofilament afhængigt af responsen på stimulus via op-ned-metoden23. For eksempel, hvis rotten reagerer, stimulere næste med 2 g monofilamentet; Hvis rotten ikke reagerer, skal du stimulere med 6 g monofilamentet osv. I alt skal du anvende 5-10 stimuli afhængigt af reaktionen.
6. Von Frey-test af neuroma-stedet
- Håndter dyrene dagligt i mindst 5-7 dage før baseline foranstaltninger eller 2 uger før operationen. Sørg for, at dyrene holdes som beskrevet i trin 6.2, så de er trygge ved stillingen.
- Hold rotterne med næsen rettet mod albuefolden. Hvis rotten holdes i højre hånd, skal dens venstre bagpote hænge frit mellem højre tommelfinger og pegefinger (første webhotel). Hvis rotten holdes i venstre hånd, skal deres højre bagpote hænge frit mellem venstre tommelfinger og pegefinger.
- Start med baseline foranstaltninger mindst 1 uge før operationen. Sørg for, at tre uafhængige baseline-målinger udføres på separate dage.
- Kontroller, at rotterne er rolige og komfortable, mens de holdes. Ved baseline anbringes monofilamentet 15 g forsigtigt på den prætibiale overflade af den blottede bagpote. Efter operationen placeres 15 g monofilamentet på den synlige sutur (fx på neuromaets placering). Påfør tilstrækkelig kraft på monofilamentet, så håret bøjes og holdes i 1 s.
- Optag reaktionen på hver stimulus. Reaktionsmulighederne inkluderer ingen reaktion, langsom tilbagetrækning, hurtig tilbagetrækning og vokalisering. Optag svaret som 0 point for ingen reaktion og et punkt for langsom tilbagetrækning, hurtig tilbagetrækning eller vokalisering.
- Gentag fem klynger af fem anvendelser af monofilamentet, med 2-3 s mellem hver applikation og 2-3 min eller mere mellem de fem klynger. I alt skal hver bagpote have 25 anvendelser af monofilamentet med registrerede reaktioner.
7. Prøvegendannelse til histologi og forberedelse
BEMÆRK: Histologisk undersøgelse udføres 12 uger efter den første operation.
- Inducer anæstesi og forbered dyrene som beskrevet i trin 2.2, 2.3 og 2.4.
- Lav forsigtigt et snit på 2-3 cm ved hjælp af en skalpel over arret, der blev lavet ved den første operation, men pas på ikke at skære for dybt, da nerven er overfladisk placeret.
- Bestem neuromets position, disseker omhyggeligt neuromet og nerven fri for omgivende arvæv, og placer det høstede neurom i fikseringsmiddel. For at evaluere neuromamorfologi er vævet fortrinsvis i længderetningen indlejret i paraffin eller epoxyharpiks som beskrevet af Tork et al.18.
- Efter høst af vævet aflives rotterne under terminal anæstesi (5% isofluran) via hjertepunktur eller halshugning.
BEMÆRK: Det anbefales først at høste neuromet, før rotterne dræbes, for så er det lettere at skelne neuromet fra dets omgivende væv in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering på neuromastedet viste øget følsomhed over for påføring af 15 g von Frey-monofilamentet. Ved baseline responderede rotter typisk på 10%-15% (± 13%) af de 25 anvendelser af et 15 g monofilament. Responsraten steg til 45%-50% (± 24%) 1 uge efter TNT-operationen. På den kontralaterale side svarede antallet af responser efter operationen til responserne ved baseline (figur 2A). Omkring 20% af rotterne udviklede ikke et smertefuldt neurom; besvarelsesprocenten steg ikke i forhold til basisscenariet (figur 2B). Dette kan sammenlignes med den menneskelige situation, hvor ikke alle patienter (50% efter amputation) udvikler smerte efter dannelsen af et neuroma. Alle rotter udviklede et neurom i slutningen af den transekterede og transponerede tibiale nervestump 12 uger efter operationen (figur 3). Dette neurom var karakteriseret ved hvirvlende axoner og mikrofascikler inden for kollagenaflejringer.
Transsektion af tibialnerven reducerede mekanisk følsomhed i midten af plantarsiden af bagpoten, inderveret af tibialnerven (figur 1). Hyposensitiviteten var til stede 1 uge efter operationen, var signifikant forskellig fra den kontralaterale side og baseline fra 3 uger efter operationen og forblev indtil mindst 12 uger efter operationen (figur 4). På den laterale del af plantarsiden af bagpoten innerveret af den intakte suralnerve udviklede rotterne mekanisk overfølsomhed, der var signifikant forskellig fra den kontralaterale side og baseline fra 1 uge efter operationen (figur 4). Denne overfølsomhed varede ved i mindst 12 uger efter operationen. Ved den kontralaterale pote blev den mekaniske følsomhed ikke påvirket sammenlignet med baseline i de områder, der enten var innerveret af den kirurgiske eller tibiale nerve (figur 4).
Figur 1: Nervefordeling på plantarsiden af bagpoten. Rød = sural nervefordeling (lateral); lilla = tibial nervefordeling (midten); grøn = saphenøs nervefordeling (medial). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Von Frey fra neuroma-stedet. Tibialnerven blev transekteret, og forløbet af mekanisk følsomhed over neuromastedet blev vurderet med et 15 g monofilament påført i fem klynger af fem applikationer hver med i alt 25 applikationer. Et svar scores som et point. (A) Neuromastedet viste et signifikant højere respons 1 uge efter operationen sammenlignet med baseline og den kontralaterale side. N = 15; fejlbjælker: standardfejl i middelværdien (SEM); blandet modelanalyse med flere sammenligninger og Tukey-test. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. (B) Individuelle værdier af det ipsilaterale sted viser mangfoldighed i reaktion. Tre rotter (20 %) havde en relativt høj baseline score, og tre rotter (20 %) viste ingen ændringer i prætibial følsomhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Morfologi af neuroma. Histologiske billeder af et 12 uger gammelt neurom. (A) Hematoxylin-Eosin-farvning, (B) Massons trikromfarvning og (C) Neurofilamentfarvning. Grøn pil = tibial nerve bare proksimal til neuroma. Orange pil = neuroma, identificeret ved hvirvlende axoner og diffusion af fasciklerne. Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Von Frey af plantar bagpote (tibial og sural nerve). Tibialnerven blev transekteret, og forløbet af mekanisk følsomhed blev vurderet ved Von Frey-test på plantaroverfladen af bagpoten. Den midterste del af den ipsilaterale opererede bagpote inderveret af tibialnerven viste hyposensitivitet. Den laterale del af den ipsilaterale opererede bagpote inderveret af den kirurgiske nerve viste overfølsomhed. De midterste og laterale dele af plantar kontralaterale bagpote viste ingen ændringer i følsomhed sammenlignet med baseline. N = 15; fejlbjælker: standardfejl i middelværdien (SEM); blandet modelanalyse med flere sammenligninger og Tukey-test. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
TNT-modellen indebærer at skære tibialnerven og transponere den lateralt og subkutant til en prætibial placering for at muliggøre følsomhedstest af neuroma ud over plantar hyperalgesi over suralnerven. I TNT-modellen er det nøglen, at neuromaets sted er synligt for forskerne. Derfor foretrækkes en albino rottestamme, fordi subkutane suturer er let synlige gennem huden, og suturens farve skal helst være mørkeblå eller sort.
Når operationen udføres, og tibialnerven er eksponeret, er der variation i stedet (fx proksimal eller distal) for bifurcation af tibialnerven. Hvis rotter har en proksimal bifurcation, er det muligt, at der kan findes to nerver (den mediale og laterale plantar nerve) proksimal til anklen (figur 5A) i stedet for kun en tibial nerve (figur 5B). Det er vigtigt, at begge grene skæres og transponeres for at fremkalde plantar hyperalgesi over suralnerven. Man kunne vælge kun at transponere en plantar nerve; Imidlertid skelnes der ikke let mellem den laterale og mediale plantarnerve på dette niveau og kan påvirke resultaterne. Derfor anbefales det at transponere begge nerver. Desuden kan nogle rotter have en mere distal bifurcation af tibialnerven, og det kan være umuligt at transponere kun en plantar nerve.
Figur 5: Proksimal og distal bifurcation af tibialnerven. Anatomisk variation i niveauet af bifurcation (*) af tibialnerven. (A) Proksimal bifurcation af tibialnerven; (B) distal bifurcation af tibialnerven. Forkortelser: MPN = medial plantar nerve, LPN = lateral plantar nerve. Klik her for at se en større version af denne figur.
I det originale papir af Dorsi et al.17 placeres en ligatur omkring den proksimale tibiale nerveende, og nerven transponeres og fastgøres via denne ligatursutur. Da ligaturen omkring nerven kan fremkalde indsnævringssmerter24, er et alternativ beskrevet i denne metode at fikse nerven ved hjælp af epineurinale suturer. Hvis tibialnerven skæres og transponeres, er det vigtigt, at suturen til at fiksere nerven subkutant placeres gennem epineurium og ikke nervefasciklerne selv, da dette også kan påvirke smerteforanstaltninger. Derudover bør man undgå at placere suturen gennem huden, da rotter har tendens til at gnave synlige suturer, hvilket resulterer i forskydning af neuromet og dermed ikke-pålidelige resultater af smertemålinger.
Når huden er lukket, er det også vigtigt at bruge intraepidermale suturer for at undgå gnave, der vil resultere i et åbent sår. Desuden vil den efter transponering af tibialnerven være placeret i et mere overfladisk lag lige under huden. Et åbent sår i kombination med en overfladisk placeret nerve er uønsket.
Von Frey-målinger kan udføres for at teste neuromasmerter på neuromastedet og for at teste plantar hyperalgesi over den kirurgiske nerve på den laterale side af bagpoten. Neuromastedet er synligt efter operationen på grund af suturens mørke farve. Til test af den kirurgiske nerveoverfølsomhed skal der vælges et sted, hvor Von Frey-monofilamentet påføres. Dette kan være proksimalt eller distalt til den laterale fødepude, men bør være omtrent det samme sted under baseline målinger og målinger i ugerne efter operationen.
Fejlfinding af metoden
Hvis rotterne reagerer på alle stimuli, der påføres prætibialområdet allerede under baselinemålinger, skal du sørge for, at de er rolige og afslappede, og at de er korrekt akklimatiseret til testområdet. Gentag baseline måling, indtil rotterne reagerer mindre på stimuli. Derudover foretrækkes det ikke at bære parfume, mens du udfører målinger. Ideelt set reagerer rotter ikke på den prætibiale stimulus, når et 15 g monofilament påføres før operationen. Men hvis rotterne er rolige, og 50% -100% af rotterne stadig reagerer på 15 g monofilamentet, skal du ændre det til et monofilament, der har en responsrate på 10% -20% under baseline. Men hvis monofilamentet ændres, anbefales det først at udføre et pilotforsøg for at teste, om TNT-rotterne reagerer på denne lavere styrke af monofilament. I TNT-modellens indledende papir blev neuromastedet målt ved at påføre monofilamentet gennem en åbning i bunden af en Perspex-boks17. I pilotforsøg viste rotter sig at reagere på hver stimulus, når de blev påført via bunden af buret og havde tendens til at angribe monofilamentet. Når de blev holdt tæt af forskeren, var rotterne i en rolig tilstand, hvilket resulterede i en lavere responsrate på monofilamentet under baseline-måling.
Hvis den proksimale tibiale nerveende ikke kan nå langt nok i den subkutane tunnel, skal du følge løbet af tibialnerven mere proksimal og fjerne kollagenøst og fedtvæv omkring nerven. Skær eventuelle mindre nervegrene eller kar, der holder nerven fastgjort til dens omgivelser. Dette vil give nerven et bredere bevægelsesområde, der skal transponeres mere sideværts. Bemærk, at i det originale papir af Dorsi et al.17 blev nerven transponeret mere lateralt. I pilotforsøg viste det sig at være umuligt at nå den laterale position. Derfor beskriver denne metode en prætibial position af neuromastedet.
Begrænsninger af metoden
En begrænsning ved TNT-modellen er, at operationen involverer flere (mikro)kirurgiske trin, der skal følges. En anden begrænsning er, at TNT-modellen ikke let oversættes til mus. Fra erfaring har mus tendens til at være ret følsomme over for stimuli påført på et prætibialt område, selv ved anvendelse af et 0,008 g monofilament.
Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder
I TNT-modellen kan neuromsmerter testes uafhængigt af plantar hyperalgesi over suralnerven. Sidstnævnte induceres også i andre neuropatiske smertemodeller såsom SNI-modellen, men her kan neuromsmerter ikke testes uafhængigt21. Derudover skæres både tibial og peroneal nerve i SNI-modellen, hvilket resulterer i mere tab af motorisk funktion, hvilket resulterer i lammede indre muskler i poten21. Fordi kun tibialnerven skæres på et distalt niveau i TNT-modellen, viser føddernes indre muskler kun et ubetydeligt tab af motorisk funktion.
Potentielle anvendelser af metoden
Tidligere forskning har allerede vist, at TNT-modellen kan bruges til at teste forskellige smertestillende medicin, nervehætter eller andre kirurgiske værktøjer til neurombehandling18,19,20. Alle forskergrupper, der er interesseret i smerte, kan dog have potentiel fordel af at bruge TNT-modellen, da to forskellige smertemetoder kan testes i samme dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ikke at have nogen interessekonflikt. Selvom dette forskningsarbejde delvist blev finansieret af Axogen, havde virksomheden ingen indflydelse på udførelsen af undersøgelsen og på resultaterne.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Sabine Versteeg for at hjælpe under mikrokirurgi og Anja van der Sar og Trudy Oosterveld-Romijn fra Fællesdyrlaboratoriet (Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium) for deres hjælp med at forberede mikroskopet og operationsrummet og tage sig af dyrene.
Denne forskning blev finansieret af Axogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
- Stokvis, A., vander Avoort, D. J., van Neck, J. W., Hovius, S. E., Coert, J. H. Surgical management of neuroma pain: a prospective follow-up study. Pain. 151 (3), 862-869 (2010).
- Domeshek, L. F., et al. Surgical treatment of neuromas improves patient-reported pain, depression, and quality of life. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (2), 407-418 (2017).
- Lame, I. E., Peters, M. L., Vlaeyen, J. W., Kleef, M., Patijn, J. Quality of life in chronic pain is more associated with beliefs about pain, than with pain intensity. European Journal of Pain. 9 (1), 15-24 (2005).
- Koch, H., Haas, F., Hubmer, M., Rappl, T., Scharnagl, E. Treatment of painful neuroma by resection and nerve stump transplantation into a vein. Annals of Plastic Surgery. 51 (1), 45-50 (2003).
- Fisher, G. T., Boswick, J. A. Neuroma formation following digital amputations. Journal of Trauma. 23 (2), 136-142 (1983).
- Bowen, J. B., Ruter, D., Wee, C., West, J., Valerio, I. L. Targeted muscle reinnervation technique in below-knee amputation. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (1), 309-312 (2019).
- Jensen, T. S., Krebs, B., Nielsen, J., Rasmussen, P. Phantom limb, phantom pain and stump pain in amputees during the first 6 months following limb amputation. Pain. 17 (3), 243-256 (1983).
- Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 4 (12), 1038 (2016).
- Arnold, D. M. J., et al. Diagnostic criteria for symptomatic neuroma. Annals of Plastic Surgery. 82 (4), 420-427 (2019).
- Liedgens, H., Obradovic, M., De Courcy, J., Holbrook, T., Jakubanis, R. A burden of illness study for neuropathic pain in Europe. Clinicoeconomics and Outcomes Research. 8, 113-126 (2016).
- Langley, P. C., Van Litsenburg, C., Cappelleri, J. C., Carroll, D. The burden associated with neuropathic pain in Western Europe. Journal of Medical Economics. 16 (1), 85-95 (2013).
- Dworkin, R. H., et al. Interpreting the clinical importance of group differences in chronic pain clinical trials: IMMPACT recommendations. Pain. 146 (3), 238-244 (2009).
- Mackinnon, S. E., Dellon, A. L. Results of treatment of recurrent dorsoradial wrist neuromas. Annals of Plastic Surgery. 19 (1), 54-61 (1987).
- Harden, R. N. Chronic neuropathic pain. Mechanisms, diagnosis, and treatment. Neurologist. 11 (2), 111-122 (2005).
- Poppler, L. H., et al. Surgical interventions for the treatment of painful neuroma: a comparative meta-analysis. Pain. 159 (2), 214-223 (2018).
- Eberlin, K. R., Ducic, I. Surgical algorithm for neuroma management: a changing treatment paradigm. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (10), 1952 (2018).
- Dorsi, M. J., et al. The tibial neuroma transposition (TNT) model of neuroma pain and hyperalgesia. Pain. 134 (3), 320-334 (2008).
- Tork, S., et al. Application of a porcine small intestine submucosa nerve cap for prevention of neuromas and associated pain. Tissue Engineering Part A. 26 (9-10), 503-511 (2020).
- Miyazaki, R., Yamamoto, T. The efficacy of morphine, pregabalin, gabapentin, and duloxetine on mechanical allodynia is different from that on neuroma pain in the rat neuropathic pain model. Anesthesia and Analgesia. 115 (1), 182-188 (2012).
- Tian, J., et al. Swimming training reduces neuroma pain by regulating neurotrophins. Medicine and Science in Sports Exercise. 50 (1), 54-61 (2018).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
- Poublon, A. R., et al. The anatomical relationship of the superficial radial nerve and the lateral antebrachial cutaneous nerve: A possible factor in persistent neuropathic pain. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 68 (2), 237-242 (2015).
- Dixon, W. J.
- Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats. Journal of Visualized Experiments. (61), e3393 (2012).
